Quelle
Abteilung für Zell- und Neurobiologie, Keck School of Medicine, Universität von Südkalifornien, Los Angeles, CA 90033, USA.
Abstrakt
Anabole androgene Steroid (AAS) Missbrauch ist weit verbreitet. Darüber hinaus verstärken AAS, wie durch Selbstverwaltung in Nagetieren gezeigt. Die Rezeptoren, die die verstärkende Wirkung von AAS vermitteln, sind jedoch unklar. AAS kann an klassische nukleäre Androgenrezeptoren (ARs) oder Membranrezeptoren binden. Wir verwendeten zwei Ansätze, um die Rolle nuklearer AR bei der AAS-Selbstverwaltung zu untersuchen. Zunächst testeten wir die Androgen-Selbstverabreichung bei Ratten mit der testikulären Feminisierungsmutation (Tfm), die die Androgenbindung stört. Wenn nukleäre ARs für die Selbstverwaltung der AAS essentiell sind, sollten Tfm-Männchen Androgene nicht selbst verabreichen. Tfm-Männchen und Wildtyp- (WT) Wurfgeschwister verabreichten das nicht-aromatisierbare Androgen-Dihydrotestosteron (DHT) oder das Vehikel intracerebroventrikulär (ICV) bei Fixed-Ratio-Zeitplänen (FR) bis FR5. Sowohl Tfm- als auch WT-Ratten gewannen eine Präferenz für den aktiven Nasepoke während der DHT-Selbstverabreichung (66.4 +/- 9.6-Antworten / 4 h für Tfm und 79.2 +/- 11.5 für WT-Antworten / 4 h), und Nasenstöpsel nahmen zu FR-Anforderung erhöht. Die Präferenzwerte waren signifikant niedriger bei Ratten, die sich selbst verabreichten (42.3 +/- 5.3 Antworten / 4 h für Tfm und 19.1 +/- 4.0 Antworten / 4 h für WT). Wir testeten auch die Selbst-Verabreichung von DHT, konjugiert an Rinderserumalbumin (BSA) an C3 und C17, das auf Wirkungen an der Zelloberfläche beschränkt ist. Hamster durften DHT-, BSA- und DHT-BSA-Konjugate für 15-Tage bei FR1 selbst verabreichen. Die Hamster zeigten eine signifikante Präferenz für DHT (18.0 +/- 4.1 Antworten / 4 h) oder DHT-BSA Konjugate (10.0 +/- 3.7 Antworten / 4 h und 21.0 +/- 7.2 Antworten / 4 h), aber nicht für BSA (2.5 + / -2.4 Antworten / 4 h). Zusammengefasst zeigen diese Daten, dass nukleare ARs nicht für die Selbstverabreichung von Androgen erforderlich sind. Darüber hinaus kann die Androgen-Selbstverabreichung durch Plasmamembran-Rezeptoren vermittelt werden.
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Anabol-androgene Steroide (AAS) sind Drogen des Missbrauchs. Diese Testosteron (T) -Derivate werden für sportliche und ästhetische Zwecke verwendet (Yesalis et al., 1993). Die Nebenwirkungen reichen von Hypogonadismus und Gynäkomastie bis hin zu Herz- und Leberfunktionsstörungen (Leshner, 2000). Darüber hinaus häufen sich Hinweise, dass AAS-Missbrauch Stimmungsschwankungen verursacht (Papst und Katz, 1994), Aggression (Choi und Papst, 1994, Kouri et al., 1995), und kann Abhängigkeit erzeugen (Brower et al., 1991, Brower, 2002). Trotz wachsender Bedenken wurden die zugrunde liegenden Mechanismen des Missbrauchs von AAS nicht gut verstanden.
Im Menschen wird argumentiert, dass die Initiierung der AAS-Anwendung weitgehend durch anabole Effekte motiviert ist, aber einige Missbraucher entwickeln schließlich Abhängigkeit (Brower, 2002). Beweise aus der Tierforschung unterstützen diese Hypothese. AAS induziert konditionierte Platzpräferenz (CPP) in Mäusen (Arnedo et al., 2000) und Ratten (Packard et al., 1997, Packard et al., 1998, Frye et al., 2002). Darüber hinaus konsumieren Hamster freiwillig AAS oral (Holz, 2002), intravenös (Wood et al., 2004), und intracerebroventricular (ICV) Selbstverwaltung (DiMeo und Holz, 2004, Triemstra und Holz, 2004, Wood et al., 2004, DiMeo und Holz, 2006b).
Während die ICV-Selbstverabreichung zentrale Wirkorte vorschlägt, sind die spezifischen Hormone und Rezeptoren, die die AAS-Verstärkung vermitteln, unklar. Aktuelle Beweise deuten darauf hin, dass die verstärkenden Effekte von T durch Androgene statt durch Östrogene nach der Aromatisierung vermittelt werden. Männliche Hamster werden Dihydrotestosteron (DHT; DiMeo und Holz, 2006b) und andere nicht aromatisierbare Androgene (Ballard und Holz, 2005). Zusätzlich wird die T-Selbstverabreichung durch das Antiandrogen Flutamid blockiert (Peters und Holz, 2004). Die Frage wird nun: Wie wird das androgene Signal im Gehirn transduziert?
Der Androgenrezeptor (AR) ist ein klassischer nukleärer Steroidrezeptor, der als Transkriptionsfaktor fungiert. ARs sind in Strukturen, die mit Drogenmissbrauch assoziiert sind, wie dem Nucleus Accumbens (Acb) und dem ventralen Tegmentum (VTA; Simerly et al., 1990, Holz und Newman, 1999). Es gibt auch Hinweise auf gonadale Steroide, die über Zelloberflächenrezeptoren wirken (Mermelstein et al., 1996, Zhu et al., 2003, Thomas et al., 2006, Vasudevan und Pfaff, 2007).
