J Neurosci. 2006 May 10;26(19):5131-42.
Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ.
Quelle
Abteilung für Psychiatrie, Zentrum für grundlegende Neurowissenschaften, Texas University Southwestern Medical Center, Dallas, Texas 75390-9070, USA.
Abstract
Der Transkriptionsfaktor DeltaFosB (auch als FosB2 oder FosB [Kurzform] bezeichnet) ist ein wichtiger Mediator der Langzeitplastizität, die im Gehirn durch chronische Exposition gegenüber verschiedenen Arten von psychoaktiven Stimuli induziert wird, einschließlich Missbrauchsdrogen, Stress und elektrokonvulsiven Anfällen . Ein eindeutiges Merkmal von DeltaFosB ist, dass es, einmal induziert, im Gehirn für längere Zeiträume in Abwesenheit einer weiteren Stimulation bestehen bleibt. Die Mechanismen, die dieser scheinbaren Stabilität zugrunde liegen, sind jedoch unbekannt geblieben. Hier zeigen wir, dass DeltaFosB ein relativ stabiler Transkriptionsfaktor mit einer Halbwertszeit von etwa 10 h in Zellkultur ist. Weiterhin zeigen wir, dass DeltaFosB ein Phosphoprotein im Gehirn ist und dass die Phosphorylierung eines hoch konservierten Serinrestes (Ser27) in DeltaFosB es vor proteasomalem Abbau schützt. Wir liefern mehrere Hinweise darauf, dass diese Phosphorylierung durch Caseinkinase 2 vermittelt wird. Diese Befunde stellen den ersten Beweis dafür dar, dass DeltaFosB phosphoryliert ist, und zeigen, dass die Phosphorylierung zu seiner Stabilität beiträgt, die den Kern seiner Fähigkeit darstellt, lang anhaltende Anpassungen im Gehirn zu vermitteln.
Einführung
Der Transkriptionsfaktor ΔFosB, auch als FosB2 oder FosB [kurze Form] bezeichnet, ist eine C-terminusverkürzte Spleißvariante des unmittelbaren frühen Gens fosb (Dobrazanski et al., 1991; Nakabeppu und Nathans, 1991; Yen et al., 1991). Wie FosB in voller Länge besitzt ΔFosB eine DNA-bindende basische Domäne und einen Leucin-Zipper, durch den es mit Jun-Proteinen zu Aktivator-Protein-1 (AP-1) Transkriptionsfaktor-Komplexen dimerisiert, die die Expression vieler Gene regulieren (Morgan und Curran, 1995; Rylski und Kaczmarek, 2004). Trotz fehlenden Teils der Transaktivierungsdomäne im C-Terminus von FosB fungiert ΔFosB sowohl als potenter Transkriptionsaktivator als auch als Repressor in kultivierten Zellen und im Gehirn (Dobrazanski et al., 1991; Nakabeppu und Nathans, 1991; Chen et al., 1997; McClung und Nestler, 2003; Kumaret al., 2005).
ΔFosB wird im Gehirn nach einer chronischen, aber nicht akuten Exposition gegenüber einer Vielzahl von psychoaktiven Stimuli, einschließlich Stress, bestimmter Läsionen, antipsychotischer und antidepressiver Medikamente, Missbrauchsdrogen und natürlichen Belohnungen, auf eine hohe Region induziert (Hope et al., 1994b; Hiroi und Graybiel, 1996; Moratalla et al., 1996; Binget al., 1997; Mandelzys et al., 1997; Kelz et al., 1999; Werme et al., 2002; Andersson et al., 2003; Colby et al., 2003; Peakman et al., 2003; Perrottiet al., 2004; Zachariouet al., 2006). Die Induktion von ΔFosB wurde direkt mit den funktionellen Effekten einiger dieser Reize auf das Gehirn in Verbindung gebracht. Die Persistenz von ΔFosB selbst in Abwesenheit einer zusätzlichen Stimulation unterscheidet es von allen anderen Transkriptionsfaktoren der Fos-Familie, die schnell als Antwort auf akute Stimuli induziert werden, innerhalb weniger Stunden auf Basalwerte zurückfallen und nach chronischer Stimulation im Allgemeinen Desensibilisierung zeigen (Hope et al., 1992; Daunais et al., 1993; Persico et al., 1993; Hiroi und Graybiel, 1996; Perrottiet al., 2004). Dies macht ΔFosB zu einem attraktiven Kandidaten, um einige der lang anhaltenden Veränderungen in der Genexpression zu vermitteln, die den stabilen neuronalen Anpassungen zugrunde liegen, die durch bestimmte chronische Stimuli verursacht werden.
Weil das verlängerte Vorhandensein von ΔFosB in Abwesenheit einer weiteren Induktion seiner mRNA auftritt (Chen et al., 1995) spekulierten wir, dass ΔFosB im Gegensatz zu FosB und allen anderen Proteinen der Fos-Familie, die an sich instabil sind, ein ungewöhnlich stabiler Transkriptionsfaktor sein kann (Hope et al., 1994b; Chen et al., 1997; Nestler et al., 2001; McClung et al., 2004). Darüber hinaus deutet die Immunoblotting-Analyse von akutem gegenüber chronisch stimuliertem Hirngewebe darauf hin, dass sich ΔFosB offensichtlich verschiebt Mr (Molekülmasse) von ~33 kDa im akuten Zustand bis zu ~35-37 kDa während der chronischen Behandlung (Hope et al., 1994a; Chen et al., 1995). Da es keine Beweise für die Existenz zusätzlicher mRNAs gibt, die für diese verschiedenen Isoformen kodieren könnten, spekulierten wir weiter, dass ΔFosB posttranslational modifiziert ist und dass dies vielleicht zu seiner ungewöhnlichen Stabilität beiträgt. Bis heute wurden jedoch keine biochemischen Analysen des Umsatzes oder posttranslationaler Modifikationen von ΔFosB berichtet. Das Ziel der vorliegenden Studie war es, festzustellen, ob ΔFosB ein Phosphoprotein ist und ob die Phosphorylierung eine Rolle für seine Stabilität spielt.
Vorherige SektionNächster Abschnitt
Materialen und Methoden
Säugetierzelllinien und DNA-Konstrukte.
PC12-Zellen (Clontech, Mountainview, CA) wurden in DMEM mit hohem Glucosegehalt, das 1-Glutamin (L-Gln) enthielt und mit 5% fötalem Rinderserum (FBS), 10% Pferdeserum (beide von Invitrogen, Carlsbad, CA) ergänzt wurde, kultiviert. 100 U / ml Penicillin und 100 & mgr; g / ml Streptomycin (beide von Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). HeLa-Zellen (American Type Culture Collection, Manassas, VA) wurden in DMEM mit hohem Glucosegehalt, das L-Gln enthielt und mit 10% FBS, Penicillin und Streptomycin ergänzt war, kultiviert. Beide Zelllinien wurden bei 37 ° C in einem feuchten 5% CO gehalten2 Atmosphäre.
Für die transienten Transfektionen mit DNA wurden PC12- oder HeLa-Zellen auf Platten mit sechs Vertiefungen (beschichtet mit Kollagen I für PC12-Zellen) ausgesät, um 90-100% Konfluenz am nächsten Tag zu erreichen, und wurden dann unter Verwendung von Lipofectamin 2000 (Invitrogen) transfiziert. In einigen Experimenten (siehe Feigen. 1⇓⇓⇓⇓⇓-7), Wurde ΔFosB in PC12 - Zellen über eine Infektion mit rekombinantem Herpes Simplex Virus (HSV) transient exprimiert.
ΔFosB- und FosB-cDNAs wurden von unseren eigenen pTetop-Konstrukten erhalten (Chen et al., 1997) und in einen pcDNA3.1 - Vektor (Invitrogen) subkloniert. Diese pcDNA3.1-ΔFosB / FosB-Konstrukte wurden zur Expression in Säugetierzellen und als Matrize für die ortsgerichtete Mutagenese verwendet. Rekombinantes HSV-ΔFosB wurde wie zuvor beschrieben hergestellt (Neve et al., 1997), und die Zubereitung hatte einen Titer von ~ 1 × 108 pfu / ml.
Pulse-Chase-Experimente.
Ungefähr 24 h nach Infektion / Transfektion wurden die Zellen (PC12 oder HeLa) in Platten mit sechs Vertiefungen zwei- bis dreimal mit 2 ml PBS gewaschen und bei 37ºC für 1h in 2 ml Cys / Met-freiem DMEM inkubiert (Invitrogen), ergänzt mit 5% dialysiertem FBS (Hyclone, Logan, UT), um intrazelluläre Pools von Met und Cys zu depletieren. Am Ende dieser "Hunger" -Periode wurden Arzneimittel (falls Zellen behandelt werden sollten) hinzugefügt und die Zellen wurden mit 12-25 & mgr; Ci von (e) markiert (Puls) 35S Proteinmarkierungsmischung (PerkinElmer, Wellesley, MA) für ~ 1 h bei 37 ° C, um alle neu synthetisierten Proteine zu markieren. Die Radiomarkierung wurde dann entfernt, indem die Zellen zwei- bis dreimal mit 2 ml PBS gewaschen wurden, und die 35S-markierten Proteinen wurde gefolgt (Chase), indem das Medium durch "kaltes" (nicht-radioaktives) Medium, ergänzt mit 5% FBS, ersetzt wurde und die Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten geerntet wurden. Zellbehandlungen wurden während der gesamten Jagd aufrechterhalten. Alle Figuren dieser Experimente zeigen ähnliche Anfangsmengen der verschiedenen Proteine, um Vergleiche ihrer Umsatzraten zu optimieren.
Tiere und chronische Elektrokrampfanfall.
Erwachsene männliche Sprague-Dawley-Ratten (200-300 g; Charles River Laboratories, Kingston, RI) wurden einmal täglich mit elektrokonvulsiven Anfällen (ECS) für 7-9 d behandelt. ECS wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (Hope et al., 1994a) mit einem Ugo Basile (Comerio VA, Italien) ECS-Einheit mit folgenden Einstellungen: Frequenz, 100-Impulse / s; Puls mit, 0.5 ms; Schockdauer, 1.0 s; und Strom, 75 mA. Sham-Kontrolltiere wurden parallel behandelt, indem die Ohrclip-Elektroden ohne elektrischen Strom angelegt wurden.
32 P metabolische Markierung.
Für die Markierung von Hirnschnitten wurden Ratten enthauptet, die Gehirne schnell seziert und 300 & mgr; m frontale kortikale Schnitte wurden mit einem DSK-Mikroslicer (Ted Pella, Redding, CA) präpariert. Die Schnitte wurden in Plastikröhrchen in 2 ml phosphatarmem, künstlichem CSF (ACSF) inkubiert und bei konstantem sanften Durchperlen von O bei 30 ° C gehalten2/ CO2 Mischung (Hemmings et al., 1989). Die Schnitte (zwei Schnitte pro Röhrchen) wurden mit 1.3 mCi für 8-10 h in Gegenwart oder Abwesenheit von Okadasäure (100 ng / ml) markiert. Am Ende dieser Inkubation wurden die Schnitte mindestens dreimal mit kaltem ACSF gespült und dann durch Ultraschallbehandlung in 250 & mgr; l kaltem Radioimmunpräzipitationstest (RIPA) -Puffer [PBS, pH 7.4, 150 mm NaCl, 1% (v / v) homogenisiert ) Igepal, 0.5% (Gew./Vol.) Natriumdesoxycholat, 0.1% (Gew./Vol.) SDS, 1 mm EDTA] ergänzt vor der Verwendung mit SDS bis zu 0.6%, Proteaseinhibitor-Cocktail für Säugetierzellen (verwendet bei 5 & mgr; l / ml; Sigma-Aldrich), Phosphatase-Inhibitor-Cocktails I und II (verwendet bei 1: 100; Sigma-Aldrich), 1 mm PMSF und 2% Glycerin. Die Homogenate wurden dann für 15 min gekocht und durch Zentrifugation bei 15,000 x gereinigt g für 15 min. Die Proteinkonzentration in den resultierenden Überständen wurde unter Verwendung des BCA-Proteinassays (Pierce, Holmdel, NJ) bewertet.
Bei der 32P-Markierung von kultivierten Zellen, ~ 24 h nach Infektion / Transfektion, wurden die Zellen zwei- bis dreimal mit phosphatfreiem Medium gewaschen und in diesem Medium für ~ 1 h inkubiert. Nach dieser Hungerperiode, 0.2-0.3 mCi von 32PH3PO4 (PerkinElmer) wurden in jede Vertiefung gegeben, und die Zellen wurden für 4-12 h markiert, abhängig von der Art des Experiments (für Spezifikationen siehe Fig. 1-7). Die Zellen wurden dann dreimal mit PBS gewaschen und auf Eis für 15 min mit 50 & mgr; l ergänztem RIPA-Puffer lysiert. Die Lysate wurden durch Abkratzen gesammelt und wurden 10-Male durch eine 25-ga-Nadel gegeben, um die DNA zu scheren, sie wurden für 10 min gekocht und bei 15,000 rpm für 15-30 min bei 4 ° C zentrifugiert. Die geklärten Lysate (Überstände) wurden in ein neues Röhrchen überführt und ein BCA-Protein-Assay (Pierce) wurde durchgeführt. Alle Figuren dieser Experimente zeigen ähnliche Mengen an Gesamt-Wildtyp- (WT) und S27A-ΔFosB-Proteinen, um Vergleiche ihrer relativen Phosphorylierungsgrade zu optimieren.
Chemikalien und Zellkulturbehandlungen.
