Plus eins. 2013 Nov 25; 8 (11): e81245. doi: 10.1371 / journal.pone.0081245.
Nishijima T, Kawakami M, Kita ich.
Quelle
Labor für Verhaltensphysiologie, Graduiertenschule für menschliche Gesundheitswissenschaften, Tokyo Metropolitan University, Tokio, Japan.
Abstract
Körperliche Bewegung verbessert mehrere Aspekte der Hippocampus-Funktion. In Übereinstimmung mit der Vorstellung, dass neuronale Aktivität der Schlüssel zur Förderung neuronaler Funktionen ist, hat die bisherige Literatur durchweg gezeigt, dass akute Bewegungsausbrüche eine neuronale Aktivierung im Hippocampus hervorrufen. Wiederholte aktivierende Stimuli führen zu einer Akkumulation des Transkriptionsfaktors ΔFosB, der eine langfristige neurale Plastizität vermittelt.
In dieser Studie testeten wir die Hypothese, dass ein langfristiges freiwilliges Radlaufen die Expression von ΔFosB im Hippocampus induziert und mögliche regionenspezifische Effekte innerhalb der Hippocampus-Teilfelder entlang der dorso-ventralen Achse untersucht. Männliche C57BL / 6-Mäuse wurden für 4-Wochen mit oder ohne Laufrad untergebracht. Langzeitradfahren erhöhte die FosB / ΔFosB-Immunoreaktivität in allen gemessenen Hippocampusregionen signifikant (z. B. in den DG-, CA1- und CA3-Unterfeldern des dorsalen und ventralen Hippocampus). Die Ergebnisse bestätigten, dass das Wheel Running eine regionsspezifische Expression der FosB / ΔFosB-Immunreaktivität im Cortex induziert, was darauf hindeutet, dass der gleichmäßige Anstieg von FosB / ΔFosB im Hippocampus keine unspezifische Konsequenz des Laufens ist. Western-Blot-Daten zeigten, dass die erhöhte hippokampale FosB / ΔFosB-Immunreaktivität hauptsächlich auf erhöhte ΔFosB zurückzuführen war. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass langfristige körperliche Aktivität ein starker Auslöser für die Induktion von ΔFosB im gesamten Hippocampus ist, was erklären könnte, warum Sport sowohl dorsale als auch ventrale Hippocampus-abhängige Funktionen verbessern kann. Interessanterweise fanden wir heraus, dass die FosB / ΔFosB-Expression in der DG positiv mit der Anzahl von doppelkortin-immunoreaktiven (dh unreifen) Neuronen korreliert war.
Obwohl die Mechanismen, durch die ΔFosB die belastungsinduzierte Neurogenese vermittelt, immer noch unsicher sind, deuten diese Daten darauf hin, dass die trainingsinduzierte Neurogenese zumindest aktivitätsabhängig ist. Zusammenfassend legen unsere aktuellen Ergebnisse nahe, dass ΔFosB ein neues molekulares Zielmolekül ist, das an der Regulation der belastungsinduzierten Plastizität des Hippocampus beteiligt ist.
Einführung
Übung bietet vielfältige Vorteile auf molekulare, strukturelle und funktionelle Aspekte des Hippocampus bei Nagetieren [1,2], von denen einige durch menschliche Studien unterstützt wurden [3,4]. Die Mechanismen, die den belastungsinduzierten Veränderungen der Hippocampus-Plastizität zugrunde liegen, sind jedoch nicht ausreichend verstanden. Frühere Literatur hat konsistent gezeigt, dass Bewegung neuronale Aktivierung im Hippocampus bei Nagetieren hervorruft. Immunhistochemische Studien mit c-Fos, einem Marker für vorübergehende neuronale Aktivierung, haben gezeigt, dass sowohl erzwungenes als auch freiwilliges Laufen die c-Fos-Expression in den Untergruppen des dentalen Gyrus (DG), CA1 und CA3 des Nagetierhippocampus erhöht [5-7]. Darüber hinaus hat eine frühere Studie mit Laser-Doppler-Flowmetrie (LDF) gezeigt, dass mildes Laufband einen erhöhten regionalen zerebralen Blutfluss (rCBF), einen alternativen Marker für neuronale Aktivierung, im Caxnumx-Unterfeld bei Ratte zeigt.8]. Immunhistochemische Studien ermöglichen detaillierte regionspezifische Analysen nach Beendigung des Trainings, während LDF eine Echtzeitüberwachung von rCBF in einem lokalisierten Bereich während des Trainings ermöglicht. Trotz der Vorteile und Einschränkungen jeder Studie zeigten diese Studien in ähnlicher Weise eine Wirkung von akuten Trainingsausbrüchen auf die neuronale Aktivität des Hippocampus. Diese Ergebnisse weisen auf einen Mechanismus hin, durch den eine regelmäßige regelmäßige Bewegung die Hippocampus-Plastizität fördert, indem wiederholt neuronale Aktivierung ausgelöst wird [9].