In der vorliegenden Studie verwendeten wir zwei Ansätze, um die Rolle der klassischen nuklearen AR in der Androgenverstärkung zu bestimmen. Um die mögliche Aktivierung von Östrogenrezeptoren (ER) zu minimieren, testeten wir die DHT-Selbstverwaltung. In dem ersten Experiment wurden Ratten mit der testikulären Feminisierungsmutation (Tfm) auf ICV-Selbstverabreichung von DHT getestet. Tfm ist eine Einzelbasensubstitution, die zu defekten ARs mit begrenzter Ligandenbindung führt (Yarbrough et al., 1990). Männliche Tfm-Ratten weisen aufgrund einer unzureichenden androgenen Stimulation während der Entwicklung einen äußeren weiblichen Phänotyp auf (Zuloaga et al., 2008b). Wenn funktionelle nukleäre ARs für die AAS-Verstärkung erforderlich sind, sollten Tfm-Ratten DHT nicht selbst verabreichen. Stattdessen konnten Tfm-Ratten DHT-Selbstverwaltung erwerben. Im zweiten Experiment testeten wir die ICV-Selbstverabreichung von membranundurchlässigen DHT-Formen bei Hamstern. Wenn DHT an Rinderserumalbumin (BSA) konjugiert ist, sind seine Wirkungen auf Zelloberflächenrezeptoren beschränkt. Wenn nukleare ARs für die Androgenverstärkung erforderlich sind, sollten Hamster DHT, das an BSA konjugiert ist, nicht selbst verabreichen. Im Gegensatz dazu zeigten die Hamster eine deutliche Präferenz für an BSA konjugiertes DHT. Zusammen zeigen diese Studien, dass nukleare ARs nicht für die Selbstverabreichung von Androgen benötigt werden. Stattdessen kann die Androgenverstärkung durch Membran-ARs vermittelt werden.
Methoden und Materialien
Themen
Ratten
Erwachsene männliche Tfm-Ratten und Wildtyp- (WT) Wurfgeschwister wurden von einer Kolonie an der Michigan State University erhalten. Ihr Genotyp wurde mittels PCR, ähnlich wie zuvor beschrieben, verifiziert (Fernandez et al., 2003). Kurz gesagt wurden die Ohrclips über Nacht bei 55 ° C in Lysepuffer, der Proteinase K enthielt, verdaut und dann bei 95 ° für 30 Minuten hitzeinaktiviert. AR wurde unter Verwendung des Vorwärtsprimers 5'-GCAACTTGCATGTGGATGA-3 'und des Rückwärtsprimers 5'-TGAAAACCAGGTCAGGTGC-3' amplifiziert, was ein 135bp-Produkt ergab. Amplifizierte Proben wurden dann mit Sau96I Restriktionsenzym (R0165L, New England BioLabs, Ipswich, MA) über Nacht bei 37 ° C verdaut und auf einem 3% Agarosegel laufen gelassen. Nur der WT AR wird mit diesem Restriktionsenzym geschnitten, wobei zwei Banden unter 100bp zurückbleiben, während der Tfm AR ungeschnitten bleibt. Tfm Tiere wurden auch durch den Phänotyp, durch die Anwesenheit von Brustwarzen, weibliche Anogenitalabstände und Bauchhoden verifiziert. Tfm-Ratten wurden früher verwendet, um nicht-genomische Androgeneffekte im Hippocampus nachzuweisen (MacLusky et al., 2006). Zu Beginn des Experiments waren WT-Ratten zwischen 75 bis 140-Tag alt, und Tfm-Ratten waren zwischen 75 und 138-Tag alt.
Hamster
Erwachsene männliche syrische Hamster (130 - 150 g) wurden von Charles River Laboratories (Wilmington, MA) erhalten. Die Tiere wurden einzeln in einem umgekehrten Lichtzyklus (14L: 10D) mit Nahrung und Wasser gehalten ad libitum. Alle experimentellen Verfahren wurden von tierärztlichen Tierschutz - und Tierarztausschüssen der jeweiligen Institutionen genehmigt und in Übereinstimmung mit den Richtlinien durchgeführt Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren (NationalResearchRat, 1996).
Chirurgie
Allen Tieren wurde eine 22g-Edelstahl-Führungskanüle (Plastic One, Roanoke, VA) in den Seitenventrikel implantiert [Ratte: AP: 0.7, ML: -1.8, DV: -4.0 ~ -5.0 (Paxinos und Watson, 1998); Hamster: AP: + 1.0, ML, + 1.0, DV: -3.0 ~ -5.0 (Morin und Holz, 2001), mm von bregma], unter Na+ Pentobarbitalanästhesie (Ratte: 50 mg / kg, Hamster: 100mg / kg) wie zuvor beschrieben (Wood et al., 2004). Alle chirurgischen Eingriffe wurden unter aseptischen Bedingungen durchgeführt Prinzipien der Labortierpflege (NIH, 1985). Die Tiere konnten sich nach der Operation vor dem Testen für mindestens eine Woche erholen.
Drogen
DHT, DHT-Carboxymethyl-Oxim (CMO), DHT-CMO-BSA, DHT-Hemisuccinat (Hemis) und DHT-Hemis-BSA wurden von Steraloiden (Newport, RI) erhalten. In DHT-CMO-BSA ist DHT mit BSA an der C3-Position mit CMO als Linker konjugiert. In ähnlicher Weise ist DHT mit BSA an der C17-Position über Hemis verbunden, um DHT-Hemis-BSA zu bilden. Beide DHT-CMO-BSA (Gatson et al., 2006) und DHT-Hemis-BSA (Braun und Thomas, 2003) wurden bereits verwendet, um mögliche Wirkungen von Androgenen an der Plasmamembran zu untersuchen. DHT wurde in einer wässrigen Lösung von 13% & bgr; -Cyclodextrin (& bgr; CD, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) bei 1 & mgr; g / & mgr; l gelöst. Wie aus unserer früheren Studie mit Hamstern hervorgeht, produziert diese Dosis robuste operante Reaktion während der ICV-Selbstverabreichung (DiMeo und Holz, 2006b). DHT-Derivate wurden in dem gleichen Vehikel bei der molaren Äquivalentkonzentration von DHT (DHT-CMO: 1.25 & mgr; g / & mgr; l, DHT-CMO-BSA: 8.7 & mgr; g / & mgr; l, DHT-Hemis: 1.34 & mgr; g / & mgr; l, DHT-Hemis-BSA) gelöst : 8.83 & mgr; g / & mgr; l). BSA (Sigma-Aldrich) wurde in dem gleichen Vehikel bei 7.45 & mgr; g / & mgr; l gelöst, um die molare Äquivalentkonzentration von BSA wie in DHT-CMO-BSA und DHT-Hemis-BSA zu erreichen. BSA-haltige Arzneimittel wurden täglich unmittelbar vor der Verwendung hergestellt, um einen Abbau zu vermeiden, und alle Lösungen wurden durch einen 0.22 & mgr; m-Filter filtriert. Frühere Studien haben gezeigt, dass nur ein kleiner Teil der Steroide von BSA dissoziiert (Stevis et al., 1999), und diese Menge reicht nicht aus, um signifikante androgene Wirkungen zu induzieren (Lieberherr und Grosse, 1994, Gatson et al., 2006). In ähnlicher Weise hat unsere frühere Studie gezeigt, dass DHT bei 1.0 & mgr; g / & mgr; l, aber nicht bei 0.1 & mgr; g / & mgr; l (DiMeo und Holz, 2006b). Daher ist es unwahrscheinlich, dass freies DHT (> 10%) in ausreichender Menge von BSA dissoziiert, um die Selbstverabreichung zu unterstützen.
