Dopamin ist notwendig für quellenabhängige Angstkonditionierung (2009)

Jonathan P. Fadok, 1,2 Tavis MK Dickerson, 2 und Richard D. Palmiter2 *
J Neurosci. Autorenmanuskript; verfügbar in PMC 2010 March 9.
Veröffentlicht in endgültig bearbeiteter Form als:
J Neurosci. 2009 September 9; 29 (36): 11089 – 11097.
doi: 10.1523 / JNEUROSCI.1616-09.2009.

1-Graduiertenprogramm für Neurobiologie und Verhalten, Universität Washington, Seattle, WA 98195
2 Department of Biochemistry und Howard Hughes Medical Institute, Universität Washington, Seattle, WA, 98195
* Die Korrespondenz sollte an folgende Adresse gerichtet werden: Richard D. Palmiter, HHMI und Department of Biochemistry, Box 357370, Universität Washington, Seattle, WA 98195. Email: [E-Mail geschützt]
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Abstrakt

Dopamin (DA) ist an vielen Verhaltensweisen beteiligt, einschließlich motorischer Funktion, Wahrnehmung und Belohnungsverarbeitung. Die Rolle von DA in der Angstverarbeitung bleibt jedoch unklar. Um die Rolle der DA beim angstbezogenen Lernen zu untersuchen, wurden Dopamin-defiziente (DD) Mäuse in einem angstpotenzierten Aufriss-Paradigma getestet. Die DA-Synthese kann in DD-Mäusen durch Verabreichung von 3, 4-Dihydroxy-L-phenylalanin (L-Dopa) wiederhergestellt werden, wodurch die Beurteilung der Angstverarbeitung entweder in einem an DA erschöpften oder -repleten Zustand ermöglicht wird. In den DD-Mäusen fehlte ein angstpotenziertes Aufschrecken, das jedoch durch die Verabreichung von L-Dopa unmittelbar nach der Angstbehandlung wiederhergestellt werden konnte. Die selektive viralvermittelte Wiederherstellung der DA-Synthese im ventralen tegmentalen Bereich stellte das Angstlernen in DD-Mäusen vollständig wieder her und die Wiederherstellung der DA-Synthese in DA-Neuronen, die auf die basolaterale Amygdala projizieren, stellte das Kurzzeitgedächtnis wieder her, nicht jedoch das Langzeitgedächtnis oder die Schocksensibilisierung. Wir zeigen auch, dass der DA-D1-Rezeptor (D1R) und D2-artige Rezeptoren für das steuerrelevante Angstlernen notwendig sind.
Diese Ergebnisse zeigen, dass DA, das auf mehrere Rezeptor-Subtypen in mehreren Zielregionen wirkt, die Stabilisierung des Angstgedächtnisses erleichtert.

Schlüsselwörter: Dopamin, Angst, angstpotenziertes Schrecken, Amygdala, Dopamin-D1-Rezeptor, Dopamin-D2-Rezeptor

Einleitung

Der Neuromodulator DA ist wichtig für belohnungsbezogenes Lernen und drogenabhängiges Verhalten (Schultz, 2002; Wise, 2004), und die Anhäufung von Beweisen legt nahe, dass DA auch für angstbezogenes Lernen wichtig sein kann (Lamont und Kokkinidis, 1998; Guarraci et al 1999; Greba und Kokkinidis, 2000; Guarraci et al., 2000; Greba et al., 2001; Pezze und Feldon, 2004; de Oliveira et al., 2006). DA-Neuronen des ventralen Mittelhirnprojekts für limbische Gehirnbereiche, die für das Lernen mit Angst wichtig sind, und die DA-Spiegel in diesen Gehirnbereichen steigen während aversiver Ereignisse an (Abercrombie et al., 1989; Kalivas und Duffy, 1995; Doherty und Gratton, 1997; Inglis und Moghaddam) 1999). Außerdem erhöhen einige DA-Neuronen in der Mitte des Gehirns ihre Schießgeschwindigkeit auf aversive Stimuli und vorhersagende Signale (Guarraci und Kapp, 1999; Horvitz, 2000; Joshua ua, 2008). Darüber hinaus hat DA gezeigt, dass die Langzeitpotenzierung, ein wichtiges neuronales Korrelat des Gedächtnisses, in Bereichen, die für das Lernen der Angst wichtig sind, wie Hippocampus und Amygdala, erleichtert wird (Bissiere et al., 2003; Lemon und Manahan-Vaughan, 2006; Swant) und Wagner, 2006).

