PMCID: PMC2820240
NIHMSID: NIHMS174679
Abstract
Kokaininduzierte Veränderungen der Genexpression führen zu Veränderungen der neuronalen Morphologie und des Verhaltens, die der Kokainabhängigkeit zugrunde liegen könnten. Wir identifizierten eine essenzielle Rolle der Histon-3-Lysin-9-Dimethylierung (H3K9) und der Lysin-Dimethyltransferase G9a für die kokaininduzierte strukturelle und Verhaltensplastizität. Wiederholte Kokainverabreichung reduzierte den globalen H3K9-Dimethylierungsgrad im Nucleus accumbens. Diese Reduktion der Histonmethylierung wurde durch die Repression von G9a in dieser Hirnregion vermittelt, welche durch den kokaininduzierten Transkriptionsfaktor ΔFosB reguliert wird. Mithilfe von konditionaler Mutagenese und viral vermitteltem Gentransfer fanden wir heraus, dass die Herunterregulierung von G9a die dendritische Dornenplastizität von Neuronen des Nucleus accumbens erhöhte und die Präferenz für Kokain verstärkte. Dies belegt die entscheidende Rolle der Histonmethylierung für die Langzeitwirkungen von Kokain.
Einführung
Wiederholter Kokainkonsum ist durch anhaltende Veränderungen der Genexpression und der neuronalen Morphologie im Nucleus accumbens (NAc), einer Schlüsselkomponente des Belohnungssystems im Gehirn, gekennzeichnet ( 1–2 ) . Chromatin -Remodellierung spielt eine wichtige Rolle bei den aberranten transkriptionellen Veränderungen in dieser Hirnregion, die Aspekten der Kokainabhängigkeit zugrunde liegen könnten ( 3–9 ). Die Kokainregulation der Chromatin-Struktur im NAc resultiert teilweise aus direkten, kokaininduzierten Modifikationen der Chromatin-Enzyme, die zu Veränderungen der Histonacetylierung und -phosphorylierung führen ( 4 , 7–9 ); die Rolle von Enzymen , die die Histonmethylierung steuern, wurde jedoch noch nicht untersucht.
Eine kürzlich durchgeführte genomweite Promotoranalyse mittels Chromatin-Immunpräzipitation gekoppelt mit Mikroarrays (ChIP-Chip) identifizierte veränderte Muster der repressiven Histon-H3-Lysin-9- (H3K9) und -27- (H3K27) Methylierung an spezifischen Genpromotoren im Nucleus accumbens (NAc) nach wiederholter Kokainbehandlung ( 6 ). Daher untersuchten wir zahlreiche Lysin-Methyltransferasen (KMTs) und -Demethylasen (KDMs), die bekanntermaßen die H3K9- oder H3K27-Methylierung regulieren ( Abb. 1A ). Nur zwei Enzyme, G9a und GLP, zeigten 24 Stunden nach wiederholter Kokainverabreichung eine anhaltende transkriptionelle Regulation, obwohl die Expression beider Gene zu diesem Zeitpunkt signifikant herunterreguliert war . Da G9a und GLP spezifisch die Dimethylierung von H3K9 (H3K9me2) katalysieren, korreliert ihre Herunterregulierung durch Kokain mit den zu diesem Zeitpunkt beobachteten verringerten globalen Spiegeln von euchromatischem H3K9me2 ( Abb. 1B ). Im Gegensatz dazu blieben die globalen Spiegel der heterochromatischen H3K27-Methylierung durch wiederholte Kokainexposition unverändert ( Abb. S1 im Online-Zusatzmaterial ). Aufgrund seiner hohen katalytischen Aktivität in vitro und in vivo ( 10 ) untersuchten wir die funktionelle Bedeutung der G9a-Repression nach wiederholter Kokainexposition im Nucleus accumbens (NAc) genauer. Die G9a-Proteinspiegel waren, ebenso wie die mRNA-Spiegel, 24 Stunden nach wiederholter Kokainverabreichung signifikant reduziert ( Abb. S2 ). Obwohl die G9a-mRNA-Expression im NAc um 35 % reduziert war, zeigte die immunhistochemische Analyse eine geringere Reduktion des G9a-Proteinspiegels um 15 %, was mit dem beobachteten Rückgang von H3K9me2 um 21 % nach wiederholter Kokainverabreichung übereinstimmt ( Abb. 1B ). Die G9a-mRNA-Expression war in dieser Hirnregion nach wiederholter Selbstverabreichung von Kokain ebenfalls um 20 % herabreguliert ( Abb. S3 ).
Um festzustellen, ob Veränderungen der euchromatischen H3K9me2-Methylierung mit genomweiten Veränderungen der Genexpression im Nucleus accumbens (NAc) korrelieren, untersuchten wir mittels Microarray-Analysen die durch eine Kokain-Provokationsdosis induzierten Genexpressionsprofile von Tieren mit und ohne vorherige Kokainexposition (siehe ergänzende Genlisten in den Tabellen S1–S3 ). Tiere, die wiederholt Kokain erhalten hatten, zeigten eine Stunde nach der Provokation eine deutlich erhöhte Genexpression im Vergleich zu akut behandelten Tieren ( Abb. 1C ). Diese erhöhte Genexpression trat auch nach einer einwöchigen Kokainabstinenzphase auf. Übereinstimmend mit früheren Berichten zeigte ein kleiner Prozentsatz der Gene (~10 %) nach wiederholter Kokainverabreichung desensibilisierte Transkriptionsreaktionen ( Abb. 1C ; siehe Tabelle S1 ) ( 5 ). Um die Rolle der G9a-Herunterregulierung bei der nach wiederholtem Kokainkonsum beobachteten erhöhten Genexpression direkt zu untersuchen, erhielten Mäuse intra-NAc-Injektionen von Herpes-simplex-Virus (HSV)-Vektoren, die entweder GFP oder G9a exprimierten. Anschließend wurden sie mit Kochsalzlösung oder wiederholtem Kokain behandelt, um festzustellen, ob eine G9a-Überexpression ausreicht, um die durch wiederholten Kokainkonsum induzierte Steigerung der Genexpression zu blockieren. Von 12 zufällig ausgewählten Genen, die nach wiederholtem Kokainkonsum erhöhte Expressionsniveaus aufwiesen, beobachteten wir, dass G9a die erhöhte Expression von 50 % dieser Gene signifikant reduzierte ( Tabelle S4 ).