Apparatur
Die Tiere durften sich 4-Stunden / Tag, 5-Tage / Woche in einer operanten Kammer (Med Associates, St. Albans, VT) in einer schalldämpfenden Kammer mit Zwangsbelüftung selbst verabreichen. Jede Kammer war mit einem Hauslicht, 2-Nasenlochlöchern und einer computergesteuerten Spritzenpumpe ausgestattet, die mit einer Flüssigkeit verbunden war, die an einem Waagenarm schwenkbar war. Lösungen von einer 100 & mgr; l-Glasspritze wurden durch Tygon-Schläuche, die mit dem Drehgelenk verbunden waren, an das Tier abgegeben. Der Schlauch, der den Wirbel und die ICV-Kanüle verbindet, wurde durch eine Metallfeder geschützt. Die Wirkstofflösung oder das Vehikel wurde über eine interne 28-ga- Kanüle, die unmittelbar vor dem Test in die Führungskanüle eingeführt wurde, abgegeben. Jede Infusion lieferte 1 & mgr; l der Lösung bei 0.2 & mgr; l / s. Nasenlöcher befanden sich 6 cm vom Boden unter dem Hauslicht. Eines der Nasenlöcher wurde als aktives Nasenloch bezeichnet. Eine Antwort auf dieses Loch wurde als aktiver Nasenstocher (R: aktiv-verstärkt) aufgezeichnet und auf die Antwortanforderung (FR1 bis 5) zum Auslösen einer Infusion gezählt. Sobald eine Infusion ausgelöst wurde, wurde das Hauslicht gelöscht und das aktive Loch wurde während der 5-Infusion beleuchtet, um die Unterscheidung des aktiven Nasenlochs zu erleichtern. Während des 5-s-Timeout-Zeitraums wurde während des XNUMX-s-Nose-Stosses ein Stochern beobachtet, das jedoch nicht zur weiteren Verstärkung gezählt wurde (NR: aktiv-nicht-verstärkt). Eine Reaktion auf das andere Nasenloch wurde als inaktiver Nasenstocher (I) aufgezeichnet, führte jedoch zu keiner Infusion. Die Position des aktiven Nasenlochlochs an der Vorderseite oder der Rückseite der Kammer wurde ausgeglichen, um Seitenpräferenzen zu steuern. Die Daten wurden von der WMPC-Software (Med Associate) auf einem Windows-PC aufgezeichnet.
ICV-Selbstverwaltung
Ratten
Die Selbstverabreichung von DHT in Tfm- und WT-Ratten folgte einem aufsteigenden Fixed-Ratio-Zeitplan (FR) von FR1 zu FR5. Die Ratten wurden zunächst auf FR1 trainiert, wobei jede Reaktion auf den aktiven Nasenstöpsel verstärkt wurde. Danach wurde die Anzahl der Antworten, die erforderlich waren, um eine Infusion zu erhalten, um jeweils einen 5-Tag erhöht. Bei FR5 waren fünf Antworten auf das aktive Nasenloch für eine Infusion erforderlich. Insgesamt wurden Ratten an FR1 für 10-Tage und FR2 bis FR5 (jeweils 5-Tage) für insgesamt 30-Tage getestet. Ratten von jedem Genotyp wurden zufällig entweder DHT- oder Vehikel- (Veh) -Gruppen zugeordnet und durften sich jeweils DHT oder das & beta; CD-Vehikel selbst verabreichen. Sechsunddreißig Ratten (nWT = 19, ntFM = 17) wurden in diesem Experiment verwendet.
Hamster
Hamster wurden unter einem FR1-Plan für 15-Tage getestet. In früheren Studien waren 15-Tage der ICV T-Selbstverwaltung ausreichend, um eine Präferenz für den aktiven Nasenstöpsel zu erhalten. Hamster wurden randomisiert DHT (n = 8), DHT-CMO (n = 9), DHT-CMO-BSA (n = 10), DHT-Hemis (n = 11), DHT-Hemis-BSA (n = 8 ) oder BSA (n = 9) Gruppen.
Datenanalyse
Ratten
Die täglichen Präferenzwerte für den aktiven Nasenstöpsel wurden durch Subtrahieren von inaktiven Nasenstöcken von der Summe von aktiv verstärkten und aktiven nicht verstärkten Nasenstöcken (R + NR-I) bestimmt. Der mittlere Präferenzwert wurde für jedes Tier von den letzten 5-Tagen von FR1 und während FR2 bis FR5 berechnet. Zusätzlich wurde die durchschnittliche Anzahl der Verstärkungen pro Sitzung für jedes Tier bei jeder FR verglichen.
Die Daten wurden durch 3-Weg-ANOVA mit Genotyp (WT oder Tfm), Arzneimittel (DHT oder Vehikel) und FR-Zeitplan (1 ~ 5) als zwischen Subjektfaktoren analysiert. Der FR-Zeitplan wurde als Zwischenfaktor behandelt, da einige Tiere aufgrund der Verstopfung der ICV-Führungskanüle nicht die gesamten 30-Testtage absolvierten. In diesen Fällen wurden nur die Daten der fertiggestellten Pläne in die Analysen einbezogen. Die Anzahl der Tiere in jeder Bedingung ist in gezeigt Tabelle 1. Eine Drei-Wege-ANOVA wurde gefolgt von entsprechenden ANOVAs niedrigerer Ordnung für einfache Effekte. Der Newman-Keuls-Test für post-hoc-paarweise Vergleiche wurde bei Bedarf verwendet.