Trotz des Fortschritts in Bezug auf die Angstphysiologie von DA-Neuronen ist die genaue Rolle von DA und seiner verwandten Rezeptoren beim Lernen mit Angst nicht geklärt. Es wurde gezeigt, dass systemische Injektionen von D1R-ähnlichen Antagonisten oder in die Amygdala den Erwerb oder Ausdruck von angstbezogenem Lernen blockieren; Andere haben jedoch gezeigt, dass diese Medikamente keine Wirkung haben (Guarraci et al., 1999; Greba und Kokkinidis, 2000; de Oliveira et al., 2006). Außerdem wurde gezeigt, dass D1R-artige Agonisten die Angstkonditionierung entweder verbessern oder keine Wirkung haben (Guarraci et al., 1999; Greba et al., 2000; Inoue et al., 2000; de Oliveira et al., 2006). Analoge Diskrepanzen wurden in Studien gefunden, bei denen Agonisten oder Antagonisten für D2R-ähnliche Rezeptoren verwendet wurden (Guarraci et al., 2000; Greba et al., 2001; Ponnusamy et al., 2005; de Oliveira et al., 2006). Diese Diskrepanzen könnten auf Verhaltensmethoden, dosisabhängige Wirkungen von injizierten Arzneimitteln oder auf unterschiedliche pharmakologische Wirkstoffe zurückzuführen sein. Zum Beispiel unterscheiden sich DA-Rezeptorantagonisten stark in ihrer Selektivität, während einige Studien D2-Rezeptoren selektiver antagonisieren können, während andere D2-, D3- und D4-Rezeptoren breiter antagonisieren können (Missale et al., 1998).

Um die Rolle von DA in furchtbezogenem Lernen zu verdeutlichen, verwendeten wir Mäuse, denen es an DA (DD-Mäusen) fehlt, sowie Mäuse, denen entweder der D1R- oder der DA-D2-Rezeptor (D2R) fehlt, und testeten sie in einem angstpotenzierten Aufriss-Paradigma. Angstpotenziertes Aufschrecken ist ein Pavlovian-Angst-Konditionierungs-Paradigma, bei dem ein neutraler Stimulus in der akustischen Schreckreaktion nach Paarungen mit einem Fußschock (Koch, 1999) eine Zunahme hervorruft. Angstpotenziertes Aufschrecken ist ein ideales Paradigma für diese Studien, da es nicht von einer Einschätzung des Einfrierverhaltens abhängt, das bei hypoaktiven DD-Mäusen (Zhou und Palmiter, 1995) schwer zu messen ist. Da DD-Mäuse entweder in einem DA-erschöpften oder einem DA-vervollständigten Zustand untersucht werden können, bieten sie eine ideale Gelegenheit, die Rolle der DA bei der Lern- und Gedächtnisbildung zu untersuchen. Weiterhin kann durch Virus-vermittelte Abgabe von Cre-Rekombinase die DA-Signalisierung durch Reaktivierung eines Th-Allels von DD-Mäusen selektiv in spezifischen Zielregionen wiederhergestellt werden (Hnasko et al., 2006). Die selektive Wiederherstellung von DA in bestimmten Zielgebieten ermöglicht die Bewertung von Gehirnregionen, die durch DA-Signale während der Angstkonditionierung reguliert werden.