Der Transkriptionsfaktor ΔFosB, eine verkürzte Spleiß-Isoform von FosB in voller Länge, wird durch verschiedene Arten von wiederholten Stimuli in bestimmten Hirnregionen induziert, wo er sich aufgrund seiner einzigartigen Stabilität (Halbwertszeit von Wochen) allmählich ansammelt [10-12]. Eine wachsende Zahl von Beweisen zeigt, dass erhöhte Spiegel von ΔFosB langfristige neurale und Verhaltensplastizität in Verbindung mit bestimmten Reizen vermitteln [11,13]. Zum Beispiel erhöht die chronische Verabreichung von Missbrauchsdrogen wie Kokain und Morphin gewöhnlich die ΔFosB-Expression im Nucleus accumbens, was einen der molekularen Mechanismen darstellt, die einer erhöhten Empfindlichkeit gegenüber diesen Arzneimitteln zugrunde liegen [11,14,15]. Sähnlich zu anderen Belohnungsreizen, einschließlich fettreicher Diät und sexueller Erfahrung [16,17], lDas freiwillige Laufradfahren auf dem Laufrad erhöhte auch die FosB / ΔFosB-Immunreaktivität im Nucleus accumbens der Ratte, was nahe legt, dass das willkürliche Laufen eine natürliche Belohnung für Nagetiere ist [18,19]. Nach unserem besten Wissen wurde jedoch in keiner Literatur untersucht, ob eine wiederholte Exposition gegenüber körperlicher Bewegung die Expression von ΔFosB im Hippocampus induziert. Da Bewegung eine neuronale Aktivierung im Hippocampus auslöst, stellten wir die Hypothese auf, dass ein langfristiges freiwilliges Radlaufen auch eine ΔFosB-Expression im Hippocampus induzieren würde. Während die genauen Mechanismen, nach denen ΔFosB die Plastizität des Hippocampus reguliert, ungewiss bleiben, haben Studien gezeigt, dass Mäuse, denen die Apoptose fehlt fosB Gen zeigt eingeschränkte hippocampale Neurogenese und erhöhtes depressionsähnliches Verhalten20,21]. ichEs ist bekannt, dass Sport die Neurogenese fördert und antidepressive Eigenschaften hat [22-25]. ichWenn unsere Hypothese korrekt ist, wäre ΔFosB ein neues potenzielles molekulares Ziel, das eine belastungsinduzierte Hippocampus-Plastizität vermittelt.
Der Hippocampus hat einen anatomischen und funktionellen Gradienten entlang seiner longitudinalen (dorso-ventralen) Achse [26]. Der dorsale Hippocampus spielt eine Schlüsselrolle im räumlichen Lernen und Gedächtnis [27,28], während der ventrale Hippocampus vorzugsweise an der Regulation des emotionalen Verhaltens beteiligt ist [29,30]. Darüber hinaus haben Studien gezeigt, dass physiologische Stimuli verschiedene Muster der c-Fos-Expression in den dorsalen und ventralen Abschnitten des Hippocampus induzieren [4].31-33]. Weil Übung sowohl dorsal verbessert34-37] und ventrale Hippocampus-abhängige Funktionen [24,25,38], ist es wichtig zu untersuchen, ob das langfristige willkürliche Laufen eine regionspezifische Expression von ΔFosB im Hippocampus verursacht.
Die primäre Hypothese dieser Studie war, dass ein langfristiger freiwilliger Radlauf eine ΔFosB-Expression im Hippocampus der Maus induzieren würde. Diese Hypothese wurde mittels FosB / ΔFosB-Immunhistochemie in den dorsalen und ventralen Hippocampus-Unterfeldern DG, CA1 und CA3 untersucht, wobei besonderes Augenmerk auf die Identifizierung der regionsspezifischen Induktion gelegt wurde. Die Ergebnisse wurden durch Western Blotting bestätigt, mit dem die Isoform von fosB Genprodukte, die im Hippocampus induziert werden. Wir untersuchten auch den Kortex auf regionspezifische FosB / ΔFosB-Induktion, um die Möglichkeit auszuschließen, dass Langzeiterfahrung unspezifisch die FosB / ΔFosB-Immunreaktivität im Gehirn erhöht. Schließlich wurde die Korrelation zwischen FosB / ΔFosB-Expression und Neurogenese als erster Schritt untersucht, um die funktionellen Implikationen der belastungsinduzierten ΔFosB-Induktion in der Regulation der Hippocampus-Plastizität zu untersuchen.
Materialen und Methoden
1: Tiere und Ethik-Erklärung
Zwanzig männliche C57BL / 6-Mäuse (8-Wochen alt) wurden von einem kommerziellen Züchter (SLC, Shizuoka, Japan) gekauft. Zehn Mäuse wurden für das Experiment 1 und die anderen zehn für das Experiment 2 verwendet. Die Mäuse wurden unter kontrollierten Temperaturbedingungen (22-24 ° C) und Licht (12 / 12-h Hell / Dunkel-Zyklus, Licht an 0500) gehalten und wurden mit Nahrung und Wasser versorgt ad libitum. Alle experimentellen Verfahren wurden vom Animal Experimental Ethics Committee der Tokyo Metropolitan University genehmigt.
In jedem Experiment wurden die Mäuse bei der Ankunft zufällig einer Kontrollgruppe (Kontrolle, n = 5) oder einer laufenden Gruppe (Runner, n = 5) zugewiesen. Während der ersten Woche wurden alle Mäuse in Standard-Plastikkäfigen in Gruppen (5-Mäuse / Käfig) zur anfänglichen Akklimatisierung gehalten. Dann wurden Runner-Mäuse in einen Käfig mit einem Laufrad (ENV-046, Med Associate Inc., Georgia, VT, USA) überführt. Es ist bekannt, dass soziale Isolation die belastungsinduzierte Neurogenese im Hippocampus unterdrückt.39], Runner Mäuse wurden als eine Gruppe (5 Mäuse / Käfig) für eine zusätzliche 4 Wochen untergebracht. Die Anzahl der Radumdrehungen wurde jeden Morgen aufgezeichnet und das Körpergewicht (g) wurde wöchentlich gemessen.
