(MENSCHLICHE) Verhaltens- und Strukturreaktionen auf chronisches Kokain erfordern eine Feedforward-Schleife, die ΔFosB und Calcium / Calmodulin-abhängige Proteinkinase II in der Nucleus-Accumbens-Schale enthält (2013)

Der Transkriptionsfaktor ΔFosB und die im Gehirn angereicherte Kalzium / Calmodulin-abhängige Proteinkinase II (CaMKIIα) werden im Nucleus Accumbens (NAc) durch chronische Exposition gegenüber Kokain oder anderen missbräuchlichen Psychostimulanzien induziert, in denen die beiden Proteine ​​sensibilisierte Arzneimittelreaktionen vermitteln . Obwohl ΔFosB und CaMKIIα beide die Expression und Funktion des AMPA-Glutamatrezeptors in NAc, die Bildung dendritischer Wirbelsäulen bei NAc-Medium-Spiny-Neuronen (MSNs) und die Sensibilisierung des Bewegungsapparats gegen Kokain regulieren, wurde bisher keine direkte Verbindung zwischen diesen Molekülen untersucht. Hier zeigen wir, dass ΔFosB durch CaMKIIα am Protein-stabilisierenden Ser27 phosphoryliert wird und CaMKII ist erforderlich für die Kokain-vermittelte Akkumulation von ΔFosB in Ratten-NAc.

Umgekehrt zeigen wir, dass ΔFosB für die Kokain-Induktion der CaMKIIα-Genexpression in vivo sowohl notwendig als auch ausreichend ist, eine für D selektive Wirkung₁-type MSNs im NAc-Shell-Unterbereich.

Darüber hinaus sind sowohl die Induktion dendritischer Stacheln bei NAc-MSNs als auch die erhöhte Verhaltensreaktion auf Kokain nach NAc-Überexpression von ΔFosB beide CaMKII-abhängig.

Wichtig ist, dass wir erstmals die Induktion von ΔFosB und CaMKII in der NAc von zeigen menschliche KokainabhängigeVorschläge für mögliche therapeutische Maßnahmen. Diese Daten belegen, dass ΔFosB und CaMKII in eine zelltyp- und hirnregionsspezifische positive Feedforward-Schleife als Schlüsselmechanismus für die Regulierung der Belohnungsschaltung des Gehirns als Reaktion auf chronisches Kokain eingreifen.

Einführung

Zunehmende Beweise stützen die Ansicht, dass Änderungen der Genexpression zu Mechanismen der Drogensucht beitragen (Robison und Nestler, 2011). Ein wichtiger Mediator dieser Veränderungen ist ΔFosB, ein Transkriptionsfaktor der Fos-Familie (Nestler, 2008). Die chronische Verabreichung praktisch aller Missbrauchsdrogen induziert die langanhaltende Anhäufung von ΔFosB im Nucleus Accumbens (NAc), einer für das Belohnungsverhalten essenziellen limbischen Region. SEine solche Induktion scheint spezifisch für die Klasse des NAc-Medium-Spiny-Neurons (MSN) zu sein, das D1-Dopamin-Rezeptoren exprimiert. Induzierbare Überexpression von ΔFosB in diesen NAc-MSNs vom D1-Typ erhöht die Bewegungsfähigkeit und die lohnenden Reaktionen auf Kokain und Morphin (Kelz et al., 1999; Zachariouet al., 2006), einschließlich einer verstärkten Eigenverantwortung für Kokain (Colby et al., 2003). Darüber hinaus verringert die genetische oder virale Blockade der Transkriptionsaktivität von ΔFosB die lohnenden Wirkungen dieser Arzneimittel (Zachariouet al., 2006), was darauf hinweist, dass diese anhaltende Induktion von ΔFosB ein kritischer Mediator für die dauerhaften Veränderungen ist, die durch chronische Medikamentengabe in NAc induziert werden.

Die ungewöhnliche Stabilität von ΔFosB (relativ zu allen anderen Proteinen der Fos-Familie) ist eine intrinsische Eigenschaft des Moleküls aufgrund der Verkürzung von Degron-Domänen, die in FosB voller Länge (Carle ua, 2007) und einen regulierten Prozess. ΔFosB wird phosphoryliert in vitro mit einem in vivo bei Ser27, und diese Reaktion stabilisiert ΔFosB, ~ 10-fach, in Zellkultur und NAc weiter in vivo (Ulery-Reynolds et al., 2009). Obwohl Ser27-ΔFosB als Substrat für Caseinkinase-2 nachgewiesen wurde in vitro (Ulery et al., 2006), sein Mechanismus von in vivo Phosphorylierung bleibt unbekannt.

Die Calcium / Calmodulin-abhängige Proteinkinase II (CaMKII) ist eine stark exprimierte Serin / Threonin-Kinase, deren α- und β-Isoformen dodecamere Homo- und Hetero-Holoenzyme bilden in vivound sind für mehrere Formen der Neuroplastizität unerlässlich (Lisman et al., 2002; Colbran und Brown, 2004). CaMKIIα wird in der NAc-Schale durch chronisches Amphetamin selektiv induziert (Loweth et al., 2010) und die pharmakologische Blockade der CaMKII-Aktivität in der NAc-Schale reduziert die Sensibilisierung des Verhaltens gegen Amphetamin (Loweth et al., 2008) und Kokain (Pierce et al., 1998), während die virale Überexpression von CaMKIIα in diesem NAc-Subbereich die Sensibilisierung des Bewegungsapparates und die Selbstverabreichung von Amphetamin (Loweth et al., 2010). CaMKIIα kann das Belohnungsverhalten durch Modulation von AMPA-Glutamatrezeptor-Untereinheiten beeinflussen (Pierce et al., 1998), da die CaMKIIα-Aktivität seit langem mit der AMPA-Rezeptorfunktion und dem synaptischen Targeting bei verschiedenen Formen der Neuroplastizität in Zusammenhang steht (Malinow und Malenka, 2002).

Diese Literatur zeigt mehrere Parallelen zwischen ΔFosB und CaMKII: Beide sind notwendig und ausreichend für mehrere Verhaltenseffekte von Missbrauchsdrogen. Beide regulieren dendritische Stacheln in verschiedenen neuronalen Zelltypen in vivo (Jourdain et al., 2003; Maze et al., 2010) und beide üben zumindest einen Teil ihrer Verhaltensweisen durch Modulation von AMPA-Rezeptoren aus (Kelz et al., 1999; Malinow und Malenka, 2002; Vialou et al., 2010). Trotz dieser Parallelen ist kein funktioneller Zusammenhang zwischen ΔFosB und CaMKII bekannt. Hier stellen wir eine wechselseitige Regulation zwischen ΔFosB und CaMKII her und zeigen, dass die beiden Proteine ​​eine MSN-spezifische Feed-Forward-Schleife des D1-Typs in der NAc-Hülle bilden, die durch Kokain induziert wird und eine Reihe von Kokainreaktionen reguliert in vivo.

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Materialen und Methoden

Experiment 1: iTRAQ-Proteomanalyse von NAc-Schale und -Kern nach Kokainbehandlung (Abb. 1A)

Erwachsene (8-Wochen) männliche Ratten erhielten sieben Tage lang einmal pro Tag 20 mg / kg Kokain- oder Kochsalz-Vehikel-IP. 24 Stunde nach der letzten Injektion wurden NAc-Schale und Kern mikrodissiert (Abb. 1A) und flash eingefroren. iTRAQ-Analysen wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt (Ross et al., 2004; Davalos et al., 2010).

Figure 1

Shell-spezifische Induktion von CaMKII in NAc durch Kokain

Experiment 2: Quantifizierung der Proteinveränderungen im Kern und der Schale von Ratten nach Kokainbehandlung (Abb. 1B – D)

Männlichen Ratten (8-Wochen) wurden sieben Tage lang täglich 10 mg / kg Kokain- oder Kochsalz-Vehikel-IP in Bewegungsapparaten verabreicht. Bei den zuvor mit Kokain behandelten Tieren ("chronisch") und bei einem Teil der mit Kochsalzlösung ("akut") behandelten Tiere und den Bewegungsreaktionen auf Kochsalzlösung wurden lokomotorische Reaktionen auf eine einzelne Kokaininjektion (5 mg / kg IP) aufgezeichnet Alleine bei den verbleibenden, mit chronischer Salzlösung behandelten Tieren (als „Salzlösung“ bezeichnet) wurde allein berichtet. Die Bewegungsaktivitätstests wurden wie beschrieben durchgeführt (Hiroi et al., 1997). In Kürze, erwachsene männliche Ratten wurden in 18-min-PAS-Freiland-Aufzeichnungsboxen (San Diego Instruments) zur Gewöhnung in 24 × 30-PAS-Freiland-Aufzeichnungsboxen (San Diego Instruments) gegeben, erhielten eine einzige IP-Injektion von Kochsalzlösung und wurden auf eine zusätzliche 30-min überwacht Einmalige IP-Injektion von 5 mg / kg Kokain und Überwachung auf 30 min.

