PMCID: PMC2820240
NIHMSID: NIHMS174679
Abstract
Kokaininduzierte Veränderungen in der Genexpression verursachen Veränderungen der neuronalen Morphologie und des Verhaltens, die der Kokainabhängigkeit zugrunde liegen können. Wir identifizierten eine essentielle Rolle für Histon 3 Lysin 9 (H3K9) Dimethylierung und die Lysin-Dimethyltransferase G9a in Kokain-induzierte strukturelle und Verhaltensplastizität. Wiederholte Kokainverabreichung reduzierte die globalen Konzentrationen der H3K9-Dimethylierung im Nucleus accumbens. TSeine Reduktion der Histonmethylierung wurde durch die Repression von G9a in dieser Hirnregion vermittelt, die durch den Kokain-induzierten Transkriptionsfaktor ΔFosB reguliert wurde. Mittels konditioneller Mutagenese und viral-vermittelten Gentransfer fanden wir, dass G9a-Herunterregulation die dendritische Wirbelsäulenplastizität von Nucleus accumbens-Neuronen erhöht und die Präferenz für Kokain erhöht, wodurch eine entscheidende Rolle für die Histon-Methylierung in den Langzeitwirkungen von Kokain etabliert wird.
Einführung
Wiederholte Kokainexposition ist durch anhaltende Veränderungen in der Genexpression und veränderte neuronale Morphologie innerhalb des Nucleus accumbens (NAc), einer Schlüsselkomponente der Belohnungsschaltung des Gehirns (1-2). Chromatin Remodeling ist wichtig in aberrante Transkriptionsveränderungen in dieser Hirnregion, die Aspekte der Kokainsucht zugrunde liegen können (3-9). Die Kokainregulation der Chromatinstruktur im NAc resultiert zum Teil aus direkten Kokain-induzierten Modifikationen der enzymatischen Chromatin-Maschinerie, die zu Veränderungen der Histonacetylierung und Phosphorylierung führen (4, 7-9); Rollen für Enzyme, die Histon-Methylierung kontrollieren, wurden jedoch noch nicht untersucht.
Eine kürzlich durchgeführte genomweite Promotoranalyse unter Verwendung von an Mikroarrays gekoppelter Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP-Chip) identifizierte nach wiederholter Kokainbehandlung veränderte Muster von reprimierendem Histon H3 Lysin 9 (H3K9) und 27 (H3K27) Methylierung an spezifischen Genpromotoren in der NAc (6). Wir haben daher zahlreiche Lysin-Methyltransferasen (KMTs) und Demethylasen (KDMs) beschrieben, von denen bekannt ist, dass sie die Methylierung von H3K9 oder H3K27 kontrollieren (Abb. 1A). Nur zwei Enzyme, G9a und GLP, zeigten nach wiederholter Kokainverabreichung persistente transkriptionelle Regulation 24 Stunden, als die Expression beider Gene signifikant herunterreguliert war. Da G9a und GLP spezifisch die Dimethylierung von H3K9 (H3K9me2) katalysieren, ist ihre Herabregulierung durch Kokain konsistent mit den zu diesem Zeitpunkt beobachteten globalen Werten von euchromatischem H3K9me2 (Abb. 1B). Im Gegensatz dazu blieben die globalen Werte der heterochromatischen H3K27-Methylierung durch wiederholte Kokainexposition unverändert (Abb. S1 zur Unterstützung von Online-Material). Aufgrund seiner hohen katalytischen Aktivität sowohl in vitro mit einem in vivo (10), untersuchten wir die funktionelle Bedeutung der G9a - Repression nach wiederholter Kokainexposition im NAc. Die Spiegel von G9a-Protein, wie die Spiegel seiner mRNA, waren 24 Stunden nach wiederholter Kokaingabe signifikant reduziert (Abb. S2). Obwohl die G9a-mRNA-Expression im NAc um 35% reduziert wurde, zeigte die immunhistochemische Analyse eine bescheidenere 15% -Reduktion der G9a-Proteinspiegel, übereinstimmend mit der beobachteten Abnahme von 21% in H3K9me2 nach wiederholter Kokaingabe (Abb. 1B). G9a-mRNA-Expression wurde in dieser Gehirnregion durch 20% nach wiederholter Selbstverabreichung von Kokain ebenfalls herunterreguliert (Abb. S3).
Um zu identifizieren, ob Veränderungen in euchromatischem H3K9me2 mit genomweiten Veränderungen in der Genexpression im NAc korrelieren, haben wir Microarray-Analysen verwendet, um Genexpressionsprofile zu untersuchen, die durch eine Kokain-Provokationsdosis bei Tieren mit oder ohne vorangegangene Kokainexposition induziert wurden Genlisten in Tabellen S1-S3). Tiere, die wiederholt Kokain erhalten hatten, zeigten eine dramatisch erhöhte Genexpression 1-Stunde nach einem Kokain-Challenge im Vergleich zu akut behandelten Tieren (Abb. 1C). Diese erhöhte Genexpression trat immer noch in Reaktion auf eine Kokain-Herausforderung auf, die nach der 1-Woche des Entzugs von wiederholtem Kokain gegeben wurde. Übereinstimmend mit früheren Berichten zeigte ein kleiner Prozentsatz von Genen (~ 10%) nach wiederholter Kokaingabe desensibilisierte Transkriptionsreaktionen (Abb. 1C; sehen Tabelle S1) (5). Um die Rolle der G9a-Herunterregulierung in der verstärkten Genexpression nach wiederholtem Kokain direkt zu untersuchen, erhielten die Mäuse intrainavische Injektionen von Herpes-simplex-Virus (HSV) -Vektoren, die entweder GFP oder G9a exprimierten, und wurden mit Kochsalzlösung oder wiederholtem Kokain behandelt, um festzustellen, ob G9a überexprimiert war war ausreichend, um die wiederholte Kokain-induzierte Verstärkung der Genexpression zu blockieren. Aus einem Satz zufällig ausgewählter 12-Gene, die erhöhte Expressionsraten nach wiederholtem Kokain zeigten, beobachteten wir, dass G9a die erhöhte Expression von 50% dieser Gene signifikant reduzierte (Tabelle S4).