Um die vorgelagerten Transkriptionsereignisse zu identifizieren, die die wiederholte, durch Kokain induzierte Repression der G9a-Expression vermitteln, untersuchten wir die mögliche Rolle von ΔFosB, einem hochstabilen Spleißprodukt des frühen Gens fosB . ΔFosB reichert sich nach wiederholter Kokainexposition im Nucleus accumbens (NAc) an, wo es mit einer verstärkten Kokainbelohnung in Verbindung gebracht wurde ( 11 ). ΔFosB kann je nach Zielgen entweder als Transkriptionsaktivator oder -repressor wirken ( 3 , 5 , 6 , 12 ). Mithilfe bitransgener NSE- tTA × tetOP-ΔFosB - Mäuse, bei denen die ΔFosB-Expression selektiv im NAc und im dorsalen Striatum adulter Tiere induziert werden kann ( 13 ), untersuchten wir den Einfluss der ΔFosB-Expression auf die Kokainregulation von H3K9me2 und KMTs im NAc. Die Überexpression von ΔFosB reichte aus, um sowohl die H3K9me2-Methylierung ( Abb. 1D ) als auch die G9a-Expression ( Abb. 1E ) zu reduzieren und somit die Wirkung wiederholten Kokainkonsums nachzuahmen. Im Gegensatz dazu reduzierte ΔFosB die GLP-Expression in dieser Hirnregion nicht und hatte keinen Einfluss auf SUV39H1 und EZH2, die wichtigsten Trimethylierungsenzyme für H3K9 bzw. H3K27 ( Abb. S4 ). Um diese Daten mithilfe eines unabhängigen ΔFosB-Überexpressionssystems zu bestätigen, erhielten adulte Wildtyp-Mäuse bilaterale intra-NAc-Injektionen von Adeno-assoziierten Virus(AAV)-Vektoren, die entweder GFP oder ΔFosB exprimierten. Die virusvermittelte Überexpression von ΔFosB verringerte die G9a-Expression in dieser Hirnregion ( Abb. 1E ).
Diese ausgeprägte und spezifische Regulation von G9a veranlasste uns zu untersuchen, ob eine Veränderung der G9a-Expression spezifisch in NAc-Neuronen die Verhaltensreaktionen auf Kokain reguliert. Wildtyp-Mäuse erhielten intra-NAc-Injektionen von HSV-Vektoren, die GFP oder G9a exprimierten, und wurden anschließend mithilfe eines unvoreingenommenen, auf Kokain basierenden Konditionierungsparadigmas zur Bestimmung der Ortspräferenz analysiert, welches ein indirektes Maß für die Drogenbelohnung darstellt. Die virale Überexpression von G9a in NAc-Neuronen wurde nach den Verhaltenstests bestätigt ( Abb. 2A ). Die G9a-Überexpression verringerte die Präferenz für Kokain im Vergleich zu Tieren mit GFP-Überexpression signifikant ( Abb. 2B ) und erhöhte die H3K9me2-Spiegel im NAc ( Abb. 2C ). Die Überexpression einer katalytisch inaktiven Mutante von G9a (G9aH1093K) ( 14 ) hatte keinen Einfluss auf die Kokainpräferenz ( Abb. 2B ) und hatte keinen Einfluss auf den H3K9me2-Spiegel in dieser Hirnregion ( Abb. 2C ).
Um die Rolle von G9a bei den Verhaltenswirkungen von Kokain weiter zu untersuchen und insbesondere die wiederholte, durch Kokain induzierte Repression der G9a-Expression im Nucleus accumbens (NAc) nachzuahmen, erhielten adulte G9a <sup>fl/fl </sup>-Mäuse ( 14 ) intra-NAc-Injektionen von AAV-Vektoren, die Cre-Rekombinase oder, als Kontrolle, GFP exprimierten. Die AAV-Cre-vermittelte Herunterregulierung von G9a im NAc, die immunhistochemisch bestätigt wurde ( Abb. S5 ), verstärkte die Kokainwirkung in Konditionierungsexperimenten signifikant und verringerte den H3K9me2-Spiegel im NAc ( Abb. 2D, E ). Der kommerziell erhältliche pharmakologische Inhibitor von G9a und GLP, BIX01294 ( 15–16 ), wurde eingesetzt, um zu überprüfen , ob eine Enzymhemmung ähnliche Auswirkungen auf die Verhaltensreaktionen auf Kokain hat . Tatsächlich führte die pharmakologische Hemmung von G9a und GLP zu einer signifikanten Steigerung der Präferenz für Kokain und einer Verringerung von H3K9me2 im NAc ( Abb. 2F, G ).
Die wiederholte Gabe von Kokain erhöht die Dichte dendritischer Dornen an mittelgroßen Stachelneuronen des Nucleus accumbens (NAc) ( 17 ) . Dieser Prozess ist mit funktionellen Veränderungen an exzitatorischen glutamatergen Synapsen dieser Neuronen ( 18–19 ) und einer verstärkten Verhaltensreaktion auf die Droge assoziiert ( 17 , 20 ). Wir vermuteten daher , dass die durch wiederholten Kokainkonsum bedingte Herabregulierung der G9a-Aktivität im NAc die Fähigkeit von Kokain vermitteln könnte, die Dichte dendritischer Dornen von NAc-Neuronen zu regulieren. Mithilfe der Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) mit einem Anti-G9a-Antikörper identifizierten wir mehrere potenzielle G9a-Zielgene im NAc, die jeweils bereits mit kokaininduzierter dendritischer Plastizität in Verbindung gebracht wurden ( Abb. 3A ) ( 20–26 ) . Wir stellten fest, dass wiederholte Kokainverabreichung die G9a-Bindung sowie den H3K9me2-Spiegel an diesen Genpromotoren signifikant verringerte ( Abb. 3B ). Im Gegensatz dazu führte die akute Kokainverabreichung zu einer raschen Rekrutierung von G9a an einige dieser Genpromotoren, was mit der erhöhten G9a-Expression im NAc eine Stunde nach einer akuten Kokaindosis übereinstimmt ( Abb. S6 ). Obwohl die G9a-Bindung an spezifischen Genpromotoren mit Veränderungen ihrer Expression korreliert, bleibt unklar, ob diese Ereignisse durch veränderte Gesamtkonzentrationen von G9a im NAc und/oder durch Unterschiede in der G9a-Rekrutierung nach akuter versus wiederholter Kokainverabreichung vermittelt werden.