24 Stunde nach dieser letzten Injektion wurden die Ratten ohne Anästhesie enthauptet, um Auswirkungen von Anästhetika auf neuronale Proteinspiegel und Phospho-Zustände zu vermeiden. Die Gehirne wurden seriell in eine 1.2-mm-Matrix (Braintree Scientific) geschnitten und das Zielgewebe wurde in phosphatgepufferter Salzlösung, die Protease (Roche) und Phosphatase (Sigma Aldrich) -Hemmstoffe enthielt, unter Verwendung eines 14-Messstempels für den NAc-Kern und eines 12-Messstempels für den verbleibenden Teil entfernt Gewebe für die NAc-Schale (Siehe Abb. 1A) und sofort auf Trockeneis eingefroren. Die Proben wurden durch leichte Ultraschallbehandlung in modifiziertem RIPA-Puffer homogenisiert: 10 mM Tris-Base, 150 mM Natriumchlorid, 1 mM EDTA, 0.1% Natriumdodecylsulfat, 1% Triton X-100, 1% Natriumdeoxycholat, pH 7.4, Protease und Phosphatase-Inhibitoren wie oben. Nach Zugabe von Laemmli-Puffer wurden die Proteine ​​auf 4-15% -Polyacrylamaid-Gradientengelen (Criterion System, BioRad) aufgetrennt, und das Western-Blotting wurde unter Verwendung des Odyssey-Systems (Li-Cor) gemäß den Herstellerprotokollen durchgeführt.

Experiment 3: Quantifizierung der Proteinveränderungen im Kern und der Schale von Ratten nach dem Entzug von Kokain (Bild 1E)

Erwachsene (8-Wochen) männliche Ratten erhielten sieben Tage lang einmal pro Tag 10 mg / kg Kokain oder Kochsalzlösung. 14 Tage nach der letzten Injektion erhielten Tiere, die mit Kochsalzlösung behandelt wurden, eine weitere Kochsalzinjektion ("Kochsalzlösung" genannt), und mit Kokain behandelte Tiere erhielten eine weitere Kochsalzlösung ("14-Tagesentnahme" oder "14d WD") oder eine einzige Kokaininjektion ( genannt "14d WD Chal" (Herausforderung). Eine Stunde nach der letzten Injektion wurden die Tiere enthauptet und ein Western-Blotting wie in durchgeführt Experiment 2.

Experiment 4: Quantifizierung von Proteinveränderungen im Kern und der Schale von Ratten nach Kokain-Selbstverabreichung (Abb. 2A – C)

Die Ratten wurden trainiert, um 0.5 mg / kg / Infusion von Kokain in einstündigen Sitzungen unter einem 1-Zeitplan mit festem Verhältnis neun Tage lang selbst zu verabreichen. Nach neun Baseline-Sitzungen wurden die Ratten in den beiden letzten Sitzungen in zwei Gruppen eingeteilt, die durch Kokainkonsum ausgeglichen wurden. Eine Gruppe von Ratten durfte Kokain selbst (0.5 mg / kg / Infusion) in einstündigen Sitzungen (kurzer Zugang, ShA) verabreichen, während sich die andere Gruppe von Ratten in sechsstündigen Sitzungen selbst verabreichte (langer Zugang, LgA) ) für zehn zusätzliche Tage (Eskalationssitzungen).

Gehirnschnitte wurden für die Immunhistochemie wie beschrieben verarbeitet (Perrottiet al., 2004). Gehirne wurden 18-24 nach der letzten Medikamentenexposition perfundiert, was zum Abbau von verbleibendem FosB-Protein voller Länge führte, so dass die verbleibende Immunreaktivität ΔFosB widerspiegelte. Dieser Abbau wurde durch Western-Blotting bestätigt, das mit einem gegen den C-Terminus von FosB voller Länge gerichteten Antikörper, der ΔFosB nicht erkennt, keine signifikante Färbung zeigte (Daten nicht gezeigt). Nach dem Schneiden in 35 & mgr; m-Abschnitte wurde die Anzahl der ΔFosB-immunopositiven Zellen durch einen verblindeten Beobachter in zwei Abschnitten durch die NAc jeder Ratte quantifiziert, und die Mittelwerte pro 40 × -Feld wurden dann für jedes Tier nach Region berechnet. Jedes Tier wurde als individuelle Beobachtung für die statistische Analyse betrachtet. Interessante Regionen wurden mit Paxinos und Watson identifiziert (Paxinos und Watson, 2007).

Die Quantifizierung der CaMKIIα-Immunreaktivität wurde unter Verwendung eines Licor-Systems wie beschrieben durchgeführt (Covington et al., 2009). Integrierte Intensitäten von CaMKII und GAPDH wurden mit Odyssey-Software bestimmt. Die Ergebnisse werden als integrierte Intensitätswerte pro mm dargestellt² und werden als Mittelwerte ± sem dargestellt (n = 4-10 pro Gruppe). Werte für GAPDH wurden als Referenz verwendet, um die CaMKII-Intensität für Scheibendicke und -bedingungen zu normalisieren.

Figure 2

Induktion von CaMKII in der NAc-Hülle von selbst verabreichenden Ratten und menschlichen Kokainabhängigen

Experiment 5: Quantifizierung der Proteingehalte bei kokainabhängigen Menschen (Bild 2D)

Ablauf

Hirngewebe des Menschen nach dem Tod wurde von der Quebec Suicide Brain Bank bezogen (Institut für geistige Gesundheit der Douglas, Montreal, Quebec, Kanada). Die Gewebekonservierung verlief im Wesentlichen wie beschrieben (Quirion et al., 1987). Nach dem Extrahieren wird das Gehirn kurz auf feuchtem Eis in einer Styroporschachtel platziert und zu den Einrichtungen der Quebec Suicide Brain Bank gebracht. Hemisphären werden sofort durch einen sagittalen Schnitt in der Mitte des Gehirns, des Hirnstamms und des Kleinhirns getrennt. Blutgefäße, Zirbeldrüse, Plexus choroideus, halbes Kleinhirn und halber Hirnstamm werden typischerweise aus der linken Hemisphäre herauspräpariert, die dann vor dem Einfrieren koronal in 1-cm-dicke Scheiben geschnitten wird. Das letzte Kleinhirn wird vor dem Einfrieren sagittal in 1cm-dicke Scheiben geschnitten. Gewebe werden in 2-Methylbutan bei -40 ° C für ~ 60 sec. Flash-gefroren. Alle gefrorenen Tücher werden für eine längere Lagerung getrennt bei -80 ° C in Kunststoffbeuteln aufbewahrt. Bestimmte Hirnregionen werden aus gefrorenen koronalen Scheiben auf einer Edelstahlplatte mit rundum Trockeneis präpariert, um die Umgebungstemperatur zu kontrollieren. Western-Blotting wurde wie in beschrieben durchgeführt Experiment 2.

Kohorte

Die Kohorte bestand aus männlichen 37- und 3-Probanden im Alter zwischen 15 und 66. Alle Probanden starben plötzlich ohne einen längeren agonalen Zustand oder eine langwierige medizinische Krankheit. In jedem Fall wurde die Todesursache durch das Coroner-Büro in Quebec ermittelt, und es wurden toxikologische Untersuchungen mit Gewebeproben durchgeführt, um Informationen über Medikamente und den Konsum illegaler Substanzen zum Zeitpunkt des Todes zu erhalten. Die Probandengruppe bestand aus 20-Individuen, die die SCID-I-Kriterien für die Kokainabhängigkeit erfüllten. Die Kontrollgruppe bestand aus 20-Probanden ohne Anamnese einer Kokainabhängigkeit und ohne größere psychiatrische Diagnosen. Alle Probanden starben plötzlich an Ursachen, die keinen direkten Einfluss auf das Gehirngewebe hatten. Die Gruppen wurden hinsichtlich Durchschnittsalter, Kühlungsverzögerung und pH-Wert abgeglichen. Für alle Probanden wurden psychologische Autopsien wie zuvor beschrieben durchgeführt (Dumais et al., 2005), so dass wir Zugang zu detaillierten Fallinformationen zur psychiatrischen und medizinischen Vorgeschichte sowie zu anderen relevanten klinischen und soziodemographischen Daten haben. In Kürze führte ein geschulter Interviewer die Strukturiertes klinisches Interview für DSM-IV Psychiatrische Störungen (SCID-I) mit einem oder mehreren Informanten des Verstorbenen. Eine Gruppe von Klinikern überprüfte die SCID-I-Beurteilungen, Fallberichte, Notizen und medizinischen Aufzeichnungen, um psychiatrische Konsensdiagnosen zu erhalten.

Experiment 6: Chromatin-Immunpräzipitation für Ratten-NAc (Abb. 3A – C)

Erwachsene (8-Wochen) männliche Ratten erhielten sieben Tage lang einmal pro Tag 10 mg / kg Kokain oder Kochsalzlösung. 24 Stunde nach der letzten Injektion wurden NAc-Schale und Kern mikrodissiert. Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) wurde durchgeführt, wobei bilaterale NAc-Punchs von Schale oder Kern von sieben Ratten pro Gruppe in 14-Gesamtgruppen (98-Gesamttiere, 7-Kokainpools, 7-Salzlösungspools) gepoolt wurden. Die Gewebe wurden vernetzt, gewaschen und bei -80 ° C bis zur Chromatinscherung durch Ultraschallbehandlung aufbewahrt. Das gescherte Chromatin wurde über Nacht mit Antikörpern inkubiert, die zuvor an Magnetkügelchen (Dynabeads M-280, Invitrogen) gebunden waren. Nicht-Immun-IgG wurde als Kontrolle verwendet. Nach reverser Vernetzung und DNA-Reinigung wurde qPCR verwendet, um die CaMKIIα-Promotor-DNA zu messen. Primer wurden entworfen, um eine Region zu amplifizieren, die eine AP-1-Konsensussequenz enthält, die vor der Transkriptionsstartstelle ~ 450 bp angeordnet ist (Forward: ACTGACTCAGGAAGAGGGATA; Reverse: TGTGCTCCTCAGAATCCACAA).