Um Upstream-Transkriptionsereignisse zu identifizieren, die die wiederholte Kokain-induzierte Repression der G9a-Expression vermitteln, untersuchten wir eine mögliche Rolle für ΔFosB, ein hochstabiles Spleißprodukt des unmittelbaren frühen Gens fosB. ΔFosB akkumuliert in der NAc nach wiederholter Exposition gegenüber Kokain, wo es mit erhöhter Kokainbelohnung in Verbindung gebracht wurde (11). ΔFosB kann je nach Zielgen entweder als Transkriptionsaktivator oder als Repressor wirken (3, 5, 6, 12). Verwendung von bitransgenem NSE-tTA × tetOP-ΔFosB Mäuse, wobei die ΔFosB-Expression selektiv im NAc und dorsalen Striatum erwachsener Tiere induziert werden kann (13) untersuchten wir den Einfluss der ΔFosB - Expression auf die Kokainregulation von H3K9me2 und KMTs in der NAc. Die ΔFosB-Überexpression war ausreichend, um die Spiegel von H3K9me2 (Abb. 1D) und G9a-Ausdruck (Abb. 1E), wodurch die Auswirkungen von wiederholtem Kokain nachgeahmt werden. Im Gegensatz dazu reduzierte ΔFosB die GLP-Expression in dieser Hirnregion nicht und hatte keine Wirkung auf SUV39H1 und EZH2, die hauptsächlichen Trimethylierungsenzyme für H3K9 bzw. H3K27 (Abb. S4). Um diese Daten unter Verwendung eines unabhängigen & Dgr; FosB-Überexpressionssystems zu bestätigen, erhielten erwachsene Wildtyp-Mäuse bilaterale Intra-NAc-Injektionen von Vektoren des Adeno-assoziierten Virus (AAV), die entweder GFP oder & Dgr; FosB exprimieren. Die virale Überexpression von ΔFosB verringerte die Expression von G9a in dieser Hirnregion (Abb. 1E).
Eine derart ausgeprägte und spezifische Regulation von G9a veranlasste uns zu untersuchen, ob die Veränderung der G9a-Expression spezifisch in NAc-Neuronen Verhaltensreaktionen auf Kokain reguliert. Wildtyp-Mäuse erhielten intra-NAc-Injektionen von HSV-Vektoren, die GFP oder G9a exprimieren, und wurden dann unter Verwendung eines unverzerrten Kokain-konditionierten Platzpräferenzmusters analysiert, das ein indirektes Maß für die Arzneimittelbelohnung liefert. Die virale Überexpression von G9a in NAc-Neuronen wurde nach Verhaltenstests bestätigt (Abb. 2A). Die Überexpression von G9a verringerte signifikant die Präferenz für Kokain im Vergleich zu Tieren, die GFP überexprimieren (Abb. 2B), und erhöhten H3K9me2 Ebenen in der NAc (Abb. 2C). Überexpression einer katalytisch toten Mutante von G9a (G9aH1093K) (14) hatte keinen Einfluss auf die Kokainpräferenz (Abb. 2B) und hatte keinen Einfluss auf H3K9me2 Ebenen in dieser Hirnregion (Abb. 2C).
Um die Rolle von G9a in den Verhaltenseffekten von Kokain weiter zu untersuchen, und insbesondere die wiederholte Kokain-induzierte Repression der G9a-Expression in der NAc nachzuahmen, wurde adultes G9afl / fl Mäuse (14) erhielten Intra-NAc-Injektionen von AAV-Vektoren, die Cre-Rekombinase oder GFP als Kontrolle exprimieren. AAV-Cre-Knockdown von G9a im NAc, der immunhistochemisch bestätigt wurde (Abb. S5), erhöhte signifikant die Effekte von Kokain in Platzkonditionierungsexperimenten und verringerte H3K9me2-Spiegel im NAc (Abb. 2D, E). Ein kommerziell erhältlicher pharmakologischer Inhibitor von G9a und GLP, BIX01294 (15-16) wurde verwendet, um festzustellen, ob die Enzymhemmung in ähnlicher Weise die Verhaltensreaktionen auf Kokain beeinflusst. In der Tat erhöhte die pharmakologische Hemmung von G9a und GLP signifikant die Präferenz für Kokain und verringerte H3K9me2 im NAc (Abb. 2F, G).
Wiederholte Verabreichung von Kokain erhöht die Dichte von dendritischen Stacheln auf NAc-Medium stacheligen Neuronen (17), ein Prozess, der mit funktionellen Veränderungen an exzitatorischen glutamatergen Synapsen auf diese Neuronen assoziiert ist (18-19) und sensibilisierte Verhaltensreaktionen auf die Droge (17, 20). Wir stellten daher die Hypothese auf, dass eine Herunterregulierung der G9a-Aktivität in der NAc durch wiederholtes Kokain die Fähigkeit von Kokain vermitteln könnte, die dendritische Wirbelsäulendichte von NAc-Neuronen zu regulieren. Unter Verwendung von Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) mit einem Anti-G9a-Antikörper identifizierten wir mehrere mutmaßliche G9a-Gen-Targets im NAc, von denen jedes zuvor mit Kokain-induzierter dendritischer Plastizität in Verbindung gebracht wurde (Abb. 3A) (20-26). Wir fanden heraus, dass die wiederholte Verabreichung von Kokain die G9a-Bindung sowie die H3K9me2-Spiegel bei diesen Genpromotoren signifikant verringerte (Abb. 3B). Im Gegensatz dazu rekrutierte die Verabreichung von akutem Kokain G9a schnell an einige dieser Genpromotoren, was mit einer erhöhten G9a-Expression, die in der NAc 1-Stunde nach einer akuten Kokaindosis beobachtet wurde, übereinstimmte (Abb. S6). Obwohl die Bindung von G9a an spezifische Genpromotoren mit Veränderungen ihrer Expression korreliert, bleibt unklar, ob solche Ereignisse durch veränderte globale Spiegel von G9a in der NAc und / oder durch Unterschiede in der G9a-Rekrutierung nach akuten Ereignissen vermittelt werden vs wiederholte Kokainverabreichung.