Okadainsäure (OA; Sigma-Aldrich) wurde in Ethanol gelöst und in einer Endkonzentration von 100 ng / ml verwendet. 5,6-Dichlor-1-β-d-Ribofuranosyl-Benzimidazol (DRB; Biomol, Plymouth Meeting, PA) wurde in Dimethylsulfoxid (DMSO; Sigma-Aldrich) gelöst und in Zellkultur bei einer Endkonzentration von 50 & mgr; m verwendet. Spermin (Sigma-Aldrich) wurde in Wasser gelöst und in einer Endkonzentration von 200 & mgr; m verwendet. Calphostin-C (Biomol) wurde in DMSO gelöst und bei 0.2 & mgr; m verwendet, wohingegen Phorbol 12-Myristat 13-Acetat (PMA; Promega, Madison, WI) in DMSO gelöst und bei 0.1 & mgr; m verwendet wurde. Myristoyliertes-Autocamtid-2-verwandtes inhibitorisches Peptid (m-AIP; Biomol) wurde in Wasser gelöst und in einer Endkonzentration von 1 und 10 & mgr; m verwendet. Die Breitspektrum-Proteinkinaseinhibitoren H-7 und H-8 (Biomol) wurden in Wasser gelöst und in einer Endkonzentration von 150 bzw. 200 & mgr; m verwendet. MG132 (Calbiochem, San Diego, CA) und Epoxomicin (Peptides International, Louisville, KY) wurden beide in DMSO gelöst und in einer Endkonzentration von 12.5 bzw. 7.5 & mgr; m verwendet. In allen Experimenten wurde DMSO (Vehikel) zu den Zellen zugegeben, wie es notwendig ist, um eine konstante Menge an DMSO über die Behandlungen hinweg aufrechtzuerhalten. Zum 32P-Markierungsexperimenten wurden die Wirkstoffe unmittelbar vor der Markierung zugegeben und für die verbleibende Markierungsdauer aufbewahrt. Für Pulse-Chase-Experimente wurden Arzneimittel zu der Zeit des "Hungerns" von Cys / Met zugegeben, während der Markierungsperiode gehalten und dann wieder in das Chase-Medium gegeben. Die Proteasom-Inhibitoren wurden während des gesamten Laufs jedes 3-4 h versetzt, um den schnellen Umsatz dieser Peptide zu kompensieren.
ΔFosB-Immunopräzipitation, Immunoblotting und Autoradiographie.
Für Immunopräzipitationen wurden die Lysate 1: 5 mit einfachem RIPA verdünnt, um die SDS-Konzentration auf 0.1% zu senken, bevor mit der Immunpräzipitation (IP) fortgefahren wurde. Um die unspezifische Bindung zu begrenzen, wurden die Lysate zuerst durch Immunpräzipitieren mit nicht immunem IgG und Protein-G-Sepharose (Sigma-Aldrich) für mindestens 4 h geklärt. ΔFosB wurde dann aus den geklärten Lysaten unter Verwendung eines polyklonalen Ziegen-Antikörpers immunpräzipitiert, der ein internes Epitop erkennt, das sowohl in FosB als auch in ΔFosB (SC-48G; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) bei 0.5-1 & mgr; g IgG pro 10 & mgr; g Lysatprotein vorhanden ist (50-300 & mgr; g Gesamtprotein) in einem Gesamtvolumen von 0.5 ml. Die IPs wurden vorsichtig bei 4 ° C auf einem Rotor für mindestens 8h gemischt und dann wurden 15 & mgr; l Protein G-Sepharose zugegeben und IPs wurden für mindestens ein weiteres 4 h gemischt. IPs wurden durch Spinnen bei 3000 x pelletiert g für3-5 min bei 4 ° C, dreimal mit 0.5 ml kaltem Plain-RIPA und zweimal mitkalter PBS, die 0.1% Tween 20 enthielt, gewaschen. IPs wurden dann in 0.5 ml kaltem PBS resuspendiert, transferiert, in ein neues Röhrchen pelletiert und immunpräzipitierte Proteine wurden dann durch die Zugabe von 15-25 & mgr; l 2 × reduzierendem Laemmli-Proteinprobenpuffer eluiert. Dieses IP-Protokoll führte zur spezifischen und effektiven Ausfällung von praktisch dem gesamten & Dgr; FosB im Lysat. Die immunpräzipitierten Proteine wurden einer SDS-PAGE unterzogen, indem die gesamte IP auf ein 12.5% Tris-HCl-Criterion-Gel (Bio-Rad, Hercules, CA) geladen und dann auf PVDF oder Nitrocellulose übertragen wurde. Nach der Übertragung wurde die Membran luftgetrocknet und getrocknet 32P- und 35S-radiomarkierte Proteinbanden wurden durch Autoradiographie unter Verwendung eines autoradiographischen Films von Kodak (Rochester, NY) sowie durch Phosphorimaging unter Verwendung eines PhosphorImagers von Storm (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) beobachtet. Das gesamte (nicht phosphorylierte und phosphorylierte) ΔFosB in Zelllysaten oder Hirnhomogenaten wurde durch Immunoblotting von entweder dem immunpräzipitierten Protein (unter Verwendung der gleichen Membran, die zum Nachweis des 32P-markiertes Protein) oder von gleichen Mengen an Lysat / Homogenat-Protein, die einer SDS-PAGE unterzogen und auf PVDF oder Nitrocellulose übertragen wurden. Die Membran wurde zuerst durch Inkubieren mit 1% (Gew./Vol.) Fettfreier Trockenmilch (Bio-Rad) in PBS, ergänzt mit 0.1% (V / V) Tween 20 (Sigma) für 1 h bei 25ºC, blockiert. Die Membran wurde dann über Nacht bei 4 ° C mit unserem eigenen polyklonalen Kaninchen-anti-FosB-Antikörper immunogeblottet, der gegen die Aminosäuren 1-16 von FosB / & Dgr; FosB (verwendet bei 1: 10,000) erzeugt wurde. Nach der primären Inkubation wurden die Membranen viermal für 5 min mit Blockierungspuffer gewaschen und dann bei 25 ° C für ~ 1h mit einem Ziegen-anti-Kaninchen-IgG inkubiert, das mit Meerrettichperoxidase konjugiert war (verwendet bei 1: 5000 in Blockierungspuffer von Vector Labors, Burlingame, CA). Die Membranen wurden dann dreimal für 10 min mit Blockierungspuffer und einmal für 5 min mit PBS gewaschen. Die gesamten ΔFosB-Proteinbanden wurden auf einem Kodak-MR-Film durch verstärkte Chemilumineszenz (Pierce) und / oder durch Detektion der Fluoreszenz unter Verwendung der ECL-Plus-Reagenzien (Amersham Biosciences) und des Storm PhosphorImagers sichtbar gemacht.
Überexpression und Reinigung von rekombinantem ΔFosB aus Insektenzellen.
ΔFosB wurde in Sf9-Insektenzellen als N-terminales Hexa-His-markiertes Protein (N-His (6) ΔFosB) unter Verwendung des Bac-Bac-Baculovirus-Expressionssystems (Invitrogen) und unter Befolgung der Anweisungen des Herstellers überexprimiert. Kurz gesagt wurde die & Dgr; FosB-cDNA (Reste 2-237), der von der Affinitäts-N-terminalen Markierung MGHHHHHHAG vorangegangen war, in den pFASTBacTM1-Vektor subkloniert, der verwendet wurde, um rekombinantes Baculovirus zu erzeugen. Sf9-Zellen wurden mit rekombinantem Virus infiziert und N-His (6) ΔFosB wurde aus Zelllysaten durch mehrere chromatographische Schritte einschließlich Affinitätschromatographie unter Verwendung einer Nickelsäule (Qiagen, Valencia, CA), Anionenaustausch unter Verwendung einer Mono-Q-Säule (Amersham) gereinigt Biosciences) und Größenausschluss unter Verwendung einer Gelfiltrationssäule (Amersham Biosciences).
In vitro Phosphorylierungsstudien.
In vitro Phosphorylierungsreaktionen für die Zeitverlaufs- und Stöchiometrieanalyse wurden in einem Volumen von 30 & mgr; l, das 10 & mgr; m Substrat (N-His (6) & Dgr; FosB oder ein positives Kontrollsubstrat enthielt), 250 & mgr; m ATP und 1 & mgr; Ci / & mgr; l [& ggr;32P] ATP, der vom Kinase-Hersteller bereitgestellte Puffer und eine der folgenden Kinasen: CK2 (20 ng / μl; Upstate, Charlottesville, VA), CaMKII (10 ng / μl; Upstate), PKC (1.6 ng / μl; Calbiochem) oder p70S6K (2.5 mU / μl; Upstate). Zeitverlaufsreaktionen wurden durchgeführt, indem 5 & mgr; l-Aliquots zu den angegebenen Zeitpunkten aus der Reaktionslösung entfernt wurden und ein gleiches Volumen von 4 × reduzierendem Laemmli-Proteinprobenpuffer zugegeben wurde. Michaelis-Menten-kinetische Parameter für die CK2-Reaktion wurden unter empirisch definierten linearen stationären Bedingungen bestimmt. Diese Reaktionen wurden für 15 min in einem Volumen von 10 & mgr; l, das 2 ng / & mgr; l Enzym, 250 & mgr; M ATP, 1 & mgr; Ci / & mgr; l [& ggr;32P] ATP- und N-His (6) ΔFosB-Konzentrationen im Bereich von 2.5-30 & mgr; m. Alle Reaktionen wurden bei 30 ° C in einem Wasserbad durchgeführt. Nach SDS-PAGE und Färbung des Gels mit Bio-Safe Coomassie (Bio-Rad) wurde das Gel getrocknet und 32Der P-Phosphat-Einbau wurde durch eine Phosphorimaging-Analyse (siehe unten, Datenquantifizierung, Berechnungen und Statistiken) bewertet.
Zweidimensionale Phosphopeptid-Karte und Phosphoaminosäure-Analyse.
Beide dieser Analysen wurden wie von beschrieben durchgeführt Ploegh und Dunn (2000). Kurz gesagt, trockene Gelfragmente enthaltend 32P-markiertes ΔFosB (entweder von in vitro Reaktionen oder aus Immunpräzipitaten metabolisch markierter Zellen) ausgeschnitten, rehydratisiert, gewaschen und einer tryptischen Verdauung unterzogen. Der die tryptischen Verdauungsprodukte enthaltende Überstand wurde lyophilisiert und das Lyophilat mehrere Male gewaschen und in 10 & mgr; l Elektrophoresepuffer, pH 1.9, resuspendiert. Die Probe (3 & mgr; l) wurde auf eine Cellulose-Dünnschichtchromatographie (TLC) -Platte (Analtech, Newark, DE) aufgetragen und in einer Dimension durch Elektrophorese und die andere Dimension durch aufsteigende DC getrennt. Die resultierenden Phosphopeptidkarten wurden durch Autoradiographie und Phosphorimaging sichtbar gemacht. Für die Phosphoaminosäureanalyse wurden 2 & mgr; l der tryptischen Verdaus, die in Elektrophoresepuffer resuspendiert worden waren, durch HCl-Hydrolyse bei 105 ° C für 25 min in 3 m HCl unter einem N weiter gespalten2 Atmosphäre. Die Reaktion wurde durch sechsfache Verdünnung in Wasser gestoppt und die Mischung wurde lyophilisiert. Das Lyophilisat wurde in 5 & mgr; l Elektrophoresepuffer, pH 1.9, resuspendiert und auf eine Cellulose-DC-Platte zusammen mit den Phospho-Ser-, -Thr- und -Tyr-Standards aufgetragen. Elektrophorese wurde über die Hälfte der Länge der DC-Platte unter Verwendung von Elektrophoresepuffer, pH 1.9, durchgeführt, und dann wurde die Platte in den pH-3.5-Puffer überführt und die Elektrophorese wurde bis zur Vollständigkeit durchgeführt. Die Phosphoaminosäurestandards wurden sichtbar gemacht, indem die DC - Platte mit einer 1% (v / v) Ninhydrinlösung in Aceton besprüht wurde, und die 32P-markierte Aminosäureproben wurden sowohl durch Autoradiographie als auch durch Phosphorimaging sichtbar gemacht.
siRNA-induziertes CK2α-Knock-down.
Wir verwendeten eine RNA-Interferenz-Methode, um die CK2-Spiegel selektiv auszuschalten (Di Maira et al., 2005). PC12-Zellen wurden auf Kollagen-I-beschichtete Platten mit sechs Vertiefungen ausgesät, um am nächsten Tag ~ 70-80% Konfluenz zu erreichen, wenn sie vorübergehend mit 20 nm (Endkonzentration) entweder nicht zielender siRNA oder siRNA, gerichtet auf die mRNA des Katalysators, transfiziert wurden α-Untereinheit von Ratte CK2, unter Verwendung von 5 & mgr; l des Transfektionsmittels SilentFectin (Bio-Rad) und unter Befolgung der Anweisungen des Herstellers. Ungefähr 24 h später wurden Zellen transient mit dem ΔFosB-Plasmid transfiziert, wie oben angegeben. Ungefähr 24 h später (~ 48 h nach siRNA-Transfektion) wurden Zellen entweder unterworfen 32P metabolische Markierung oder Puls-Chase-Analyse wie oben beschrieben. Die folgenden vier CK2α-siRNAs wurden mit ähnlichen Ergebnissen verwendet: 5'P-CAAACUAUAAAUCGUACAUCUU3 ', 5'P-UCAAUCAU-GACAUUAUGCGUU3', 5'P-UAGUCAUAUAAAAUCUUCCGUU3 ', 5'P-AAAUCUCCUGACAUCAAUUUUU3' (Dharmacon, Lafayette, CO). Als negative Kontrolle haben wir gebraucht Schalldämpfer Negativkontrolle #3 siRNA von Ambion (Austin, TX). Das Ausmaß des CK2-Knock-down wurde durch Immunoblotting unter Verwendung eines polyklonalen anti-CK2-Antikörpers (Katalog # 06-873 von Upstate) über Nacht bei einer 1: 1000-Verdünnung überwacht. β-Tubulin wurde als Ladungskontrolle verwendet und mit einem monoklonalen Antikörper (Katalog # 05-661 von Upstate) über Nacht bei einer 1: 20,000-Verdünnung nachgewiesen.
Ortsgerichtete Mutagenese.
Die Mutation von Ser27 zu Ala oder zu Asp wurde unter Verwendung eines Quick Change Site-Directed Mutagenesis-Kits (Stratagene, La Jolla, CA) und unter Befolgung der Anweisungen des Herstellers erreicht. Um die Ser27-Mutationen in das Maus-ΔFosB-Protein einzuführen, wurden die folgenden Mutageneseprimer verwendet. Ser27 zu Ala: (Rückwärtsprimer) 5'GCCGAAGGAGTCCACCGAAGCCAGGTACTGAGACTCGGCGGAGGG3 '. Ser27 zu Asp (Vorwärtsprimer) 5'CCCTCCGCCGAGTCTCAGTACCTGGATTCGGTGGACTCCTTCGGC3 '. Die mutierten Basen sind fett gedruckt und das Ser27-Codon ist kursiv dargestellt.