Aufgrund der Regulation zahlreicher Plastizitäts-assoziierter Gene im Nucleus accumbens (NAc) durch G9a untersuchten wir direkt, ob die Aufrechterhaltung der G9a-Expression in dieser Hirnregion nach wiederholter Kokainbehandlung ausreicht, um die kokaininduzierte Bildung dendritischer Dornen zu blockieren. Mithilfe eines Kokainbehandlungsprotokolls, das zuvor die Induktion dendritischer Dornen im NAc förderte ( 20 ), untersuchten wir die Dornendichte in Tieren, denen entweder HSV-GFP oder HSV-G9a injiziert wurde. In Übereinstimmung mit früheren Befunden beobachteten wir einen signifikanten Anstieg der dendritischen Dornendichte im NAc nach Kokainbehandlung. Dieser Effekt wurde durch die Überexpression von G9a vollständig blockiert ( Abb. 3C ). Die alleinige Überexpression von G9a reichte nicht aus, um die dendritische Dornendichte im NAc in Abwesenheit von Kokain zu verringern. Ergänzend zu diesen Daten erhielten G9a <sup>fl/fl</sup> -Mäuse intra-NAc-Injektionen von HSV-Cre. Die Dornendichte wurde quantifiziert und mit der von Tieren verglichen, die HSV-GFP in Abwesenheit von Kokain erhielten. Die Reduktion der G9a-Expression führte zu einer signifikanten Erhöhung der Spinedichte an den mittelgroßen Stachelneuronen des NAc ( Abb. 3C ).
Angesichts der Hinweise, dass die Herunterregulierung von G9a im Nucleus accumbens (NAc) nach wiederholtem Kokainkonsum durch ΔFosB vermittelt wird, untersuchten wir anschließend, ob dieser Transkriptionsfaktor auch an der Regulation dendritischer Dornen im NAc beteiligt ist . Obwohl ΔFosB bisher nicht kausal mit dieser dendritischen Plastizität in Verbindung gebracht wurde, sind mehrere seiner Zielgene, darunter Cdk5 und NFκB-Untereinheiten, damit assoziiert (20–23 ) , und die persistierende Expression von ΔFosB in NAc-Neuronen korreliert mit einer erhöhten Dichte dendritischer Dornen nach wiederholter Kokainbehandlung ( 27 ). Zunächst stellten wir fest, dass die Induktion von ΔFosB in bitransgenen Mäusen in Abwesenheit von Kokain, welche die Expression von G9a und H3K9me2 herunterregulierte ( Abb. 1D, E ), die Bindung von G9a an zahlreiche Plastizitäts-assoziierte Gene verringerte. Viele dieser Gene sind auch als direkte Zielgene von ΔFosB selbst bekannt ( Abb. 3D ) ( 3 , 6 ). Anschließend zeigten wir, dass die virale Überexpression von ΔFosB im Nucleus accumbens (NAc) die Dichte dendritischer Dornen unter basalen Bedingungen signifikant erhöhte, ähnlich wie nach wiederholter Kokainverabreichung ( Abb. 3E ). Umgekehrt blockierte die Überexpression von ΔJunD, einem dominant-negativen Mutantenprotein, das die Transkriptionsaktivität von ΔFosB hemmt, im NAc die Fähigkeit von wiederholtem Kokain, die Bildung dendritischer Dornen im NAc zu erhöhen ( Abb. 3C ).
Unsere Beobachtung, dass ΔFosB die G9a-Expression im Nucleus accumbens (NAc) reguliert und dass ΔFosB und G9a teilweise dieselben Zielgene regulieren, veranlasste uns, weitere Interaktionen zwischen ΔFosB und G9a zu untersuchen. Nach akutem Kokainkonsum, bei dem die G9a-Konzentration erhöht war, war die Bindung von G9a an das fosB -Gen erhöht, während sie nach wiederholtem Kokainkonsum, bei dem die G9a-Expression unterdrückt war, abnahm ( Abb. 3A ). Eine solche Abnahme der G9a-Bindung nach wiederholtem Kokainkonsum wurde für c-fos nicht beobachtet ; hier wird die G9a-Bindung durch wiederholten Kokainkonsum erhöht ( Abb. S7 ). Dies steht im Einklang mit der Tatsache, dass c-fos im Gegensatz zu fosB durch chronische Psychostimulanzienexposition nicht induziert, sondern reprimiert wird ( 5 ). Die Überexpression von ΔFosB in bitransgenen Mäusen reichte aus, um die G9a-Bindung an das fosb -Gen signifikant zu verringern ( Abb. 3D ). Des Weiteren reichte die Überexpression von G9a aus, um die erhöhte ΔFosB-Expression nach wiederholter Kokainverabreichung zu reduzieren ( Tabelle S4 ). Diese Daten deuten auf einen autoregulatorischen Regelkreis hin, in dem G9a die Induktion von ΔFosB durch akute Kokainverabreichung zunächst begrenzt. Mit zunehmender Akkumulation von ΔFosB durch wiederholte Drogenexposition unterdrückt dieses jedoch G9a und verstärkt dadurch seine eigene weitere Induktion.
Zusammenfassend haben wir gezeigt, dass die Histon-Lysin-Methylierung im Nucleus accumbens (NAc) entscheidend an der Regulation der neuronalen Genexpression als Reaktion auf Kokain beteiligt ist. Die Repression von G9a und H3K9me2 nach wiederholter Kokainverabreichung fördert die Kokainpräferenz, unter anderem durch die transkriptionelle Aktivierung zahlreicher Gene, die bekanntermaßen aberrante Formen der dendritischen Plastizität regulieren. Ein besseres Verständnis der durch solche Mechanismen regulierten Gene wird unser Wissen über die komplexen biologischen Grundlagen der Drogenabhängigkeit erweitern und zur Entwicklung effektiverer Therapien für Suchterkrankungen beitragen.