Tabelle 1
Hamster
Die einzelnen Mittel von R, NR und I wurden für die Datenanalyse verwendet. Der Präferenz-Score für jedes Tier wurde durch Subtrahieren des mittleren inaktiven Nasen-Stochers (I) von dem mittleren aktiven Nasen-Stocher (R + NR-I) bestimmt. Der mittlere Präferenz-Score wurde mit einer Ein-Probe analysiert t-test gegen 0 (dh keine Präferenz) für jede Gruppe. Zusätzlich wurde die Anzahl der erhaltenen Verstärkungen für jedes Tier gemittelt. Die mittlere Verstärkung, die für jede Arzneimittelgruppe erhalten wurde, wurde mit der von BSA-Kontrollen mit 2-unabhängigen Proben verglichen t-Prüfung. Tiere, die ein Minimum an 5-Sitzungen nicht beendeten, wurden von der Analyse ausgeschlossen (1 jeweils von DHT-Hemis und DHT-Hemis-BSA-Gruppen).
Alle statistischen Analysen wurden unter Verwendung von SPSS 12 (SPSS Inc., Chicago, IL) durchgeführt. Für alle Analysen, p <0.05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Die Daten sind als Mittelwert ± SEM pro 4-stündiger Sitzung dargestellt.
Ergebnisse
WT- und Tfm-Ratten verabreichen DHT selbst
Operant antwortet
Feigen. 1 veranschaulicht die mittlere Präferenz für aktiven Nasenstich (R + RN - I) an jedem FR für DHT- und Veh-Gruppen. Ratten, die DHT selbst verabreichten, zeigten eine größere Präferenz für den aktiven Nasenstich (73.1 ± 7.6 bzw. 4 Stunden) im Vergleich zu Fahrzeugkontrollen (29.8 ± 3.5 bzw. 4 Stunden; F.1,145 = 31.77, p <0.001). Es gab auch einen Haupteffekt des FR-Zeitplans (F.4,145 = 4.25, p <0.01), Genotyp-Arzneimittel-Wechselwirkung (F.1,145 = 5.27, p = 0.02) und eine Drug-FR-Schedule-Interaktion (F4,145 = 2.60, p = 0.02). Es gab keinen Haupteffekt des Genotyps und andere Wechselwirkungen waren nicht signifikant.
Post-hoc-Tests zeigten, dass die Ratten, die sich DHT selbst verabreichten, eine signifikant größere Präferenz gegenüber dem FR-Schema zeigten (F4,73 = 4.18, p <0.01), zunehmende Präferenz von FR1 (33.4 ± 4.4 bzw. 4 Stunden) gegenüber FR4 (110.8 ± 26.7 bzw. 4 Stunden) und FR5 (106.4 ± 18.9 bzw. 4 Stunden). In dieser Gruppe wurde keine Auswirkung des Genotyps beobachtet (Genotyp-FR-Zeitplan: F.4,73 = 0.13, ns; Genotyp: F1,73 = 0.86, ns).
Im Gegensatz dazu zeigten die Ratten, die sich selbst verabreichten Veh, keine Änderung gegenüber dem FR-Schema (F4,72 = 0.31, ns), und keine Genotyp-FR-Schedule-Interaktion (F4,72 = 0.12, ns). Anders als bei DHT zeigten Tfm - Ratten in dieser Gruppe eine höhere Präferenz als WT (42.3 ± 5.3 bzw. 19.1 ± 4.0 resps / 4h; F4,72 = 11.81, p <0.01).
Infusionen
Die durchschnittliche Anzahl der DHT - und Veh - Infusionen, die bei jeder FR erhalten wurden, ist in Abb.. 2. Insgesamt erhielten Ratten mehr Infusionen, wenn sie DHT (26.9 ± 2.2 & mgr; g / 4h) gegen Vehikel (15.4 ± 1.9 & mgr; l / 4h, F1,145 = 14.70, p <0.001). Es gab auch einen Haupteffekt des FR-Zeitplans (F.1,145 = 3.32, p = 0.01) und Genotyp-Arzneimittel-Interaktion (F1,145 = 6.41, p = 0.01). Alle anderen Wechselwirkungen und Haupteffekte waren nicht signifikant.
Die durchschnittliche tägliche Aufnahme von DHT über alle FR-Zeitpläne war ähnlich bei Tfm (24.3 ± 2.9 & mgr; g / 4hr) und WT (29.4 ± 3.4 & mgr; g / 4h) Ratten. In beiden Gruppen blieb die Medikamentenaufnahme konstant, während der FR - Zeitplan zunahm (F4,73 = 0.54, ns). Während FR1 verabreichten Tfm- und WT-Männchen DHT selbst bei 24.5 ± 2.3 & mgr; g / 4h bzw. 37.3 ± 6.7 & mgr; g / 4h. Unter einem FR5-Zeitplan durchschnitt die DHT-Selbst-Verabreichung 18.3 ± 4.5 & mgr; g / 4h für Tfm und 23.9 ± 5.9 & mgr; g / 4h für WT-Ratten. Diese Gruppe zeigte keine Genotyp- oder Genotyp-FR-Schedule-basierten Unterschiede (F1,73 = 1.17, ns; F4,73 = 0.34, ns, jeweils).
Im Gegensatz dazu nahm sowohl bei Tfm - als auch bei WT - Ratten die Anzahl der Fahrzeuginfusionen signifikant ab, als die FR - Anforderung zunahm (F4,72 = 4.73, p <0.01). Etwas überraschend verabreichten sich Tfm-Ratten ungefähr doppelt so viel Vehikel (20.7 ± 2.4 μl / 4 h) wie WT-Ratten (10.7 ± 1.4 μl / 4 h, F.1,72 = 7.77, p <0.01). Bei Tfm-Ratten bei FR1 überstieg die Anzahl der Vehikelinfusionen (39.9 ± 13.2 μl / 4 h) die Anzahl der DHT-Infusionen (24.5 ± 2.3 μl / 4 h). Am Ende des Experiments war die Selbstverabreichung des Vehikels jedoch auf 10.3 ± 2.4 & mgr; l / 4 h gesunken. Ebenso verabreichten WT-Ratten 18.6 ± 4.1 & mgr; l / 4 h Vehikel bei FR1 selbst, was bei FR6.6 auf 1.8 ± 4 & mgr; l / 5 h abnahm.