Basierend auf der G9a-Regulation zahlreicher plastizitätsbezogener Gene in NAc untersuchten wir direkt, ob die Aufrechterhaltung der G9a-Expression in dieser Hirnregion nach wiederholter Kokainbehandlung ausreichend war, um die durch Kokain induzierte dendritische Wirbelsäulenbildung zu blockieren. Verwendung eines Kokainbehandlungsprotokolls, von dem zuvor gezeigt wurde, dass es die dendritische Wirbelsäuleninduktion in NAc fördert (20) untersuchten wir die Dichte der Wirbelsäule bei Tieren, denen entweder HSV-GFP oder HSV-G9a injiziert wurde. In Übereinstimmung mit früheren Befunden beobachteten wir einen signifikanten Anstieg der dendritischen Wirbelsäule in der NAc nach Kokainbehandlung, ein Effekt, der vollständig durch G9a Überexpression blockiert wurde (Abb. 3C). Die G9a-Überexpression allein war nicht ausreichend, um die dendritische Dichte der NAc-Spine in Abwesenheit von Kokain zu verringern. Um diese Daten zu ergänzen, bietet G9afl / fl Mäuse erhielten intra-NAc-Injektionen von HSV-Cre und die Rückenmarksdichte wurde quantifiziert und mit Tieren verglichen, die HSV-GFP in Abwesenheit von Kokain erhielten. Die Unterdrückung der Expression von G9a führte zu einer signifikanten Erhöhung der Dorndichte auf NAc-Medium-Spinyneuronen (Abb. 3C).
Angesichts des Beweises, dass die G9a-Herunterregulierung in der NAc nach wiederholtem Kokain durch ΔFosB vermittelt wird, untersuchten wir als nächstes, ob dieser Transkriptionsfaktor ebenfalls an der Regulation von NAc-dendritischen Stacheln beteiligt ist. Obwohl ΔFosB bisher nicht kausal mit einer solchen dendritischen Plastizität in Verbindung gebracht wurde, sind einige seiner Ziele, einschließlich der Cdk5- und NFκB-Untereinheiten, damit in Zusammenhang gebracht worden (20-23), und die anhaltende Expression von ΔFosB in NAc-Neuronen korreliert mit einer erhöhten dendritischen Wirbelsäulendichte nach wiederholter Kokainbehandlung (27). Zuerst fanden wir, dass die Induktion von ΔFosB in bitransgenen Mäusen in Abwesenheit von Kokain, die G9a und H3K9me2 Expression herunterreguliert (Abb. 1D, E), verringerte G9a-Bindung an zahlreiche plastizitätsbezogene Gene, von denen viele auch direkte Ziele von ΔFosB selbst sind (Abb. 3D) (3, 6). Als nächstes zeigten wir, dass die virale Überexpression von ΔFosB im NAc die dendritische Wirbelsäulendichte unter basalen Bedingungen signifikant erhöhte. ähnlich wie nach wiederholter Kokaingabe (Abb. 3E). Umgekehrt blockierte die Überexpression von ΔJunD, einem dominant negativen Mutantenprotein, das der ΔFosB-Transkriptionsaktivität entgegenwirkt, in der NAc die Fähigkeit von wiederholtem Kokain, die dendritische Rückenmarksbildung in der NAc zu erhöhen (Abb. 3C).
Unsere Beobachtung, dass ΔFosB die G9a-Expression in der NAc reguliert und dass ΔFosB und G9a einige der gleichen Zielgene regulieren, führte uns dazu, andere Wechselwirkungen zwischen ΔFosB und G9a zu untersuchen. Nach akutem Kokain, wenn die G9a - Spiegel erhöht waren, wurde die Bindung von G9a an die fosB Gen wurde erhöht, während nach wiederholtem Kokain, wenn G9a Expression unterdrückt wurde, G9a an die Bindung bindet fosB Gen wurde verringert (Abb. 3A). Eine solche verringerte G9a-Bindung nach wiederholtem Kokain wurde nicht beobachtet c-fos, wo die G9a-Bindung durch wiederholtes Kokain erhöht wird (Abb. S7). Dies steht im Einklang mit der Tatsache, dass im Gegensatz zu fosB, c-fos wird durch chronische Psychostimulans-Exposition unterdrückt (nicht induziert)5). Die Überexpression von ΔFosB in bitransgenen Mäusen reichte aus, um die Bindung von G9a an die Maus signifikant zu verringern fosb Gen (Abb. 3D). Darüber hinaus war die G9a-Überexpression ausreichend, um die erhöhte ΔFosB-Expression nach wiederholter Kokaingabe zu reduzieren (Tabelle S4). Diese Daten legen eine autoregulatorische Schleife nahe, wobei G9a anfänglich die Induktion von ΔFosB durch akute Kokainverabreichung begrenzt. Da sich ΔFosB jedoch mit wiederholter Arzneimittelexposition akkumuliert, unterdrückt es G9a und verstärkt dadurch seine eigene weitere Induktion.
Zusammenfassend haben wir gezeigt, dass die Histon-Lysin-Methylierung in der NAc maßgeblich an der Regulation der neuronalen Genexpression als Reaktion auf Kokain beteiligt ist. Die Unterdrückung von G9a und H3K9me2 nach wiederholter Kokainverabreichung fördert Kokainpräferenz, teilweise durch die transkriptionelle Aktivierung zahlreicher Gene, von denen bekannt ist, dass sie abweichende Formen der dendritischen Plastizität regulieren. Ein besseres Verständnis der Gene, die durch solche Mechanismen reguliert werden, wird unser Wissen über die komplexen biologischen Grundlagen der Drogenabhängigkeit verbessern und könnte bei der Entwicklung effektiverer Behandlungen von Suchterkrankungen helfen.
Materialen und Methoden
Tiere und Behandlungen
Sofern nicht anders angegeben, wurden die Mäuse vier bis fünf pro Käfig in einer Kolonie mit einem 12-Stunden-Hell / Dunkel-Zyklus (Licht von 7: 00 AM bis 7: 00 PM) bei konstanter Temperatur (23 ° C) gehalten ad libitum Zugang zu Wasser und Nahrung. Alle Tierprotokolle wurden von IACUC sowohl am UT Southwestern Medical Center als auch an der Mount Sinai School of Medicine genehmigt.