Materialen und Methoden
Tiere und Behandlungen
Sofern nicht anders angegeben, wurden die Mäuse in Gruppen von vier bis fünf Tieren pro Käfig in einer Kolonie mit einem 12-Stunden-Hell-Dunkel-Zyklus (Licht an von 7:00 bis 7:00 Uhr) bei konstanter Temperatur (23 °C) gehalten und hatten freien Zugang zu Wasser und Futter. Alle Tierversuchsprotokolle wurden von der Ethikkommission für Tierversuche (IACUC) des UT Southwestern Medical Center und der Mount Sinai School of Medicine genehmigt.
Für die Kokain-Experimente [Immunhistochemie, Western Blot, quantitative PCR (qPCR), Microarray-Analyse und Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP)] wurden 8–10 Wochen alte männliche C57BL/6J-Mäuse verwendet. Die Tiere erhielten täglich Injektionen von entweder „Kochsalzlösung“ (7 Behandlungen, i.p.), „akutem“ Kokain (6 Behandlungen, Kochsalzlösung + eine Behandlung, 20 mg/kg Kokain-HCl, i.p.) oder „wiederholtem“ Kokain (7 Behandlungen, 20 mg/kg Kokain-HCl, i.p.). Die Mäuse wurden entweder 1 Stunde oder 24 Stunden nach der letzten Behandlung getötet. Für die Microarray-Studien wurden die Tiere täglich mit einer der folgenden Substanzen behandelt: Kochsalzlösung (15 Behandlungen, i.p.), akutes Kokain (14 Behandlungen, Kochsalzlösung + 1 Behandlung mit 20 mg/kg Kokain-HCl, i.p.), wiederholtes + akutes Kokain (7 Behandlungen, Kochsalzlösung + 8 Behandlungen mit 20 mg/kg Kokain-HCl, i.p.) oder wiederholter Entzug + akutes Kokain (7 Behandlungen mit 20 mg/kg Kokain-HCl + 7 Behandlungen, Kochsalzlösung + 1 Provokationsbehandlung mit 20 mg/kg Kokain-HCl, i.p.). Die Tiere wurden eine Stunde nach der letzten Behandlung getötet. In den Verhaltensstudien wurden die Mäuse nach der Operation einzeln gehalten und wie unten beschrieben mit 10 mg/kg Kokain-HCl, i.p., behandelt. Zur Analyse dendritischer Dornen und zur Validierung von Microarray-Daten nach Infektion mit HSV-GFP und HSV-G9a-GFP wurden Mäuse über drei Tage mit Kochsalzlösung (5 i.p.-Gaben) oder wiederholtem Kokain (5 i.p.-Gaben mit 20 mg/kg Kokain-HCl) behandelt. Dieses Injektionsprotokoll erhöht nachweislich die Dornendichte an Neuronen des Nucleus accumbens (NAc) innerhalb des Zeitraums der Herpes-simplex-Virus (HSV)-Transgenexpression (siehe ergänzende Referenz S1 ). Die für die Analyse dendritischer Dornen verwendeten Mäuse wurden vier Stunden nach der letzten Behandlung getötet.
Um eine lokale Deletion des G9a-Transkripts in NAc-Neuronen zu induzieren, verwendeten wir homozygote Mutantenmäuse mit einem floxierten G9a-Allel, die bereits ausführlich beschrieben wurden ( S2 ). Die Cre-induzierte Rekombination führt zu einem Leserahmen-freien Spleißen der Exons 22 bis 25 und damit zum Nonsense-vermittelten Abbau des mutierten Transkripts. Wir verwendeten G9a-floxierte Mäuse, die vollständig mit C57BL/6J-Mäusen rückgekreuzt wurden. Die Mäuse wurden im Alter von 7 bis 10 Wochen stereotaktisch in den NAc mit Adeno-assoziierten Virus(AAV)-Vektoren (Serotyp 2) injiziert, die GFP oder Cre-GFP exprimierten. Die Effizienz der Cre-vermittelten Rekombination wurde mittels immunhistochemischer Analyse verifiziert (siehe Abb. S5 im Anhang ). Wir verwendeten AAV-injizierte Tiere 21 Tage nach der Operation, da die Rekombination in G9a-floxed Mäusen zu diesem Zeitpunkt stabil und maximal war, was mit publizierten Berichten übereinstimmt ( S3 – S4 ). G9a- und ΔJunD-Überexpressionsexperimente wurden analog mit HSV-Virusvektoren durchgeführt, die entweder GFP, Wildtyp-G9a-GFP, katalytisch inaktives G9aH1093K-GFP oder ΔJunD-GFP exprimierten (Details zur Entwicklung der G9a-Konstrukte siehe S2 ). HSV-überexprimierende Mäuse wurden 3 Tage nach der Operation verwendet, da die Überexpression zu diesem Zeitpunkt, wie immunhistochemisch beobachtet, maximal war. Aufgrund der transienten Natur der HSV-Expression und der deutlich stabileren Natur der AAV-Expression wurden HSV-Vektoren in Experimenten verwendet, die eine schnelle, kurzfristige Transgenexpression erforderten, während AAV-Vektoren in Experimenten mit längeren Transgenexpressionszeiten zum Einsatz kamen. In umfangreichen Vorstudien wurde gezeigt, dass beide Vektoren ausschließlich neuronale Zellkörper innerhalb des injizierten Hirnareals infizieren, ohne dass afferente oder efferente Neuronen infiziert werden.
Für Verhaltensexperimente unter Verwendung des pharmakologischen G9a / GLP-Inhibitors, BIX01294 (25 ng / & mgr; l), wurden den Mäusen stereotaktisch zwei subkutane Minipumpen sowie bilaterale Führungskanülen in den NAc implantiert. Minipumpen wurden 12 Stunden vor der Implantation aktiviert, wobei die kontinuierliche Abgabe (0.25 & mgr; l / Stunde) von entweder Vehikel (5 Hydroxypropyl & bgr; -Cyclodextrin) oder Arzneimittel für 14 Tage initiiert wurde, während welcher Zeit Verhaltensbewertungen durchgeführt wurden.