Das mittlere Körpergewicht zu Beginn jedes FR-Plans und die Anzahl der Tiere in jedem Zustand sind in gezeigt Tabelle 1. Die WT - Ratten waren signifikant schwerer als Tfm - Ratten (F1,174 = 144.62, p <0.001) und alle Gruppen nahmen mit der Zeit an Gewicht zu (F.5,174 = 5.59, p <0.001). Es gab keine Auswirkung des Arzneimittelzustands (DHT vs Veh) auf das Körpergewicht (F.1, 174 = 0.31, ns) oder irgendeine Interaktion. Die auf das Körpergewicht angepasste DHT-Aufnahme war bei beiden Genotypen sowohl bei FR1 (WT: 77.9 & mgr; g / kg, Tfm: 65.4 & mgr; g / kg) als auch FR5 (WT: 46.5 & mgr; g / kg, Tfm: 42.6 & mgr; g / kg) ähnlich.
Syrische Hamster selbst verabreichen DHT, das an BSA konjugiert ist
Operant antwortet
Hamster selbst verabreicht DHT und DHT konjugiert mit BSA, aber nicht BSA allein. Abb. 3a zeigt die mittlere Präferenz (aktiv - inaktiv Nasenstiche) für DHT, BSA, DHT-CMO-BSA und DHT-Hemis-BSA, DHT-CMO, DHT-Hemis. In Übereinstimmung mit unseren früheren Studien entwickelten Hamster eine Präferenz für den aktiven Nasenstich während der DHT-Selbstverabreichung (t7 = 4.34, p <0.01), zeigte jedoch keine Präferenz bei der Selbstverabreichung von BSA (t8 = 1.03, ns). Ebenso zeigten Hamster eine Präferenz für den aktiven Nasepoke mit DHT-CMO-BSA (t9 = 2.71, p = 0.02) und DHT-Hemis-BSA (t7 = 2.92, p = 0.02). Mit DHT an Linkern allein, Hamster selbst verabreicht DHT-CMO (t8 = 3.91, p <0.01), zeigte jedoch keine signifikante Präferenz bei der Selbstverabreichung von DHT-Hemis (t10 = 1.87, p = 0.09). Bei DHT-Hemis waren die Reaktionen auf den aktiven Nasenstöpsel (40.5 ± 10.3 bzw. 4h) ähnlich wie bei DHT-Hemis-BSA (41.2 ± 11.4 bzw. 4h), aber diese Männchen zeigten auch erhöhte Reaktionen auf die inaktive Nase (28.7 ± 6.6 bzw. 4h) verglichen mit denen für DHT-Hemis-BSA (20.3 ± 4.4 bzw. 4h).
Infusionen
Die Anzahl der Infusionen, die für jede Gruppe erhalten wurden, ist in Abb. 3b. Hamster erhielten signifikant mehr DHT- als BSA-Infusionen (t15 = 3.04, p = 0.01). In ähnlicher Weise erhielten Hamster mehr Infusionen, wenn sie DHT-Hemis-BSA selbst verabreichen (t15 = 2.72, p = 0.02) oder DHT-CMO (t16 = 2.70, p = 0.02) im Vergleich zu BSA. Die Anzahl der Infusionen, die für DHT-CMO-BSA- (17.2 ± 3.2 & mgr; l / 4hr) und DHT-Hemis (22.7 ± 5.9 & mgr; l / 4hr) -Gruppen erhalten wurden, waren ähnlich denen selbst verabreichenden DHT, DHT-Hemis-BSA und DHT- CMO. Trotzdem erhielten die Hamster nicht signifikant mehr DHT-CMO-BSA (t17 = 1.96, p = 0.07) oder DHT-Hemis (t18 = 1.91, p = 0.07) im Vergleich zu BSA.
Überdosis
Elf von 55-Hamstern starben, bevor alle 15-Testsitzungen beendet waren. Todesfälle aufgrund einer Androgenüberdosierung während der Testosteron-Selbstverabreichung wurden bereits beschrieben (Peters und Holz, 2005). In der vorliegenden Studie starb 2 von 8-Männern (25%) während der DHT-Selbstverabreichung, ähnlich dem 24-Wert, der für eine Überdosierung von Testosteron berichtet wurde (Peters und Holz, 2005). Die Selbstbehandlung von DHT-CMO und DHT-Hemis war mit den höchsten Verlusten (3 von 8 pro Gruppe, 38%) assoziiert, während es bei Hamstern, die BSA (1 von 9, 11%) oder DHT selbst verabreichten, nur wenige Todesfälle gab -Hemis-BSA (0 von 8). Wie bei der Überdosierung mit Testosteron starb keiner der Hamster in der vorliegenden Studie während der Selbstverabreichung. Stattdessen starben Hamster einige Stunden später in ihren eigenen Käfigen mit schweren Bewegungsstörungen und Atemdepression.
Eine Überdosierung von Testosteron korreliert eng mit der Testosteronaufnahme, insbesondere der maximalen Aufnahme pro Sitzung (Peters und Holz, 2005). Abb.. 4 vergleicht die Präferenzwerte, die Anzahl der erhaltenen Verstärkungen und die Spitzenaufnahme für Hamster, die alle 15-Tests absolviert haben, und diejenigen, die dies nicht getan haben. Beide Gruppen zeigten eine signifikante Präferenz für den aktiven Nasenpoke (p <0.05). Die Präferenz war jedoch bei Hamstern, die während der Selbstverabreichung starben (25.7 ± 5.2 bzw. 4 Stunden), signifikant höher als bei denen, die überlebten (9.5 ± 2.0 bzw. 4 Stunden, t53 = 3.42, p <0.01). Hamster, die 15 Sitzungen nicht absolvierten, erhielten mehr als doppelt so viele Infusionen pro Sitzung (31.2 ± 5.0 inf / 4h) wie diejenigen, die alle Sitzungen abgeschlossen hatten (14.8 ± 1.1 inf / 4h, t53 = 5.05, p <0.001). Darüber hinaus war bei Hamstern, die während der Studie starben, die maximale Aufnahme pro Sitzung signifikant höher (77.0 ± 9.8 inf / 4 h) als bei überlebenden Männern (36.1 ± 2.9 inf / 4 h, t53 = 5.41, p <0.001).