Bioinformatik.
Potentielle Phosphorylierungsstellen und Kinasen für ΔFosB wurden gesucht, indem die Mausproteinsequenz spezialisierten Datenbanken einschließlich ProSite (http://www.expasy.org/prosite/), PredictProtein (Rost et al., 2004) und NetPhosK (Blomet al., 2004).
Datenquantifizierung, Berechnungen und Statistiken.
Die Menge an Protein, die in der PVDF- oder Nitrocellulosemembran vorhanden war, wurde unter Verwendung eines Storm PhosphorImagers und der begleitenden ImageQuant-Software (Amersham Biosciences / Molecular Dynamics) quantifiziert. In den Zellkultur - und Hirnschnitt - Phosphorylierungsstudien wurden die für die 32P-markiertes Protein wurde dann durch die erhaltenen Werte für das Gesamt-ΔFosB dividiert und als Verhältnis ausgedrückt. In dem in vitro Phosphorylierungsstudien, die Menge an 32P-markiertes ΔFosB pro Mol ΔFosB (Stöchiometrie) wurde wie zuvor beschrieben berechnet (Sahinet al., 2004). Alle Messungen wurden innerhalb des Linearitätsbereichs des verwendeten Instruments durchgeführt. Kinetische Parameter wurden mit dem Michaelis-Menten-Modell berechnet, wobei V = VMax[S] / ([S]+KM) und VMax = k2[EGesamt]. Die Halbwertszeit (t1/2) von ΔFosB und FosB wurden aus den Pulse-Chase-Plots geschätzt (unter Verwendung der nichtlinearen Regression, die am besten zu den Datenpunkten passte) und entsprechen der Zeit, zu der die Menge an verbleibendem Protein 50% des Originals beträgt. In allen Figuren sind die gezeigten Ergebnisse repräsentativ für mindestens zwei bis drei unabhängige Experimente. In allen Graphen sind die gezeigten Daten Mittelwerte ± SEM (3 ≤ n ≤ 16). Die statistische Signifikanz von Unterschieden wurde mit einer ungepaarten Bewertung bewertet t Test, korrigiert für Mehrfachvergleiche, und die Sternchen zeigen an p ≤ 0.05.
Vorherige SektionNächster Abschnitt
Ergebnisse
ΔFosB ist ein ungewöhnlich stabiler Transkriptionsfaktor
Obwohl wir zuvor spekuliert haben, dass ΔFosB ein relativ stabiler Transkriptionsfaktor ist (Nestler et al., 2001) wurde eine direkte Analyse des Umsatzprofils des Proteins bisher nicht durchgeführt. Um diese Frage zu beantworten, führten wir Pulse-Chase-Experimente unter Verwendung von PC12-Zellen durch, die extensiv als neuronähnliche Zelllinien verwendet wurden, in denen ΔFosB durch Infektion mit einem rekombinanten Herpes-simplex-Virus (HSV-ΔFosB) transient exprimiert wurde. Neu synthetisierte Proteine wurden metabolisch mit markiert 35S-Met / Cys und das Degradationsmuster von 35S-markiertes ΔFosB (35S-ΔFosB) wurde durch Immunpräzipitation von Zelllysaten, die zu verschiedenen Zeitpunkten nach Entfernung der radiomarkierten Aminosäuren erhalten wurden, überwacht. Die Analyse der Immunopräzipitate durch SDS-PAGE und Autoradiographie ergab, dass die Halbwertszeit von ΔFosB in PC12-Zellen ~ 10 h (Abb. 1). Diese Befunde zeigen, dass die Halbwertszeit von ΔFosB höher ist als die der meisten induzierbaren Transkriptionsfaktoren (siehe Diskussion), einschließlich des FosB in voller Länge, dessen Halbwertszeit in der Zellkultur bei ~90 min (Dobrazanski et al., 1991; Carleet al. 2004). Darüber hinaus ist anzumerken, dass die Degradation von ΔFosB nicht zu einer exponentiellen Abklingkurve ersten Grades passt, sondern eher zweiphasig ist, beginnend mit einer langsameren Degradationsrate. Dies legt die Existenz von mehr als einer ΔFosB-Spezies und / oder mehr als einem Abbauweg nahe.
Größere Version anzeigen:
Abbildung 1.
ΔFosB ist ein ungewöhnlich stabiler Transkriptionsfaktor. Die Halbwertszeit von ΔFosB ist ~ 10 h in Zellkultur. ΔFosB wurde in PC12-Zellen entweder durch Infektion mit HSV-ΔFosB oder durch transiente Transfektion mit ΔFosB-enthaltendem Plasmid exprimiert, und die Zellen wurden Pulse-Chase-Experimenten wie in Materialien und Methoden beschrieben unterzogen. Äquivalente Ergebnisse wurden unabhängig von der Methode erhalten, die zur Überexpression von ΔFosB verwendet wurde. Die Figur zeigt den Zeitverlauf (und das repräsentative Autoradiogramm) des ΔFosB-Abbaus. Die aufgetragenen Daten sind der Durchschnitt ± SEM von mindestens 15 individuellen Datenpunkten, die aus mindestens fünf unabhängigen Experimenten erhalten wurden. Zum Vergleich ist die berichtete Halbwertszeit von FosB in voller Länge angegeben.
ΔFosB ist ein Phosphoprotein im Gehirn
Wir haben die Hypothese aufgestellt, dass die posttranslationale Modifikation von ΔFosB zu seiner scheinbaren Stabilität beitragen könnte. Es wurde gezeigt, dass die Phosphorylierung die Aktivität von Transkriptionsfaktoren auf vielfältige Art und Weise moduliert, einschließlich ihrer Stabilität (zur Überprüfung, siehe Desterroet al., 2000; Whitmarsh und Davis, 2000) untersuchten wir, ob ΔFosB ein Phosphoprotein ist. Zu diesem Zweck wurde die Expression von ΔFosB im Rattenhirn mit chronischer ECS induziert, einer Behandlung, von der bekannt ist, dass sie besonders im frontalen Kortex hohe ΔFosB-Spiegel induziert (Hope et al., 1994a). Einen Tag nach der letzten ECS-Behandlung, als die ΔFosB-Spiegel hoch blieben, wurden dünne frontale kortikale Schnitte präpariert und metabolisch mit markiert 32P-Orthophosphat. Ein paralleler Satz von Scheiben wurde nicht radiomarkiert, und diese wurden verwendet, um die Gesamt-ΔFosB-Gehalte nachzuweisen. Nach Immunpräzipitation mit einem spezifischen Anti-FosB / ΔFosB-Antikörper und Abtrennung der immunpräzipitierten Proteine durch SDS-PAGE, phosphoryliert 32P-markiertes ΔFosB wurde durch Autoradiographie nachgewiesen, während Gesamt-ΔFosB durch Immunoblotting nachgewiesen wurde. Diese Analyse ergab, dass & Dgr; FosB im Gehirn phosphoryliert ist, wie durch eine spezifische nachgewiesen wird 32P-markierte Bande von ~ 35 kDa, die in den chronisch behandelten Gehirnproben vorhanden ist, aber in den scheinbehandelten Kontrollen praktisch nicht nachweisbar ist (Abb. 2A). Dies steht im Einklang mit der Tatsache, dass in Abwesenheit einer chronischen Stimulation die Grundspiegel von ΔFosB sehr niedrig sind. Die Spezifität der Immunpräzipitationsreaktion wird durch das Fehlen eines Signals in dem nicht-immunologischen IgG-Präzipitat veranschaulicht.
Größere Version anzeigen:
Abbildung 2.
ΔFosB ist ein Phosphoprotein im Gehirn. A, ΔFosB ist im Gehirn phosphoryliert. Endogenes ΔFosB wurde im Rattengehirn durch chronische ECS-Behandlung wie in Materialien und Methoden beschrieben induziert. Frontale kortikale Schnitte wurden metabolisch mit markiert 32PH3PO4 für mehrere Stunden. Nach Homogenisierung der Schnitte wurde ΔFosB immunpräzipitiert und phosphoryliertes ΔFosB (32P-ΔFosB) wurde durch Autoradiographie nachgewiesen (oberes Feld). Das Gesamt-ΔFosB in nichtradioaktiven Immunpräzipitaten wurde durch Immunoblotting nachgewiesen (unteres Feld). Als negative Kontrollen sind das Immunopräzipitat eines scheinbehandelten Tieres und nicht-immunologisches IgG gezeigt. BPhosphorylierungsstellen und Kinasen mit entsprechenden Vorhersagewerten für die Maus-ΔFosB-Proteinsequenz wurden durch bioinformatische Analyse erhalten. Die Kandidatenstellen mit den höheren Vorhersagewerten sind in der Proteinsequenz hervorgehoben und in der Tabelle aufgelistet. Die DNA-bindende (basische) Domäne und der Leucin-Zipper sind in der Proteinsequenz fett gedruckt. C, DDie ΔFosB-Phosphorylierung wird durch den Ser / Thr-Phosphatase-Inhibitor OA erhöht. C, 32P-ΔFosB-Spiegel in Immunpräzipitaten von frontalen kortikalen Scheiben, die in Abwesenheit (Ctr) markiert waren, oder das Vorhandensein von 100 ng / ml OA (Graph und oberes Feld) wurden durch Autoradiographie nachgewiesen. Das untere Feld zeigt das Gesamt-ΔFosB, das in Immunpräzipitaten von unmarkierten Schnitten durch Immunoblotting nachgewiesen wurde. DPC12-Zellen wurden mit HSV-ΔFosB oder HSV-LacZ (Vektor) infiziert und metabolisch mit markiert 32PH3PO4 in Abwesenheit (Ctr) oder Anwesenheit von 100 ng / ml OA. 32P-ΔFosB-Spiegel in Immunopräzipitaten wurden durch Autoradiographie nachgewiesen (Graph, oberes Feld). Das untere Feld zeigt das Gesamt-ΔFosB, das in Zelllysaten durch Immunoblotting nachgewiesen wurde.
Als ein erster Schritt zur Aufklärung, welche Kinase (n) und Stelle (n) an der ΔFosB-Phosphorylierung beteiligt sind, unterzogen wir seine Aminosäuresequenz mehreren bioinformatischen Analysen. Dies zeigte, dass, obwohl ΔFosB keine Tyr-Phosphorylierungskandidatenstellen enthält, es mehrere Ser / Thr-Kinase-Konsensusstellen enthält, einschließlich drei CaMKII-Stellen, drei CK2-Stellen und zwei PKC-Stellen mit sehr hohen Phosphorylierungs-Vorhersagewerten (Abb. 2B). Wenn, wie durch Bioinformatik vorhergesagt, ΔFosB nur an Ser- oder Thr-Resten phosphoryliert wird, sollte seine Phosphorylierung signifikant durch die Aktivität von Ser / Thr-Phosphatasen moduliert werden. Um diese Hypothese zu testen, markierten wir frontale kortikale Schnitte mit 32P-Orthophosphat in Gegenwart oder Abwesenheit von OA, einem Ser / Thr-Protein-Phosphatase-Inhibitor. Wie gezeigt in Figure 2C, OA verursacht eine große (~ 2.5-fache) Zunahme in 32P-ΔFosB. Es führte auch zu einem geringfügigen Anstieg der Gesamt-ΔFosB-Spiegel, was mit früheren Berichten übereinstimmt, die die kanzerogenen Wirkungen von OA mit seiner Fähigkeit zur Induktion mehrerer unmittelbar früher Gene einschließlich Fos-Proteinen in Verbindung bringen (Miller et al., 1998; Choeet al., 2004). Das Nettoergebnis ist ein signifikanter Gesamtanstieg (~ 60%) in den phosphorylierten ΔFosB-Werten.
Wir untersuchten dann, ob ΔFosB in PC12-Zellen, die für experimentelle Manipulation zugänglicher sind, ein Phosphorylierungsmuster ähnlich dem im Gehirn beobachteten zeigte. Wir exprimierten ΔFosB in PC12-Zellen über eine Infektion mit HSV-ΔFosB und markierten die Zellen metabolisch mit 32P-Orthophosphat in Gegenwart oder Abwesenheit von OA. Die erfolgreiche Expression und Immunpräzipitation des Proteins aus HSV-ΔFosB-infizierten Zellen wird durch das Vorhandensein sowohl im Immunoblot (Abb. 2D, unteres Feld) und das Autoradiogramm (oberes Feld) einer ~ 35 kDa-Bande, die in den Vektor-infizierten Zellen nicht vorhanden ist. Wie im Gehirn beobachtet, verursachte OA einen geringen Anstieg der Gesamt - ΔFosB - Spiegel, jedoch einen viel höheren (etwa zweifachen) Anstieg von 32P-ΔFosB, was zu einem signifikanten (~ 50%) Nettoanstieg der ΔFosB-Phosphorylierung führt. In Übereinstimmung mit den bioinformatischen Vorhersagen führte die Behandlung von PC12 - Zellen mit einem Tyr - Phosphatase - Inhibitor nicht zu signifikanten Veränderungen in 32P-ΔFosB-Niveaus (Daten nicht gezeigt). Zusammen zeigten diese Befunde, dass ΔFosB an Ser- und / oder Thr-Resten im Gehirn und in PC12-Zellen phosphoryliert ist und bestätigte, dass letzteres ein gutes Zellkultursystem ist, um die Phosphorylierungs- und Abbauprofile von ΔFosB weiter zu untersuchen.