Für die ΔFosB-Überexpressionsexperimente (Western Blot, qPCR und ChIP) wurden männliche bitransgene NSE- tTA × tetOP – ΔFosB - Mäuse (10 Wochen alt) verwendet. In Abwesenheit des Tetracyclinderivats Doxycyclin (8 Wochen ohne Doxycyclin) zeigten die Tiere eine starke, auf das Striatum beschränkte, konstitutive Expression von ΔFosB ( S5 ). Die ΔFosB-Überexpression in diesen Mäusen wurde mittels qPCR bestätigt. Um die Ergebnisse mit NSE- tTA × tetOP – ΔFosB - Mäusen zu bestätigen , wurden 8 Wochen alte männliche Wildtyp-Mäuse des Stammes C57BL/6J stereotaktisch intra-NAc mit AAV-Vektoren injiziert, die entweder GFP oder ΔFosB-GFP exprimierten. In diesem Fall wurden AAV-Vektoren verwendet, um eine maximale ΔFosB-Expression 8 Wochen nach der Operation zu gewährleisten und so einen direkten Vergleich zwischen virusinfizierten und bitransgenen ΔFosB-überexprimierenden Mäusen zu ermöglichen. Die virale Überexpression wurde 8 Wochen nach der Operation mittels qPCR bestätigt (15-Gauge-NAc-Stanzen wurden unterhalb der Injektionsstelle präpariert). AAV-GFP- und AAV-ΔFosB-GFP-überexprimierende Mäuse, die nicht für die qPCR verwendet wurden, wurden ab 6 Wochen nach der Operation mit Kochsalzlösung (14 Behandlungen, i.p.) oder wiederholtem Kokain (14 Behandlungen, 30 mg/kg Kokain-HCl, i.p.) behandelt. 4 Tage nach der letzten Behandlung wurden die Gehirne mit 4%igem Paraformaldehyd fixiert, mit einem Vibratom geschnitten und für die Analyse der dendritischen Dornen verwendet.
Western-Blot-Analyse
Mithilfe einer Edelstahlmatrix wurden NAc-Stanzen (14 Gauge) aus 1 mm dicken koronalen Schnitten von Mäusehirnen entnommen und in 1 M HEPES-Lysepuffer (1 % SDS) mit Protease- und Phosphataseinhibitoren sonifiziert. 10–30 μg Gesamtprotein wurden auf 18%igen SDS-Gelen elektrophoretisch aufgetrennt. Die Proteine wurden auf PVDF-Membranen übertragen und über Nacht bei 4 °C mit einem der folgenden Antikörper inkubiert: anti-H3K9me2 (monoklonaler Maus-Antikörper, 1:500), anti-β-Tubulin (monoklonaler Maus-Antikörper, 1:60,000), anti-Gesamt-Histon H3 (polyklonaler Kaninchen-Antikörper, 1:5,000), anti-GFP (zur Überprüfung der gleichmäßigen viralen Expression im ausgestanzten Gewebe) (polyklonaler Kaninchen-Antikörper, 1:1000), anti-H3K27me3 (polyklonaler Kaninchen-Antikörper, 1:500) oder anti-Aktin-Antikörper (monoklonaler Maus-Antikörper, 1:60,000) (alle Membranen wurden mit 5 % Milch oder 5 % Rinderserumalbumin blockiert). Die Membranen wurden anschließend mit Peroxidase-markierten Sekundärantikörpern (1:15,000 – 1:60,000, abhängig vom verwendeten Primärantikörper) inkubiert und die Banden mit SuperSignal West Dura Substrat sichtbar gemacht. Die Quantifizierung der Banden erfolgte mit der NIH ImageJ Software. Die H3K9me2-Banden wurden entweder auf Aktin oder β-Tubulin sowie auf Gesamthiston H3 normiert, um eine gleiche Beladung zu gewährleisten. Wiederholter Kokainkonsum hatte keinen Einfluss auf die Aktin- ( Abb. S8 ) oder Gesamthiston-3-Konzentration ( Abb. S1 ) im NAc. Des Weiteren hatte die Infektion mit HSV-G9a-GFP und HSV-G9aH1093K-GFP keinen Einfluss auf die Gesamtmenge an β-Tubulin im NAc ( Abb. S8 ).
Immunhistochemie
Mäuse wurden mit einer letalen Dosis Chloralhydrat sediert und mit 4%igem Paraformaldehyd perfundiert, bevor sie wie zuvor beschrieben ( S6 ) mittels einfacher oder doppelter Immunhistochemie analysiert wurden. Kurz gesagt, wurden die fixierten Gehirne über Nacht bei Raumtemperatur in 30%iger Saccharoselösung inkubiert und anschließend in 35 µm dicke Schnitte zerlegt (Gehirne für die Analyse der dendritischen Dornen wurden ohne 30%ige Saccharoselösung mit einem Vibratom in 100 µm dicke Schnitte zerlegt). Freischwimmende NAc-Schnitte wurden mit 1x PBS gewaschen, blockiert (3% normales Eselserum, 0.1% Triton X-3, 1x PBS) und anschließend mit Anti-GFP- (polyklonal vom Huhn, 1:8000) und/oder Anti-G9a-Antikörpern (polyklonal vom Kaninchen, 1:500) in Blockierungslösung inkubiert. Für die Analyse dendritischer Dornen wurden Schnitte mit einem polyklonalen Kaninchen-Anti-GFP-Antikörper (1:200) inkubiert. Nach Inkubation über Nacht wurden die NAc-Schnitte dreimal für je 10 Minuten mit 1x PBS gespült und anschließend für 2 Stunden mit Cy2- und/oder Cy3-fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörpern in 1x PBS-Blockierungslösung inkubiert. Schnitte für morphologische Untersuchungen wurden über Nacht bei Raumtemperatur mit Sekundärantikörpern inkubiert. Die Kernfärbung erfolgte durch Inkubation der Schnitte in 1x PBS mit DAPI (1:50,000) für 10 Minuten. Die Schnitte wurden erneut gewaschen, anschließend mit Ethanol entwässert und mit DPX eingedeckt. Alle Schnitte wurden konfokalmikroskopisch untersucht.
RNA-Isolierung und qPCR
Bilaterale NAc-Stanzen (14 Gauge) wurden in Trizol homogenisiert und gemäß den Herstellerangaben weiterverarbeitet. Die RNA-Reinigung erfolgte mit RNesy Micro-Säulen. Spektroskopisch wurde bestätigt, dass die RNA-Verhältnisse 260/280 und 260/230 >1.8 waren. Anschließend wurde die RNA mit einem Bio-Rad iScript Kit revers transkribiert. Die cDNA-Konzentration wurde mittels qPCR mit SYBR Green bestimmt. Jede Reaktion wurde in Duplikaten oder Triplikaten durchgeführt und nach der ΔΔCt-Methode analysiert, wie zuvor beschrieben. Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) diente als Normalisierungskontrolle ( S7 ). Die mRNA-Primersequenzen sind in der ergänzenden Tabelle S5 aufgeführt.