Figure 3

Zelltyp- und regionenspezifische ΔFosB-Induktion von CaMKIIα in vivo

Experiment 7: Messung des CaMKII-Transkripts und der Proteinexpression mit zelltypspezifischer ΔFosB-Überexpression (Bild 3D)

Männliche bitransgenische Mäuse abgeleitet von NSE-tTA (Linie A) × TetOp-ΔfosB (Zeile 11) und NSE-tTA (Linie B) × TetOp-FLAG-ΔfosB (Linie 11) Mäuse (Chen et al., 1998; Kelz et al., 1999; Werme et al., 2002; Zachariouet al., 2006) wurden mit 100 & mgr; g / ml Doxycyclin konzipiert und erhöht, um die Expression von ΔFosB während der Entwicklung zu unterdrücken. Die Wurfgeschwister wurden beim Absetzen aufgeteilt: die Hälfte blieb Doxycyclin und die Hälfte wurde auf Wasser umgestellt, und die Tiere wurden Wochen später mit 8 bis 11 verwendet, wenn die transkriptionellen Wirkungen von ΔFosB maximal waren (Kelz et al., 1999; McClung und Nestler, 2003). Für Transkriptionsanalysen wurden Mäuse rasch enthauptet und das Gehirn entfernt und auf Eis gestellt. Die NAc-Sektionen wurden mit einem Nadelstempel mit 14-Stärke entnommen und auf Trockeneis schnell eingefroren, bis die RNA extrahiert wurde. RNA-Isolierung, qPCR und Datenanalyse wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt (LaPlant et al., 2009). Kurz gesagt, RNA wurde mit TriZol-Reagenz (Invitrogen) isoliert, mit dem RNAeasy-Mikro-Kit von Qiagen weiter aufgereinigt und mit Agilents Bioanalyzer auf Qualität geprüft. Die umgekehrte Transkription wurde mit iScript (BioRad) durchgeführt. qPCR wurde mit einem Applied Biosystems 7900HT RT-PCR-System mit folgenden Zyklusparametern durchgeführt: 10 min bei 95 ° C; 40-Zyklen von 95 ° C für 1 min, 60 ° C für 30 sec, 72 ° C für 30 sec; abgestuftes Erhitzen auf 95 ° C zur Erzeugung von Dissoziationskurven zur Bestätigung einzelner PCR-Produkte. Immunhistochemische Analysen der Expression von ΔFosB und CaMKIIα wurden wie in beschrieben durchgeführt Experiment 4.

Experiment 8: Auswirkungen von Intra-NAc-D1- und D2-Dopaminrezeptorantagonisten auf Kokain-vermittelte Proteinveränderungen (Fig 3H)

Männliche Ratten (8-Wochen) erhielten sieben Tage lang einmal pro Tag 10 mg / kg Kokain- oder Kochsalz-Vehikel ("Vehikelgruppe"). 30 min vor jeder Kokaininjektion wurde Ratten IP entweder der D1-Rezeptorantagonist SCH 23390 (0.5 mg / kg, Gruppe "D1 Ant") oder der D2-Rezeptorantagonist Eticlopride (0.5 mg / kg, Gruppe "D2 Ant") oder eine Salzspritzeinnahme (Gruppe „Kokain“). 24 Stunde nach der letzten Injektion wurden die Tiere enthauptet und die Proteine ​​durch Western-Blotting gemäß bestimmt Experiment 2.

Experiment 9: Auswirkungen von AAV-vermittelter ΔFosB-Überexpression auf die Proteinexpression (Abb. 4 A – C)

Eine stereotaktische Operation wurde an erwachsenen männlichen Ratten (8-Wochen) durchgeführt, um AAV-GFP (grün fluoreszierendes Protein) oder AAV-GFP-ΔFosB (Maze et al., 2010). 33-Gauge-Nadeln (Hamilton) wurden für alle Operationen verwendet, während der 0.5-ul gereinigtes Virus mit hohem Titer über einen Zeitraum von mindestens 5 bilateral infundiert wurde, gefolgt von einer zusätzlichen Ruhezeit von 5 min nach der Infusion. Alle Abstände werden relativ zu Bregma gemessen: 10 ° Winkel, AP = + 1.7 mm, Lat = 2.5 mm, DV = -6.7 mm. 14-Tage nach der Operation erhielten die Tiere eine einmalige IP-Injektion von 10 mg / kg Kokain in Bewegungskammern, um die Verhaltensweisen der ΔFosB-Überexpression zu beurteilen. 24 Stunde nach dieser letzten Injektion wurden die Ratten gemäß enthauptet Experiment 2und die Mikrodissektion des Gewebes wurde unter fluoreszenzmikroskopischer Führung durchgeführt, um GFP-positives NAc-Gewebe zu erhalten. Western-Blotting wurde dann gemäß durchgeführt Experiment 2.

Figure 4

ΔFosB ist sowohl notwendig als auch ausreichend für die durch Kokain vermittelte D1-Rezeptor-abhängige CaMKIIα-Induktion in der NAc-Hülle

Experiment 10: Auswirkungen der AAV-vermittelten ΔJunD-Überexpression auf die Kokain-abhängige Proteinexpression (Abb. 4 D – F)

Die stereotaktische Injektion von AAV-GFP oder AAV-GFP-ΔJunD wurde gemäß durchgeführt Experiment 8. 14 Tage nach der Operation erhielten die Tiere einmal täglich 10 mg / kg Kokain- oder Kochsalz-Vehikel-IP für sieben Tage in Aufnahmekammern. Die lokomotorischen Reaktionen auf eine einzelne Injektion von Kokain (5 mg / kg IP) oder Salzlösung wurden aufgezeichnet. 24 Stunde nach dieser letzten Injektion wurden die Ratten enthauptet, das Gewebe geerntet und Western Blots wie in durchgeführt Experiment 9.

Experiment 11: In-vitro- Proteinkinase-Assays (Abb. 5A – D)

Rekombinantes CaMKIIα und ΔFosB wurden aus Insektenzellen gereinigt (Brickey et al., 1990; Jorissen et al., 2007) und Proteinkinase-Assays wurden durchgeführt (Colbran, 1993), wie zuvor beschrieben. Kurz gesagt, CaMKII wurde auf Eis mit 2.5 & mgr; M (oder der angegebenen Konzentration) von ΔFosB, 1 mM Ca vorinkubiert²⁺40 mM Mg²⁺, 15 uM Calmodulin und 200 mM HEPES pH 7.5. Die Phosphorylierung wurde durch Zugabe von 200 µM ​​ATP mit oder ohne [γ-³²P] ATP und ließ 10 min bei Raumtemperatur (Fig. 5A & B.) oder 2 min auf Eis (Fig. 5C & D.). Die Produkte wurden durch Western-Blotting (Fig. 5A & B.) oder durch Autoradiogramm und Szintillationszählung (Abb. B – D).

Figure 5

ΔFosB ist ein starkes Substrat für CaMKIIα

Versuch 12: Identifizierung der Ser27-ΔFosB-Phosphorylierung (Bild 5E)

In vitro Kinaseassays wurden gemäß durchgeführt Experiment 11Die Proteine ​​wurden durch SDS-PAGE getrennt und Banden, die ΔFosB entsprachen, wurden ausgeschnitten und einer Tandem-Massenspektrometrie unterzogen. Die m / z-Zuordnungen der entsprechenden Ionenfragmente in allen Feldern sind auf den Ionenspitzen markiert. Nicht alle Fragmentionen sind aus Platzgründen markiert. Im Allgemeinen ist der Text für die Fragmention-Markierungen schwarz gefärbt, es sei denn, sie bestätigen das Vorhandensein der interessierenden Phosphorylierungsstellen direkt oder fügen Beweise hinzu. In diesem Fall sind sie rot markiert. Anhaltspunkte für Fragmentierungsprodukte des Rückgrats werden in der Sequenzauslesung des Phosphopeptids dargestellt, wobei die detektierte Stelle des Phosphorylierungsrests rot mit einer einzelnen Aminosäure-Buchstabenbezeichnung angegeben ist. Die numerische Beschreibung der beobachteten Fragmentionen ist auch auf der Peptidsequenz als b- und y-Ionen markiert. Die Zoomfaktoren für die Abschnitte der m / z-Achse, um die Fragmentionen mit niedrigerer Intensität zu zeigen, sind an der Spitze jedes Fragmentmassenspektrums markiert. Die in Tafel H gezeigten Fragmentionen bestätigen die Anwesenheit von Ser27-phosphorylierter Isoform, jedoch innerhalb einer Mischung anderer phosphorylierter Isoformen an den Stellen Ser28, Ser31, Ser34 und Thr37. Die Anwesenheit von pa5-, pa5-P-, pb5- und pb5-P-Ionen bestätigt eindeutig die Phosphorylierung des Ser27-Rests.