CK2, aber nicht PKC oder CaMKII phosphoryliert ΔFosB in vitro
Wie oben beschrieben, zeigte die Analyse der ΔFosB-Aminosäuresequenz hohe Vorhersagewerte für CK2-, PKC- und CaMKII-Phosphorylierungsstellen. Um zu bestimmen, welche dieser Kinasen ΔFosB phosphorylieren können, führten wir eine Reihe von in vitro Phosphorylierungsreaktionen unter Verwendung von gereinigten Kinasen und gereinigtem rekombinantem ΔFosB. Wie gezeigt in Figure 3AVon den drei Kandidatenkinasen phosphorylierte nur CK2 ΔFosB in signifikanter Weise. Zusätzlich wurden mehrere andere Kinasen getestet (z. B. GSK3 und p70S6K), es gelang jedoch nicht, ΔFosB signifikant zu phosphorylieren (Daten nicht gezeigt). Eine zusätzliche Charakterisierung der CK2-Reaktion durch Zeitverlaufsanalyse ergab, dass diese Kinase den Einbau von ~ 0.5 mol Phosphat pro mol ΔFosB (Abb. 3B). Die Tatsache, dass CK2 ΔFosB phosphorylieren kann in vitro zu einer beträchtlichen Stöchiometrie (~ 50%) deutet auf eine physiologisch relevante Reaktion hin. Wir untersuchten dann die Kinetik dieser Reaktion durch Inkubation von CK2 in Gegenwart von steigenden Mengen an gereinigtem ΔFosB, und wir ermittelten, dass CK2 ΔFosB mit a phosphoryliert Vmax von 5.8 pmol · min-1 · Μg-1 von Enzym, a KM von 18.4 & mgr; m und a kKatze von 0.2 / s (Abb. 3C). Die für diese kinetischen Parameter erhaltenen Werte unterstützen zusätzlich die physiologische Relevanz dieser Reaktion. Zum Beispiel, die KM von CK2 für DARPP32, eines seiner bekanntesten Substrate, ist 3.4 & mgr; kKatze ist ~ 0.3 / s (Girault et al., 1989); das KM für ATP reicht von ~10-40 μm (Cochet et al., 1983; Silva-Neto et al., 2002), und das für Casein reicht von ~ 10-50 μm (Meggio et al., 1977; Pyerinet al., 1987). Zusammen zeigen diese Daten, dass ΔFosB ein echtes Substrat für CK2 ist in vitro.
Größere Version anzeigen:
Abbildung 3.
CK2, aber nicht PKC oder CaMKII phosphoryliert ΔFosB in vitro. Der Autoradiograph (oberes Feld) zeigt das phosphorylierte Produkt, und das Coomassie-gefärbte Gel (unteres Feld) zeigt das gesamte in der Reaktion vorhandene ΔFosB. AGereinigtes rekombinantes ΔFosB wurde unterworfen in vitro Phosphorylierung durch verschiedene Kandidatenkinasen (von denen drei gezeigt sind). BZeitverlauf und stöchiometrische Analysen zeigen, dass CK2 ΔFosB phosphorylieren kann in vitro mit einer Stöchiometrie von ~ 50%. CDie kinetische Analyse der CK2-Reaktion ergab, dass ΔFosB ein echter Beweis ist in vitro Substrat. Die Linearisierung der Reaktion ist in einer doppelt-reziproken Darstellung (unten) dargestellt, die kinetischen Parameter wurden jedoch aus der Michaelis-Menten-Kurve (oben) abgeleitet.
CK2 moduliert die Phosphorylierung und Stabilität von ΔFosB in intakten Zellen
Um die physiologische Relevanz der CK2-vermittelten Phosphorylierung von ΔFosB zu untersuchen, führten wir eine vergleichende Phosphopeptidkartierung durch in vitro phosphoryliertes und PC12-Zell-phosphoryliertes ΔFosB. Nach SDS-PAGE und Gelelution von 32P-ΔFosB (von der in vitro Reaktionen oder aus dem Immunopräzipitat von 32P-markierte Zellen), wurde das Protein mit Trypsin verdaut und die resultierenden Phosphopeptide wurden einer zweidimensionalen Trennung unterzogen. Diese Analyse ergab, dass das Hauptphosphopeptid aus der CK2-Reaktion mit einem von zwei Hauptphosphopeptiden aus ΔFosB, das in PC12-Zellen phosphoryliert wurde, (Abb. 4A), während die Phosphopeptide, die sich aus der PKC- oder CaMKII- (Daten nicht gezeigt) -Reaktion ergaben, dies nicht taten. Es gab ein zweites ΔFosB-Phosphopeptid, das in der Karte von PC12-Zellen vorhanden war, aber aufgrund der Unfähigkeit irgendeiner der Kinasen, die wir getestet hatten, ein ähnliches Phosphopeptid zu erzeugen in vitroWir wissen derzeit nicht, ob dieses zweite Phosphopeptid eine Phosphorylierungsstelle enthält, die sich von dem anderen Phosphopeptid unterscheidet, oder ob es ein unterschiedliches tryptisches Peptid darstellt, das die gleiche Phosphorylierungsstelle enthält.
Größere Version anzeigen:
Abbildung 4.
CK2 moduliert die Phosphorylierung und Stabilität von ΔFosB in intakten Zellen. AScheint CK2, aber nicht PKC, ΔFosB in Zellen zu phosphorylieren. Zweidimensionale Phosphopeptidkarten von ΔFosB, die durch CK2 oder PKC phosphoryliert wurden in vitro oder durch intakte PC12-Zellen. Die Pfeile zeigen die Comigration des CK2-phosphorylierten Peptids, jedoch nicht des PKC-phosphorylierten Peptids mit einem der aus PC12-Zellen erhaltenen & Dgr; FosB-Phosphopeptide. BDie ΔFosB-Phosphorylierung in PC12-Zellen wird durch Behandlung der Zellen mit dem potenten CK2-Aktivator Spermin (SP) erhöht und durch Behandlung mit dem CK2-Inhibitor DRB verringert. Im Gegensatz dazu wurde die ΔFosB-Phosphorylierung in PC12-Zellen durch die Behandlung mit entweder einem PKC-Aktivator (PMA) oder dem PKC-spezifischen Inhibitor Calphostin-C (Calph) nicht beeinflusst. Ein repräsentatives Autoradiogramm (oberes Feld) und Immunoblot (unteres Feld) werden gezeigt. C-F, Wirkung der CK2-Aktivität auf die ΔFosB-Stabilität. Die Figuren zeigen den zeitlichen Verlauf (und das repräsentative Autoradiogramm) der ΔFosB-Degradation. PC12-Zellen, die ΔFosB transient exprimieren, wurden Pulse-Chase-Experimenten unterzogen, die in Abwesenheit oder Anwesenheit des CK2-Inhibitors DRB durchgeführt wurden (C), der CK2-Aktivator Spermin (D) oder der Breitbandkinase-Inhibitor H-8 (E), die verwendet wurde, um die unspezifischen Wirkungen von DRB zu kontrollieren. F, Effekt des Abschlagens der katalytischen Untereinheit von CK2 auf ΔFosB-Stabilität. PC12-Zellen wurden entweder mit einer nicht zielgerichteten siRNA (Ctr) oder siRNA, die auf Ratten-CK2 & agr; und 24 h transfiziert war, später mit einem & Dgr; FosB-Plasmid transfiziert. Das obere Feld zeigt Immunoblots von Ganzzelllysaten, die die Wirkung der CK2-siRNA auf CK2- und ΔFosB-Proteinspiegel zeigen. Der entsprechende Immunoblot für & bgr; -Tubulin ist als eine Ladesteuerung gezeigt.
Um die physiologische Relevanz von CK2 als eine ΔFosB-Kinase weiter zu untersuchen, behandelten wir ΔFosB-exprimierende PC12-Zellen mit zwei Medikamenten, die die CK2-Aktivität modulieren. Wie gezeigt in Figure 4BΔFosB-Phosphorylierung wurde durch Behandlung von PC12-Zellen mit dem zellpermeablen CK2-Inhibitor DRB (Meggio et al., 1990; Szyszka et al., 1995) und durch Behandlung mit dem Polyamin Spermin erhöht, von dem bekannt ist, dass es ein potenter CK2-Aktivator ist (Cochet und Chambaz, 1983; Meggio et al., 1983). Im Gegensatz dazu Behandlung von PC12-Zellen mit dem PKC-Inhibitor Calphostin-C (Kobayashi et al., 1989; Tamaoki et al., 1990) oder der PKC-Aktivator PMA (Schmidt und Hecker, 1975; Beh et al., 1989) führte zu keinen signifikanten Veränderungen der ΔFosB Phosphorylierung. Im Fall von PMA ist der leichte (und nicht signifikante) Anstieg von 32P-ΔFosB könnte durch einen Anstieg der gesamten von diesem Wirkstoff verursachten ΔFosB-Spiegel erklärt werden; In der Tat wurde berichtet, dass Phorbolester die Expression mehrerer Proteine der Fos-Familie induzieren, einschließlich FosB (Yoza et al., 1992; Suh et al., 2004). Weiterhin wurde die Behandlung von Zellen mit dem spezifischen zellpermeablen CaMKII-Inhibitor m-AIP (Ishida und Fujisawa, 1995; Stevens et al., 1999) führte auch nicht zu einer verminderten ΔFosB-Phosphorylierung (Daten nicht gezeigt). Zusammen sind diese Ergebnisse konsistent mit unseren in vitro Befunde und weisen darauf hin, dass ΔFosB in intakten Zellen wahrscheinlich durch CK2, nicht jedoch durch PKC oder CaMKII phosphoryliert wird. Die Tatsache, dass die CK2-Inhibierung die ΔFosB-Phosphorylierung nicht vollständig verhindert, zeigt die Existenz von zusätzlichen Phosphorylierungsstellen in dem Protein an.
Als nächstes untersuchten wir, ob CK2 eine Rolle beim Umsatz von ΔFosB und somit bei seiner Stabilität spielt. Zu diesem Zweck führten wir Pulse-Chase-Experimente mit ΔFosB-exprimierenden PC12-Zellen durch, die entweder mit dem CK2-Inhibitor oder dem CK2-Aktivator, der in der Phosphorylierungsstudie verwendet wurde, behandelt wurden. Wie gezeigt in Figure 4CDie Behandlung von Zellen mit dem CK2-Inhibitor DRB hatte eine signifikante Wirkung auf die Umsatzrate von ΔFosB, was durch die Änderung der Form seiner Abbaukurve von biphasisch zu einer Kurve, die näher an der eines exponentiellen Zerfalls ist, deutlich wird. Umgekehrt führte die Anwesenheit des CK2-Aktivators Spermin zu einer signifikanten Abnahme der Abbaurate von ΔFosB, was zur Anreicherung des Proteins während der ersten Stunden der Jagd führte (Abb. 4D).
Wie bei vielen Kinaseaktivatoren und -inhibitoren können Spermin und DRB metabolische Effekte außerhalb der Modulation der CK2-Aktivität haben. Tatsächlich wurde gezeigt, dass DRB die Transkriptionsfaktor IIH (TFIIH) -assoziierte Kinase (Yankulov et al., 1995), was zu einer Hemmung der RNA-Polymerase-II-vermittelten Transkription führt. Da dieser Effekt die Stabilität von ΔFosB beeinflussen könnte, haben wir die Wirkung des Breitbandkinase-Inhibitors H-8 (Hidaka und Kobayashi, 1992) bei ΔFosB-Umsatz bei einer Konzentration (200 μm), von der bekannt ist, dass sie TFIIH-assoziierte Kinasen, nicht aber CK2 (Yankulov et al., 1995). Wie gezeigt in Figure 4EDie Behandlung mit H-8 beeinflusste die Umsatzrate von ΔFosB nicht. Ähnliche Ergebnisse wurden mit H-7, einem anderen Breitbandkinase-Inhibitor, erhalten, der in einer Konzentration verwendet wurde, die TFIIH-assoziierte Kinase, aber nicht CK2 inhibiert (Daten nicht gezeigt). Diese Daten unterstützen weiterhin die Interpretation, dass die durch DRB verursachte Verringerung der ΔFosB-Stabilität höchstwahrscheinlich auf die Hemmung von CK2 zurückzuführen ist.
Um die Rolle von CK2 im ΔFosB-Umsatz weiter zu untersuchen, untersuchten wir die Konsequenzen des Herunterbrechens von CK2 über siRNA. Wir führten diese Experimente unter Verwendung von PC12-Zellen durch, die zuerst mit Kontroll-siRNA (non-targeting) oder einer siRNA, die auf die mRNA der katalytischen Untereinheit von Ratten-CK2 (CK2 & agr;) und 24 h, die später mit & Dgr; FosB transfiziert wurde, transfiziert wurden. Wie gezeigt in Figure 4F, die Transfektion mit der CK2α-siRNA führte zu einer effizienten und spezifischen Abschwächung des CK2α-Proteinspiegels, ohne die ΔFosB-Spiegel zu beeinflussen (oberes Bild). Die Pulse-Chase-Analyse zeigte, dass das Herunterbrechen von CK2 zu einem signifikanten Anstieg der ΔFosB-Umsatzrate führte, wie durch den schnelleren Abbau des Proteins gezeigt wurde. Die Tatsache, dass die Inhibierung der CK2-Aktivität (ob über DRB-Behandlung oder siRNA) den Umsatz von ΔFosB erhöht und zum Verschwinden der Komponente mit langsamer Rate der biphasischen Kurve führt, während die CK2-Aktivierung die langsame Phase der Kurve verstärkt, bietet eine starke Unterstützung für die Idee, dass CK2 eine Rolle bei der Regulierung der Stabilität von ΔFosB spielt.
CK2 phosphoryliert ΔFosB auf Ser27
Um zu beginnen, die Stelle (n) auf ΔFosB zu identifizieren, die durch CK2 phosphoryliert wurde, führten wir eine Phosphoaminosäureanalyse von rekombinantem ΔFosB, das durch CK2 phosphoryliert wurde, durch in vitro und von ΔFosB, das in PC12-Zellen phosphoryliert ist. Diese Experimente zeigten, dass in beiden Fällen die einzige nachgewiesene Phosphoaminosäure Phospho-Ser (Abb. 5A). Dieser Befund zusammen mit der für das CK2 erhaltenen Stöchiometrie in vitro Phosphorylierungsreaktion (~ 50%) (Abb. 3B) und das Vorhandensein von nur einem signifikanten Punkt auf der CK2-Phosphopeptidkarte (Abb. 4A), legt nahe, dass die CK2 - Phosphorylierung von ΔFosB wahrscheinlich auf einen einzelnen Serinrest beschränkt ist. Diese Schlussfolgerung steht im Einklang mit der Phosphorylierungs-Konsensus-Standortanalyse (Abb. 2B), die nur ein Kandidaten-Serin, dh Ser27, für CK2 vorhersagte. Die taxonomische Analyse ergab, dass Ser27 durch die Evolution der Fos-Familienmitglieder (Abb. 5B), was darauf hindeutet, dass es eine wichtige physiologische Funktion tragen kann.