2: Experiment 1. Immunhistochemische Untersuchung der FosB / ΔFosB Expression und der hippokampalen Neurogenese
2.1: Perfusion und Gewebeverarbeitung
Am Morgen (0900-1100) nach dem letzten Tag der Laufzeit wurden die Mäuse mit Pentobarbital-Natrium tief anästhesiert und mit kalter Kochsalzlösung transkardial perfundiert. Das Gehirn wurde schnell entfernt und in 4% Paraformaldehyd in 0.1 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7.4) über Nacht nachfixiert. Das Gehirn wurde dann in 30% Saccharose in PBS kryogeschützt und bis zur weiteren Verarbeitung eingefroren. Koronare Gehirnschnitte (40 & mgr; m) einer Hemisphäre wurden unter Verwendung eines Gefriermikrotoms erhalten und in PBS mit 0.01% Natriumazid gesammelt.
2.2: Immunhistochemie
Eine Reihe von Sektionen wurde zufällig für die FosB / AFosB-Immunfärbung ausgewählt. Eine benachbarte Serie wurde für die Markierung von Doublecortin (DCX) verwendet, einem Marker für unreife Neuronen, der für die Beurteilung der Neurogenese validiert wurde [40,41]. Nach dem Quenchen der endogenen Peroxidaseaktivität mit 1% H2O2 in PBS wurden frei schwimmende Schnitte mit Blockierungslösung, die 10% normales Pferdeserum in PBS enthielt, für 2 h vorinkubiert. Nach dem Spülen in PBS wurden die Schnitte mit polyklonalem Kaninchen-Pan-FosB-Antikörper (1: 1000, sc-48, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), verdünnt in PBS mit 0.5% Triton X-100 und 0.5% BSA (PBST) inkubiert (BSA) für 24 h bei 4 ° C. Eine weitere Reihe von Schnitten wurde mit polyklonalem Ziegen-anti-DCX-Antikörper (1: 500, sc-8066, Santa Cruz) in PBST-BSA für 48h bei 4ºC inkubiert. Die Schnitte wurden weiter mit einem geeigneten biotinylierten sekundären Antikörper (Anti-Kaninchen-IgG, 1: 1000, AP182B; Anti-Ziegen-IgG, 1: 1000, AP180B, beide Antikörper von Merck Millipore, Billerica, MA, USA) in PBST-BSA inkubiert für 2 h bei Raumtemperatur. Die Schnitte wurden dann mit Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex (Vectastain-ABC-Peroxidase-Kit, Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA) für 90min gemäß den Anweisungen des Herstellers behandelt. Die Antigene wurden schließlich mit 0.02% 3,3-Diaminobenzidin (DAB) in 0.1 M Tris-HCl (pH 7.6) sichtbar gemacht, das 0.01% H enthielt2O2. Für die FosB / AFosB-Immunfärbung wurde die Reaktion mit Nickelammoniumsulfat verstärkt. Für die DCX-Färbung wurden Zellkerne mit Nissl-Färbung gegengefärbt. Die Schnitte wurden auf mit Gelatine beschichteten Objektträgern angebracht und Deckgläser wurden darauf gelegt.
2.3: Quantifizierung der FosB / & Dgr; FosB-Immunreaktivität unter Verwendung von Bildschwellenbildung
Der Pan-FosB-Antikörper, der in dieser Studie verwendet wurde, war gegen eine innere Region gerichtet, die von FosB und ΔFosB N-terminaler Region geteilt wird, so dass zwischen den beiden Isoformen nicht unterschieden werden kann. Daher wurden die immunogefärbten Strukturen als FosB / & Dgr; FosB-immunoreaktive (FosB / & Dgr; FosB-ir) -Kerne beschrieben. Für eine unvoreingenommene Blindquantifizierung wurden die Objektträger vor der Analyse kodiert. Der Mäusegehirnatlas [42] wurde verwendet, um den Ort der folgenden Regionen von Interesse (ROIs) zu identifizieren: Körnerzellschicht (GCL) von DG (3-Abschnitten), Pyramidenzellenschicht von CA1 (3-Abschnitte) und CA3 (2-3-Abschnitte) im dorsalen Hippocampus (geschlossen bis -2.2 mm vom Bregma); DG (2-Schnitte), CA1 (2-Schnitte) und CA3 (2-Schnitte) im ventralen Hippocampus (geschlossen bis -3.4 mm vom Bregma) (Figure 4, links). Die kaudalen Abschnitte enthalten sowohl den dorsalen als auch den ventralen Teil des Hippocampus, aber der ventrale Teil wurde gezielt. In der DG wurden suprapyramidale (DGsp) und infrapyramidale (DGip) Schaufeln separat analysiert. Motorische Kortex (2-3 Abschnitte, geschlossen bis-0.6 mm von der Bregma), somatosensorischen Barrel Kortex (2-3 Abschnitte, geschlossen bis-0.6 mm von der Bregma), visuellen Kortex (3 Abschnitte, geschlossen zu -2.9 mm von der bregma), der auditorische Kortex (3-Schnitte, geschlossen bis -2.9 mm vom Bregma) und der Riechkolben (3-Schnitte, geschlossen bis + 4.3 mm vom Bregma) wurden ebenfalls analysiert (Figure 6, links).