Figure 4
Diskussion
Die Selbstverabreichung von Androgen kann durch Membran-assoziierte, nicht jedoch durch Kern-Androgen-Rezeptoren vermittelt werden
Die aktuelle Studie zeigt, dass klassische nukleäre ARs für die Androgen-Selbstverabreichung nicht essentiell sind. Sowohl Tfm- als auch WT-Ratten entwickelten eine Präferenz für den aktiven Nasepoke während der DHT-Selbstverabreichung. Darüber hinaus waren sie in der Lage, auf den aufsteigenden FR-Zeitplan zu reagieren, indem sie das aktive Nasepoking erhöhten, wodurch unabhängig von dem FR-Schema ein kontinuierliches Niveau der Arzneimittelaufnahme aufrechterhalten wurde. Im Gegensatz dazu reagierten Ratten, die ein Vehikel erhielten, nicht auf die Änderungen in dem FR-Plan. Ihre aktiven Nasenpokes nahmen als Reaktion auf Änderungen des FR-Schemas nicht signifikant zu und sie erhielten weniger Infusionen, als die Antwortanforderung zunahm. Da die Ligandenbindung an den "klassischen" nukleären Androgenrezeptor in Tfm-Mutanten beeinträchtigt ist, stützt dies unsere Hypothese, dass Androgenverstärkung über alternative Wege vermittelt wird.
Das unerwartet hohe Ansprechen von Tfm-Ratten auf ein Fahrzeug ist wahrscheinlich nicht auf das Fahrzeug selbst zurückzuführen. Wir beobachteten ähnliche Phänomene in einer separaten Gruppe von Tfm-Ratten, die keine Infusionen erhielten (Daten nicht gezeigt). Stattdessen kann es mit feminisierten Verhaltensmerkmalen in den Tfm-Männchen verwandt sein. Die erhöhten Nasenausstöße durch Tfm-Ratten können analog zu höheren explorativen Kopfsenken sein, die bei weiblichen Ratten beobachtet werden (Braun und Nemes, 2008). Alternativ ist bekannt, dass die Tfm-Ratten und -Mäuse erhöhte angstähnliche Verhaltensweisen aufweisen (Zuloaga et al., 2006, Zuloaga et al., 2008a). Vielleicht, die sedative / anxiolytische Wirkung von DHT (Agren et al., 1999, Arnedo et al., 2000, Frye und Seliga, 2001, Berbos et al., 2002, Peters und Holz, 2005) stumpf die Angst-ähnliche Verhaltensweisen, wenn Tfm Ratten DHT selbst verabreicht.
Zusätzlich liefert die Selbstverabreichung von DHT-BSA-Konjugaten bei männlichen Hamstern den Beweis, dass Androgene an der neuronalen Plasmamembran wirken können, um verstärkende Wirkung zu haben. Hamster zeigten eine signifikante Präferenz für beide DHT-BSA-Konjugate. Die selbst verabreichten Dosen entsprechen unseren früheren Studien zu T, DHT und häufig missbrauchten Steroiden (Ballard und Holz, 2005, DiMeo und Holz, 2006b). Im Gegensatz dazu zeigten Hamster keine Präferenz für BSA allein. Die Daten über Sterblichkeit und Drogenkonsum zeigen, dass DHT und seine Derivate tödlich sein können, was unsere früheren Daten zur T-Überdosierung (Peters und Holz, 2005).
Die aktuelle Studie zeigt ein artspezifisches Muster operanter Reaktionen. Hamster bevorzugen nicht den aktiven Nasepoke während der Selbstverwaltung, wie zuvor gezeigt (Johnson und Wood, 2001, Holz, 2002, DiMeo und Holz, 2004, Triemstra und Holz, 2004, Wood et al., 2004, Ballard und Holz, 2005, DiMeo und Holz, 2006b). Bei Ratten gab es jedoch eine klare Präferenz für einen aktiven Nasepoke unabhängig von dem erhaltenen Arzneimittel. Wir beobachteten einen ähnlichen Trend in unserer früheren Studie zur IV-Selbstverabreichung von T in Ratten, obwohl es statistisch nicht signifikant war (Wood et al., 2004). Basierend auf solchen artspezifischen Verhaltensunterschieden bei der Selbstverabreichung muss beim Vergleich von Verhaltensdaten von Ratten und Hamstern vorsichtig vorgegangen werden.
Es gibt mehrere Einschränkungen, die bei der Interpretation der aktuellen Studie berücksichtigt werden müssen. Erstens sind nukleäre ARs mit signifikant verschlechterter Ligandenbindung noch in Tfm-Ratten vorhanden (Yarbrough et al., 1990), anders als bei Tfm-Mäusen (Er und andere, 1991). Es ist möglich, dass diese mutierten nuklearen AR ausreichend sind, um die Wirkung von Androgenen in supraphysiologischen Dosen zu vermitteln. Zweitens können die DHT-BSA-Konjugate abgebaut werden in vivo, was zu freiem DHT führt. Obwohl dies kein signifikantes Problem zu sein schien in vitro (Lieberherr und Grosse, 1994, Gatson et al., 2006), Grad und Zeitverlauf der DHT-BSA-Degradation in vivo im Gehirn ist derzeit unbekannt. Schließlich können DHT-BSA-Konjugate nicht signifikant in das Hirngewebe eindringen. DHT-BSA ist signifikant größer als DHT, daher werden die in der vorliegenden Studie beobachteten Wirkungen von DHT-BSA wahrscheinlich an Stellen in der Nähe der Ventrikel vermittelt.