Größere Version anzeigen:
Abbildung 5.
CK2 Phosphorylate ΔFosB auf Ser27. APhosphoaminosäureanalyse von CK2-phosphorylierten (in vitro) und PC12-zellphosphoryliertes ΔFosB zeigen, dass in beiden Fällen der phosphorylierte Hauptrest Serin ist. BDie speziesübergreifende Analyse der FosB / ΔFosB-Aminosäuresequenz ergab eine hohe Erhaltung von Ser27 unter Fos-Familienmitgliedern vom Menschen bis zum Zebrafisch (dunkles Highlight). Der saure Rest an der Position + 3, der für die CK2-Konsensusstelle benötigt wird, ist jedoch nicht konserviert (heller Glanz). CHeLa-Zellen wurden transient mit entweder Wildtyp-ΔFosB (WT) oder ΔFosB transfiziert, die eine Punktmutation enthielten, um Ser27 durch Ala (S27A) zu ersetzen. Die Zellen wurden metabolisch mit markiert 32PH3PO4 und mit Vehikel oder mit Spermin (SP) behandelt, um CK2 zu aktivieren. Ein repräsentatives Autoradiogramm (oberes Feld) und Immunoblot (unteres Feld) der erhaltenen ΔFosB-Immunopräzipitate sind gezeigt. Das Immunpräzipitat von scheintransfizierten Zellen (Vektor) ist gezeigt.
Um zu bestimmen, ob Ser27 in ΔFosB phosphoryliert ist, mutierten wir diesen Rest zu Ala und analysierten die Konsequenzen für den Phosphorylierungsstatus des Proteins. Zu diesem Zweck verwendeten wir HeLa-Zellen (die mit höherer Effizienz transfiziert werden können), um entweder WT- oder S27A-Mutante ΔFosB transient zu exprimieren. Ungefähr 24 h nach der Transfektion wurden die Zellen metabolisch mit markiert 32P-Orthophosphat und Ganzzelllysate wurden hergestellt. Nach Immunopräzipitation und SDS-PAGE, 32P-ΔFosB wurde durch Autoradiographie und Gesamt-ΔFosB durch Immunoblotting nachgewiesen. Wie gezeigt in Figure 5C (unteres Feld) wurde ΔFosB in den Vektor-transfizierten Zellen nicht nachgewiesen, während Zellen, die entweder mit WT- oder S27A-Mutanten ΔFosB transfiziert waren, das Protein erfolgreich exprimierten. Wir fanden, dass die S27A - Mutation eine signifikante (~ 30%) Reduktion verursachte 32P-ΔFosB-Spiegel (Abb. 5C, oberes Feld und Graph), was darauf hinweist, dass ΔFosB in lebenden Zellen an Ser27 phosphoryliert ist. Um herauszufinden, ob Ser27 in Zellen tatsächlich durch CK2 phosphoryliert wird, haben wir die Fähigkeit des CK2-Aktivators Spermin verglichen, die Phosphorylierung von WT und S27A ΔFosB zu modulieren. Wie wir zuvor in PC12-Zellen beobachtet hatten (Abb. 4B), verbesserte die Behandlung von HeLa - Zellen mit Spermin die Phosphorylierung des WT - Proteins. Die Tatsache, dass dieser Effekt durch die S27A-Mutation signifikant verringert wurde (Abb. 5C) unterstützt die Interpretation, dass Ser27 in ΔFosB ein physiologisches Substrat für CK2 ist.
Die Phosphorylierung von Ser27 reguliert die Stabilität von ΔFosB
Es wurde festgestellt, dass die Stabilität von ΔFosB verringert ist, wenn CK2 inhibiert und verstärkt wird, wenn CK2 aktiviert wird (Abb. 4), und dass CK2 ΔFosB auf Ser27 phosphoryliert (Abb. 5), prognostizierten wir, dass die Verhinderung der Phosphorylierung dieser Stelle das Protein destabilisieren sollte. Pulse-Chase-Experimente, die mit HeLa-Zellen durchgeführt wurden, die entweder WT- oder S27A-Mutante ΔFosB transient exprimierten, zeigten, dass die S27A-Mutation, wie vorhergesagt, zu einem signifikanten Anstieg der Degradationsgeschwindigkeit von ΔFosB und einer damit einhergehenden Abnahme der Halbwertszeit des Proteins führte (Abb. 6A). Wir untersuchten dann, ob dieser Regulationsmechanismus auch in der neuronenähnlichen PC12-Zelllinie auftritt. Diese Experimente zeigten, dass, wie wir in HeLa-Zellen beobachtet haben, die S27A-Punktmutation eine dramatische Abnahme der Halbwertszeit von ΔFosB in PC12-Zellen bewirkt (von ~ 11 zu ~4 h) (Abb. 6B). Die Tatsache, dass diese Destabilisierung der von CK2-Inhibition oder Knock-down (Abb. 4) unterstützt die Idee, dass die CK2-vermittelte Phosphorylierung von Ser27 die Stabilität von ΔFosB reguliert. Weitere Hinweise auf die regulatorische Rolle der Ser27-Phosphorylierung auf den ΔFosB-Proteinumsatz wurden mit einer phosphomimetischen Ser27-Asp-Mutation (S27D) erhalten. Die S27D-Mutation wird als phosphomimetisch angesehen, da sie eine große negativ geladene (Carboxyl-) Gruppe an der Aminosäure 27 platziert und dadurch teilweise die Phosphorylierung von Ser27 imitiert. Wie gezeigt in Figure 6Cverursachte die S27D-Mutation den gegenteiligen Effekt der S27A-Mutation und führte zu einem Protein, das signifikant stabiler war als das WT-Protein. Ähnlich wie bei der CK2-Aktivierung (Abb. 4D), führte die S27D - Mutation zu einer Akkumulation und somit zu erhöhten ΔFosB - Spiegeln während der ersten Stunden der Verfolgung.
Größere Version anzeigen:
Abbildung 6.
Die Phosphorylierung von Ser27 reguliert die Stabilität von ΔFosB. A, CPulse-Chase-Analyse, die den Effekt der Ser27-Phosphorylierung auf die Umsatzrate von ΔFosB zeigt. Das Abbauprofil und die geschätzten Halbwertszeiten von Wildtyp-ΔFosB (WT), der Ser27 zu Ala-Mutante (S27A) und der phosphomimetischen Ser27 zu Asp-Mutante (S27D) sind gezeigt. Die gleichen Ergebnisse wurden in HeLa-Zellen erhalten (A) und PC12-Zellen (B, C).
Die Phosphorylierung von Ser27 stabilisiert ΔFosB, indem es seinen proteasomalen Abbau verhindert
Um den Mechanismus aufzuklären, mit dem die Phosphorylierung von Ser27 ΔFosB stabilisiert, untersuchten wir die Fähigkeit der Proteasom-Inhibitoren MG132 (Palombella et al., 1994; Tsubuki et al., 1996) und Epoxomicin (Hanada et al., 1992; Kim et al., 1999) um die Abbaurate der WT- und S27A-Mutante ΔFosB zu modulieren. Pulse-Chase-Experimente wurden unter Verwendung von PC12-Zellen durchgeführt, die mit einem rekombinanten HSV infiziert waren, das entweder WT oder S27A & Dgr; FosB exprimierte und entweder mit DMSO oder einem der beiden Proteasom-Inhibitoren behandelt wurde. Diese Experimente zeigten, dass, obwohl die Abbaurate des WT-Proteins relativ unempfindlich gegen das Vorhandensein eines der beiden Proteasom-Inhibitoren ist (Abb. 7A), der der S27A-Mutante ist empfindlich auf diese Medikamente (Abb. 7B). Dies deutet darauf hin, dass die S27A-Mutante, anders als das WT-Protein, Ziel eines proteasomalen Abbaus ist. In der Tat kehrte die Behandlung von Zellen mit entweder MG132 oder Epoxomicin den Effekt der S27A-Mutation auf die Abbaurate von ΔFosB vollständig um, was durch einen Anstieg der Halbwertszeit der S27A-Mutante von ~4 auf ~9h für MG132 und auf ~ gezeigt wurde 12 h für Epoxomicin (Abb. 7B). Zusammengenommen weisen diese Befunde darauf hin, dass die Phosphorylierung von ΔFosB auf Ser27 das Protein vor proteasomalem Abbau schützt und daher für seine ungewöhnliche Stabilität wesentlich ist.
Größere Version anzeigen:
Abbildung 7.
Die Phosphorylierung von Ser27 stabilisiert ΔFosB durch Verhinderung seines proteasomalen Abbaus. A, B, Pulse-Chase-Analyse mit HSV-infizierten PC12-Zellen, die das Abbauprofil und die geschätzten Halbwertszeiten von Wildtyp-ΔFosB (A) oder S27A ΔFosB (B) in Abwesenheit oder Anwesenheit von zwei Proteasom-Inhibitoren [MG132 und Epoxomicin (Epoxo)]. Beachten Sie, dass beide Medikamente keinen signifikanten Einfluss auf den Umsatz von Wildtyp-ΔFosB haben, während die Behandlung von Zellen mit Proteasominhibitoren zur Stabilisierung von S27A ΔFosB führte. C, Ein Modell für die Rolle der Ser27-Phosphorylierung in der Fähigkeit von ΔFosB, langfristige Plastizität des Gehirns zu vermitteln. Nach der Induktion wird ein Teil von ΔFosB im Gehirn durch die CK2-vermittelte Phosphorylierung von S27 stabilisiert. Dies führt zu seiner Akkumulation, die wiederum zu lang anhaltenden Veränderungen der Genexpression führt. Diese stabilen Veränderungen in der Genexpression tragen zu stabilen Verhaltensanpassungen bei. Umgekehrt führt die Dephosphorylierung von S27 durch die Ser / Thr-Phosphatasen PP1 und / oder PP2A zu einer Destabilisierung des Proteins und seiner Verarbeitung durch die proteasomale Maschinerie.
Vorherige SektionNächster Abschnitt
Diskussion
In der vorliegenden Studie zeigen wir, dass ΔFosB eine Halbwertszeit von ~10 h in Zellkultur hat, was es im Vergleich zu FosB voller Länge und den meisten anderen induzierbaren Transkriptionsfaktoren, deren Halbwertszeiten in Zellkultur so kurz sein können, stabil macht als ein paar Minuten und selten überschreiten 3 h (Hann und Eisenman, 1984; Dobrazanski et al., 1991; Roberts und Whitelaw, 1999; Ferrara et al., 2003; Hirataet al., 2004). Zusätzlich finden wir, dass ΔFosB im Gehirn phosphoryliert ist und dass seine Phosphorylierung empfindlich auf den PP1 / PP2A-Inhibitor Okadasäure reagiert. Unsere Zellkulturstudien zeigen, dass die Stabilität von ΔFosB durch CK2 moduliert wird, wobei eine höhere CK2-Aktivität das Protein stabilisiert. Schließlich legen unsere Ergebnisse nahe, dass CK2 ΔFosB an einem hochkonservierten N-terminalen Serin (S27) phosphoryliert und demonstriert, dass die Phosphorylierung von S27 ΔFosB vor proteasomalem Abbau schützt. Wir schlagen daher ein Modell vor, bei dem die Phosphorylierung von ΔFosB auf S27 durch CK2 ein kritischer Regulationsmechanismus des Umsatzes von ΔFosB ist (Abb. 7C). Eine solche Phosphorylierungs-vermittelte Stabilisierung von & Dgr; FosB ist funktionell wichtig, weil nachgewiesen wurde, dass erhöhte Konzentrationen von & Dgr; FosB in bestimmten Gehirnregionen zahlreiche neuronale Gene direkt regulieren in vivo und in Tiermodellen mehrerer neuropsychiatrischer Störungen starke Verhaltenseffekte auszuüben (siehe Einleitung).
Die Phosphorylierung ist zwar ein schneller und reversibler Weg zur Regulierung der Transkriptionsaktivität bestimmter Transkriptionsfaktoren wie CREB (cAMP-Response-Element-bindendes Protein) (Bohmann, 1990), die Modulation der Degradation von Transkriptionsfaktoren bietet eine noch stärkere (weniger leicht reversible) Form der Regulierung (Desterroet al., 2000). Transkriptionsfaktoren, deren funktionelle Aktivität auf der Ebene ihres Abbaus reguliert wird, umfassen NF & kgr; B (Desterroet al., 2000), c-Myc (Sears et al., 1999), und c-Fos (Ferrara et al., 2003), unter anderen. In vielen Fällen ist die Phosphorylierung ein Schlüsselregulator für die Stabilität eines Transkriptionsfaktors, wie für c-Fos gezeigt wurde (Okazaki und Sagata, 1995; Tsurumi et al., 1995), Fos-verwandtes Antigen-1 (Fra-1) (Fläschchen und Marshall, 2003), Fra-2 (Manabeet al., 2001), c-Juni (Fuchs et al., 1996), JunB (Fuchs et al., 1997), ATF2 (Fuchs et al., 2000) und p53 (Buschmann et al., 2001). Unsere Studien fügen somit ΔFosB zu dieser Liste von Transkriptionsfaktoren hinzu, deren funktionelle Aktivität durch ihre phosphorylierungsabhängige Stabilität reguliert wird.