Materialen und Methoden

Tiere und Behandlungen
DD-Mäuse wurden wie beschrieben erzeugt (Hnasko et al., 2006). Kurz gesagt tragen DD (Thfs / fs; DbhTh / +) -Mäuse zwei nichtfunktionelle Tyrosinhydroxylase (Th)-Allele, die durch Insertion eines Neomycinresistenzgenes (NeoR), das von Lox-P-Stellen flankiert wurde, in das erste Intron des Th-Gens inaktiviert wurden . Diese Mäuse tragen auch ein intaktes Dopamin-β-Hydroxylase (Dbh) -Allel und ein Dbh-Allel mit einer gezielten Insertion des Th-Gens. Kontrolltiere tragen mindestens ein intaktes Th-Allel und ein intaktes Dbh-Allel. Die Spiegel von nicht-dopaminergen Katecholaminen sind bei DD-Tieren normal und die Spiegel aller Katecholamine sind bei Kontrolltieren normal (Zhou und Palmiter, 1995; Szczypka et al., 1999). Die Mäuse wurden auf einem gemischten genetischen Hintergrund von C57BL / 6 X 129 / Sv gehalten. Aufgrund schwerer Hypophagie wurde DD-Mäusen täglich (ip) L-Dopa in einer Menge von 50 mg / kg in einem Volumen von 33 μl / g (Zhou und Palmiter, 1995) injiziert, etwa am Tag 10 am Tag nach der Geburt. Diese Injektionen stellen die DA-Funktion für 8 auf 10 hr wieder her (Szczypka et al., 1999). D1R-Knockout- (KO) - und D2R-KO-Mäuse wurden beschrieben (Drago et al., 1994; Kelly et al., 1997). Beide Stämme wurden auf einem C57BL / 6-Hintergrund gehalten. Aufgrund der Wachstumsverzögerung bei D1R KO-Mäusen wurden sie nach vier Wochen abgesetzt und dann mit angefeuchtetem Futter gefüttert, um das Wachstum zu fördern. Alle Tiere wurden durch PCR-Analyse genotypisiert. Männliche und weibliche Mäuse wurden im Alter zwischen 2 und 5 Monaten Verhaltenstests unterzogen. Alle Mäuse wurden unter einem 12: 12-Zyklus (hell: dunkel) in einer temperaturkontrollierten Umgebung mit Nahrungsmitteln (5LJ5; PMI Feeds, St. Louis, MO) und Wasser nach Belieben gehalten. Alle Verhaltensexperimente wurden während des Lichtzyklus durchgeführt. Alle Mäuse wurden gemäß den Richtlinien behandelt, die von den National Institutes of Health und dem Institutional Animal Care and Use Committee der University of Washington festgelegt wurden

Um zu beurteilen, ob andere D2-ähnliche Rezeptoren für das Angstlernen wichtig sind, wurde D2R-KO-Mäusen der D2-ähnliche Antagonist Eticloprid (Sigma, St. Louis, MO) mit 0.5 mg / kg (ip) verabreicht. Eticloprid wurde in 0.9% Kochsalzlösung gelöst und mit einem Endvolumen von 10 μl / g verabreicht. D2R Wildtyp (WT) -Mäusen wurde ein Vehikel injiziert.

Apparatur
Schalldämpfende Schreckkammern (SR-Lab, San Diego Instruments, San Diego, CA) wurden zur Messung der Vorimpulshemmung, der Schreckreaktionen und des angstpotenzierten Schreckens verwendet. Für die ersten Reaktionen wurden 65 1-ms-Messungen ab dem Pulsbeginn durchgeführt. Um die Reaktion auf einen Fußschock zu messen, wurden 500-1-ms-Messungen ab dem Schockbeginn durchgeführt. Die Spitzenamplitude der Antwort wurde zur Berechnung der Vorimpulshemmung, der Schreckreaktionen, des angstpotenzierten Schreckens und der Schockreaktivität verwendet. Weißes Rauschen wurde von einem Hochfrequenzlautsprecher in der Kammerdecke erzeugt. Der Hintergrundklang wurde auf einem konstanten Pegel von 65 dB gehalten. Der Schallpegel wurde in Dezibel (A-Skala) mit einem Schallpegelleser (RadioShack, Fort Worth, TX) gemessen. Eine Kalibrierungseinheit wurde verwendet, um die Integrität der Schreckreaktionsmesswerte sicherzustellen (San Diego Instruments, San Diego, CA). Eine 8-Watt-Lampe wurde an der Rückwand der Startle-Box als Hinweis angebracht.

Schreckreaktionskurven
Nach einer Gewöhnungsphase von 5-min wurde den Tieren eine Serie von sieben Versuchen mit eskalierenden Schallpegeln präsentiert: von 80 bis 120 dB, mit einem ITI von 30 sec. Diese Serie wurde 10-mal für insgesamt 70-Versuche präsentiert. In allen Versuchen, mit Ausnahme von Nullversuchen, bei denen kein Ton auftrat, war der Schallimpuls 40 ms.