Experiment 13: Quantifizierung der Ser27-Phosphorylierung (Fig. 5F)

Standardpeptide wurden entworfen, um die Phospho- und Nicht-Phospho-Formen von Ser27 ΔFosB nachzuahmen. Nach der Synthese und Reinigung wurde jedes "schwere" idiotypische Peptid in einem 50 / 50-Acetonitril / Wasser-Puffer gelöst und zur Aminosäureanalyse geschickt, um die absolute Konzentration in der synthetischen Peptid-Stammlösung zu bestimmen. Jedes "schwere" Peptid wurde dann direkt in das 4000 QTRAP-Massenspektrometer (MS) infundiert, um die beste Kollisionsenergie für die MS / MS-Fragmentierung und zwei bis vier MRM-Übergänge zu bestimmen. Als nächstes wurden die reinen "schweren" Peptide einer LCMS auf dem 4000 QTRAP unterzogen, um die Peptidtrennung sicherzustellen. Das Instrument wurde im dreifachen Quadrupolmodus betrieben, wobei Q1 auf den spezifischen Vorläufer-m / z-Wert eingestellt war (Q1 scannt nicht) und Q3 auf den spezifischen m / z-Wert eingestellt wurde, der einem bestimmten Fragment dieses Peptids entspricht. Im MRM-Modus wurde eine Reihe von Einzelreaktionen (Vorläufer / Fragmentionenübergänge, bei denen die Kollisionsenergie zur Optimierung der Intensität der interessierenden Fragmentionen eingestellt ist) sequentiell gemessen und der Zyklus (typischerweise 1 – 2 sec) durchgängig durchlaufen die gesamte Zeit der HPLC-Trennung. MRM-Übergänge wurden aus den MS / MS-Spektren der vorhandenen Peptide bestimmt. Dann wurden zwei Übergänge pro Peptid, die Fragmentionen hoher Intensität entsprechen, ausgewählt und die Kollisionsenergie optimiert, um die Signalstärke von MRM-Übergängen unter Verwendung von Automatisierungssoftware zu maximieren. Die Peaks, die sich aus Standardpeptiden und ΔFosB-Proben ergeben, die CaMKII oder Kontrolle ausgesetzt waren, wurden dann verglichen, um die absolute Häufigkeit jeder Peptidform in der Reaktion zu bestimmen. Die Datenanalyse von LC-MRM-Daten wird mit der AB Multiquant 1.1-Software durchgeführt.

Experiment 14: Induktion von ΔFosB in CaMKII-überexprimierenden Mäusen (Fig. 5G & H.)

Transgene Mäuse, die T286D CaMKII überexprimieren (Mayford et al., 1996; Kourrich et al., 2012) und Wildtyp-Wurfgeschwister wurden in Abwesenheit von Doxycyclin gezüchtet, um die Transgenexpression zu ermöglichen. Erwachsene Mäuse wurden 20 mg / kg Kokain oder Salzlösung IP einmal täglich für 14-Tage verabreicht. 24 Stunde nach der letzten Injektion wurden die Tiere enthauptet und die Immunhistochemie und die Quantifizierung der ΔFosB-Expression wurden wie in durchgeführt Experiment 4.

Experiment 15: Auswirkungen von HSV-vermittelter ΔFosB-Überexpression und CaMKII-Hemmung auf NAc-dendritische Stacheln (Abb. 6A – E)

Erwachsene männliche Mäuse (8-Wochen) wurden stereotaktisch HSV-GFP, HSV-GFP-ΔFosB (Olausson et al., 2006), HSV-GFPAC3I oder HSV-GFPAC3I-ΔFosB. In diesen Konstrukten wird AC3I, ein peptidbasierter Inhibitor der CaMKII-Aktivität, an den C-Terminus von GFP fusioniert. GFPAC3I wurde durch PCR unter Verwendung des pMM400-Vektors, der GFPAC3I enthielt, als Template mit den folgenden Primern kloniert: GFP-AC3I-F: 5 GFP-AC3I-R: 3 'CC TCCGGA TTACAGGCAGTCCACGGCCT 5' (clampBspEIstop). Das resultierende PCR-Produkt wurde unter Verwendung von NheI- und BspEI-Stellen in die Vektoren p3 + und p1005 + -Δ-FosB eingefügt. Das Konstrukt wurde durch Sequenzierung validiert. Stereotaktische Koordinaten waren: 1005 ° -Winkel, AP = + 10 mm, Lat = + 1.6 mm, DV = -1.5 mm (Barrot et al., 4.4). Perfusion und Gehirnschnitt wurden gemäß durchgeführt Experiment 4.

Die Analyse der Wirbelsäule wurde wie beschrieben durchgeführt (Christoffel et al., 2011). Kurz gesagt, wurden dendritische Segmente 50 – 150 um vom Soma entfernt zufällig aus HSV-infizierten Zellen ausgewählt, die GFP exprimieren. Die Bilder wurden auf einem konfokalen LSM 710 (Carl Zeiss) zur morphologischen Analyse mit NeuronStudio mit dem Rayburst-Algorithmus aufgenommen. NeuronStudio klassifiziert Stacheln auf der Grundlage der folgenden Werte als "dünn", "pilzartig" oder "stubby": (1) - Seitenverhältnis, (2) Kopf-Hals-Verhältnis und (3) Kopfdurchmesser. Stacheln mit einem Hals können entweder als dünn oder als Pilz klassifiziert werden, und diejenigen ohne bedeutenden Hals werden als Stubby eingestuft. Stacheln mit einem Hals werden auf der Grundlage des Kopfdurchmessers als dünn oder als Pilz bezeichnet.

Figure 6

Die Blockade der CaMKII-Aktivität verhindert die morphologischen und Verhaltensänderungen von ΔFosB in NAc

Experiment 16: Auswirkungen von HSV-vermittelter ΔFosB-Überexpression und CaMKII-Hemmung auf Kokainantworten (Fig. 6F)

Bei erwachsenen männlichen Mäusen wurden Viren gemäß injiziert Experiment 15und die motorischen Reaktionen auf eine einzige 5-mg / kg-Injektion von Kokain wurden gemäß gemessen Experiment 9. Die Bewegungsdaten werden als Gesamtstrahlbrüche über 30 min nach der Kokaininjektion ausgedrückt.

Weitere Informationen

Tierhaltung

Männliche Sprague-Dawley-Ratten (250-275 g; Charles River Laboratories) waren paarweise untergebracht. Acht Wochen alte männliche C57BL / 6J-Mäuse (The Jackson Laboratory) wurden mit maximal fünf Tieren pro Käfig in einer Gruppe untergebracht. Alle Tiere wurden ≥1-Woche vor experimentellen Manipulationen an die Tiereinrichtung gewöhnt und in klimatisierten Räumen (23 – 25 ° C) in einem 12-Stunden-Licht / Dunkel-Zyklus (Lichter an 7: 00 AM) mit Zugang zu Futter untergebracht und Wasser ad libitum. Die Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Society for Neuroscience und des Instituts für Tierpflege und -nutzung (IACUC) am Berg Sinai durchgeführt.

Drogen

Den Arzneimitteln wurde IP verabreicht und in steriler Salzlösung gelöst, einschließlich Kokain (5-20 mg / kg pro 10 ul für Mäuse, pro 1 ml für Ratten, NIDA) und SCH 23390 oder Eticlopridhydrochlorid (0.5 mg / kg pro 1 ml, Tocris). . Für stereotaktische Operationen wurden Mäuse mit einem "Cocktail" aus Ketamin (100 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg) (Henry Schein) in steriler Kochsalzlösung anästhesiert.

Antikörper

CaMKIIα (gesamt): Upstate 05 – 532, 1: 5,000

CaMKII Phospho-Thr286: Promega V111A, 1: 1,000

ΔFosB (gesamt): Zellsignalisierung 5G4, 1: 250

& Dgr; FosB-Phospho-Ser27: Phosphosolutions, 1: 500

GluA1 (gesamt): Abcam, Ab31232, 1: 1,000

GluA1 Phospho-Ser831: Millipore N453, 1: 1,000

GluA1 Phospho-Ser845: Chemicon Ab5849, 1: 2,000

GluA2: Millipore 07 – 598, 1: 2,000

NR2A: Sigma HPA004692, 1: 2,500

NR2B: Millipore Ab1557P, 1: 1,000

Statistische Analysen

Alle statistischen Analysen wurden mit dem Prism 6-Softwarepaket (GraphPad) durchgeführt. T-Tests für Studenten wurden für alle paarweisen Vergleiche verwendet (angegeben in Ergebnisse, in denen der t-Wert angegeben ist), und Einweg-ANOVAs wurden für alle Mehrfachvergleiche verwendet (angegeben im Ergebnisabschnitt, in dem der F-Wert angegeben ist).

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Ergebnisse

Chronisches Kokain induziert CaMKII in der NAc-Schale

Viele Studien haben gezeigt, dass MSNs in der NAc-Schale und im Kern unterschiedliche biochemische und physiologische Reaktionen auf chronische Exposition mit Missbrauchsmedikamenten haben (Kourrich und Thomas, 2009; Loweth et al., 2010) und dass die beiden Subregionen drogenabhängiges Verhalten differenzieren (Ito et al., 2004). Bestimmung der unterschiedlichen Auswirkungen von Kokain auf die Eiweißbestandteile der NAc-Schale vs Im Kern verwendeten wir das Multiplexed Isobaric Tagging (iTRAQ) und die Tandem-Massenspektroskopie (MS / MS). Erwachsene männliche Ratten erhielten täglich für 20-Tage IP-haltiges Kokain (7 mg / kg) oder Kochsalzlösung. 24 Stunde nach der letzten Injektion wurden NAc-Schale und Kern mikrodissiert (Abb. 1A) und flash eingefroren. Die Proteine ​​in diesen Proben wurden dann mit iTRAQ quantifiziert. Alle vier CaMKII-Isoformen zeigten nach Kokainbehandlung einen starken Anstieg der Expression, der für die NAc-Schale spezifisch war, im Vergleich zum Kern. Mehrere Proteinphosphatasen, darunter katalytische und regulatorische PP1-Untereinheiten sowie PP2A, die zuvor mit verschiedenen CaMKII-Substraten in anderen Systemen in Verbindung gebracht wurden (Colbran, 2004) folgte ein ähnliches Muster. Diese Ergebnisse lieferten neuartige, unvoreingenommene Befunde, die besagen, dass der CaMKII-Signalweg in NAc in einer shell-spezifischen Weise durch Kokain deutlich reguliert wird.