CK2 ist eine allgegenwärtige und konstitutiv aktive Ser / Thr-Kinase mit> 300 angeblichen Substraten, die bisher identifiziert wurden und an mehreren biologischen Prozessen beteiligt sind, einschließlich Zelltod und Überleben (Litchfield, 2003; Unger et al., 2004), zelluläre Stressreaktionen (Yanagawa et al., 1997; Kato et al., 2003) und DNA-Reparatur und Chromatin Remodelling (Barz et al., 2003; Krohn et al., 2003). Mehr als ein Drittel der mutmaßlichen Substrate von CK2 sind Proteine, die an der Regulation der Genexpression beteiligt sind (Meggio und Pinna, 2003). Tatsächlich wurde gezeigt, dass CK2 eine herausragende Nuklearkinase ist (Krek et al., 1992) (zur Überprüfung, siehe Yu et al., 2001) und mit den bZIP-Domänen mehrerer Transkriptionsfaktoren interagieren (Yamaguchi et al., 1998). Es wurde auch gezeigt, dass CK2-vermittelte Phosphorylierung den Abbau vieler Proteine, einschließlich IkB, moduliert (entweder verstärkt oder vermindert).Schwarz et al., 1996), PTEN (Torres und Pulido, 2001), Linsenverbindung (Yinet al., 2000), Chromatin-assoziiertes Protein HMG1 (Wisniewski et al., 1999) und mehrere Transkriptionsfaktoren wie HMGB (Stemmer et al., 2002), Myf-5 (Winter et al., 1997) und c-Myc (Channavajhala und Seldin, 2002). CK2 ist am häufigsten im Gehirn vorhanden (Alcazar et al., 1988; Girault et al., 1990), und seine Aktivität wurde mit vielen Aspekten der Gehirnfunktion in Verbindung gebracht, einschließlich des neuronalen Überlebens (Boehning et al., 2003), Unterscheidung (Nuthall et al., 2004), Ionenkanalfunktion (Jones und Yakel, 2003; Bildl ua, 2004) und Langzeitpotenzierung und neuronale Plastizität (Diaz-Nido et al., 1992; Lieberman und Mody, 1999; Reikhardt et al., 2003).
Trotz dieser wachsenden Evidenz für die Rolle von CK2 bei der Regulierung der neuronalen Funktion ist wenig darüber bekannt, was seine Aktivität steuert. Es wird angenommen, dass CK2 konstitutiv aktiv ist, mit der Regulierung seiner Fähigkeit, spezifische Substrate zu phosphorylieren, die hauptsächlich auf Veränderungen in seiner intrazellulären Lokalisierung angewiesen sind (z. B. Cytosol vs. Nukleus) (Ahmed und Tawfic, 1994; Yu et al., 1999). Diese Information wirft eine wichtige Frage auf, welche Signale benötigt werden, um nach chronischer Stimulation eine ΔFosB-Akkumulation im Gehirn zu induzieren (Abb. 7C). Eine Voraussetzung ist die wiederholte Aktivierung des fosB Gen und Induktion von ΔFosB-mRNA (Chen et al., 1995). Unsere Daten zeigen, dass die CK2-Phosphorylierung von ΔFosB für seine Stabilität kritisch ist, was darauf hindeutet, dass ein zweites Signal für die Langzeitwirkungen von ΔFosB auf die Genexpression erforderlich ist, nämlich ein Signal, das die Phosphorylierung von Protein durch CK2 stimuliert. Dies könnte die Aktivierung von CK2 durch einen unbekannten Mechanismus oder dessen Translokation in den Zellkern beinhalten. Alternativ kann die CK2-Phosphorylierung von ΔFosB konstitutiv sein, so dass, wenn das ΔFosB-Protein als Reaktion auf jeden Stimulus translatiert wird, ein Teil davon phosphoryliert und dadurch stabilisiert wird, so dass es sich bei wiederholter Stimulation in betroffenen Neuronen zu hohen Spiegeln ansammelt.
Unsere Ergebnisse zeigen, dass CK2 und S27 wahrscheinlich nicht die einzige Kinase und Stelle sind, die für die Phosphorylierung von ΔFosB verantwortlich ist, da weder die Hemmung von CK2 noch die S27A-Mutation die Phosphorylierung von ΔFosB vollständig verhindern konnten. Aus dem gleichen Grund spricht die Tatsache, dass die S27A-Mutation zu einer 30% -Reduktion von Phospho-ΔFosB führt, dass S27 eine Hauptphosphorylierungsstelle auf dem Protein ist. Wir untersuchen jedoch noch andere mutmaßliche Kinasen und Phosphorylierungsstellen auf ΔFosB. Letztlich wird es auch wichtig sein, die Phosphorylierung von S27 und anderen Phosphorylierungsstellen in & Dgr; FosB im Gehirn zu analysieren in vivo nach verschiedenen Arten der chronischen Stimulation, zum Beispiel durch die Verwendung von Massenspektrometrie oder phosphospezifischen Antikörpern.
Wie oben erwähnt, ist S27 in & Dgr; FosB während der gesamten Evolution und unter anderen Proteinen der Fos-Familie hochkonserviert. Die Consensus-Site für CK2 ist jedoch nicht: wie in Figure 5B, nur FosB / ΔFosB (und das Zebrafisch-Xenolog), aber nicht c-Fos oder Fra-2, besitzen einen sauren Rest bei + 3, einer Schlüsseldeterminante der CK2-Phosphorylierung (Marin et al., 1986; Meggio et al., 1994). Daher könnte das Fehlen der CK2-Phosphorylierung auf S27 erklären, warum andere Proteine der Fos-Familie nicht so stabil sind wie ΔFosB. Dies erklärt jedoch nicht, warum FosB voller Länge, das die gleiche CK2-Konsensusstelle wie ΔFosB aufweist, nicht in ähnlicher Weise stabilisiert ist. Wir wissen nicht, ob FosB voller Länge durch CK2 an diesem konservierten Rest phosphoryliert wird. Die einzigen Berichte von FosB (Skinner et al., 1997) und c-Fos (Okazaki und Sagata, 1995; Chen et al., 1996) Phosphorylierung beschreibt Stellen in der C-terminalen Region dieser Proteine, die in ΔFosB nicht vorkommen. Die potentielle Phosphorylierung von FosB-Proteinen voller Länge und anderer Fos-Familie-Proteine durch CK2 erfordert direkte Untersuchung. Jedoch, selbst wenn sie phosphoryliert sind, ist bekannt, dass die Proteine der anderen Fos-Familie Motive an ihren C-Termini enthalten, die auf die Proteine für einen schnellen Abbau zielen (Papavassiliouet al., 1992; Jariel-Encontreet al., 1997; Acquaviva et al., 2002). Zum Beispiel wurde gezeigt, dass eine Strecke von ~ 21-Resten, die im C-Terminus aller Proteine der Fos-Familie vorhanden sind, aber in ΔFosB nicht vorhanden sind, als destabilisierende Domäne für c-Fos wirkt (Acquaviva et al., 2001). Wir fanden, dass, obwohl diese Sequenz in ähnlicher Weise das FosB in voller Länge destabilisiert (Carle ua, 2004), die Abwesenheit dieser Domäne in ΔFosB nicht vollständig für seine Stabilisierung. Vielmehr scheint die Kombination der Abwesenheit dieser C-terminalen Domäne und der Ser27-Phosphorylierung den ungefähr fünffachen Unterschied in der Stabilität zwischen ΔFosB und FosB vollständig zu erklären.
Obwohl der Abbau von Proteinen der Fos-Familie komplex und nicht vollständig verstanden ist, scheint der proteasomale Abbau der Hauptweg zu sein (Salvat et al., 1999; Acquaviva et al., 2002; Ferrara et al., 2003). Die hier vorgestellten Daten, in denen proteasomale Inhibitoren die Rate des ΔFosB-Abbaus nicht signifikant verändern, argumentieren, dass ΔFosB im Gegensatz zu anderen Proteinen der Fos-Familie das 26S-Proteasom umgeht, und dies spielt eine zentrale Rolle bei seiner Stabilisierung. Wir schlagen daher ein Schema vor, bei dem die erhöhte Stabilität von ΔFosB auf die Kombination zweier Hauptfaktoren zurückzuführen ist: (1) das Fehlen einer C-terminalen destabilisierenden Domäne und (2) die Phosphorylierung von S27 durch CK2.
Zusammenfassend liefert die vorliegende Studie mechanistische Erkenntnisse darüber, warum ΔFosB ein Produkt des unmittelbaren frühen Gens ist fosBIm Gegensatz zu allen anderen Fos-Familienmitgliedern ist es ein relativ langlebiges Protein. Obwohl angenommen wird, dass andere Proteine der Fos-Familie eine schnelle, aber vorübergehende Stimulus-Transkription-Kopplung vermitteln (Morgan und Curran, 1995), vermittelt die relative Stabilität von ΔFosB ihm die Fähigkeit, länger anhaltende Transkriptionsveränderungen zu vermitteln, die durch chronische Stimulation induziert werden. Dies unterstützt die Ansicht, dass & Dgr; FosB als ein anhaltender molekularer Schalter im Gehirn funktioniert und akute Reaktionen allmählich in chronische Anpassungen umwandelt. Die Identifizierung der Ser27-Phosphorylierung als zentraler Mechanismus für die Stabilität von ΔFosB eröffnet neue Wege für die Entwicklung von Mitteln, um die Funktion von ΔFosB zu regulieren und dadurch seine Langzeitwirkungen auf neurale und Verhaltensplastizität zu modulieren.
Vorherige SektionNächster Abschnitt
Fußnoten
- Empfangen November 21, 2005.
- Revision erhalten Februar 21, 2006.
- Akzeptiert April 2, 2006.
- Diese Arbeit wurde von einer Nationalen Allianz für Forschung über Schizophrenie und Depression Young Investigator Award an PGU, einem nationalen Institut für Drogenmissbrauch (NIDA) National Research Service Award an PGU, und Zuschüsse vom National Institute of Mental Health und NIDA an EJN We unterstützt danke Dr. James Bibb für seine Hilfe bei der in vitro Phosphorylierungsassays, Dr. Ming-Hu Han für seine Hilfe bei der Herstellung von Gehirnschnitten, die für die metabolische Markierung verwendet werden, und Dr. Rachael Neve für ihre Hilfe bei der Verpackung der rekombinanten HSVs.
- Derzeitige Adresse von G. Rudenko: Life Sciences Institute und Abteilung für Pharmakologie, Universität von Michigan, 210 Washtenaw Avenue Nr. 3163A, Ann Arbor, MI 48109-2216.
- Korrespondenz sollte an Eric J. Nestler, 5323 Harry Hines Boulevard, Dallas, TX 75390-9070 adressiert werden. Email: [E-Mail geschützt]
Referenzen
Acquaviva C, Brockly F, Ferrara P, Bossis G, Salvat C, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2001) Identifizierung eines C-terminalen Tripeptidmotivs, das an der Kontrolle des schnellen proteasomalen Abbaus von c-Fos-Protoonkoprotein während des G (0) -zu-S-Phasenübergangs beteiligt ist. Onkogen 20:7563-7572.
Acquaviva C, Bossis G, Ferrara P, Brockly F., Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2002) Mehrere Abbauwege für Proteine der Fos-Familie. Ann NY Acad Sci 973:426-434.
Ahmed K, Tawfic S (1994) Mechanismus der intrazellulären Regulation der Proteinkinase CK2: Rolle der Reiz-vermittelten subnuklearen Assoziation. Zelle Mol Biol Res 40:539-545.
Alcázar A, Martin E, López-Fando J, Salinas M (1988) Ein verbessertes Reinigungsverfahren und Eigenschaften der Caseinkinase II aus dem Gehirn. Neurochem 13:829-836.
Andersson M., Westin JE, Cenci MA (2003) Zeitverlauf striataler DeltaFosB-ähnlicher Immunreaktivitäts- und Prodynorphin-mRNA-Spiegel nach Absetzen der chronischen dopaminomimetischen Behandlung. Eur J Neurosci 17:661-666.
Barz T, Ackermann K, Dubois G, Eils R, Pyerin W (2003) Genomweite Expressionsbilder weisen auf eine globale Rolle der Proteinkinase CK2 beim Chromatin Remodeling hin. J Cell Sci 116:1563-1577.
Zusammenfassung / KOSTENLOSER Volltext
Beh I, Schmidt R., Hecker E (1989) Zwei in HL-60-Zellen gefundene Isozyme von PKC zeigen einen Unterschied in der Aktivierung durch den Phorbolester TPA. FEBS Lett 249:264-266.
Bildl W, Straussmaier T, Thurm H, Andersen J, Eble S, Oliver D, Knipper M, Mann M, Schulte U, Adelman JP, Fakler B (2004) Die Proteinkinase CK2 wird zusammen mit Ca (2 +) - aktivierten K + -Kanälen mit geringer Leitfähigkeit zusammengesetzt und reguliert das Channel Gating. Neuron 43:847-858.
Bing G, Wang W, Qi Q, Feng Z, Hudson P, Jin L, W W Zhang, Bing R, Hong JS (1997) Langzeitexpression von Fos-verwandtem Antigen und transiente Expression von Delta FosB assoziiert mit Anfällen im Hippocampus und Striatum der Ratte. J Neurochem 68:272-279.
Blom N, Sicheritz-Ponten T, Gupta R, Gammeltoft S, Brunak S (2004) Vorhersage der posttranslationalen Glykosylierung und Phosphorylierung von Proteinen aus der Aminosäuresequenz. Proteomics 4:1633-1649.
Boehning D, Mond C, Sharma S, Verletzte KJ, Hester LD, Ronnett GV, Shugar D, Snyder SH (2003) Kohlenmonoxid-Neurotransmission, aktiviert durch CK2-Phosphorylierung von Hämoxygenase-2. Neuron 40:129-137.
Bohmann (1990) Transkriptionsfaktor-Phosphorylierung: eine Verbindung zwischen Signaltransduktion und der Regulation der Genexpression. Krebszellen 2:337-344.
Buschmann T., Potapova O, Bar-Shira A., Ivanov VN, Fuchs SY, Henderson S., Fried VA, Minamoto T., Alarcon-Vargas D., Pincus MR, Gaarde WA, Holbrook N.J., Holilok N.J. (2001) Jun NH2-terminale Kinase-Phosphorylierung von p53 auf Thr-81 ist wichtig für p53-Stabilisierung und transkriptionelle Aktivitäten als Reaktion auf Stress. Mol Cell Biol 21:2743-2754.
Zusammenfassung / KOSTENLOSER Volltext
Carle TL, Ulery PG, Nestler EJ (2004) Das Fehlen einer konservierten C-terminalen Domäne der Fos-Familie trägt zur einzigartigen Stabilität von deltaFosB bei. Soc Neurosci Abstr 30: 692.2.
Channavajhala P, Seldin DC (2002) Funktionelle Interaktion der Proteinkinase CK2 und c-Myc in der Lymphomagenese. Onkogen 21:5280-5288.
Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y, Hoffnung BT, Nestler EJ (1995) Regulation von Delta FosB und FosB-ähnlichen Proteinen durch elektrokonvulsive Anfälle und Kokainbehandlungen. Mol Pharmacol 48:880-889.