Digitale Bilder (2070 × 1548-Pixel) jeder ROI wurden unter Verwendung eines optischen Mikroskops (BX-51, Olympus, Tokio, Japan), das mit einer CCD-Kamera (DP-73, Olympus) und einer Bildgebungssoftware (cellSens, Olympus) ausgestattet war, aufgenommen Objektive Linsenvergrößerung war 10 × für Hippocampus-ROIs und 4 × für kortikale ROIs. Um eine mäßige bis starke FosB / ΔFosB-Immunreaktivität zu identifizieren (Abbildung 1D-G) unter Verwendung mehrerer Abschnitte im Voraus wurden sowohl die Bildaufnahmeeinstellungen (Lichtintensität, Größe der Feldblende, Belichtungszeit und Weißabgleich) als auch die Schwellenwerte für jede der RGB-Komponenten für hippocampale und kortikale ROIs optimiert. Die folgende Analyse wurde dann unter den optimierten Bedingungen (1) durchgeführt. ROIs wurden durch ein unregelmäßig geformtes Polygon (Abbildung 1A, B) (2). Das Bild wurde mit einem Schwellenwert versehen, der die FosB / ΔFosB-ir-Kerne in eine rote Farbe umwandelte (Abbildung 1C-G) (3). Der% ROI wurde dann automatisch wie folgt berechnet:% ROI = (umgewandelter Bereich (in rot) / gesamter ROI-Bereich) × 100.
Um diese Bild-Schwellenwertanalyse zu validieren, wurden 20-Regionen zufällig aus verschiedenen Hirnregionen mit unterschiedlichen Regionengrößen ausgewählt. Zusätzlich zu der Bildschwellenwertquantifizierung wurde die Anzahl der FosB / ΔFosB-ir-Kerne innerhalb der ausgewählten Bereiche manuell gezählt, und die Dichte der FosB / ΔFosB-ir-Kerne wurde durch Dividieren der Anzahl der FosB / ΔFosB-ir-Kerne durch die gemessenen erhalten Fläche (mm2).
2.4: Quantifizierung von DCX-ir unreifen Neuronen im Gyrus dentatus
Die unreifen DCX-ir-Neuronen in der DG von Runner-Mäusen waren reichlich vorhanden und überlappten sich, was es schwierig macht, die diskrete Anzahl von DCX-ir-Soma unter Verwendung eines optischen Mikroskops genau zu zählen. In einer früheren Studie zeigte die Sholl-Analyse für die morphologische Untersuchung jedoch, dass jedes DCX-ir-Neuron durchschnittlich einen einzelnen Dendriten aufweist, wenn es innerhalb von 40 & mgr; m des Soma gemessen wird.43]. Daher wurde die folgende ursprüngliche Analyse entwickelt, um eine regionspezifische Quantifizierung von DCX-ir-Neuronen zu ermöglichen.
-
(1) Ein Bild der GCL wurde auf einem Computerbildschirm unter Verwendung einer Bildgebungssoftware und einer 40 × -Objektivlinse (2) projiziert. Auf dem Livebild wurde ein Liniensegment (150 ± 0.1 & mgr; m) entlang der Mitte des GCL gezeichnet (Figure 2) (3). Durch Ändern der Fokustiefe wurde die Anzahl der Kreuzungen von DCX-ir-Dendriten gezählt (4). Die ROIs (dorsale DGsp, dDGsp; dorsale DGip, dDGip; ventrale DGsp, vDGsp; ventrale DGip, vDGip) entsprachen den Regionen, in denen die FosB / ΔFosB-Immunoreaktivität analysiert wurde (5). In jedem ROI wurden 2-3-Liniensegmente pro Abschnitt gezeichnet und die Anzahl der Kreuzungen wurde über 2-3-Abschnitte pro Maus gemittelt. Da die Dicke der GCL ungefähr 60-80 & mgr; m beträgt, sollte die Anzahl der Kreuzungen die Anzahl der DCX-ir-Neuronen innerhalb der analysierten eingeschränkten Region widerspiegeln.
Ein repräsentatives Bild von DCX-ir unreifen Neuronen und ein Liniensegment (150 ± 0.1 & mgr; m) überlagert zum Zählen der Anzahl von Kreuzungen mit DCX-ir-Dendriten.
3. Experiment 2. Identifizierung der durch Radlauf induzierten FosB / ΔFosB-Isoform
3.1: Perfusion und Gewebeverarbeitung
Eine zusätzliche Kohorte von Mäusen wurde wie oben in Experiment 1 behandelt. Nach 4-Wochen der laufenden Intervention wurden die Mäuse transkardial mit kalter Kochsalzlösung unter Vollnarkose perfundiert. Der Hippocampus wurde schnell seziert und mit flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 ° C gelagert. Die Hippocampi jeder Maus wurden in RIPA-Puffer (150 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl, pH 7.6, 1% NP-40, 1% Natriumdesoxycholat, 0.1% SDS, # 8990, Thermo Scientific, IL, USA), die Protease enthielten, homogenisiert Inhibitoren (cOmplete Mini, Roche, Manheim, Deutschland). Die Lysate wurden für 15 min bei 5000 rpm bei 4 ° C zentrifugiert und die Überstände wurden gesammelt. Die Proteinkonzentrationen wurden mit einem BCA-Protein-Assay-Kit (# 23227, Thermo Scientific, IL, USA) gemessen.
3.2: Western Blotting
Gleiche Proteinmengen (30 & mgr; g / Spur) wurden einer Elektrophorese auf einem 10% -Polyacrylamidgel unterzogen und dann auf eine PVDF-Membran (Immun-Blot, 0.2 & mgr; m, Bio-Rad, MD, USA) übertragen. Unspezifische Bindung wurde durch Vorinkubieren der Membran für 1h in TBST (0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.1% Tween-20), enthaltend 3% BSA, blockiert. Die Membran wurde mit dem Pan-FosB-Antikörper (1: 1000) inkubiert, der oben für die Immunhistochemie verwendet wurde, gelöst in TBST, enthaltend 3% BSA. Nach dem Waschen mit TBST wurde die Membran mit HRP-konjugiertem Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper (1: 5000 in TBST, NA934, GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) für 1h bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Waschen mit TBST wurden Proteinbanden durch Inkubation mit Enhanced Chemiluminescence (Western Lightning Plus-ECL, PerkinElmer, MA, USA) sichtbar gemacht und unter Verwendung eines Image Quant LAS 4000 mini (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) gewonnen. Die Membran wurde dann erneut mit Anti-Glyceraldehyd-3-Phosphatdehydrogenase (GAPDH) -Antikörper (# 2275, 1: 5000 in TBS-T, Trevigen, MD, USA) als Ladungskontrolle erneut untersucht. Die optische Dichte der Proteinbanden wurde unter Verwendung von Image-J quantifiziert und auf das Niveau von GAPDH normalisiert.