Für Kokain-Experimente [Immunhistochemie, Western Blotting, quantitative PCR (qPCR), Microarray-Analyse und Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP)] wurden 8- bis 10-Wochen alte männliche C57BL / 6J-Mäuse verwendet. Tiere erhielten tägliche Injektionen von entweder "Kochsalzlösung" (7-Kochsalzlösung, ip), "akutem" Kokain (6-Kochsalzlösung + eine Behandlung 20 mg / kg Kokain-HCl, ip) oder "wiederholtem" Kokain (7-Behandlungen 20 mg / kg Kokain-HCl, ip). Die Mäuse wurden entweder zu der 1-Stunde oder 24-Stunden nach der letzten Behandlung getötet. Für Microarray-Studien wurden die Tiere täglich entweder mit "Kochsalzlösung" (15-Kochsalzlösung, ip), "akutem" Kokain (14-Kochsalzlösung + 1-Behandlung 20 mg / kg Kokain-HCl, ip), "wiederholtem + akutem" Kokain ( 7-Behandlungen Kochsalzlösung + 8-Behandlungen 20 mg / kg Kokain-HCl, ip) oder "wiederholtes Absetzen + akutes" Kokain (7-Behandlungen 20 mg / kg Kokain-HCl + 7-Behandlungen Kochsalzlösung + 1-Expositionsbehandlung 20 mg / kg Kokain-HCl, ip) und wurden 1 Stunde nach der letzten Behandlung getötet. In Verhaltensexperimenten wurden Mäuse einzeln postoperativ untergebracht und wurden wie nachstehend beschrieben mit 10 mg / kg Kokain-HCl ip behandelt. Zur dendritischen Wirbelsäulenanalyse und Microarray-Validierung nach HSV-GFP- und HSV-G9a-GFP-Infektion wurden Mäuse mit "Kochsalzlösung" (5-Behandlungen, Kochsalzlösung, ip) oder "wiederholtem Kokain" behandelt (5-Behandlungen 20 mg / kg Kokain-HCl, ip ) im Laufe von 3-Tagen, da zuvor gezeigt wurde, dass dieses Injektionsprotokoll die Wirbelsäulendichte auf Nucleus accumbens (NAc) -Neuronen innerhalb des Zeitrahmens der Herpes-simplex-Virus (HSV) -Transgenexpression erhöht (Ergänzende Referenz S1). Mäuse, die für die Analyse der dendritischen Wirbelsäule verwendet wurden, wurden 4 Stunden nach der letzten Behandlung getötet.
Um eine lokale Deletion des auf NAc-Neuronen beschränkten G9a-Transkripts zu induzieren, verwendeten wir mutierte Mäuse, die homozygot für ein floxiertes G9a-Allel waren, die an anderer Stelle ausführlich beschrieben wurden (S2). Die Cre-induzierte Rekombination erzeugt Exon 22 bis 25 außerhalb des Rahmens, was zu Nonsense-vermittelten Zerfall des mutierten Transkripts führt. Wir verwendeten G9a-floxed-Mäuse, die vollständig zu C57BL / 6J-Mäusen rückgekreuzt wurden. Die Mäuse wurden mit Adeno-assoziierten Virus (AAV) -Vektoren (Serotyp 2), die zwischen dem Alter von 7- und 10-Wochen GFP oder Cre-GFP exprimieren, in den NAc sterotaxial injiziert. Immunhistochemische Analyse wurde verwendet, um die Effizienz der Cre-vermittelten Rekombination zu überprüfen (vgl Ergänzend Abb. S5). Wir verwendeten AAV-injizierte Tiere 21 Tage nach der Operation, da die Rekombination in G9a-gefloxten Mäusen zu diesem Zeitpunkt stabil und maximal war, im Einklang mit veröffentlichten Berichten (S3-S4). G9a- und ΔJunD-Überexpressionsexperimente wurden in ähnlicher Weise unter Verwendung von HSV-Virusvektoren durchgeführt, die entweder GFP, Wildtyp-G9a-GFP, katalytisch totes G9aH1093K-GFP oder ΔJunD-GFP exprimieren (vgl S2 für Einzelheiten zur Entwicklung von G9a-Konstrukten). HSV-überexprimierende Mäuse wurden 3 Tage nach der Operation verwendet, da die Überexpression zu diesem Zeitpunkt maximal war, wie durch Immunhistochemie beobachtet wurde. Aufgrund der transienten Natur der HSV-Expression und der beträchtlich stabileren Natur der AAV-Expression wurden HSV-Vektoren in Experimenten verwendet, die eine schnelle, kurzzeitige Transgenexpression erforderten, wohingegen AAV-Vektoren in Experimenten verwendet wurden, die längere Zeiträume der Transgenexpression erforderten. Bei beiden Vektoren wurde in umfangreichen früheren Studien gezeigt, dass nur neuronale Zellkörper innerhalb des injizierten Hirnareals ohne eine Infektion von afferenten oder efferenten Neuronen infiziert werden.
Für Verhaltensexperimente unter Verwendung des pharmakologischen G9a / GLP-Inhibitors, BIX01294 (25 ng / & mgr; l), wurden den Mäusen stereotaktisch zwei subkutane Minipumpen sowie bilaterale Führungskanülen in den NAc implantiert. Minipumpen wurden 12 Stunden vor der Implantation aktiviert, wobei die kontinuierliche Abgabe (0.25 & mgr; l / Stunde) von entweder Vehikel (5 Hydroxypropyl & bgr; -Cyclodextrin) oder Arzneimittel für 14 Tage initiiert wurde, während welcher Zeit Verhaltensbewertungen durchgeführt wurden.