Chen J, Kelz MB, Hoffnung BT, Nakabeppu Y, Nestler EJ (1997) Chronische Fos-verwandte Antigene: Stabile Varianten von ΔFosB, die im Gehirn durch chronische Behandlungen induziert werden. J Neurosci 17:4933-4941.
Zusammenfassung / KOSTENLOSER Volltext
Chen RH, Juo PC, Curran T, Blenis J (1996) Die Phosphorylierung von c-Fos am C-Terminus verstärkt seine transformierende Aktivität. Onkogen 12:1493-1502.
Choe ES, Parelkar NK, Kim JY, Cho HW, Kang HS, Mao L, Wang JQ (2004) Der Proteinphosphatase 1 / 2A-Inhibitor Okadasäure erhöht die CREB- und Elk-1-Phosphorylierung und c-fos-Expression im Rattenstriatum in vivo. J Neurochem 89:383-390.
Cochet C, Chambaz EM (1983) Polyamin-vermittelte Proteinphosphorylierungen: ein mögliches Ziel für die intrazelluläre Polyaminwirkung. Mol Cell Endocrinol 30:247-266.
Cochet C, Feige JJ, Chambaz EM (1983) Katalytische und molekulare Eigenschaften einer hochgereinigten Caskinase vom G-Typ aus Rinderlungengewebe. Biochim Biophys Acta 743:1-12.
Colby CR, Whisler K, Steffen C., Nestler EJ, Self DW (2003) Striatale zelltypspezifische Überexpression von DeltaFosB erhöht den Anreiz für Kokain. J Neurosci 23:2488-2493.
Zusammenfassung / KOSTENLOSER Volltext
Daunais JB, Roberts DC, McGinty JF (1993) Die Selbstverabreichung von Kokain erhöht Preprodynorphin, aber nicht c-fos, mRNA im Striatum der Ratte. Neurobericht 4:543-546.
Desterro JM, Rodríguez MS, Hay RT (2000) Regulation von Transkriptionsfaktoren durch Proteinabbau. Zelle Mol Leben Sci 57:1207-1219.
Diaz-Nido J, Armas-Portela R, Avila J (1992) Die Zunahme der cytoplasmatischen Kaseinkinase II-Aktivität begleitet das Auswachsen von Neuriten nach der Hemmung der DNA-Synthese in NIA-103-Neuroblastomzellen. J Neurochem 58:1820-1828.
Di Maira G, Salvi M, Arrigoni G, Marin O, Sarno S, Brustolon F, Pinna LA, Ruzzene M (2005) Die Proteinkinase CK2 phosphoryliert und reguliert Akt / PKB hoch. Zelltod unterscheidet sich 12:668-677.
P. Dobrazanski, T. Noguchi, K. Kovary, CA Rizzo, PS Lazo, Bravo R. (1991) Beide Produkte des fosB-Gens, FosB und seine kurze Form, FosB / SF, sind Transkriptionsaktivatoren in Fibroblasten. Mol Cell Biol 11:5470-5478.
Zusammenfassung / KOSTENLOSER Volltext
Ferrara P, Andermarcher E, Bossis G, Acquaviva C, Brockly F., Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2003) Die strukturellen Determinanten, die für den proteasomalen Abbau des c-Fos-Proteins verantwortlich sind, unterscheiden sich je nach den Bedingungen der Expression. Onkogen 22:1461-1474.
Fuchs SY, Dolan L., Davis RJ, Ronai Z (1996) Phosphorylierung-abhängiges Targeting der c-Jun Ubiquitinierung durch Jun N-Kinase. Onkogen 13:1531-1535.
Fuchs SY, Xie B, Adler V., Fried VA, Davis RJ, Ronai Z (1997) c-Jun-NH2-terminale Kinasen zielen auf die Ubiquitinierung ihrer assoziierten Transkriptionsfaktoren ab. J Biol Chem 272:32163-32168.
Zusammenfassung / KOSTENLOSER Volltext
Fuchs SY, Tappin I., Ronai Z (2000) Die Stabilität des ATF2-Transkriptionsfaktors wird durch Phosphorylierung und Dephosphorylierung reguliert. J Biol Chem 275:12560-12564.
Zusammenfassung / KOSTENLOSER Volltext
Girault JA, Hemmings HC Jr., Williams KR, Nairn AC, Greengard P (1989) Phosphorylierung von DARPP-32, einem Dopamin- und cAMP-regulierten Phosphoprotein, durch Caseinkinase II. J Biol Chem 264:21748-21759.
Zusammenfassung / KOSTENLOSER Volltext
Girault JA, Hemmings HC Jr., Zorn SH, Gustafson EL, Greengard P (1990) Charakterisierung im Säugetiergehirn einer DARPP-32-Serinkinase, die mit Caseinkinase II identisch ist. J Neurochem 55:1772-1783.
Hanada M. Sugawara K. Kaneta K. Toda S. Nishiyama K. Tomita K. Yamamoto H. Konishi M. Oki T. (1992) Epoxomicin, ein neues Antitumormittel mikrobiellen Ursprungs. J Antibiot (Tokio) 45:1746-1752.
Hann SR, Eisenman RN (1984) Proteine, die vom humanen c-myc-Onkogen kodiert werden: differentielle Expression in neoplastischen Zellen. Mol Cell Biol 4:2486-2497.
Zusammenfassung / KOSTENLOSER Volltext
Hemmings HC Jr., Girault JA, Williams KR, LoPresti MB, Greengard P (1989) ARPP-21, ein zyklisches AMP-reguliertes Phosphoprotein (Mr = 21,000), angereichert mit Dopamin-innervierten Hirnregionen. Aminosäuresequenz der durch zyklisches AMP in intakten Zellen phosphorylierten Stelle und kinetische Untersuchungen seiner Phosphorylierung in vitro. J Biol Chem 264:7726-7733.
Hidaka H, Kobayashi R (1992) Pharmakologie von Proteinkinase-Inhibitoren. Annu Rev Pharmacol Toxicol 32:377-397.
Hirata H, Bessho Y, Kokubu H, Masamizu Y, Yamada S, Lewis J, Kageyama R (2004) Die Instabilität des Hes7-Proteins ist für die Somit-Segmentierungsuhr entscheidend. Nat Genet 36:750-754.
Hiroi N., Graybiel AM (1996) Atypische und typische neuroleptische Behandlungen induzieren unterschiedliche Programme der Transkriptionsfaktorexpression im Striatum. J Comp Neurol 374:70-83.
Hoffnung B, Kosofsky B, Hyman SE, Nestler EJ (1992) Regulation der unmittelbaren frühen Genexpression und AP-1-Bindung im Rattenkern accumbens durch chronisches Kokain. Proc Natl Acad Sci USA 89:5764-5768.
Zusammenfassung / KOSTENLOSER Volltext
Hoffnung BT, Kelz MB, Duman RS, Nestler EJ (1994a) Die Behandlung mit chronischem Elektrokrampfanfall (ECS) führt zur Expression eines langanhaltenden AP-1-Komplexes im Gehirn mit veränderter Zusammensetzung und Eigenschaften. J Neurosci 14:4318-4328.
Hoffnung BT, Nye HE, Kelz MB, Selbst DW, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, Duman RS, Nestler EJ (1994b) Induktion eines langanhaltenden AP-1-Komplexes aus veränderten Fos-ähnlichen Proteinen im Gehirn durch chronisches Kokain und andere chronische Behandlungen. Neuron 13:1235-1244.
Ishida A, Fujisawa H (1995) Stabilisierung der Calmodulin-abhängigen Proteinkinase II durch die autoinhibitorische Domäne. J Biol Chem 270:2163-2170.
Zusammenfassung / KOSTENLOSER Volltext
Jariel-Encontre I, Salvat C., Steff AM, Pariat M, Acquaviva C, Furstoss O, Piechaczyk M (1997) Komplexe Mechanismen für den Abbau von c-fos und c-jun. Mol Biol Rep 24:51-56.
Jones S., Yakel JL (2003) Caseinkinase ii (Proteinkinase ck2) reguliert die Serotonin 5-ht (3) -Rezeptor-Kanalfunktion in ng108-15-Zellen. Neurowissenschaften 119:629-634.
Kato T Jr., Delhase M, Hoffmann A, Karin M (2003) CK2 ist eine C-terminale IkappaB-Kinase, die für die Aktivierung von NF-kappaB während der UV-Reaktion verantwortlich ist. Mol Cell 12:829-839.
Kelz MB, Chen J, Carlezona WA Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Selbst DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR, Nestler EJ (1999) Die Expression des Transkriptionsfaktors deltaFosB im Gehirn steuert die Empfindlichkeit gegenüber Kokain. Natur 401:272-276.
Kim KB, Myung J, Sünde N, Crews CM (1999) Proteasom-Hemmung durch die Naturstoffe Epoxomicin und Dihydroeponemycin: Einblicke in Spezifität und Potenz. Bioorg Med Chem 9:3335-3340.
Kobayashi E, Nakano H., Morimoto M., Tamaoki T. (1989) Calphostin C (UCN-1028C), eine neuartige mikrobielle Verbindung, ist ein hochpotenter und spezifischer Inhibitor der Proteinkinase C. Biochem Biophys Res Commun 159:548-553.
W Krek, Maridor G, Nigg EA (1992) Casein-Kinase II ist ein überwiegend nukleäres Enzym. J Zelle Biol 116:43-55.
Zusammenfassung / KOSTENLOSER Volltext
Krohn NM, Stemmer C, Fojan P, Grimm R, Grasser KD (2003) Die Proteinkinase CK2 phosphoryliert das hochmobile Gruppendomänenprotein SSRP1 und induziert die Erkennung von UV-geschädigter DNA. J Biol Chem 278:12710-12715.
Zusammenfassung / KOSTENLOSER Volltext
Kumar A, Choi KH, Renthal W, Tsankova NM, Theobald DEH, Truong HT, Russo SJ, LaPlant Q, Whistler K, Neve RL, Selbst DW, Nestler EJ (2005) Chromatin-Remodelling ist ein Schlüsselmechanismus, der der Kokain-induzierten Plastizität im Striatum zugrunde liegt. Neuron 48:303-314.
Lieberman DN, Mody I (1999) Casein-Kinase-II reguliert die NMDA-Kanalfunktion in Hippocampus-Neuronen. Nat Neurosci 2:125-132.
Litchfield DW (2003) Proteinkinase CK2: Struktur, Regulation und Rolle in zellulären Entscheidungen von Leben und Tod. Biochem J 369:1-15.
Manabe T, Kuramoto N, Nakamichi N, Aramachi K, Baba K, Hirai T, Yoneyama M, Yoneda Y (2001) Abbau von c-Fos-Protein, ausgedrückt durch N-Methyl-d-Asparaginsäure in Kernfraktionen des murinen Hippocampus. Brain Res. 905:34-43.
Mandelzys A, Gruda MA, Bravo R, Morgan JI (1997) Fehlen eines anhaltend erhöhten 37-kDa-fos-verwandten Antigens und AP-1-ähnlicher DNA-Bindungsaktivität in den Gehirnen von Kainsäure-behandelten fosB-Null-Mäusen. J Neurosci 17:5407-5415.
Zusammenfassung / KOSTENLOSER Volltext
Marin O, Meggio F, Marchiori F, Borin G, Pinna LA (1986) Ortsspezifität von Caseinkinase-2 (TS) aus Rattenleberzytosol. Eine Studie mit Peptidsubstraten. Eur J Biochem 160:239-244.
McClung CA, Nestler EJ (2003) Regulation der Genexpression und Kokainbelohnung durch CREB und DeltaFosB. Nat Neurosci 6:1208-1215.
McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V., Berton O, Nestler EJ (2004) DeltaFosB: ein molekularer Schalter für die langfristige Anpassung im Gehirn. Gehirn Res Mol Gehirn Res 132:146-154.
Meggio F, Pinna LA (2003) Eintausendeinundsiebzig Substrate der Proteinkinase CK2? FASEB J 17:349-368.
Zusammenfassung / KOSTENLOSER Volltext
Meggio F, Donella Deana A, Pinna LA, Moret V (1977) Phosphorylierung von Kaseinfraktionen durch Rattenleber-Phosvitinkinase. FEBS Lett 75:192-196.
Meggio F, Brunati morgens, Pinna LA (1983) Autophosphorylierung von Typ-2-Casein-Kinase-TS an seinen alpha- und beta-Untereinheiten. Einfluss verschiedener Effektoren. FEBS Lett 160:203-208.
Meggio F, Shugar D, Pinna LA (1990) Ribofuranosyl-Benzimidazol-Derivate als Inhibitoren von Casein-Kinase-2 und Casein-Kinase-1. Eur J Biochem 187:89-94.
Meggio F, Marin O, Pinna LA (1994) Substratspezifität der Proteinkinase CK2. Zelle Mol Biol Res 40:401-409.
Miller C, Zhang M., He Y, Zhao J., Pelletier JP, Martel-Pelletier J., Di Battista JA (1998) Transkriptionsinduktion des Cyclooxygenase-2-Gens durch Okadainsäure-Inhibition der Phosphataseaktivität in humanen Chondrocyten: Co-Stimulation von AP-1- und CRE-Kernbindungsproteinen. J-Zell-Biochem 69:392-413.
Moratalla R, Elibol B, Vallejo M, Graybiel morgens (1996) Veränderungen auf der Ebene der Expression von induzierbaren Fos-Jun-Proteinen im Striatum während der Behandlung und des Entzugs von Kokain. Neuron 17:147-156.
Morgan JI, Curran T (1995) Immediate-Early-Gene: zehn Jahre später. Trends Neurosci 18:66-67.
Nakabeppu Y, Nathans D (1991) Eine natürlich vorkommende verkürzte Form von FosB, die die Transkriptionsaktivität von Fos / Jun hemmt. Zelle 64:751-759.
Nestler EJ, Barrot M, Selbst DW (2001) Delta FosB: ein nachhaltiger molekularer Schalter für Sucht. Proc Natl Acad Sci USA 98:11042-11046.
Zusammenfassung / KOSTENLOSER Volltext
Neve RL, Howe JR, Hong S, Kalb RG (1997) Einführung der Glutamat-Rezeptor-Untereinheit 1 in Motorneuronen in vitro und in vivo unter Verwendung eines rekombinanten Herpes-Simplex-Virus. Neurowissenschaften 79:435-447.