4: Statistische Analyse
Veränderungen im Mauskörpergewicht wurden durch zweifache ANOVA mit wiederholter Messung (Gruppe × Zeit) analysiert. Ein ungepaarter t-Test wurde verwendet, um statistische Unterschiede zwischen Gruppen (Kontrolle vs. Runner) zu bestimmen. Die Korrelationsanalyse nach Pearson wurde verwendet, um die FosB / ΔFosB-Immunoreaktivitätsanalyse (manuelle Zählung vs. Bildschwellenbildung) zu validieren und um die Assoziation zwischen der Expression von FosB / ΔFosB und der Anzahl von DCX-Kreuzungen in der DG zu untersuchen. Die Daten wurden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Der Schwellenwert für die statistische Signifikanz wurde auf P <0.05.
Ergebnisse
1: Körpergewicht und Laufstrecke in den Experimenten 1 und 2
Änderungen des Körpergewichts sowohl der Kontroll- als auch der Runner-Mäuse in den Experimenten 1 und 2 werden gesammelt und in gezeigt Figure 3. Zweiweg-ANOVA mit wiederholter Messung zeigte eine signifikante Interaktion (Gruppen × Zeit, F(4, 72) = 13.6, P <0.001) und Haupteffekt der Gruppe F(1, 18) = 6.07, P <0.05), was auf ein signifikant niedrigeres Körpergewicht bei Runner-Mäusen hinweist. Die Laufstrecke pro Käfig ist in angegeben Tabelle 1. Obwohl die genaue Laufdistanz jeder Maus ungewiss war, weil die Mäuse zusammen untergebracht waren, bestätigte die regelmäßige Beobachtung, dass alle Mäuse häufig Laufräder durchführten. Die Runner-Mäuse in Experiment 2 liefen länger als die in Experiment 1, aber die mittlere Laufdistanz (m / Tag / Käfig) war während jedes Experiments konsistent.
2: Validierung der FosB / ΔFosB-Immunreaktivitätsquantifizierung unter Verwendung von Bildschwellenbildung
Es gab eine signifikante Korrelation zwischen FosB / ΔFosB-ir-Bereich, erhalten durch Bildschwellenbildung, und Dichte von FosB / ΔFosB-ir-Kernen, erhalten durch manuelles Zählen (r = 0.941, P <00001, Figure 4).
3: FosB / ΔFosB-Immunreaktivität im Hippocampus
Repräsentative Bilder der FosB / ΔFosB - Immunfärbung in den dorsalen und ventralen Hippocampus - Unterfeldern wurden gezeigt Figure 5. In allen analysierten ROIs wurde die FosB / ΔFosB-Immunreaktivität in Runner-Mäusen (Figure 5, rechts) war qualitativ höher als in Kontrollmäusen (Figure 5, Center). In Runner-Mäusen zeigte die quantitative Analyse einen signifikanten Anstieg des FosB / ΔFosB-ir-Bereichs in der dorsalen Region (DGsp: P <0.01; DGip: P <0.01; CA1: P <0.05; CA3: P <0.05) und die ventralen Hippocampus-Teilfelder (DGsp: P <0.01; DGip: P <0.05; CA1: P <0.05; CA3: P <0.05; Figure 6).
4: FosB / ΔFosB-Immunreaktivität im Kortex
Repräsentative Bilder der FosB / ΔFosB Immunfärbung in den kortikalen ROIs sind in gezeigt Figure 7. Die quantitative Analyse ergab regionalabhängige Veränderungen der FosB / ΔFosB-Immunoreaktivität bei Langzeitbetrieb (Figure 8). In Runner-Mäusen war der FosB / ΔFosB-ir-Bereich im motorischen Kortex signifikant höher (P <0.05) und der somatosensorische Barrelcortex (P <0.05), jedoch nicht im visuellen Kortex (P = 0.662) oder der Riechkolben (P = 0.523). Im auditorischen Kortex tendierte der FosB / ΔFosB-ir-Bereich zu einer Zunahme von Runner-Mäusen (P = 0.105).
5: Neurogenese
Repräsentative Bilder von DCX Immunfärbung sind in gezeigt Figure 9. Im dorsalen Hippocampus, DCX-Immunoreaktivität in Runner-Mäusen (Figure 9, rechts) war qualitativ höher als bei Kontrollmäusen (Figure 9, links). Verglichen mit dem dorsalen Hippocampus war die DCX-Immunoreaktivität im ventralen Hippocampus sowohl bei Kontroll- als auch bei Runner-Mäusen schwächer. Bei Runner-Mäusen war die Anzahl der Kreuzungen im dDGsp signifikant höher (P <0.01) und dDGip (P <0.01; Figure 10). Im ventralen Hippocampus war die Anzahl der Kreuzungen in Runner-Mäusen tendenziell erhöht, aber es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen (vDGsp, P = 0.101; vDGip, P = 0.257; Figure 10).