DNA-Microarray-Analyse
Für die Microarray-Studie wurden vier Gruppen (jeweils drei unabhängige biologische Replikate) verwendet, insgesamt also zwölf Microarrays. Eine Stunde nach der letzten Kokaininjektion wurden die Tiere schnell dekapitiert, die Gehirne entnommen und auf Eis gelegt. NAc-Präparate wurden mit einer 15-Gauge-Nadelstanze entnommen und bis zur RNA-Extraktion auf Trockeneis schockgefroren. Bilaterale Präparate von jeweils vier Tieren pro Replikation wurden gepoolt, sodass insgesamt zwölf Mäuse pro Gruppe vorlagen. RNA-Isolierung, Microarray-Prozessierung und Datenanalyse erfolgten wie zuvor beschrieben ( S8 ). Kurz gesagt, die RNA wurde wie oben beschrieben isoliert und gereinigt und ihre Qualität mit dem Agilent Bioanalyzer überprüft. Reverse Transkription, Amplifikation, Markierung und Hybridisierung auf Illumina MouseWG-6 v2.0-Arrays wurden nach Standardverfahren vom Microarray Core des UT Southwestern durchgeführt. Die Rohdaten wurden hintergrundkorrigiert und mit der Beadstudio-Software quantilnormalisiert. Die normalisierten Daten wurden mit Hilfe der GeneSpring-Software analysiert und Genlisten wurden unter Verwendung von Signifikanzkriterien mit einem Cutoff von 1.3-facher Änderung in Verbindung mit einem nicht strengen p-Wert-Cutoff von p < 0.05 erstellt.
Wir haben aus mehreren Gründen großes Vertrauen in diese Daten. Erstens wurden alle Tiere gleichzeitig und unter denselben Bedingungen behandelt und getötet. Auch die gesamte RNA- und Array-Verarbeitung erfolgte zeitgleich. Zweitens führten wir dreifache Array-Analysen durch und fassten die Proben mehrerer Tiere pro Array-Probe zusammen. Dadurch minimierten wir Unterschiede aufgrund individueller Variabilität und erhöhten die statistische Aussagekraft ( S9 ). Drittens entsprechen die für unsere Studie verwendeten Datenanalysekriterien den Empfehlungen des MicroArray Quality Control Project, da diese Kriterien validiert wurden und eine hohe Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen Standorten sowie zwischen und innerhalb von Plattformen gewährleisten ( S10 – S11 ).
Konstruktion von viralen Vektoren
Aufgrund von Einschränkungen hinsichtlich der Insertionsgröße viraler Vektoren wurden die kodierenden Sequenzen für entweder Wildtyp-G9a (G9a) oder katalytisch inaktives G9a (G9aH1093K) in das bikistronische p1005+ HSV-Plasmid subkloniert, das GFP unter der Kontrolle des humanen frühen Zytomegalievirus-Promotors (CMV) exprimiert (die Insertionsgröße von G9a betrug ca. 3.96 kb und überstieg damit die maximale Insertionsgröße für AAV-2-Vektoren). Der IE4/5-Promotor steuert die G9a-Expression. Fragmente wurden mittels Blunt-End-Ligation mit Klenow-behandeltem, mit PmeI und EcoRI verdautem G9a (aus pcDNA3.1) und CIP-behandeltem p1005+ nach EcoRI-Verdau subkloniert. Für die Herstellung von HSV-ΔJunD-GFP wurde die kodierende Sequenz von ΔJunD, flankiert von EcoRI-Restriktionsstellen, mittels PCR unter Verwendung von Primer-Oligonukleotiden mit der EcoRI-Schnittstelle generiert. Das PCR-Produkt wurde anschließend in die EcoRI-Schnittstelle des p1005+-Vektors ligiert. Die lokale Expression der Cre-Rekombinase in NAc-Neuronen wurde durch viral vermittelte Genübertragung mittels eines AAV-Vektors wie beschrieben erreicht ( S12 ). GFP oder eine N-terminale Fusion von GFP mit Cre wurde in einen rekombinanten AAV-2-Vektor subkloniert, der einen CMV-Promotor mit einer Spleißdonor-Akzeptor-Sequenz und einem Polyadenylierungssignal enthielt. Alle Vektorinsertionen wurden durch Didesoxy-Sequenzierung bestätigt. Die viralen Vektoren wurden mittels einer dreifachen Transfektion ohne Helferviren hergestellt, wie zuvor beschrieben ( S13 ). Gereinigte Viren wurden bei −80 °C gelagert. Die Virusqualität wurde anhand des infektiösen Titers in HEK293-Zellen bestimmt. AAV-ΔFosB-GFP-Viren wurden analog hergestellt. Bei HSV-Cre wurde die Cre-Expression durch einen IRES-Promotor anstelle des IE4/5-Promotors gesteuert, um die Cre-Expression zu minimieren und neuronale Toxizität zu verhindern (siehe S14 zur Viruskonstruktion). In allen Fällen wurde die virale Überexpression sowohl in vitro als auch in vivo mittels qPCR validiert, und die Viren zeigten nach der Operation eine auf den Nucleus accumbens (NAc) beschränkte Expression.
Stereotaxische Chirurgie
Unter Ketamin (100 mg / kg) / Xylazin (10 mg / kg) -Anästhesie wurden Mäuse in einem stereotaktischen Kleintier-Instrument positioniert und die kraniale Oberfläche wurde exponiert. Dreiunddreißig-Gauge-Spritzennadeln wurden verwendet, um 0.5 & mgr; l Virus in einem Winkel von 10 ° (AP + 1.6; ML + 1.5; DV - 4.4) mit einer Geschwindigkeit von 0.1 & mgr; l / min beidseitig in den NAc infundieren. Tieren, die HSV-Injektionen erhielten, wurde erlaubt, sich für 2 Tage nach der Operation zu erholen, während Mäusen, die für Verhaltenstests verwendet wurden, die AAV-Vektoren erhielten, sich für 20 Tage erholen konnten, bevor sie einer Platzkonditionierung unterzogen wurden. Diese Zeiten stimmen mit den Perioden maximaler viraler Transgenexpression für die beiden Vektoren überein. Für BIX01294-Infusionen wurden jeweils zwei Minipumpen subkutan auf dem Rücken der Maus positioniert. Kanülenplatzierungen wurden durch Bohren von zwei kleinen Schädellöchern oberhalb des NAc und durch die Abgabe der Kanüle aus Bregma (AP + 1.5; ML + 1.0; DV - 5.4) erreicht. Die Mäuse durften sich von der Operation für 4 bis 5 Tage erholen, bevor sie mit dem Platzkonditionierungsverfahren zu Kokain wie unten beschrieben beginnen.