Für ΔFosB-Überexpressionsexperimente [Western-Blotting, qPCR und ChIP], männliche bitransgene NSE-tTA X tetOP-ΔFosB Mäuse wurden verwendet (10 wochenalte), wobei in Abwesenheit des Tetracyclin-Derivats Doxycyclin (8-Wochen nach Doxycyclin) die Tiere eine striatal beschränkte konstitutive Expression von & Dgr; FosB (S5). Die ΔFosB-Überexpression in diesen Mäusen wurde über qPCR bestätigt. Zur Bestätigung der Ergebnisse mit NSE-tTA X tetOP-ΔFosB Mäusen, Wildtyp-8-Wochen alte männliche C57BL / 6J-Mäuse wurden intra-NAc mit AAV-Vektoren, die entweder GFP oder & Dgr; FosB-GFP exprimieren, sterotaxial injiziert. In diesem Fall wurden AAV-Vektoren verwendet, um eine maximale & Dgr; FosB-Expression zu 8 Wochen nach der Operation sicherzustellen, was einen direkten Vergleich zwischen viral infizierten und bittransgenen & Dgr; FosB-überexprimierenden Mäusen erlaubt. Die virale Überexpression wurde unter Verwendung von qPCR zu 8-Wochen nach der Operation bestätigt (15-gauge NAc-Stanzen wurden unter der Injektionsstelle präpariert). AAV-GFP- und AAV-ΔFosB-GFP-überexprimierende Mäuse, die nicht für qPCR verwendet wurden, wurden mit Kochsalzlösung (14-Behandlungen Kochsalzlösung, ip) oder wiederholtem Kokain (14-Behandlungen 30 mg / kg Kokain-HCl, ip) beginnend 6 Wochen nach Chirurgie. 4 Tage nach der letzten Behandlung wurden die Gehirne mit 4% Paraformaldehyd fixiert, auf einem Vibratom geschnitten und für die Analyse der dendritischen Wirbelsäule verwendet.
Western-Blot-Analyse
14-gauge NAc-Stanzen wurden aus koronalen 1 mm-Schnitten entnommen, die unter Verwendung einer Hirnmatrix aus rostfreiem Stahl erhalten wurden, und wurden in Protease- und Phosphatase-Inhibitoren enthaltendem 1 M HEPES-Lysepuffer (1% SDS) ultraschallbehandelt. 10-30 & mgr; g-Proben des Gesamtproteins wurden einer Elektrophorese auf 18% SDS-Gelen unterzogen. Die Proteine wurden auf PVDF-Membranen übertragen und entweder mit anti-H3K9me2 (monoklonaler Maus, 1: 500), anti-β-Tubulin (monoklonaler Maus, 1: 60,000), anti-Gesamt-Histon H3 (polyklonales Kaninchen, 1: 5,000) inkubiert. Anti-GFP (verwendet für die Verifizierung der gleichen viralen Expression in gestanztem Gewebe) (Kaninchen polyklonal, 1: 1000), anti-H3K27me3 (Kaninchen polyklonal, 1: 500) oder Anti-Aktin-Antikörper (Maus monoklonal, 1: 60,000) über Nacht bei 4 ° C (alle Membranen wurden in 5% Milch oder 5% Rinderserumalbumin blockiert). Die Membranen wurden dann mit Peroxidase-markierten sekundären Antikörpern inkubiert (1: 15,000-1: 60,000 in Abhängigkeit vom verwendeten primären Antikörper) und Banden wurden mit SuperSignal West Dura Substrat visualisiert. Die Banden wurden mit der NIH Image J Software quantifiziert, und die H3K9me2-Banden wurden auf Actin oder β-Tubulin und auf das gesamte Histon H3 normalisiert, um die gleiche Beladung zu kontrollieren. Wiederholtes Kokain hatte keinen Einfluss auf den Actinspiegel (Abb. S8) oder Gesamt-Histon 3 (Abb. S1) in der NAc. Darüber hinaus hatte die HSV-G9a-GFP- und HSV-G9aH1093K-GFP-Infektion keinen Einfluss auf die Gesamtmenge an & bgr; -Tubulin in der NAc (Abb. S8).
Immunhistochemie
Mäuse wurden mit einer tödlichen Dosis von Chloralhydrat sediert und mit 4% Paraformaldehyd perfundiert, bevor sie durch Einzel- oder Doppelimmunhistochemie, wie zuvor beschrieben, analysiert wurden (S6). Kurz gesagt wurden postfixierte Gehirne bei Raumtemperatur über Nacht in 30% Sucrose inkubiert, bevor sie bei 35 & mgr; m geschnitten wurden (Gehirne, die für die dendritische Wirbelsäulenanalyse verwendet wurden, wurden in Abwesenheit von 100% Sucrose auf einem Vibratom an 30 & mgr; m Sektionen geschnitten). Frei schwimmende NAc-Schnitte wurden mit 1X PBS gewaschen, blockiert (3% normales Eselsserum, 0.1% tritonX, 1X PBS) und später mit anti-GFP (polyclonales Huhn, 1: 8000) und / oder anti-G9a (polyklonales Kaninchen) inkubiert , 1: 500) Antikörper in Blockierungslösung. Abschnitte, die auf dendritische Stacheln analysiert wurden, wurden mit einem polyklonalen Kaninchen-Anti-GFP-Antikörper an 1: 200 inkubiert. Nach Inkubation über Nacht wurden NAc-Schnitte 3-mal für 10 Minuten mit 1X PBS gespült, gefolgt von einer Inkubation mit Cy2 und / oder Cy3 fluoreszenzgekoppelten sekundären Antikörpern in 1X PBS Blockierungslösung für 2-Stunden. Die für die Morphologieuntersuchungen verwendeten Abschnitte wurden über Nacht bei Raumtemperatur in einem sekundären Antikörper inkubiert. Die nukleare Co-Färbung wurde durch Inkubieren von Abschnitten in 1X PBS, die DAPI (1: 50,000) enthielten, für 10-Minuten erreicht. Die Schnitte wurden erneut gewaschen, gefolgt von Dehydratisierung mit Ethanol und Montieren mit DPX. Alle Schnitte wurden mittels konfokaler Mikroskopie abgebildet.
RNA-Isolierung und qPCR
Bilaterale 14-Gauge-NAc-Stempel wurden in Trizol homogenisiert und gemäß den Anweisungen des Herstellers verarbeitet. Die RNA wurde mit RNAesy Micro-Säulen gereinigt und die Spektroskopie bestätigte, dass die RNA-Verhältnisse 260/280 und 260/230> 1.8 waren. Die RNA wurde dann unter Verwendung eines Bio-Rad iScript Kits revers transkribiert. Die cDNA wurde durch qPCR unter Verwendung von SYBR Green quantifiziert. Jede Reaktion wurde doppelt oder dreifach durchgeführt und nach dem zuvor beschriebenen ΔΔCt-Verfahren unter Verwendung von Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) als Normalisierungskontrolle analysiert (S7). Sehen Zusatztabelle S5 für mRNA-Primersequenzen.