6: Korrelation zwischen FosB / ΔFosB-Expression und Neurogenese
Eine Korrelationsanalyse wurde zwischen dem FosB / ΔFosB-ir-Bereich und der Anzahl der DCX-Übergänge (Figure 11). Da jeder Datensatz (z. B. dorsale DGsp in Kontrollmäusen) nur aus 5-Paaren besteht, wurde die Analyse zuerst mit allen 40-Paaren durchgeführt. Interessanterweise bestand eine signifikante Korrelation zwischen dem FosB / ΔFosB-ir-Bereich und der Anzahl der DCX-Kreuzungen (r = 0.885, P <0.0001). Darüber hinaus wurde auch bei der dorsalen DG eine signifikante Korrelation festgestellt (r = 0.762, P <0.05) und die ventrale DG (r = 0.816, P <0.01) wurden separat analysiert.
7: Identifizierung der FosB / & Dgr; FosB-Isoform, induziert durch Langzeit-Lauf
Schließlich, um die Isoform von zu identifizieren fosB Genprodukte, induziert im Hippocampus als Antwort auf Langzeit-Lauf, wurden die Hippocampi aus einer zusätzlichen Kohorte von Mäusen einem Western-Blot unter Verwendung des gleichen Pan-FosB-Antikörpers unterzogen. Mehrere Banden von 35-37 kDa, die modifizierte Isoformen von ΔFosB darstellen [44], waren signifikant erhöht in Runner versus Control Mäusen (Figure 12, P <0.01). Andererseits war die 48 kDa FosB-Isoform in beiden Gruppen nicht nachweisbar. Eine andere Bande, die oberhalb von 25 kDa schwach sichtbar ist, repräsentiert wahrscheinlich die Δ2ΔFosB-Isoform (27 kDa). Es gab zwei andere Banden bei über 50 kDa und 37 kDa, die höchstwahrscheinlich auf unspezifische Bindung zurückzuführen waren. Bei der Quantifizierung wurden keine Unterschiede in diesen Nicht-ΔFosB-Banden zwischen Gruppen gefunden (Daten nicht gezeigt).
Diskussion
Zusammengefasst führte die vorliegende Studie zuerst eine immunhistochemische Analyse zur Untersuchung von 1 durch, ob eine langfristige freiwillige Radbewegung eine FosB / & Dgr; FosB-Expression im Hippocampus induziert; und 2), ob eine regionspezifische Antwort entlang ihrer dorso-ventralen Achse existiert.
Vier Wochen freiwilligen Radlaufs induzierten einen signifikanten Anstieg der FosB / & Dgr; FosB-Immunreaktivität in allen analysierten Hippocampusregionen (dh den DG-, CA1- und CA3-Unterfeldern sowohl des dorsalen als auch des ventralen Teils des Hippocampus). Wir bestätigten, dass die 35-37kDa & Dgr; FosB-Isoform die Hauptform war fosB Genprodukt, das sich als Reaktion auf den langfristigen Lauf ansammelt. Diese Ergebnisse unterstützen eindeutig die Hypothese, dass langfristige regelmäßige Bewegung ein potenter Auslöser für die Induktion von ΔFosB im gesamten Hippocampus ist und dass seine Induktion ein neuer molekularer Mechanismus sein könnte, durch den Bewegung verschiedene Arten dorsaler und / oder ventraler Hippocampus-abhängiger Funktionen beeinflusst.
1: Validierung und Limitierung der Quantifizierung der FosB / ΔFosB-Immunreaktivität durch Bild-Thresholding
Eine Bild-Thresholding-Technik, die weit verbreitet in immunhistochemischen Studien zur Zählung der Anzahl von Zielzellen und zur Bewertung der Zellmorphologie verwendet wird, wurde in dieser Studie für die regionsspezifische Quantifizierung der FosB / ΔFosB-Immunreaktivität angenommen [15,45,46]. Es wurde eine signifikante Korrelation zwischen den Spiegeln der FosB / ΔFosB-Immunoreaktivität, quantifiziert durch Bild-Thresholding und durch manuelle Zählung, nachgewiesen (Figure 4). Da jedoch Dichte und Überlappung das Zählen der Anzahl von FosB / ΔFosB-ir-Kernen in hochdichten Bereichen verhinderten, impliziert die nachgewiesene Korrelation nur dann die Genauigkeit des Bildschwellenwertverfahrens, wenn die FosB / ΔFosB-ir-Bereiche <~ 40% des gesamten ROI ausmachen Bereich. Daher ist eine sorgfältige Interpretation für FosB / ΔFosB-ir-Bereiche> 40% des gesamten ROI-Bereichs erforderlich.
Insbesondere in der DG von Runner-Mäusen (Figure 4), FosB / ΔFosB-Expression wurde stark durch Laufrad induziert und die meisten der FosB / ΔFosB-ir-Kerne überlappten. In diesen Bereichen führt eine erhöhte Induktion der FosB / ΔFosB-Expression zu einer größeren Unterschätzung des Expressionsniveaus, unabhängig von der verwendeten Quantifizierungsmethode (Bild-Thresholding oder manuelles Zählen). Trotz des Risikos der Unterschätzung ist es wichtig anzumerken, dass die vorliegende Studie in der DG von Runner-Mäusen erfolgreich einen signifikanten Anstieg des FosB / ΔFosB-ir-Bereichs zeigte. Dies deutet darauf hin, dass die methodischen Einschränkungen unsere Ergebnisse nicht beeinträchtigen. Stattdessen erhöht die potentielle Unterschätzung die Zuverlässigkeit des Befundes, dass Langzeitreisen die FosB / ΔFosB-Immunoreaktivität im Hippocampus erhöht.