Um diesen Befund quantitativer zu bestätigen, behandelten wir die Ratten wie oben mit Kokain (in unterschiedlichen Dosierungen) oder Kochsalzlösung und maßen die motorischen Reaktionen auf eine Kokain- (5 mg / kg) oder Kochsalz-Challenge-Dosis. Wiederholte Exposition mit 10 mg / kg Kokain führte zu einem typischen Muster der Sensibilisierung des Bewegungsapparates (Bild 1B). Weitere Studien mit diesem Dosierungsschema zeigten mittels Western Blotting, dass wiederholtes Kokain CaMKIIα selektiv in der NAc-Schale 24 h nach der letzten Kokain-Injektion induziert (Abb. 1C und D; p = 0.0019; F = 7.943; df = 29). Darüber hinaus war die Phosphorylierung des kanonischen CaMKII-Substrats Ser831 der GluA1-Untereinheit des AMPA-Rezeptors in der NAc-Schale und nicht im Kern signifikant erhöht (p = 0.0261; F = 4.208; df = 28), während die CaMKIIα-Thr286-Autophosphorylierung stark, jedoch nicht war bedeutender Trend zur Induktion nur in der Schale (Bild 1D). Mehrere andere Glutamatrezeptoren waren nicht betroffen. Im Gegensatz zu diesen Messungen von CaMKII zeigten die gleichen Gewebeproben eine Induktion von ΔFosB in beiden Schalen (p = 0.0260; F = 4.189; df = 29) und im Kern (p = 0.0350; F = 3.807; df = 29) der NAc (Abb. 1C und D), im Einklang mit früheren Feststellungen (Perrottiet al., 2008).

Da in mehreren früheren Studien zur Kokainregulierung von AMPA-Rezeptoren Tiere nach ~ 14-Tagen des Entzugs von chronischem Kokain analysiert wurden (siehe Diskussion), haben wir diese biochemischen Analysen zu diesem Zeitpunkt wiederholt. Wir fanden heraus, dass 14 Tage nach der letzten Kokain-Injektion ΔFosB in NAc erhöht bleibt (p = 0.0288; F = 4.258; df = 22), während weder CaMKII noch die Phosphorylierung von GluA1 Ser831 erhöht bleibt (Bild 1E). 1 nach einer einzigen 10 mg / kg-Challenge-Dosis von Kokain, Konzentrationen von Gesamt-CaMKII (p = 0.0330; F = 3.947; df = 26) und von GluA1 Ser831 (p = 0.0213; F = 4.509) Phosphorylierung sind beide auf einen ähnlichen Grad erhöht wie nach einer anfänglichen chronischen Kokain-Exposition (Bild 1E). Diese Daten zeigen, dass NAc-Shell-Neuronen während längerer Abstinenzperioden für die CaMKII-Induktion vorbereitet werden, möglicherweise durch direktes Priming des CaMKII-Gen-Promotors (siehe Diskussion). Darüber hinaus deutet die Tatsache, dass die ΔFosB-Induktion beständiger ist als die CaMKII-Induktion, auf das Vorhandensein zusätzlicher Mechanismen aus, die auf der Chromatin-Basis oder auf andere Weise bestehen und die die CaMKII-Regulation "bremsen", wie in der Diskussion beschrieben.

Um diese Beobachtungen weiter zu verstärken, untersuchten wir Modelle der Kokain-Selbstverwaltung, die einen freiwilligen Drogenkonsum beinhalten. Erwachsene männliche Ratten erhielten entweder kurzen oder langen Zugang zu Kokain. wie erwartet (Ahmed und Koob, 1998), führten nur lange Zugangsbedingungen zu einer eskalierenden Selbstverabreichung des Arzneimittels (Abb. 2A). ΔFosB wurde durch lange stärker induziert vs Kurzer Zugang zu Kokain sowohl in der NAc-Schale (p = 0.0011; F = 11.12; df = 17) als auch im Kern (p = 0.0004; F = 13.86; df = 17). Im Gegensatz dazu wurde CaMKIIα in der NAc-Schale nur durch einen langen Zugang zu Kokain induziert (Fig. 2B und C; p = 0.0236; F = 4.957; df = 16). Es ist interessant, die durchschnittliche tägliche Kokainzufuhr bei Tieren mit kurzem Zugang (~ 12 mg / kg iv), Tieren mit langem Zugang (~ 70 mg / kg IV) und Versuchstieren (10 mg / kg) und zu vergleichen Fragen Sie, warum letztere eine robuste Induktion von ΔFosB und CaMKII hervorruft, während dies bei Short-Access nicht der Fall ist. Diese Diskrepanz ist wahrscheinlich auf Unterschiede in den Spitzenkokainspiegeln zurückzuführen (vom Experimentator verabreichtes Kokain wird als einzelnes Bolus-IP verabreicht, während das selbst verabreichte Kokain über mehrere IV-Dosen verabreicht wird) oder durch Unterschiede in der Dauer der Arzneimittelexposition (7-Tage für den Experimentator) Verwaltung, 19-Tage für die Selbstverwaltung).

Trotz der umfangreichen Literatur zu ΔFosB und CaMKII in Kokainwirkung gibt es keine Studien zu diesen Proteinen bei menschlichen Kokainkonsumenten. Hier legen wir den ersten Beweis dafür vor, dass sowohl der Gehalt an ΔFosB (p = 0.0316; t = 1.921; df = 34) als auch CaMKII (p = 0.0444; t = 1.755; df = 32) bei NAc von Kokain-abhängigen Menschen (Bild 2D, Tabelle 1). Diese Daten zeigen, dass unsere Untersuchung der ΔFosB- und CaMKII-Induktion durch Kokain in Nager-Nagetieren klinisch für die Kokainsucht von Menschen relevant ist.

Tabelle 1

Charakterisierung von Proben von menschlichen Kokainabhängigen und übereinstimmender Kontrollgruppe

ΔFosB reguliert die CaMKII-Transkription selektiv in MSNs des D1-Typs von NAc Shell

Die Feststellung, dass sowohl CaMKII als auch ΔFosB in der Nagetier-NAc durch Kokain hochreguliert werden, führte zu der Feststellung, ob ΔFosB die Transkription des CaMKII-Gens regulieren könnte. Wir hatten bereits CaMKIIα als mögliches Ziel für ΔFosB in einer neutralen Microarray-Analyse von NAc beschrieben (McClung und Nestler, 2003), aber dieser Befund wurde in dieser Studie nicht weiter bestätigt. Wir verwendeten zuerst quantitatives ChIP (qChIP - ChIP gefolgt von quantitativer PCR), um zu bestimmen, ob ΔFosB an den CaMKIIα-Genpromotor in NAc erwachsener männlicher Ratten bindet, und es wurde auffallend gefunden, dass diese Bindung durch chronische Kokainverabreichung in der Hülle signifikant erhöht ist ( p = 0.0133; t = 2.901; df = 12), nicht jedoch der Kern-Teilbereich (Abb. 3A). Um die Mechanismen zu verstehen, die mit diesem subregionsspezifischen Unterschied in der Bindung von ΔFosB an den CaMKIIα-Promotor zusammenhängen, haben wir qChIP verwendet, um den Zustand der Histon-Modfikationen in dieser genomischen Region zu charakterisieren. Frühere Studien zeigten eine Kokaininduktion der H3-Acetylierung am CaMKIIα-Promotor in Gesamt-Mäuse-NAc (Wang et al., 2010). Im Gegensatz dazu haben wir festgestellt, dass Kokain die H3-Acetylierung am CaMKIIα-Promotor selektiv im NAc-Kern verringert (Bild 3B; p = 0.0213; t = 2.726; df = 10), wobei in der Schale keine Veränderung erkennbar ist, im Einklang mit den subregionspezifischen Chromatinveränderungen über die ΔFosB-Bindung hinaus. qChIP für das repressive Mark, dimethyliertes H3-Lysin 9 (H3K9me2), zeigte Tendenzen für einen Rückgang sowohl in den Shell- als auch in den Kern-Subregionen (Bild 3C).

Um zu bestimmen, ob ΔFosB die CaMKIIα-Transkription reguliert in vivoverwendeten wir zwei bitransgene Mauslinien, die ΔFosB spezifisch spezifisch in D1 überexprimieren vs MSNs vom Typ D2 in einer Weise, die durch die Verabreichung von Doxycyclin in Trinkwasser kontrolliert wird (Chen et al., 1998; Kelz et al., 1999; Werme et al., 2002). Erwachsene männliche Mäuse, die ΔFosB ausschließlich in MSNs vom D1-Typ überexprimierten, wiesen signifikant erhöhte Konzentrationen von CaMKIIα-mRNA in NAc auf (p = 0.0337; t = 1.996; df = 13), ein Effekt, der nicht bei Mäusen überexprimiert wurde, die ΔFosB (Bild 3D). Der Anstieg der CaMKIIα-mRNA, induziert durch die ΔFosB-Expression in MSNs vom D1-Typ, ging mit einer gleichzeitigen Zunahme des CaMKIIα-Proteins sowohl in der NAc-Schale (p = 0.0030; t = 3.578; df = 14) als auch im Kern (p = 0.0392; t) einher = 2.275; df = 14; Abb. 3E und F). Diese Daten zeigen, dass ΔFosB fähig ist, die CaMKIIα-Genexpression in MSNs vom D1-Typ in beiden Teilregionen zu steuern, obwohl Abbildung 3B legt nahe, dass Kokain-vermittelte Chromatinveränderungen am CaMKIIα-Promotor (z. B. reduzierte Acetylierung) verhindern, dass ΔFosB CaMKII in der Kernsubregion nach Kokain hochreguliert.