DNA-Microarray-Analyse
Vier Gruppen (3-unabhängige biologische Replikate pro Gruppe) wurden für die Microarray-Studie verwendet, insgesamt 12-Microarrays. Nach der 1-Stunde nach der letzten Kokaininjektion wurden die Tiere schnell enthauptet und die Gehirne entfernt und auf Eis gelegt. Dissektionen von NAc wurden unter Verwendung eines 15-Gauge-Nadelstempels genommen und schnell auf Trockeneis eingefroren, bis RNA extrahiert wurde. Bilaterale Stanzen wurden aus vier Tieren pro Replikat gepoolt, insgesamt 12-Mäuse pro Gruppe. RNA-Isolierung, Microarray-Verarbeitung und Datenanalyse wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt (S8). Kurz gesagt, RNA wurde wie oben beschrieben isoliert und gereinigt und unter Verwendung von Agilent's Bioanalyzer auf Qualität überprüft. Reverse Transkription, Amplifikation, Markierung und Hybridisierung mit Illumina MouseWG-6 v2.0-Arrays wurden unter Verwendung von Standardverfahren durch den Microarray-Kern von UT Southwestern durchgeführt. Die Rohdaten wurden im Hintergrund subtrahiert und mit der Beadstudio-Software quantilnormalisiert. Normalisierte Daten wurden unter Verwendung der GeneSpring-Software analysiert und Genelisten wurden unter Verwendung von Signifikanzkriterien eines 1.3-fachen Änderungsgrenzwerts in Verbindung mit einem nicht stringenten p-Wert-Grenzwert von p <0.05 erzeugt.
Wir haben aus verschiedenen Gründen ein hohes Maß an Vertrauen in diese Daten. Zunächst wurden alle Tiere unter den gleichen Bedingungen gleichzeitig behandelt, behandelt und getötet. Ebenso wurde die gesamte RNA- und Array-Verarbeitung zur gleichen Zeit durchgeführt. Zweitens führten wir Dreifach-Arrays und gepoolte multiple Tiere pro Array-Probe durch, wodurch Unterschiede aufgrund individueller Variabilität und zunehmender statistischer Stärke minimiert wurden (S9). Drittens werden die Datenanalysekriterien, die für unsere Studie verwendet werden, vom MicroArray-Projekt zur Qualitätskontrolle empfohlen, da diese Kriterien validiert wurden, um eine hohe Reproduzierbarkeit zwischen den Standorten und Reproduzierbarkeit der Inter- und Intraplattform zu gewährleisten (S10-S11).
Konstruktion von viralen Vektoren
Aufgrund der Einschränkungen der Virusvektorinsertionsgröße wurden codierende Sequenzen entweder für Wildtyp G9a (G9a) oder katalytisch totes G9a (G9aH1093K) in das bicistronische p1005 + HSV Plasmid, das GFP exprimiert, unter der Kontrolle des humanen Immediate Early Cytomegalovirus Promotors (CMV) (G9a) subkloniert die Insertionsgröße war ~ 3.96 kb, was die maximale Insertionsgröße für AAV-2-Vektoren übersteigt). Der IE4 / 5-Promoter steuert den G9a-Ausdruck. Fragmente wurden in das bicistronische p1005 + HSV-Plasmid über stumpfendige Ligationen mit Klenow-behandeltem PmeI und EcoRI-verdautem G9a (aus pcDNA3.1) und CIP-behandeltem p1005 + nach EcoRI-Verdau subkloniert. Zur Herstellung von HSV-ΔJunD-GFP wurde die kodierende Sequenz von ΔJunD, flankiert von EcoRI-Restriktionsstellen, durch PCR unter Verwendung von Primer-Oligonukleotiden, die die EcoRI-Stelle enthielten, erzeugt. Das PCR-Produkt wurde dann in die EcoRI-Stelle des p1005 + -Vektors ligiert. Die lokale Expression der Cre-Rekombinase in NAc-Neuronen wurde durch virale vermittelte Genabgabe unter Verwendung eines AAV-Vektors wie beschrieben erreicht (S12). GFP oder eine N-terminale Fusion von GFP an Cre wurde in einen rekombinanten AAV-2-Vektor subkloniert, der einen CMV-Promotor mit einer Spleißdonorakzeptorsequenz und einem Polyadenylierungssignal enthielt. Alle Vektorinsertionen wurden durch Dideoxy-Sequenzierung bestätigt. Virale Vektoren wurden unter Verwendung einer helferfreien Dreifachtransfektionsmethode wie zuvor beschrieben hergestellt (S13). Das gereinigte Virus wurde bei -80 ° C gelagert. Die virale Qualität wurde durch infektiösen Titer bewertet, der in HEK293-Zellen bewertet wurde. AAV-ΔFosB-GFP-Viren wurden in ähnlicher Weise hergestellt. Für HSV-Cre wurde die Cre-Expression durch einen IRES-Promotor im Gegensatz zu dem IE4 / 5-Promotor gesteuert, um die Cre-Expression zu minimieren und neuronale Toxizität zu verhindern (vgl S14 für virale Konstruktion). In allen Fällen wurde die virale Überexpression validiert in vitro mit einem in vivo, über qPCR, und Viren wurden immunhistochemisch bestätigt, um eine NAc-eingeschränkte Expression nach einer Operation anzuzeigen.