2: Gleichmäßige Induktion von ΔFosB im Hippocampus durch Langzeitlauf
Der Hippocampus hat anatomische und funktionelle Gradienten entlang seiner Längsachse [26], so wurde für die vorliegende Studie die FosB / ΔFosB-Immunoreaktivität in den dorsalen und ventralen Teilen des Hippocampus getrennt analysiert. Die Daten zeigten, dass die langfristige FosB / ΔFosB-Expression in allen gemessenen hippocampalen ROIs gleichmäßig erhöht war. Diese einheitliche Induktion der FosB / & Dgr; FosB-Immunoreaktivität könnte unspezifisch durch systemische metabolische Veränderungen verursacht werden, die mit einem Langzeitlauf einhergehen. Es ist jedoch wichtig anzumerken, dass es im Kortex regionsspezifische Erhöhungen der FosB / ΔFosB-Immunoreaktivität gab. Dieses Ergebnis wird durch neuere Befunde gestützt, die zeigen, dass ein akuter Lauf von Laufbändern einen erhöhten regionalen zerebralen Blutfluss im Hippocampus, aber nicht im Riechkolben, aufwies.8]. Darüber hinaus haben Rhodes et al. (2003) demonstrierten, dass 7-Tage des freiwilligen Radlaufs die c-Fos-Expression im DG und CA2 / 3 des Hippocampus induzierten (CA1 wurde nicht gemessen) und im sensorischen Kortex, nicht jedoch im visuellen Kortex47]. Zusammenfassend legen diese Studien nahe, dass die einheitliche Induktion der FosB / ΔFosB-Expression im Hippocampus keine unspezifische Folge des Langzeitlaufs ist. Interessanterweise haben Hawley et al. kürzlich berichtet, dass chronisch unvorhersehbare Stress erhöht FosB / ΔFosB Expression in der dorsalen, aber nicht in der ventralen, DG des Rattenhippocampus [48]. Mit weiteren Untersuchungen werden die unterschiedlichen Muster der FosB / ΔFosB-Induktion, wie sie durch Training oder Stress hervorgerufen werden, weitere Einblicke in stimulusabhängige Auswirkungen auf den Hippocampus liefern.
Der in dieser Studie verwendete primäre Pan-FosB-Antikörper erkennt bekanntermaßen alle Isoformen von FosB-Proteinen. Nach Western-Blotting-Analyse fanden wir, dass die einzigen Isoformen, die im Hippocampus nach längerem Lauf anstiegen, die modifizierten Isoformen von ΔFosB (35-37 kDa) waren, den einzigen stabilen Isoformen unter den Proteinen der Fos-Familie [11]. Dieser Befund stimmt mit früheren Arbeiten überein, die Pan-Fos-Antikörper verwenden, um zu zeigen, dass 35-37 kDa & Dgr; FosB das vorherrschende Protein der Fos-Familie ist, das durch chronischen Stress im frontalen Kortex induziert wird [44]. Daher spiegelt der Anstieg der hippocampalen FosB / ΔFosB-Immunoreaktivität, der hier durch Langzeitlauf induziert wird, höchstwahrscheinlich das Niveau von ΔFosB wider.
Über regionalspezifische Effekte von Bewegung auf molekulare und strukturelle Aspekte des Hippocampus ist weniger bekannt. Zahlreiche Verhaltensstudien zeigen jedoch ein großes Potenzial für belastungsinduzierte Verbesserungen sowohl der dorsalen als auch der ventralen Hippocampusfunktionen. Übung wurde gezeigt, um räumliches Lernen und Gedächtnis zu verbessern [34-38] und die räumliche und kontextuelle Verarbeitung hängt hauptsächlich vom dorsalen Hippocampus ab [27,28]. Im Gegensatz dazu ist bekannt, dass Sport auch anxiolytische und antidepressive Eigenschaften besitzt [24,25,38] und diese emotionalen Reaktionen werden hauptsächlich vom ventralen Hippocampus reguliert [29,30]. Die in dieser Studie beobachtete gleichmäßige Induktion von ΔFosB im Langzeitverlauf lässt darauf schließen, dass im gesamten Hippocampus eine Form von neuroplastischen Veränderungen aufgetreten ist. Dies würde erklären, warum Bewegung sowohl dorsale als auch ventrale Hippocampus-abhängige Funktionen beeinflussen kann.
3: Regionspezifische Analyse der trainingsinduzierten Neurogenese
Eine funktionelle Dissoziation der Neurogenese zwischen dorsalem und ventralem Hippocampus erfährt ebenfalls zunehmende Aufmerksamkeit [49]. In dieser Studie, unter Ausnutzung der morphologischen Eigenschaften von DCX-ir unreifen Neuronen [43], zählten wir die Anzahl der Schnittpunkte zwischen DCX-ir-Dendriten und einem Liniensegment entlang der Mitte der GCL. Diese Messung lieferte nicht die Gesamtzahl an DCX-ir-Neuronen in der DG, ermöglichte jedoch eine für die Durchführung einer Korrelationsanalyse mit FosB / ΔFosB-Expressionsdaten erforderliche bereichsspezifische Quantifizierung (siehe unten). Nach längerem Lauf nahm die Anzahl der DCX-ir-Neuronen im dorsalen, nicht aber im ventralen DG signifikant zu. Dies deutet darauf hin, dass Bewegung die Neurogenese im dorsalen im Vergleich zum ventralen Teil des DG stärker stimulieren könnte. Frühere Studien haben jedoch widersprüchliche Ergebnisse berichtet, bei denen das Radlaufen die Neurogenese sowohl in der dorsalen als auch in der ventralen DG erhöhte [50,51]. In der vorliegenden Studie tendierte die Anzahl der DCX-ir-Kreuzungen in der ventralen DG dazu, mit dem Laufen zuzunehmen, obwohl die kleine Probengröße (5-Mäuse pro Gruppe) die Fähigkeit zum Nachweis eines statistisch signifikanten Unterschieds zwischen Gruppen begrenzt haben könnte. Daher ist es wahrscheinlich verfrüht, die Möglichkeit auszuschließen, dass das willkürliche Radlaufen die ventrale hippocampale Neurogenese stimulieren kann. Weitere detaillierte Studien sind notwendig, um die Regionsspezifität der trainingsinduzierten Neurogenese hinsichtlich ihres mehrstufigen Prozesses (Zellproliferation, Differenzierung, Migration und Überleben) zu verstehen.