Nuthall HN, Joachim K, Stifani S (2004) Phosphorylierung von Serin 239 von Groucho / TLE1 durch Proteinkinase CK2 ist wichtig für die Hemmung der neuronalen Differenzierung. Mol Cell Biol 24:8395-8407.
Zusammenfassung / KOSTENLOSER Volltext
Okazaki K, Sagata N (1995) Der Mos / MAP-Kinase-Stoffwechselweg stabilisiert c-Fos durch Phosphorylierung und verstärkt seine transformierende Aktivität in NIH-3T3-Zellen. EMBO J 14:5048-5059.
Palombella VJ, Rando OJ, Goldberg, AL, Maniatis T (1994) Der Ubiquitin-Proteasom-Weg wird benötigt, um das NF-kappa-B1-Vorläuferprotein und die Aktivierung von NF-kappa B zu prozessieren. Zelle 78:773-785.
Papavassiliou AG, M. Treier, C. Chavrier, D. Bohmann (1992) Gezielter Abbau von c-Fos, aber nicht von v-Fos, durch ein Phosphorylierungs-abhängiges Signal auf c-Jun. Forschung 258:1941-1944.
Zusammenfassung / KOSTENLOSER Volltext
Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, Chao J, Duman C, Steffen C, Monteggia L, Allen MR, Stock JL, Duman RS, McNeish JD, Barrot M, Self DW, Nestler EJ , Schaeffer E (2003) Die induzierbare, für die Hirnregion spezifische Expression einer dominant negativen Mutante von c-Jun in transgenen Mäusen verringert die Empfindlichkeit gegenüber Kokain. Brain Res. 970:73-86.
Perrotti LI, Hadeishi Y, Ulery PG, Barrot M, Monteggia L, Duman RS, Nestler EJ (2004) Induktion von DeltaFosB in belohnungsbezogenen Hirnstrukturen nach chronischem Stress. J Neurosci 24:10594-10602.
Zusammenfassung / KOSTENLOSER Volltext
Persico AM, Schindler CW, O'Hara BF, Brannock MT, Uhl GR (1993) Hirn Transkriptionsfaktor Expression: Auswirkungen von akuten und chronischen Amphetamin und Injektionsstress. Gehirn Res Mol Gehirn Res 20:91-100.
Ploegh HL, Dunn BM (2000) Posttranslationale Modifikation: Phosphorylierung und Phosphatasen. In: Aktuelle Protokolle in der Proteinforschung (Dunn BM, Hrsg.) Pp. 13.01-13.02. New York: Wiley und Söhne.
Pyerin W., Burow E., Michaely K., Kübler D., Kinzel V. (1987) Katalytische und molekulare Eigenschaften von hochgereinigter Phosvitin / Casein-Kinase Typ II aus menschlichen Epithelzellen in Kultur (HeLa) und Beziehung zur Ecto-Proteinkinase. Biol Chem Hoppe Seyler 368:215-227.
Reikhardt BA, Kulikova OG, Borisowa GY, Aleksandrova IY, Sapronov NS (2003) Status des "Proteinkinase CK2-HMG14" -Systems bei altersbedingter Amnesie bei Ratten. Neurosci Behav Physiol 33:799-804.
Roberts BJ, Whitelaw ML (1999) Abbau des basischen Helix-Loop-Helix / Per-ARNT-Sim-Homologie-Dioxinrezeptors über den Ubiquitin / Proteasom-Weg. J Biol Chem 274:36351-36356.
Zusammenfassung / KOSTENLOSER Volltext
Rost B, Yachdav G, Liu J (2004) Der PredictProtein-Server. Nukleinsäuren Res 32:W321-W326.
Zusammenfassung / KOSTENLOSER Volltext
Rylski M, Kaczmarek L (2004) Ap-1 Ziele im Gehirn. Front Biosci 9:8-23.
Sahin B, Kansy JW, Nairn AC, Spychala J, Ealick SE, Fienberg AA, Greene RW, Bibb JA (2004) Molekulare Charakterisierung von rekombinanter Maus-Adenosin-Kinase und Evaluierung als Ziel für Protein-Phosphorylierung. Eur J Biochem 271:3547-3555.
Salvat C, Aquaviva C, Jariel-Encontre I, Ferrara P, Pariat M, Steff AM, Carillo S, Piechaczyk M (1999) Gibt es mehrere proteolytische Wege, die zum Abbau von c-Fos, c-Jun und p53 in vivo beitragen? Mol Biol Rep 26:45-51.
Schmidt R, Hecker E (1975) Autoxidation von Phorbolestern unter normalen Lagerbedingungen. Krebs Res 35:1375-1377.
Schwarz EM, Van Antwerpen D, Verma IM (1996) Die konstitutive Phosphorylierung von IkappaBalpha durch Caseinkinase II erfolgt bevorzugt bei Serin 293: Voraussetzung für den Abbau von freiem IkappaBalpha. Mol Cell Biol 16:3554-3559.
Zusammenfassung / KOSTENLOSER Volltext
Sears R, G Leone, DeGregori J, Nevins JR (1999) Ras erhöht die Myc-Proteinstabilität. Mol Cell 3:169-179.
Silva-Neto MA, Fialho E., Paes MC, Oliveira PL, Masuda H (2002) Cyclische Nukleotid-unabhängige Phosphorylierung von Vitellin durch Casein-Kinase II, die aus Rhodnius prolixus-Oozyten gereinigt wurde. Insekt Biochem Mol Biol 32:847-857.
Skinner M, Qu S, Moore C, Weisheit R (1997) Transkriptionelle Aktivierung und Transformation durch FosB-Protein erfordern Phosphorylierung der Carboxyl-terminalen Aktivierungsdomäne. Mol Cell Biol 17:2372-2380.
Zusammenfassung / KOSTENLOSER Volltext
Stemmer C, Schwander A, Bauw G, Fojan P, Grasser KD (2002) Die Proteinkinase CK2 phosphoryliert die chromosomalen Proteine der hochmobilen Gruppe B (HMGB) von Mais chromosomal und moduliert deren Stabilität und DNA-Wechselwirkungen. J Biol Chem 277:1092-1098.
Zusammenfassung / KOSTENLOSER Volltext
Stevens I, Derua R, Rondelez E, Waelkens E, Merlevede W, Goris J (1999) Identifizierung von Cyk, einer Cyclin-B2-Kinase, als eine neue Calcium / Calmodulin-abhängige Proteinkinase II und ihre Rolle während der Oocytenreifung von Xenopus laevis. Exp. Zelle Res 252:303-318.
Suh HW, Choi SS, Lee JK, Lee HK, Han EJ, Lee J (2004) Regulation der c-fos- und c-jun-Genexpression durch Lipopolysaccharide und Zytokine in primären kultivierten Astrozyten: Effekt von PKA- und PKC-Signalwegen. Arch Pharm Res 27:396-401.
Szyszka R, Boguszewska A, Grankowski N, Ballesta JP (1995) Differentielle Phosphorylierung ribosomaler saurer Proteine aus Hefezellen durch zwei endogene Proteinkinasen: Caseinkinase-2 und 60S-Kinase. Acta Biochim Pol 42:357-362.
Tamaoki T., Takahashi I., Kobayashi E., Nakano H., Akinaga S., Suzuki K. (1990) Calphostin (UCN1028) und Calphostin verwandte Verbindungen, eine neue Klasse von spezifischen und potenten Inhibitoren der Proteinkinase C. Adv Second Messenger Phosphoprotein Res 24:497-501.
Torres J, Pulido R (2001) Der Tumorsuppressor PTEN wird durch die Proteinkinase CK2 an seinem C-Terminus phosphoryliert. Implikationen für PTEN-Stabilität gegenüber Proteasom-vermittelter Degradation. J Biol Chem 276:993-998.
Zusammenfassung / KOSTENLOSER Volltext
Tsubuki S, Saito Y, Tomioka M, Ito H, Kawashima S (1996) Differentielle Hemmung der Calpain- und Proteasomaktivitäten durch Peptidylaldehyde von Di-Leucin und Tri-Leucin. J Biochem (Tokio) 119:572-576.
Zusammenfassung / KOSTENLOSER Volltext
Tsurumi C, Ishida N, Tamura T, Kakizuka A, Nishida E, Okumura E, Kishimoto T, Inagaki M, Okazaki K, Sagata N (1995) Der Abbau von c-Fos durch das 26S Proteasom wird durch c-Jun und multiple Proteinkinasen beschleunigt. Mol Cell Biol 15:5682-5687.
Zusammenfassung / KOSTENLOSER Volltext
Unger GM, Davis AT, Slaton JW, Ahmed K (2004) Proteinkinase CK2 als Regulator des Zellüberlebens: Implikationen für die Krebstherapie. Curr Cancer Drug Targets 4:77-84.
Fläschchen E, Marshall CJ (2003) Erhöhte ERK-MAP-Kinaseaktivität schützt das FOS-Familienmitglied FRA-1 vor proteasomalem Abbau in Kolonkarzinomzellen. J Cell Sci 116:4957-4963.
Zusammenfassung / KOSTENLOSER Volltext
Werme M, Messer C, Olson L, Gilden L, Thoren P, EJ Nestler, Brene S (2002) ΔFosB regelt den Lauf der Räder. J Neurosci 22:8133-8138.
Zusammenfassung / KOSTENLOSER Volltext
Whitmarsh AJ, Davis RJ (2000) Regulation der Transkriptionsfaktorfunktion durch Phosphorylierung. Zelle Mol Leben Sci 57:1172-1183.
Winter B, Kautzner I, Issinger OG, Arnold HH (1997) Zwei putative Proteinkinase-CK2-Phosphorylierungsstellen sind für die Myf-5-Aktivität wichtig. Biol. Chem 378:1445-1456.
Wisniewski JR, Szewczuk Z, Petry I, Schwanbeck R, Renner U (1999) Die konstitutive Phosphorylierung der sauren Enden der 1-Proteine mit hoher Mobilität durch Casein-Kinase II verändert ihre Konformation, Stabilität und DNA-Bindungsspezifität. J Biol Chem 274:20116-20122.
Zusammenfassung / KOSTENLOSER Volltext
Yamaguchi Y, Wada T, Suzuki F, Takagi T, Hasegawa J, Handa H (1998) Casein-Kinase II interagiert mit den bZIP-Domänen verschiedener Transkriptionsfaktoren. Nukleinsäuren Res 26:3854-3861.
Zusammenfassung / KOSTENLOSER Volltext
Yanagawa T., Yuki K., Yoshida H., Bannai S., Ishii T. (1997) Phosphorylierung von A170-Stressprotein durch Casein-Kinase-II-ähnliche Aktivität in Makrophagen. Biochem Biophys Res Commun 241:157-163.
Yankulov K, Yamashita K, Roy R, JM Egly, Bentley DL (1995) Der transkriptionelle Elongationsinhibitor 5,6-dichloro-1-beta-d-Ribofuranosylbenzimidazol inhibiert Transkriptionsfaktor IIH-assoziierte Proteinkinase. J Biol Chem 270:23922-23925.
Zusammenfassung / KOSTENLOSER Volltext
Yen J, Weisheit RM, Tratner I, Verma IM (1991) Eine alternative gespleißte Form von FosB ist ein negativer Regulator der Transkriptionsaktivierung und -transformation durch Fos-Proteine. Proc Natl Acad Sci USA 88:5077-5081.
Zusammenfassung / KOSTENLOSER Volltext
Yin X, Jedrzejewski PT, Jiang JX (2000) Casein-Kinase II phosphoryliert Linsen-Connexin 45.6 und ist an dessen Abbau beteiligt. J Biol Chem 275:6850-6856.
Zusammenfassung / KOSTENLOSER Volltext
Yoza BK, Brooks JW, Mizel SB (1992) Induktion von AP-1-Transkriptionsfaktor-Komponenten während der T-Zell-Aktivierung durch Interleukin 1 und Phorbolester. Zellwachstum unterscheiden 3:677-684.
Yu S, Wang H., Davis A, Ahmed K. (2001) Konsequenzen der CK2-Signalisierung für die Kernmatrix. Mol Cell Biochem 227:67-71.
Yu S, Davis AT, Guo C, Grün JE, Ahmed K (1999) Differentielles Targeting der Proteinkinase CK2 auf die Kernmatrix bei vorübergehender Überexpression ihrer Untereinheiten. J-Zell-Biochem 74:127-134.
Zachariou V., Bolanos CA, Selley DE, Theobald D., Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchmann T., O. Berton, Sim-Selley L., DiLeone RJ, A. Kumar, Nestler EJ (2006) ΔFosB: eine essentielle Rolle für ΔFosB im Nucleus Accumbens in der Morphinwirkung. Nat Neurosci 9:205-211.
Artikel, die diesen Artikel zitieren
- Verhaltens- und Strukturreaktionen auf chronisches Kokain erfordern eine Feedforward-Schleife, die {Delta} -FosB und Calcium / Calmodulin-abhängige Proteinkinase II in der Nucleus-Accumbens-Schale einbezieht Journal of Neuroscience, 6 März 2013, 33(10):4295-4307
- Striatale Überexpression von {FosB} reproduziert chronische Levodopa-induzierte unwillkürliche Bewegungen Journal of Neuroscience, 26 Mai 2010, 30(21):7335-7343
- Abstract
- Full Text
- Volltext (PDF)
- Abstract
- Full Text
- Volltext (PDF)
- Abstract
- Full Text
- Volltext (PDF)
- Abstract
- Full Text
- Volltext (PDF)
- Transkriptionsmechanismen der Abhängigkeit: Rolle von {Delta} FosB Philosophical Transactions der Royal Society B: Biological Sciences, 12 Oktober 2008, 363(1507):3245-3255
- Endgültige Anfälligkeit für die Wiederherstellung des Methamphetamin-Suchverhaltens in aus Gliazelllinien stammenden neurotrophen Faktor-mutierten Mäusen Das FASEB Journal, 1 Juli 2007, 21(9):1994-2004
- Der Activator Protein-1-Transkriptionsfaktor in der respiratorischen Epithelkarzinogenese Molekulare Krebsforschung, 1 Februar 2007, 5(2):109-120