Trotz dieser Vorbehalte ergaben diese beiden unterschiedlichen Ansätze konsistente Ergebnisse, die stark gegen die Notwendigkeit nuklearer AR bei der Androgenverstärkung sprechen. Darüber hinaus legt die Selbstverabreichung von BSA-Konjugaten nahe, dass Androgene in der Androgenverstärkung an der Plasmamembran wirken können. Nach unserem Wissen bietet die aktuelle Studie die erste in vivo Hinweise auf verhaltensrelevante Effekte von Androgenen an der Plasmamembran.
Androgene üben eine schnelle nukleare AR-unabhängige Wirkung auf die Belohnung aus
Mehrere andere Studien zur Androgenbelohnung haben Ergebnisse gezeigt, die mit nicht-genomischen oder Plasmamembraneffekten übereinstimmen. CPP entwickelt sich innerhalb von 30 min der systemischen T-Injektion (Alexander ua, 1994), kann ein Zeitverlauf konsistent mit akuten nicht-genomischen Wirkungen von T. CPP auch mit Intra-Acb-Infusionen von T oder seinem Metaboliten (Packard et al., 1997, Frye et al., 2002), obwohl Acb wenig genomisches AR hat. Darüber hinaus exprimiert die VTA Fos als Antwort auf ICV T-Infusion (Dimeo und Holz, 2006a), trotz des Fehlens eines signifikanten klassischen AR-Ausdrucks. Die aktuelle Studie liefert keine Informationen über den Wirkort im Gehirn. Nichtsdestoweniger weist es darauf hin, dass der relative Mangel an nuklearem AR allein kein ausreichender Grund ist, Strukturen wie Acb und VTA von den potentiellen Stellen auszuschließen, die androgene Effekte vermitteln könnten.
Schnelle Plasmamembraneffekte von Steroiden im dorsalen und ventralen Striatum sind nicht auf Androgene beschränkt. Es ist bekannt, dass Gestagene CPP induzieren, möglicherweise über Gamma-Aminobuttersäure (GABA) -Rezeptoren in Acb (Frye, 2007). Östrogene üben auch schnelle, membranrezeptorvermittelte Wirkungen im dorsalen Striatum aus (Mermelstein et al., 1996, Becker und Rudick, 1999). Ein membranassoziierter Rezeptor wurde bereits für Progestine isoliert (Zhu et al., 2003) und es häufen sich Hinweise auf Zelloberflächenrezeptoren für Östrogene Vasudevan und Pfaff, 2007) und Androgene (rezensiert in Thomas et al., 2006). Während Östrogene auch verstärken (DiMeo und Holz, 2006b) scheint die verstärkende Wirkung von T vorwiegend androgen zu sein. Hamster selbst verabreichen nicht aromatisierbare Androgene, wie Drostanolon und DHT (Ballard und Holz, 2005, DiMeo und Holz, 2006b). Zusätzlich kann das Anti-Androgen Flutamid T Selbstverabreichung blockieren (Peters und Holz, 2004). Während dies der Rolle von Membran-AR, die in dieser Studie berichtet wurde, zu widersprechen scheint, wurde berichtet, dass Flutamid auch die Membran-AR-Aktivierung blockiert (Braun und Thomas, 2003, Braun und Thomas, 2004).
Die Eigenschaften von Membran-Androgen-Rezeptoren
Historisch wurde angenommen, dass die Wirkungen von Steroiden, einschließlich Androgene, durch Kernrezeptor-vermittelte Prozesse transduziert werden. Berichte über schnelle Androgenwirkungen, die vermutlich durch Membran-assoziierte Rezeptoren vermittelt werden, sind jedoch seit mehreren Jahrzehnten verfügbar. Zum Beispiel können Androgene im medialen präoptischen Bereich das neuronale Feuern innerhalb von Sekunden verändern (Yamada, 1979) zu Minuten (Pfaff und Pfaffmann, 1969). Darüber hinaus Orsini und Kollegen (Orsini, 1985, Orsini et al., 1985) haben eine schnelle Veränderung der neuronalen Zündfrequenz durch Androgene im lateralen Hypothalamus (LHA) gezeigt. Diese Wirkung von Androgenen in LHA kann für die vorliegende Studie von besonderer Relevanz sein, da bekannt ist, dass die LHA an der Belohnungsschaltung beteiligt ist (Olds und Milner, 1954) und LHA Orexin / Hypocretin wird durch gonadale Steroide reguliert (Muschamp et al., 2007).
Zu den Zelltypen mit möglichen Membran-AR gehören Glia (Gatson et al., 2006), Gonaden (Braun und Thomas, 2003, Braun und Thomas, 2004) und Immunzellen (Benten et al., 1999, Guo et al., 2002), Myozyten (Estrada et al., 2003) und Osteoblasten (Lieberherr und Grosse, 1994). Obwohl die molekulare Identität noch zu bestimmen ist, umfassen die Kandidaten für die Membran AR Membranrezeptoren mit bekannten Steroidbindungsstellen wie GABA-A (Übersicht in Lambert et al., 2003) und NR2-Untereinheiten von N-Methyl-D-Asparaginsäure-Rezeptoren (Malayev et al., 2002). Alternativ haben Thomas und Kollegen (2004) Beweise für einen neuartigen G-Protein-gekoppelten Rezeptor als Membran-AR berichtet. Darüber hinaus können die Wirkungen von Androgenen, die nicht mit einem spezifischen Rezeptor in Zusammenhang stehen, in der aktuellen Studie nicht ausgeschlossen werden.
Aktuelle in vitro Studien legen nahe, dass es mehrere Membran-ARs oder mehr als eine Bindungsstelle an einem einzelnen Rezeptor gibt, wie dies für den Membran-Progesteron-Rezeptor vorgeschlagen wurde (Ramirez et al., 1996). In vielen Zelltypen scheint die Membran AR ein Membranrezeptor zu sein, der an Gq / o gekoppelt ist (Lieberherr und Grosse, 1994, Benten et al., 1999, Zhu et al., 1999, Guo et al., 2002, Estrada et al., 2003). Die Steroidbindungseigenschaften und die Empfindlichkeit gegen Androgene der mutmaßlichen Membran AR variieren jedoch stark in Abhängigkeit vom Zelltyp. Zum Beispiel können Anti-Androgene die Wirkung von DHT auf die Eierstockkrebszellen blockieren (Braun und Thomas, 2003, Braun und Thomas, 2004), während sie in anderen Zelltypen nicht wirksam sind (Lieberherr und Grosse, 1994, Benten et al., 2004, Gatson et al., 2006) oder sogar agonistenähnliche Effekte in Hippocampuszellen (Hecht, 2001, Nguyen et al., 2007) und mehrere Krebszelllinien (Peterziel et al., 1999, Zhu et al., 1999, Evangelou et al., 2000, Papakonsteinti et al., 2003). Darüber hinaus wurden verschiedene T-Bindungseigenschaften für verschiedene Organe in Fischen berichtet (Braun und Thomas, 2004).