Konditionierte Ortspräferenz
Das Konditionierungsverfahren wurde wie zuvor beschrieben mit folgenden Modifikationen durchgeführt ( S7 ). Kurz gesagt: Drei Tage nach intra-NAc-Infusionen von HSV-G9a-GFP, HSV-G9aH1093K-GFP oder HSV-GFP wurden die Mäuse in die Konditionierungskammern gesetzt, die aus drei unterschiedlichen Umgebungen bestehen. Mäuse, die eine deutliche Präferenz für eine der beiden Konditionierungskammern zeigten, wurden von der Studie ausgeschlossen (<10 % aller Tiere). Die Konditionierungsgruppen wurden anschließend ausgeglichen, um eine möglicherweise noch vorhandene Kammerpräferenz zu korrigieren. An den folgenden Tagen erhielten die Tiere nachmittags eine Kochsalzlösungsinjektion und wurden 30 Minuten lang in einer Kammer gehalten. Anschließend erhielten sie abends eine Kokaininjektion (10 mg/kg, i.p.) und wurden 30 Minuten lang in der anderen Kammer gehalten. Dieser Vorgang wurde an zwei aufeinanderfolgenden Tagen wiederholt (zwei Kochsalzlösungs- und zwei Kokain-Paarungen). Am Testtag wurden die Mäuse ohne Behandlung für 20 Minuten in den Versuchsaufbau zurückgesetzt und getestet, um ihre bevorzugte Seite zu ermitteln. Die lokomotorischen Reaktionen auf Kokain wurden mittels Lichtschrankenunterbrechungen in den mit Kokain assoziierten Kammern überprüft, um die Wirksamkeit der medikamentösen Behandlung sicherzustellen. Für die CPP-Experimente mit AAV und BIX01294 wurde ein leicht modifiziertes Protokoll verwendet. Die Tiere erhielten erneut entweder Kochsalzlösung oder Kokain (10 mg/kg, i.p.) und wurden für 30 Minuten in spezifischen Kammern gehalten. Die Konditionierung erfolgte jedoch nur einmal täglich über vier Tage, gefolgt vom Test am fünften Tag (die Konditionierung fand abends statt, und die Konditionierungsbehandlungen wurden abgewechselt). Bei allen Gruppen wurde die basale Lokomotion als Reaktion auf Kochsalzlösung gemessen, um sicherzustellen, dass die Lokomotion nicht durch die virale oder Inhibitorbehandlung beeinflusst wurde.
Intravenöse Kokain-Selbstverwaltung
Männliche, jugendliche Long-Evans-Ratten mit einem Gewicht von 230–250 g zu Beginn des Experiments wurden verwendet. Sie wurden in einer klimatisierten und feuchtigkeitskontrollierten Umgebung mit einem umgekehrten 12-Stunden-Hell-Dunkel-Zyklus (Licht aus um 9:00 Uhr) und freiem Zugang zu Futter und Wasser gehalten. Die Ratten konnten sich eine Woche vor Versuchsbeginn an ihre neue Umgebung gewöhnen und wurden täglich gehandhabt. Alle Verfahren wurden gemäß den Richtlinien des National Institute of Health für die Haltung und Verwendung von Labortieren durchgeführt und von der Ethikkommission für Tierversuche des Mount Sinai Hospital genehmigt. Die Selbstverabreichungsapparatur war mit Infrarotstrahlen zur Messung des Bewegungsverhaltens ausgestattet. Die Selbstverabreichung erfolgte wie zuvor beschrieben ( S15–S16 ) mit in die rechte Vena jugularis implantierten Kathetern unter Isofluran-Narkose (2.4–2.7 %). Die Katheter wurden mit 0.1 ml einer Kochsalzlösung gespült, die 10 IE Heparin und Ampicillin (50 mg/kg) enthielt. Nach einer Woche Erholung von der Operation begann das Selbstverabreichungstraining während der Dunkelphase des Hell-Dunkel-Zyklus. Die Tiere hatten täglich drei Stunden lang Zugang zu Kokain (0.75 mg/kg/Infusion) gemäß einem festen Verstärkungsplan (FR1), bei dem ein Hebeldruck eine einmalige Infusion des Medikaments auslöste. Die Ratten stabilisierten ihre Kokainaufnahme nach sechs Tagen (<15 % Schwankung der Reaktionsrate über drei aufeinanderfolgende Tage, wobei mindestens 75 % der Tiere den verstärkten Hebel betätigten). 24 Stunden nach der letzten Selbstverabreichungssitzung wurden die Ratten schnell dekapitiert, die Gehirne umgehend entnommen und für die RNA-Isolierung und qPCR aufbereitet.
Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP)
Frische NAc-Stanzen wurden mit Formaldehyd vernetzt und wie zuvor beschrieben ( S17–S18 ) mit geringfügigen Modifikationen für ChIP vorbereitet. Kurz gesagt, wurden pro Tier vier 14-Gauge-NAc-Stanzen (5 Tiere pro Probe) entnommen, mit 1 % Formaldehyd vernetzt und vor dem Einfrieren bei −80 °C mit 2 M Glycin abgestoppt. Einen Tag vor der Probensonikation wurden Schaf-Anti-Kaninchen/Maus-IgG-Magnetbeads (abhängig vom verwendeten Präzipitationsantikörper) hergestellt, indem die entsprechenden Magnetbeads über Nacht bei 4 °C unter ständiger Rotation in Blockierungslösung mit entweder Anti-G9a- (Kaninchen-polyklonaler ChIP-Antikörper) oder Anti-H3K9me2-Antikörpern (Maus-monoklonaler ChIP-Antikörper) inkubiert wurden. Die Gewebesonikation und das Chromatin-Shearing wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt ( S17 ). Nach der Sonifizierung wurden gleiche Chromatinkonzentrationen in neue Reaktionsgefäße überführt und ca. 5 % des Endprodukts als „Input“-Kontrollen zurückbehalten. Nach gründlichem Waschen und Resuspendieren der konjugierten Bead/Antikörper-Mischungen wurden gleiche Volumina der Antikörper/Bead-Mischungen (ca. 7.5 μg Antikörper/Probe) zu jeder Chromatinprobe gegeben und ca. 16 Stunden unter ständiger Rotation bei 4 °C inkubiert. Die Proben wurden erneut gewaschen und über Nacht bei 65 °C revers vernetzt, bevor die DNA-Reinigung mittels eines PCR-Reinigungskits erfolgte. Nach der DNA-Reinigung wurden die Proben einer qPCR unterzogen und wie zuvor beschrieben ( S17 ) auf ihre entsprechenden „Input“-Kontrollen normalisiert. Zur Kontrolle der Signalverstärkung wurden außerdem Immunpräzipitationen mit normalem Maus-IgG unter Verwendung eines polyklonalen Maus-Anti-IgG-Antikörpers durchgeführt. Adenin-Phosphoribosyltransferase (APRT) diente als Negativkontrolle für Kokain- und ΔFosB-Überexpressionsexperimente. Die Promotor-Primersequenzen sind in der ergänzenden Tabelle S5 aufgeführt .
Dendritische Wirbelsäulenanalyse
Um die Rolle von G9a bei der Regulation der neuronalen Morphologie in vivo zu untersuchen, verwendeten wir zuvor beschriebene Methoden mit folgenden Modifikationen ( S1 ). Drei Tage nach der Injektion von HSV-GFP, HSV-G9a-GFP, HSV-ΔJunD-GFP (alle Viren wurden in Wildtyp-C57Bl/6J-Mäusen verwendet) oder HSV-Cre-GFP (verwendet in G9a<sup> fl/fl</sup> -Mäusen), als die Virusexpression maximal war, wurden die Mäuse perfundiert, die Gehirne kryoprotektiert und anschließend mit einem Vibratom in 100 µm dicke Schnitte zerlegt. Die Schnitte wurden dann wie oben beschrieben mit einem Antikörper gegen GFP immungefärbt (siehe Immunhistochemie). Um die Auswirkungen der G9a-Überexpression und des G9a-Knockouts auf die Anzahl der Dendritenstacheln sowie die Wirkung der ΔJunD-Überexpression zu untersuchen, zählten wir die Stacheln an etwa 1–2 Neuriten pro Neuron, die mindestens 299 μm sekundärer Dendriten von GFP-exprimierenden mittelgroßen Stachelneuronen (MSNs) des Nucleus accumbens (NAc) entsprachen. Da sich MSNs morphologisch von anderen neuronalen Populationen im NAc unterscheiden und frühere Studien gezeigt haben, dass HSV in dieser Hirnregion primär DARPP-32-exprimierende Neuronen infiziert ( S19 ), sind wir zuversichtlich, dass in diesen Untersuchungen ausschließlich MSNs untersucht wurden. Pro Tier untersuchten wir etwa 6–8 Neuronen in 3–4 Tieren pro Gruppe (insgesamt 7 Gruppen). Anschließend wurde für jedes Tier ein Mittelwert für die statistische Analyse ermittelt. Experimente zur Untersuchung der Auswirkungen der ΔFosB-Überexpression auf die Spinedichte im Nucleus accumbens (NAc) wurden analog zu den oben beschriebenen Experimenten durchgeführt, mit der Ausnahme, dass AAV-Vektoren zur Expression von GFP oder ΔFosB-GFP über einen längeren Zeitraum (8 Wochen) verwendet wurden. Alle HSV-Bilder wurden mit einem Konfokalmikroskop und einem 100-fachen Ölimmersionsobjektiv aufgenommen (AAV-Bilder mit einem 63-fachen Ölimmersionsobjektiv). Die Bilder wurden mit einer Pinhole-Blende von 1 (willkürliche Einheit) und einer Bildgröße von 1024 × 1024 Pixeln aufgenommen. Die Dendritenlänge wurde mit der Software NIH ImageJ gemessen, und die Spineanzahl wurde vom Hauptexperimentator verblindet gezählt, da die Präparate vor dem Scannen codiert waren. Die durchschnittliche Anzahl der Spines pro 10 μm Dendritenlänge wurde berechnet.
statistische Analyse
Zur Bestimmung der Signifikanz der konditionierten Ortspräferenz und der dendritischen Dornenanalyse bei mehr als zwei Gruppen wurden ein- und zweifaktorielle Varianzanalysen (ANOVA) durchgeführt. Für weitere Vergleiche, darunter qPCR, Western Blotting, die Analyse dendritischer Dornen im Vergleich von HSV-GFP und HSV-Cre in G9a <sup>fl/fl </sup>-Mäusen, Microarray-Analysen (siehe oben) und Chromatin-Immunpräzipitations-Experimente, wurden t-Tests nach Student verwendet. Im Anschluss an die zweifaktorielle ANOVA-Analyse der dendritischen Dornendichte nach ΔFosB-Überexpression und Bestätigung signifikanter Haupteffekte der Medikamentenbehandlung und des Virus wurden geplante t-Tests nach Student durchgeführt. Alle in den Abbildungslegenden angegebenen Werte stellen den Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dar (*p ≤ 0.05; **p < 0.001). Detaillierte statistische Analysen zu den Abbildungen 1–3 im Haupttext finden sich in: Detaillierte Abbildungslegenden inklusive Statistik.
Fußnoten
Ich bestätige, dass keines der im Manuskript mit dem Titel „ Essentielle Rolle der Histonmethyltransferase G9a bei der Kokain-induzierten Plastizität“ enthaltenen Materialien zuvor veröffentlicht wurde oder anderweitig, einschließlich im Internet, zur Veröffentlichung eingereicht ist.
Alle Arbeiten im Zusammenhang mit der Verwendung von Tieren wurden gemäß den institutionellen und IACUC-Richtlinien sowohl am Southwestern Medical Center der University of Texas als auch an der Mount Sinai School of Medicine durchgeführt.
Referenzen und Notizen