4: Funktionelle Implikationen der belastungsinduzierten ΔFosB-Induktion zur Regulation der Hippocampus-Plastizität
Als ersten Schritt zum Erkennen der funktionellen Implikationen der durch Sport induzierten ΔFosB-Induktion im Hippocampus untersuchten wir die Beziehung der FosB / ΔFosB-Immunoreaktivität zu DCX-ir-Kreuzungen sowohl im dorsalen als auch im ventralen DG und fanden eine signifikante, positive Korrelation zwischen die zwei Variablen. Obwohl die genauen Mechanismen, durch die ΔFosB die belastungsinduzierte Neurogenese reguliert, unsicher bleiben, hat eine neuere Studie gezeigt, dass fosB-Null-Mäuse, denen FosB, ΔFosB und Δ2ΔFosB fehlen (alle fosB Produkte) zeigten Defizite in der basalen hippokampalen Neurogenese, einschließlich verminderter Proliferation von neuronalen Vorläuferzellen, erhöhter ektopischer Migration neugeborener Neuronen und abnormaler DG-Strukturen [20]. Diese Änderungen wurden jedoch nicht beobachtet fosB(d / d) Mäuse, denen FosB fehlt, aber nicht ΔFosB / Δ2ΔFosB. Interessanterweise, in fosB-Null-Mäuse, Expression von einigen Neurogenese-verwandten Genen, einschließlich Vgf (VGF Nervenwachstumsfaktor induzierbar) und Mädel (Galanin Prepropeptid) wurden herunterreguliert [20]. Da VGF und GAL sekretorische Moleküle sind, ist ein Vorschlag, der vielversprechend ist, der Ansicht, dass Neuronen, die ΔFosB exprimieren, die Neurogenese durch autokrine / parakrine Aktivität regulieren können [20].
Zusätzlich sollte angemerkt werden, dass die Region, in der ΔFosB durch Laufen induziert wird, sich räumlich mit der Region überlappt, in der die neurogene Aktivität hoch ist. Dieser Befund legt nahe, dass die trainingsinduzierte Neurogenese minimal aktivitätsabhängig ist. Neuronale Aktivierung ist der Schlüssel zur Aufrechterhaltung und Verbesserung der Funktion des zentralen Nervensystems [9], durch Mechanismen einschließlich der Expression und Freisetzung von Gehirn-abgeleiteten neurotrophen Faktor (BDNF)52,53], Aufnahme von Serum-insulinähnlichem Wachstumsfaktor-1 (IGF-1) durch die Blut-Hirn-Schranke54,55], Unterdrückung der Apoptose [56] und die Regulation der mitochondrialen Motilität [57]. Daher legt die vorliegende Studie nahe, dass Langzeit-Training wiederholte neuronale Aktivierung ausgelöst, offensichtlich in der erhöhten ΔFosB-Expression, die zur Verbesserung der Hippocampus Plastizität, möglicherweise durch diese mehrere Mechanismen oben beschriebenen beiträgt.
Die vorliegende Studie untersuchte nur die belastungsinduzierte Neurogenese und ihre Assoziation mit der FosB / ΔFosB-Expression in der DG. Die FosB / ΔFosB-Immunoreaktivität wurde jedoch auch in den CA1- und CA3-Teilfeldern induziert. Während weitere Studien erforderlich sind, um ein besseres Verständnis für die funktionelle Rolle der belastungsinduzierten ΔFosB-Expression in diesen Teilbereichen zu erlangen, bietet die bisherige Literatur eine vielversprechende Möglichkeit. Guanet al. (2011) demonstrierte, dass spezifische Ablation der Cyclin-abhängigen Kinase 5 (Cdk5) in den pyramidenförmigen CA1- oder CA3-Neuronen die Gedächtniskonsolidierung bzw. -wiederherstellung beeinträchtigte [58]. Interessanterweise ist Cdk5 das Downstream-Ziel von ΔFosB [59] und ist an der Regulierung der synaptischen Plastizität beteiligt [60]. Daher könnte die durch körperliche Betätigung induzierte ΔFosB-Expression bei der Regulierung der synaptischen Plastizität durch Cdk5-Aktivierung in den CA1- und CA3-Unterfeldern eine Rolle spielen.
Fazit
Während akute Sportübungen die Expression von frühen Genproteinen im Hippocampus induzieren, liefert die vorliegende Studie den ersten Beweis dafür, dass langfristige regelmäßige Bewegung die Expression von ΔFosB im gesamten Hippocampus signifikant induziert. ThDie einheitliche Induktion von ΔFosB unterstützt das aktuelle Verständnis, dass Bewegung eine effektive nicht-pharmakologische Intervention ist, die mehrere hippocampale Funktionen verbessern kann. Zusammen mit der signifikanten Korrelation zwischen FosB / ΔFosB-Expression und Neurogenese sind diese Daten provokativ und weisen auf weitere Studien hin, die die Rolle von ΔFosB bei der Vermittlung der Auswirkungen von körperlicher Aktivität auf die Funktion des Hippocampus, einschließlich der Neurogenese, beschreiben.
Finanzierungsbescheinigung
Referenzen