Unsere Erfahrung mit häufig missbrauchter AAS zeigt, dass größere Veränderungen am A-Ring (bei C2 und / oder C3) und bei C17 dazu neigen, die Selbstverwaltung zu stören (Ballard und Holz, 2005). Zum Beispiel wird Stanozolol, das eine wesentliche Modifikation an C2 und C3 sowie eine an C17 gebundene Methylgruppe aufweist, nicht selbst verabreicht. In der aktuellen Studie verabreichten Hamster sowohl BSA, konjugiert an C3 (DHT-CMO-BSA) als auch C17 (DHT-Hemis-BSA). Weitere Forschung ist erforderlich, um die Eigenschaften von selbst verabreichten Androgenen aufzuklären.
Klinische Bedeutung
AAS, insbesondere T, sind mit Abstand die häufigsten leistungssteigernden Mittel, die von Sportlern verwendet werden und fast die Hälfte der positiven Dopingtests ausmachen (Welt-Anti-Doping-Agentur, 2006). Angesichts dieser weitverbreiteten Verwendung hat Missbrauch durch AAS weitreichende gesundheitliche Folgen. Herz-und Leber-Nebenwirkungen von AAS-Missbrauch sind gut etabliert (Leshner, 2000). Es wird angenommen, dass diese und die anabolen Effekte von AAS durch nukleare AR vermittelt werden. Die möglichen nukleären AR-unabhängigen Wirkungen von Androgenen legen jedoch nahe, dass der Einfluss von AAS weit über Strukturen mit nukleärer AR-Expression hinausgehen könnte.
Was die Ähnlichkeit mit anderen Drogen betrifft, so haben AAS unterschiedliche Wirkungen und unterschiedliche Wirkungsmechanismen von Stimulanzien. Im Gegensatz zu Stimulanzien (Graybielet al., 1990), AAS induzieren c-Fos-Aktivierung nur in der VTA und nicht in Acb (Dimeo und Holz, 2006a). Außerdem schwächen AAS stimulansinduzierte Acb DA Freisetzung (Birgneret al., 2006) und hemmen die DA-Freisetzung akut (Triemstra et al., 2008). Im Verhalten induzieren AAS keine lokomotorische Aktivierungscharakteristik von Stimulanzien (Peters und Holz, 2005).
Stattdessen ähneln die Verhaltensreaktionen auf akute AAS denen von Opioiden oder Benzodiazepinen, möglicherweise additive Effekte, wenn sie zusammen genommen werden. Akute Exposition gegenüber AAS unterdrückt autonome Funktionen, einschließlich Atmung und Körpertemperatur (Peters und Holz, 2005). AAS-induzierte autonome Depression erinnert an die Symptome einer Opioidüberdosis und wird durch den Opioidantagonisten Naltrexon blockiert (Peters und Holz, 2005). Darüber hinaus potenziert Nandrolon, ein häufig verwendetes AAS, hypothermische Effekte von Morphin und verschlimmert Naloxon-präzipitierte Morphin-Entzugssymptome (Celerieret al., 2003). Darüber hinaus ist bekannt, dass akute AAS sedativ / anxiolytisch wirken (Agren et al., 1999, Arnedo et al., 2000, Frye und Seliga, 2001, Berbos et al., 2002, Peters und Holz, 2005), möglicherweise vermittelt durch ihre direkten Wirkungen auf GABA-A-Rezeptoren (Masonis und McCarthy, 1995, Masonis und McCarthy, 1996). Erhöhter Ethanolverbrauch bei Ratten, die mit AAS chronisch behandelt wurden, kann ebenfalls eine Veränderung der GABAergen Funktion (Johansson et al., 2000).
Unsere Ergebnisse zur Überdosierung werfen ein zusätzliches Gesundheitsrisiko auf. Gegenwärtig basiert die Einstufung von AAS als Kontrollsubstanzen auf ihren anabolen Eigenschaften (Gesetz über kontrollierte Substanzen, 1991). Die aktuelle Studie zeigt jedoch, dass die anabole Wirksamkeit von AAS nicht unbedingt ihren verstärkenden Eigenschaften und Überdosierungsrisiken entspricht. Zusätzlich zu den DHT-BSA-Konjugaten ist DHT-CMO, das in dieser Studie verwendet wurde, keine kontrollierte Substanz, obwohl seine verstärkenden Eigenschaften und die Mortalität aufgrund seiner Überdosierung DHT und T sehr ähnlich zu sein scheint (Peters und Holz, 2005). Das Muster der Überdosierung ähnelte auch dem zuvor für T (Peters und Holz, 2005), wo hohe Aufnahme in 24 zu 48 Stunden später Sterblichkeit führte. Angesichts dieser Ergebnisse können die Kriterien, die für die Planung eines Steroids als eine kontrollierte Substanz verwendet werden, Revisionen erfordern, um seine Missbrauchsabhängigkeit und Toxizität zusätzlich zu seiner anabolen Potenz zu erklären.
Die Ergebnisse der aktuellen Studie legen nahe, dass nukleares AR, das einzige bisher isolierte AR, für die Androgenverstärkung nicht essentiell ist. Stattdessen legen die Ergebnisse nahe, dass Androgenverstärkung an der Plasmamembran transduziert wird. Daher sind weitere Untersuchungen zur Identität der putativen Membran-AR, ihrer funktionellen Merkmale und ihrer anatomischen Verteilung erforderlich, um den zugrunde liegenden Mechanismus des AAS-Missbrauchs und seine klinischen Implikationen aufzuklären.
Fußnoten
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