Stereotaxische Chirurgie
Unter Ketamin (100 mg / kg) / Xylazin (10 mg / kg) -Anästhesie wurden Mäuse in einem stereotaktischen Kleintier-Instrument positioniert und die kraniale Oberfläche wurde exponiert. Dreiunddreißig-Gauge-Spritzennadeln wurden verwendet, um 0.5 & mgr; l Virus in einem Winkel von 10 ° (AP + 1.6; ML + 1.5; DV - 4.4) mit einer Geschwindigkeit von 0.1 & mgr; l / min beidseitig in den NAc infundieren. Tieren, die HSV-Injektionen erhielten, wurde erlaubt, sich für 2 Tage nach der Operation zu erholen, während Mäusen, die für Verhaltenstests verwendet wurden, die AAV-Vektoren erhielten, sich für 20 Tage erholen konnten, bevor sie einer Platzkonditionierung unterzogen wurden. Diese Zeiten stimmen mit den Perioden maximaler viraler Transgenexpression für die beiden Vektoren überein. Für BIX01294-Infusionen wurden jeweils zwei Minipumpen subkutan auf dem Rücken der Maus positioniert. Kanülenplatzierungen wurden durch Bohren von zwei kleinen Schädellöchern oberhalb des NAc und durch die Abgabe der Kanüle aus Bregma (AP + 1.5; ML + 1.0; DV - 5.4) erreicht. Die Mäuse durften sich von der Operation für 4 bis 5 Tage erholen, bevor sie mit dem Platzkonditionierungsverfahren zu Kokain wie unten beschrieben beginnen.
Konditionierte Ortspräferenz
Der Platzkonditionierungsvorgang wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt, mit den folgenden Modifikationen (S7). Kurz gesagt, 3 Tage nach Intra-NAc-Infusionen von HSV-G9a-GFP, HSV-G9aH1093K-GFP oder HSV-GFP wurden Mäuse in die Konditionierungskammern gebracht, die aus drei verschiedenen Umgebungen bestehen. Mäuse, die eine signifikante Präferenz für eine der beiden Konditionierungskammern zeigten, wurden von der Studie ausgeschlossen (<10% aller Tiere). Die Konditionierungsgruppen wurden dann ausgeglichen, um etwaige noch vorhandene Kammervorspannungen auszugleichen. An den folgenden Tagen wurde den Tieren Kochsalzlösung injiziert und nachmittags 30 Minuten lang in eine Kammer und dann Kokain (10 mg / kg, ip) injiziert und abends 30 Tage lang 2 Minuten lang in die andere Kammer eingeschlossen (zwei) Kochsalzlösung und zwei Kokainpaarungen). Am Tag des Tests wurden die Mäuse 20 Minuten lang ohne Behandlung in die Apparatur zurückgebracht und getestet, um zu bewerten, welche Seite sie bevorzugten. Die Reaktionen des Bewegungsapparates auf Kokain wurden über Strahlbrüche in den mit Kokain gepaarten Kammern bewertet, um die Wirksamkeit der Arzneimittelbehandlung sicherzustellen. Für AAV- und BIX01294-CPP-Experimente wurde ein leicht modifiziertes Protokoll verwendet. Den Tieren wurde erneut entweder Kochsalzlösung oder Kokain (10 mg / kg, ip) injiziert und sie wurden 30 Minuten lang in bestimmten Kammern eingeschlossen, stattdessen jedoch nur einmal täglich 4 Tage lang konditioniert, gefolgt vom Test am Tag 5 (die Tiere wurden konditioniert abends und konditionierende Behandlungen wechselten sich ab). Für alle Gruppen wurde die Grundbewegung als Reaktion auf Kochsalzlösung bewertet, um sicherzustellen, dass die Fortbewegung nicht durch die Behandlung mit Viren oder Inhibitoren beeinflusst wurde.
Intravenöse Kokain-Selbstverwaltung
Männliche adulte Long-Evans-Ratten, die zu Beginn des Experiments 230-250 g wogen, wurden erhalten. Sie wurden in einer feuchtigkeits- und temperaturgesteuerten Umgebung in einem umgekehrten 12-Stunden-Hell / Dunkel-Zyklus (leuchtet bei 9: 00 am) mit ausgeschaltet ad libitum Zugang zu Nahrung und Wasser. Ratten durften sich in ihrer neuen Umgebung akklimatisieren und wurden vor Beginn des Experiments täglich für 1 behandelt. Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden des Nationalen Gesundheitsinstituts für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und wurden vom Tierpflege- und Verwendungsausschuss des Mount Sinai genehmigt. Die Selbstverwaltungsausrüstung wurde mit Infrarotstrahlen ausgestattet, um das Bewegungsverhalten zu messen. Die Selbst-Verabreichung wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (S15-S16) mit Kathetern, die unter Isofluran-Anästhesie (2.4–2.7%) in die rechte Halsvene implantiert wurden. Die Katheter wurden mit 0.1 ml einer Salzlösung gespült, die 10 U Heparin und Ampicillin (50 mg / kg) enthielt. Nach einer Woche Erholung von der Operation begann das Selbstverwaltungstraining während der Dunkelphase des Hell / Dunkel-Zyklus. Den Tieren wurde ein 3-stündiger täglicher Zugang zu Kokain (0.75 mg / kg / Infusion) unter einem Verstärkungsplan mit festem Verhältnis 1 (FR1) gewährt, wobei 1 aktiver Hebeldruck zu einer einzelnen Infusion des Arzneimittels führte. Ratten stabilisierten ihre Kokainaufnahme nach 6 Tagen (<15% Variation der Ansprechrate über 3 aufeinanderfolgende Tage, wobei mindestens 75% auf den verstärkten Hebel reagierten). 24 Stunden nach der letzten Selbstverabreichungssitzung wurden die Ratten schnell enthauptet, die Gehirne schnell entfernt und für die RNA-Isolierung und qPCR verarbeitet.
Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP)
Frische NAc-Stempel wurden mit Formaldehyd vernetzt und wie zuvor beschrieben für ChIP vorbereitet (S17-S18) mit geringfügigen Änderungen. Kurz gesagt, 4 14-Manometer-NAc-Schläge pro Tier (5-Tiere, die pro Probe gesammelt wurden) wurden gesammelt, mit 1% Formaldehyd vernetzt und mit 2 M Glycin vor dem Einfrieren bei -80 ° C gequencht. 1-Tag vor der Probenbeschallung, Schaf-Anti-Kaninchen / Maus (abhängig vom Präzipitationsantikörper) IgG-Magnetbeads wurden durch Inkubation geeigneter Magnetbeads entweder mit Anti-G9a (Kaninchen polyklonaler ChIP-Klasse) oder Anti-H3K9me2 (Maus monoklonaler ChIP-Klasse) hergestellt. Antikörper über Nacht bei 4 ° C unter konstanter Rotation in Blocklösung. Gewebe-Ultraschallbehandlung und Chromatin-Scherung wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt (S17). Nach der Beschallung wurden gleiche Chromatinkonzentrationen auf neue Röhrchen übertragen und ~ 5% der Endprodukte wurden als "Input" -Kontrollen gespeichert. Nach gründlichem Waschen und Resuspendieren der konjugierten Kügelchen / Antikörper-Mischungen wurden gleiche Volumina Antikörper / Kügelchen-Mischungen (~ 7.5 & mgr; g Antikörper / Probe) zu jeder Chromatinprobe zugegeben und für ~ 16 Stunden unter konstanter Rotation bei 4 ° C inkubiert. Die Proben wurden weiter gewaschen und bei 65 ° C über Nacht vor der DNA-Reinigung unter Verwendung eines PCR-Reinigungskits revers vernetzt. Nach der DNA-Reinigung wurden die Proben qPCR unterzogen und wurden wie zuvor beschrieben auf ihre entsprechenden "Input" -Kontrollen normalisiert (S17). Normale Maus-IgG-Immunopräzipitationen unter Verwendung eines polyklonalen Maus-Anti-IgG-Antikörpers wurden ebenfalls durchgeführt, um eine angemessene Anreicherung der Signalamplifikation zu kontrollieren. Adenin-Phosphoribosyltransferase (APRT) wurde als negative Kontrolle für Kokain- und ΔFosB-Überexpressionsexperimente verwendet. Sehen Zusatztabelle S5 für Promotor-Primersequenzen.
Dendritische Wirbelsäulenanalyse
Um die Rolle von G9a bei der Regulierung der neuronalen Morphologie in vivo zu untersuchen, verwendeten wir Methoden, die zuvor mit den folgenden Modifikationen beschrieben wurden (S1). Drei Tage nach der Injektion von HSV-GFP wurden HSV-G9a-GFP, HSV-ΔJunD-GFP (alle Viren wurden in Wildtyp-C57B1 / 6J-Mäusen verwendet) oder HSV-Cre-GFP (verwendet in G9afl / fl Mäuse), wenn die virale Expression maximal war, wurden die Mäuse perfundiert, die Gehirne wurden kryogeschützt und später bei 100 & mgr; m auf einem Vibratom geschnitten. Die Schnitte wurden dann unter Verwendung eines Antikörpers gegen GFP immunisiert, wie oben beschrieben (siehe Immunhistochemie). Um die Effekte von G9a-Überexpression und -Knockout auf die Wirbelsäulenzahlen sowie den Effekt der ΔJunD-Überexpression zu untersuchen, maßen wir die Anzahl von Stacheln an ungefähr 1-2-Neuriten pro Neuron, die mindestens 299 & mgr; m von sekundären Dendriten von GFP-exprimierendem NAc-Medium entsprechen stachelige Neuronen (MSNs). Angesichts der Tatsache, dass sich MSNs von anderen neuronalen Populationen im NAc morphologisch unterscheiden, sowie frühere Berichte, die darauf hinweisen, dass HSV hauptsächlich DARPP-32-exprimierende Neuronen in dieser Hirnregion infiziert (S19), sind wir zuversichtlich, dass MSNs ausschließlich in diesen Studien bewertet wurden. Für jedes Tier untersuchten wir ~ 6-8-Neuronen in 3-4-Tieren pro Gruppe (7-Gruppen), wonach ein Durchschnittswert für jedes Tier zur statistischen Analyse erhalten wurde. Experimente zur Untersuchung der Auswirkungen der ΔFosB-Überexpression auf die NAc-Dorndichte wurden ähnlich wie oben beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass AAV-Vektoren verwendet wurden, um GFP oder ΔFosB-GFP über längere Zeiträume (8-Wochen) zu exprimieren. Alle HSV-Bilder wurden mit einem konfokalen Mikroskop mit einem 100X-Ölimmersionsobjektiv aufgenommen (AAV-Bilder wurden mit einem 63X-Ölimmersionsobjektiv aufgenommen). Bilder wurden mit dem Pinhole-Satz bei 1 beliebiger Einheit und einer 1024 × 1024-Rahmengröße erhalten. Die dendritische Länge wurde unter Verwendung der NIH Image J-Software gemessen, und die Wirbelsäulenzahlen wurden durch den primären Experimentator blind gezählt, da die Objektträger vor dem experimentellen Scannen codiert wurden. Die durchschnittliche Anzahl von Stacheln pro 10 & mgr; m Dendrit wurde berechnet.
statistische Analyse
Ein-und Zwei-Wege-ANOVAs wurden durchgeführt, um Signifikanz für bedingte Platzpräferenz und dendritische Wirbelsäule Analyse mit mehr als zwei Gruppen zu bestimmen. Student-t-Tests wurden für andere Vergleiche verwendet, einschließlich qPCR, Western Blotting, dendritische Wirbelsäulenanalyse, die HSV-GFP mit HSV-Cre in G9a vergleichtfl / fl Mäuse, Microarray-Analysen (siehe oben) und Chromatin-Immunpräzipitationsexperimente. Geplante Student-T-Tests wurden nach einer Zwei-Wege-ANOVA-Analyse der dendritischen Wirbelsäulendichte nach ΔFosB-Überexpression mit Bestätigung der signifikanten Haupteffekte der medikamentösen Behandlung und des Virus verwendet. Alle in den Legenden der Abbildungen enthaltenen Werte stellen den Mittelwert ± SEM dar (* p ≤ 0.05; ** p <0.001). Detaillierte statistische Auswertungen für Feigen. 1-3 im Haupttext finden Sie in: Detaillierte Abbildung Legends einschließlich Statistik.
Fußnoten
Ich bestätige, dass keines der im Manuskript enthaltenen Materialien berechtigt ist Wesentliche Rolle der Histon-Methyltransferase G9a bei Kokain-induzierter Plastizität wurden bereits veröffentlicht oder werden an anderer Stelle geprüft, einschließlich im Internet.
Alle Arbeiten im Zusammenhang mit der Verwendung von Tieren wurden gemäß den institutionellen und IACUC-Richtlinien sowohl am Southwestern Medical Center der University of Texas als auch an der Mount Sinai School of Medicine durchgeführt.
Referenzen und Notizen