Da unsere transgenen Mausdaten darauf hinwiesen, dass die ΔFosB-Induktion der CaMKII-Genexpression spezifisch für MSNs vom D1-Typ in NAc ist, wollten wir als nächstes bestimmen, ob die kokainabhängige Hochregulation von CaMKII die Aktivierung des D1-Dopaminrezeptors erfordert. Erwachsenen männlichen Ratten wurde wie zuvor chronisches Kokain oder Kochsalzlösung verabreicht, aber 30 Minuten vor jeder Injektion erhielten Ratten in der Kokaingruppe eine IP-Injektion von Kochsalzlösung, dem D1-Antagonisten SCH 23390 (0.5 mg / kg) oder dem D2-Rezeptorantagonisten Eticloprid (0.5 mg / kg). Die Tiere wurden 24 Stunden nach der letzten Injektion von Kokain analysiert. Western Blot zeigte, dass der D1-, aber nicht der D2-Antagonist den kokainvermittelten Anstieg von ΔFosB (p <0.0001; F = 18.96; df = 18) vollständig blockierte, wie zuvor berichtet (Nye et al., 1995) sowie in CaMKII (p = 0.0005; F = 10.99; df = 18; Abb. 3G und H). Diese Daten stützen die Hypothese, dass Kokain eine ΔFosB-vermittelte Erhöhung der CaMKII-Genexpression spezifisch in MSNs vom D1-Typ der NAc-Schale eingeht. In zukünftigen Studien wäre es wichtig, diesen zelltypspezifischen Effekt von Kokain auf die CaMKII-Expression in dieser Gehirnregion direkt zu demonstrieren.

ΔFosB ist sowohl notwendig als auch ausreichend für die Kokaininduktion von CaMKII in der NAc-Schale

Um die Verwendung von bitransgenen Mäusen zu ergänzen, untersuchten wir als Nächstes die Rolle von ΔFosB bei der Vermittlung der Kokaininduktion von CaMKII & agr; unter Verwendung des durch Viren vermittelten Gentransfers bei Ratten. Wir haben bilateral Adeno-assoziierte virale (AAV) -Partikel in die NAc-Hülle ausgewachsener männlicher Ratten injiziert (wobei die Hülle gezielt angesteuert werden kann), um ΔFosB plus GFP oder GFP alleine zu überexprimieren. Die Tiere erhielten dann eine einzige IP-Injektion von 10 mg / kg Kokain. Die Tiere, die ΔFosB / GFP überexprimierten, zeigten im Vergleich zu Tieren, die nur GFP überexprimierten (Abb. 4A). 24 Stunde nach der einmaligen Kokaininjektion wurde aus diesen Tieren GFP-positives NAc-Gewebe durch Dissektion unter einer fluoreszierenden Lichtquelle ausgeschnitten. Western-Blotting dieses Gewebes (Fig. 4B und C) zeigte eine starke ΔFosB-Überexpression sowie einen signifikanten Anstieg des gesamten CaMKIIα-Proteins im Vergleich zu GFP-Tieren (p = 0.0070; t = 2.894; df = 30), ähnlich der bei chronischer Kokainverabreichung beobachteten Induktion. Zusätzlich wurde die CaMKIIα-Autophosphorylierung bei Thr286 (was auf eine Enzymaktivierung hindeutet) durch ΔFosB-Überexpression erhöht (p = 0.0330; t = 2.243; df = 28), ebenso wie die Phosphorylierung des CaMKII-Substrats Ser831 von GluA1; 0.0540; df = 2.012), das wiederum die Wirkung von chronischem Kokain nachahmt (Abb. 1C und D). TZusammengefasst liefern diese Daten einen weiteren Beweis dafür, dass die Expression von ΔFosB in der NAc-Schale für die Sensibilisierung des Bewegungsapparates gegen Kokain und für die Induktion und Aktivierung von CaMKII in diesem Unterbereich ausreichend ist.

Wir verwendeten einen ähnlichen Ansatz, um zu bestimmen, ob ΔFosB auch für die Kokain-vermittelte Induktion von CaMKIIα in der NAc-Hülle erforderlich ist. AAV wurde zur Überexpression eines verkürzten JunD-Proteins mit der Bezeichnung ΔJunD verwendet, das ein negativer Regulator der Transkriptionsaktivierung von ΔFosB ist (Winstanley et al., 2007) plus GFP oder GFP alleine. Zwei Wochen später, wenn die Transgenexpression maximal ist, erhielten die Tiere für 10-Tage täglich Kokain (7 mg / kg) oder Kochsalzlösung und wurden nach der letzten chronischen Injektion (5 mg / kg) 24 auf lokomotorische Antworten getestet (XNUMX mg / kg).Bild 4D). Die Überexpression von ΔJunD verhinderte die Sensibilisierung des Bewegungsapparates gegen Kokain sowie die Induktion und Aktivierung von CaMKIIα in der NAc-Schale (Abb. 4E und F; p = 0.0437; F = 2.997; total df = 38), was anzeigt, dass die Transkriptionsaktivität von ΔFosB für die Kokain-vermittelte Induktion von CaMKIIα in diesem Unterbereich notwendig ist. Interessanterweise haben wir festgestellt, dass ΔJunD sowohl unter mit Kochsalzlösung als auch unter Kokain behandelten Bedingungen die Spiegel von ΔFosB reduzierte (p = 0.0004; F = 8.110; df = 35), was die neuartige Möglichkeit erhöht, dass ΔFosB für seine eigenen Expressionsniveaus von AP-1-Aktivität abhängt.

CaMKII-Phosphorylate ΔFosB bei Ser27

Die Verwendung von in vitro Proteinkinase-Assays haben wir festgestellt, dass gereinigtes ΔFosB ein robustes Substrat für CaMKIIα ist. Inkubation von seiner₆-ΔFosB mit CaMKIIα und ATP verursachte eine Verschiebung der elektrophoretischen Mobilität von ΔFosB nach oben (Abb. 5A); Die verschiedenen resultierenden Banden deuteten auf mehrere Phosphorylierungsstellen hin. Ähnlich in vitro Kinase-Assays unter Verwendung von [γ-³²P] ATP zeigte den Einbau von radioaktiv markiertem Phosphat in die verschobenen ΔFosB-Banden (Bild 5B), was die direkte Phosphorylierung des Proteins belegt. Wir haben einen Phospho-spezifischen Antikörper gegen das zuvor charakterisierte Ser27 von ΔFosB (Ulery et al., 2006). Während dieser Antikörper kein Signal gegen Gehirnextrakte produziert, die Ser27-phosphoryliertes ΔFosB enthalten (Daten nicht gezeigt), konnten wir die Ser27-Phosphorylierung in der Zelle nachweisen in vitro Kinase-Assay mit CaMKII (Bild 5B). Kinetische Analysen der CaMKII-Phosphorylierung von ΔFosB zeigen, dass es sich um ein starkes Substrat für die Kinase handelt (Bild 5C) mit einem scheinbaren K_M von 5.7 ± 2.0µM und K_CAT von 2.3 ± 0.3min^-1. Diese Ergebnisse sind mit vielen gut charakterisiert in vivo Substrate von CaMKII (Colbran und Brown, 2004). Außerdem haben wir festgestellt, dass CaMKII ΔFosB mit einer Stöchiometrie von 2.27 ± 0.07 mol / mol (Bild 5D), was darauf hinweist, dass innerhalb der His mindestens drei Stellen der CaMKII-Phosphorylierung vorhanden sind₆-ΔFosB-Protein, in Übereinstimmung mit Abb. 5A.

Um einzelne Phosphorylierungsstellen zu untersuchen, haben wir MS - Analysen von Proben aus unserem Labor verwendet in vitro Kinase-Assays. Bild 5E demonstriert die ΔFosB-Phosphorylierung an dem zuvor charakterisierten Ser27 und an mehreren zusätzlichen Stellen (Daten nicht gezeigt). Angesichts der früheren funktionellen Charakterisierung von Ser27 konzentrierten wir uns auf diese Stelle, indem markierte synthetische Peptide erzeugt wurden, die die Phospho- und Nichtphospho-Zustände von Ser27 nachahmen. Anschließend verwendeten wir bekannte Mengen dieser Peptide als Standard in MRM-Analysen von ΔFosB vor und nach in vitro Phosphorylierung durch CaMKII. Anschließende Quantifizierung (Fig. 5F) bestätigt, dass Ser27 ein starkes Substrat für CaMKII ist. Diese Ergebnisse zeigen, dass Ser27 unter den mehrfachen phosphorylierten Resten in ΔFosB ein besonders wirksames Substrat für CaMKII ist.

CaMKII vermittelt die Kokainakkumulation von ΔFosB in der NAc-Schale

Da CaMKII ΔFosB phosphorylieren kann in vitro an einem Ort, der seine Stabilität dramatisch erhöht in vitro mit einem in vivo (Ulery et al., 2006; Ulery-Reynolds et al., 2009) haben wir festgestellt, ob die CaMKII-Aktivität die ΔFosB-Spiegel in NAc steuert in vivo. Um diese Frage zu beantworten, haben wir zuerst eine Mauslinie verwendet, die eine Calcium-unabhängige Mutante von CaMKIIα (T286D) in mehreren Gehirnregionen einschließlich NAc (Mayford et al., 1996; Kourrich et al., 2012). Wir haben altersangepassten erwachsenen männlichen Mutanten und Wildtyp-Wurfgeschwistern 20-Tage einmal täglich 14 mg / kg Kokain oder Kochsalzlösung injiziert, und die Tiere wurden einen Tag nach der letzten Injektion analysiert. Wir fanden heraus, dass die Basalwerte von ΔFosB in den mutierten Tieren in der NAc-Schale erhöht waren (p = 0.0001; F = 9.207; df = 37), nicht jedoch der Kern (Abb. 5G und H). Überraschenderweise wurde die kokainabhängige Induktion von ΔFosB in den mutierten Tieren sowohl in der Schale als auch im Kern blockiert, was darauf hindeutet, dass CaMKII zwar die ΔFosB-Stabilität in der NAc-Schale direkt regulieren kann, es jedoch auch in beiden von Kokain aktivierten Bahnen stromaufwärts von ΔFosB liegen kann .

CaMKII-Aktivität ist für die ΔFosB-vermittelte Struktur- und Verhaltensplastizität erforderlich

Die Kokaininduktion dendritischer Stacheln bei NAc-MSNs ist eine der am besten etablierten medikamenteninduzierten Anpassungen in dieser Hirnregion. Diese Induktion der Wirbelsäule wurde mit sensibilisierten Verhaltensreaktionen auf das Medikament korreliert (Robinson und Kolb, 2004; Russo et al., 2010) und als selektiv für MSNs vom Typ D1 (Lee et al., 2006). Wir haben kürzlich gezeigt, dass die Kokaininduktion dendritischer Stacheln in NAc von ΔFosB und seinem nachgeschalteten Transkriptionsprogramm abhängt (Maze et al., 2010). Obwohl es eine umfangreiche Literatur zur Beteiligung von CaMKII an der Morphologie und Induktion der dendritischen Wirbelsäule in anderen Gehirnregionen und experimentellen Systemen gibt (Jourdain et al., 2003; Penzes et al., 2008; Okamoto et al., 2009), seine Rolle bei der Bildung von NAc-MSN-Wirbelsäulen wurde nicht untersucht. Daher haben wir unter Verwendung der HSV-vermittelten Überexpression des CaMKII-Inhibitor-Peptids AC3I, das an GFP fusioniert ist, ermittelt, ob CaMKII-Aktivität für die ΔFosB-vermittelte Induktion von MSN-dendritischen Stacheln erforderlich ist in vivo (Zhang et al. 2005; Klug et al., 2012). Die virale Überexpression von ΔFosB in der NAc-Schale adulter Mäuse induzierte einen signifikanten Anstieg der dendritischen Wirbelsäulendichte von MSN (p <0.0001; F = 8.558; df = 59; Abb. 6A und B) wie zuvor berichtet (Maze et al., 2010), und dieser Anstieg wurde in erster Linie durch dünne Wirbelsäulentypen (p = 0.0027; F = 5.319; df = 59) und stubby (p = 0.0378; F = 2.988; df = 59) getrieben.Abb. 6C – E). Bei reiferen, pilzförmigen Stacheln wurde keine Wirkung beobachtet. Wenn GFP-AC3I jedoch gleichzeitig exprimiert wurde, war die Induktion der ΔFosB-Wirbelsäule vollständig aufgehoben (Abb. 6A – E), was darauf hinweist, dass die CaMKII-Aktivität für die ΔFosB-Induktion von dendritischen Stacheln in der NAc-Schale erforderlich ist.

Als nächstes verwendeten wir die gleichen viralen Werkzeuge, um zu bestimmen, ob CaMKII-Aktivität für die Auswirkungen von ΔFosB auf die Verhaltensempfindlichkeit gegenüber Kokain erforderlich ist. 72 Stunde nach der Virusinjektion in die NAc-Schale wurden den Tieren eine einzige Injektion von 5 mg / kg Kokain gegeben und ihre Bewegungsaktivität wurde aufgezeichnet. Wie zuvor gezeigt, mit einer längeren AAV-Überexpression von ΔFosB (Abb. 4A), Erhöhte HSV-vermittelte Überexpression von ΔFosB die Empfindlichkeit der Lokomotoren gegen Kokain (p = 0.0002; F = 8.823; df = 37; Fig. 6F). Wie bei der Induktion dendritischer Stacheln blockierte die Inhibierung der CaMKII-Aktivität durch Koexpression von GFP-AC3I die durch ΔFosB vermittelte Erhöhung der Kokainsensitivität vollständig, was darauf hinweist, dass die CaMKII-Aktivität für ΔFosB-induzierte Änderungen der Verhaltensweisen von Kokain erforderlich ist.

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Diskussion

Die vorliegende Studie beschreibt einen neuen Feed-Forward-Mechanismus, bei dem Kokain in NAc ΔFosB induziert, das die Transkription des CaMKIIα-Gens in der NAc-Schale selektiv hochreguliert. CaMKIIα phosphoryliert und stabilisiert anschließend ΔFosB, was zu einer stärkeren ΔFosB-Akkumulation und zu einer weiteren CaMKIIα-Induktion führt (Abb. 6G). Die coeskalierenden Mengen der beiden Proteine ​​während einer chronischen Kokain-Exposition tragen dann wesentlich zu sensibilisierten Verhaltensreaktionen auf das Medikament bei. Dies ist eine besonders ansprechende Hypothese, da gezeigt wurde, dass sowohl ΔFosB als auch CaMKII für erhöhte Verhaltensreaktionen auf Kokain erforderlich sind (Pierce et al., 1998; Peakman et al., 2003), und wir replizieren diesen Befund für ΔFosB in der NAc-Schale spezifisch mit einem viralen Ansatz (Figuren 4 mit einem Und66).

Obwohl transgene ΔFosB-Überexpression in MSNs vom D1-Typ die CaMKII-Induktion sowohl in der NAc-Schale als auch im Kern von Kokain-naiven Tieren antreiben kann, treibt die Akkumulation von endogenem ΔFosB, die in beiden Subregionen auftritt, im Zusammenhang mit Kokain spezifisch in der NAc-Schale . Dieser Unterschied könnte sich auf die höheren Gehalte an ΔFosB beziehen, die in unserem bitransgenen Modell induziert wurden, es könnte jedoch auch die Fähigkeit von Kokain widerspiegeln, den CaMKIIα-Promotor in der Schale differentiell zu verändern vs Kern-MSNs, um entweder die ΔFosB-Bindung in der ersteren zu fördern oder sie in der letzteren Teilregion auszuschließen. Tatsächlich unterstützen unsere ChIP-Daten, die nur eine kokainvermittelte Deacetylierung von Histonen am CaMKIIα-Genpromotor im NAc-Kern zeigen, die mögliche Beteiligung eines Chromatinmechanismus. In Übereinstimmung mit dieser Hypothese konnte die ΔFosB-Überexpression in MSNs vom D1-Typ die CaMKIIα-Induktion im NAc-Kern in Abwesenheit von Kokain antreiben (Fig. 3F), was darauf hindeutet, dass es aktive Modifikationen des CaMKIIα-Promotors gibt, die diese Induktion während einer chronischen Kokain-Exposition verhindern. Die Regulation der Chromatinlandschaft am CaMKII-Promotor könnte auch erklären, warum CaMKII durch eine Provokationsdosis Kokain in der NAc-Hülle chronisch kokainabziehender Ratten induziert wird (Bild 1E), aber nicht von drogen-naiven Tieren (Bild 1D). Dies könnte einen epigenetischen "Gen-Priming" -Effekt von ΔFosB (Robison und Nestler, 2011) und könnte somit ein molekularer Mechanismus der Inkubation des Kokain-Verlangens sein (Pickens et al., 2011). Damit diese Chromatinveränderung jedoch ursächlich mit der Inkubation des Verlangens zusammenhängt, müsste sie mit der Zeit zunehmen. Es wird interessant sein zu bestimmen, ob dies der Fall ist, und zu untersuchen, ob andere Gene eine ΔFosB-abhängige, subregionsspezifische Regulation durch Kokain zeigen. Es ist auch wichtig zu beachten, dass die von uns beschriebene Feed-Forward-Schleife nicht zu einer endlosen Akkumulation von CaMKII oder ΔFosB (Bild 1E); Das Aufdecken der dafür verantwortlichen molekularen "Bremse" ist ein wichtiges Ziel zukünftiger Studien.

Die bekannten Funktionen von ΔFosB und CaMKII in verschiedenen experimentellen Systemen und Gehirnregionen konvergieren auf vielen Ebenen (Fig. 6F). Beide Moleküle sind eng mit dem Wachstum der dendritischen Wirbelsäule verbunden: CaMKII interagiert mit dem Aktin-Zytoskelett (Okamoto et al., 2009), reguliert die Kopfgröße der Wirbelsäule (Matsuzaki et al., 2004) und ist sowohl notwendig als auch ausreichend für plastilitätsinduzierte Erhöhungen der Filopodien und der Synapsenzahl in hippocampalen organotypischen Schnittkulturen (Jourdain et al., 2003), wΔFosB ist für die Kokain-induzierte dendritische Wirbelsäulenbildung in NAc-MSNs sowohl notwendig als auch ausreichend (Maze et al., 2010). Zusätzlich wurden beide Moleküle mit der Regulation von AMPA-Glutamatrezeptoren in Verbindung gebracht. CaMKII reguliert nicht die Gesamtmenge an AMPA-Rezeptor-Untereinheiten, sondern steuert die Insertion von AMPA-Rezeptoren in Synapsen und erhöht die Leitfähigkeit des AMPA-Kanals durch Phosphorylierung von GluA1 bei Ser831 in Hippocampus-Pyramiden-Neuronen in Kultur und Kultur in vivo (überprüft in (Malinow und Malenka, 2002; Colbran und Brown, 2004)). Ein derart erhöhter Handel mit GluA1 in die Synapse ist auch mit der chronischen Kokainwirkung verbunden (Boudreau und Wolf, 2005). Darüber hinaus werden Verhaltensreaktionen auf die Aktivierung des AMPA-Rezeptors in NAc durch CaMKIIα-Überexpression auf D1-Dopamin-Rezeptor-abhängige Weise verstärkt (Singer et al., 2010). Es wurde gezeigt, dass D1-spezifische Überexpression von ΔFosB die GluA2-Transkription in NAc induziert (Kelz et al., 1999), die AMPA-Reaktionen, die über GluA1 vermittelt werden, dämpft, während wir hier zeigen, dass eine kurzfristige ΔFosB-Überexpression sowie eine kurzfristigere Kokain-Exposition keinen Einfluss auf diese Untereinheit haben (Abb 1). Dennoch haben wir kürzlich festgestellt, dass die kurzfristige ΔFosB-Überexpression die AMPA-Antworten in MSNs vom D1-Typ in NAc (Grueter et al., 2013). Diese Daten deuten auf zeitlich unterschiedliche Mechanismen hin, die eine zeitabhängige Reihe von Neuroadaptationen an Kokain darstellen könnten, die verschiedenen Aspekten der Suchtentwicklung zugrunde liegen, die noch nicht gut verstanden wurden. Auf der Verhaltensebene sind sowohl CaMKII als auch ΔFosB für die Lokomotorische Sensibilisierung gegen Kokain erforderlich (siehe oben), und beide sind für die dauerhafte Kokain-Selbstverabreichung bei Nagetieren erforderlich (Colby et al., 2003; Wang et al., 2010), was darauf hindeutet, dass die beiden Proteine ​​sowohl für kurz- als auch für langfristige Verhaltensanpassungen an die Medikamentenexposition von Bedeutung sind, wenn auch durch teilweise unterschiedliche zugrundeliegende Mechanismen. Vermutlich regulieren ΔFosB und CaMKII solche komplexen Verhaltensanpassungen durch Änderungen der NAc-Synapsenfunktion, obwohl weitere Arbeit erforderlich ist, um synaptische Phänomene direkt mit Verhaltensänderungen zu verknüpfen.

Das CaMKII-Holoenzym interagiert gleichzeitig mit einer Vielzahl von synapse-assoziierten Proteinen (Robison et al., 2005), von denen angenommen wird, dass sie ihre Ausrichtung auf die postsynaptische Dichte (PSD) regulieren, ein Phänomen, das als wichtig für die synaptische Plastizität angesehen wird. Insbesondere wurde kürzlich gezeigt, dass die Wechselwirkung von CaMKII mit der GluN2B-Untereinheit des Glutamatrezeptors vom NMDA-Typ sowohl die synaptische Plastizität als auch das Lernen reguliert (Halt et al., 2012). Während das AC3I-Peptid die autoinhibitorische Domäne von CaMKII nachahmt und somit die katalytische Aktivität von Enzymen hemmt, blockiert es auch mehrere Protein-Protein-Wechselwirkungen (Strack et al., 2000; Robison et al., 2005). Daher können die hier beschriebenen Verhaltens- und morphologischen Auswirkungen von HSV-GFP-AC3I durch eine reduzierte Phosphorylierung von CaMKII-Zielproteinen, Änderungen des CaMKII-Targetings oder eine Änderung der vorgeschlagenen strukturellen Rolle von CaMKII an Synapsen (Lisman et al., 2002).

Die Beschränkung der vorgeschlagenen ΔFosB-CaMKII-Schleife auf die NAc-Schale ist besonders hervorzuheben, da kürzlich durchgeführte Arbeiten mehrere physiologische Unterschiede zwischen der NAc-Schale und dem Kern als Reaktion auf die Kokain-Verabreichung gezeigt haben, was durch unsere unparteiischen iTRAQ-Daten (Tabelle S1) bestätigt wird . MSNs in der NAc-Schale zeigen eine über Wochen anhaltende Depression in der Zündleistung nach chronischem Kokain, während Kern-MSNs derselben Tiere eine vorübergehende (1 – 3-Tag) Steigerung der Zündkapazität aufweisen, die innerhalb der 2-Wochen wieder auf ein Basalniveau zurückkehrt (Kourrich und Thomas, 2009). Darüber hinaus werden zahlreiche synaptische Proteine ​​in der NAc-Schale differentiell reguliert vs Kern von Tieren, die chronischem Kokain ausgesetzt sind, einschließlich GluA2 (Knackstedt et al., 2010). Da chronisches Amphetamin CaMKIIα spezifisch in der NAc-Schale induziert (Loweth et al., 2010), ist es nicht verwunderlich, dass wir bei Kokain eine ähnliche Wirkung feststellen. Da ΔFosB jedoch sowohl in der NAc-Schale als auch im Kern durch chronisches Kokain induziert wird (Perrottiet al., 2008) und da wir zeigen, dass die CaMKIIα-Induktion in der Schale ΔFosB-abhängig ist, liefern unsere Ergebnisse neue Beweise für unterschiedliche Transkriptionsmechanismen am CaMKIIα-Promotor zwischen diesen beiden Subregionen, die für die selektive Induktion von CaMKIIα in der Schale verantwortlich sind.

In jüngster Zeit konzentrierten sich viele Arbeiten darauf, Unterschiede zwischen NAc-MSNs vom D1- und D2-Typ abzugrenzen. Obwohl sowohl D1- als auch D2-Rezeptoren an der lohnenden Wirkung von Kokain beteiligt sind (Selbst, 2010), Aktuelle Arbeiten zeigen, dass die optogenetische Aktivierung von MSNs vom D1-Typ die Verhaltensreaktionen auf Kokain erhöht, während die MSN-Aktivierung vom D2-Typ den gegenteiligen Effekt hat (Lobo et al., 2010). Im Einklang mit diesen Befunden sind D1-Rezeptor-Knockout-Mäuse nicht ausreichend in der Akquisition von Kokain (Caine et al., 2007), während D2-Ausschnitte dies nicht sind (Caine et al., 2002). Die Verabreichung von D1-Agonisten direkt in NAc löst kokainabhängiges Verhalten in Wiederherstellungsparadigmen aus (Selbst, 2010). Interessanterweise erfordert dieser Effekt eine D1-Rezeptor-abhängige Erhöhung der CaMKII-Aktivität in der NAc-Schale, jedoch nicht den Kern (Anderson et al., 2008), ein Ergebnis, das gut zu der hier vorgeschlagenen D1- und schalen-spezifischen ΔFosB-CaMKII-Schleife passt.

Wir haben zuvor berichtet, dass Ser27 in ΔFosB durch Caseinkinase-2 phosphoryliert werden kann (Ulery et al., 2006Wir stellen hier jedoch fest, dass CaMKII ΔFosB an dieser und an anderen Stellen mit weitaus größerer Kinetik und Stöchiometrie phosphoryliert und das höher scheinbare M replizieren kann_r beobachtet für ΔFosB (Abb. 5A) mit Kokainbelastung in vivo (Nestler, 2008). Wir wissen bereits, dass die Ser27-Phosphorylierung die ΔFosB-Stabilität und die Transkriptionsaktivität erhöht (Ulery et al., 2006; Ulery und Nestler, 2007; Ulery-Reynolds et al., 2009). Die zukünftige Arbeit wird sich nun auf die Identifizierung und die funktionellen Konsequenzen neuartiger Standorte der ΔFosB-Phosphorylierung konzentrieren, die in der vorliegenden Studie gezeigt werden.

Die hier beschriebene Feed-Forward-Schleife bietet einen plausiblen neuen Mechanismus, durch den die wiederholte Verabreichung von Kokain progressive Abnormalitäten in der NAc bewirkt. Daher kann dieser biochemische Weg ein wichtiges Ziel für zukünftige therapeutische Eingriffe bei Suchtstörungen darstellen. Da CaMKII allgegenwärtig ist und für viele neuronale Grundfunktionen und Verhaltensfunktionen benötigt wird, wurde die direkte Verwendung von CaMKII-Inhibitoren als Suchtbehandlung vermieden. Unsere Daten legen nahe, dass ein subtileres Ansprechen des Mechanismus der CaMKII-Induktion, der für einen einzelnen Zelltyp und einen Teilbereich der Belohnungsschaltung des Gehirns spezifisch ist, ein therapeutisches Ziel darstellen könnte, das die Komplikationen der systemischen CaMKII-Hemmung vermeidet.

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Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des Nationalen Instituts für Drogenmissbrauch (EJN), des NIDA-Yale Proteomics Center DA018343 (AJR und EJN) und der Hartwell Foundation (AJR) unterstützt. Die Autoren danken Gabby Rundenko für die großzügige Gabe von gereinigten ΔFosB und Roger Colbran für die großzügige Gabe von gereinigtem CaMKIIα.

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