Pre-Pulse-Inhibition
Den Tieren wurde eine 10-min-Gewöhnungszeit gegeben, wonach den Probanden 5-40-ms-, 120-dB-Impulsprüfungen präsentiert wurden. Die Mäuse wurden dann mit 50-Studien entweder einer aufregenden Einzelpuls-Studie, einer von drei Vorpulsversuchen (5, 10 und 15-dB über Hintergrund) oder einer Null-Studie, bei der kein akustischer Stimulus auftrat, präsentiert. Das Intertrialintervall (ITI) betrug durchschnittlich 15 sec (Bereich 5 – 25 sec). Eine erschreckende Studie bestand aus einem 40-ms-Impuls und einem 120-dB-Impuls mit weißem Rauschen. Vorpulsversuche bestanden aus einem 20-ms-Vorimpuls mit 70-, 75- oder 80-dB-Intensität, der dem 40-ms-120-dB-Impuls 100-ms vorausging. Die Vorimpulsinhibierung wurde für jedes Vorimpulspegel unter Verwendung der folgenden Formel berechnet:% -Inhibierung = [(durchschnittliche Schreckreaktion bei Vorimpulsversuchen / durchschnittliche Schreckreaktion bei alleiniger Pulsuntersuchung) × 100]. DD-Mäuse wurden in einem von DA abgereicherten Zustand getestet, 18-24 hr nach der Injektion von L-Dopa.

Angstpotentiertes Erschrecken (7-Day-Paradigma)
Am Tag 1 (Basislinie) nach einer Gewöhnungsphase von 5-min erhielten die Mäuse eine zufällig geordnete Serie von 20-Studien, die gleichmäßig zwischen Cue- und No-Cue-Bedingungen aufgeteilt waren. Für No-Cue-Versuche wurden Tiere mit einem akustischen Impuls von 40-ms und 105-dB präsentiert. Für Cue-Versuche wurden die Tiere mit einem 10-sec-Licht-Cue präsentiert, der mit einem 40-ms-Impuls, 105-dB, terminierte. Der ITI-Durchschnitt betrug 120-Sekunden (Bereich 60 bis 180-Sekunden).

Das Training fand an den Tagen 2, 4 und 6 statt. Nach einer Gewöhnungsphase von 10-min erhielten die Mäuse 10-Präsentationen des Cue-Light, die mit einem 0.2-mA-, 0.5-sec-Fußschock kollimierten. Der ITI-Durchschnitt betrug 120-Sekunden (Bereich 60 bis 180-Sekunden). Die Testsitzungen fanden an den Tagen 3, 5 und 7 statt und waren mit der oben beschriebenen Baseline-Sitzung identisch. DD-Mäuse befanden sich im DA-verarmten Zustand, 18 bis 24 hr nach ihrer letzten L-Dopa-Injektion, während der Baseline-, Trainings- und Testsitzungen. L-Dopa wurde nach Trainingseinheiten injiziert, wie in den Legenden der Abbildungen angegeben. Die folgende Formel wurde zur Berechnung des angstpotenzierten Schreckens verwendet:% Potenzierung = [(Durchschnitt der Antworten auf Cue-Studien / Durchschnitt der Antworten auf No-Cue-Studien-1) × 100].

Angstpotentiertes Erschrecken (3-Day-Paradigma)
Die Tage 1 und 3 (Basis und Test) dieses Paradigmas waren identisch mit denen, die für das 7-Tag-Angstpotenzielles Aufriss-Paradigma beschrieben wurden. Am Tag 2 (Training) erhielten die Mäuse 30-Paarungen des 10-sec-Cue-Light mit einem 0.2-mA-, 0.5-sec-Fußstoß. Der ITI-Mittelwert war 120 sec (Bereich 60 bis 180 sec). DD-Mäuse waren während des Baseline-Trainings, des Trainings und des Testens an DA-Mangel.

Kurzzeitgedächtnis
Die Grund- und Testsitzungen waren identisch mit den für das 7-Day-Paradigma beschriebenen. Am Tag 2 erhielten die Mäuse nach einer 5-min-Gewöhnungsphase 30-Paarungen eines 10-sec-Cue-Lichts, das zusammen mit einem 0.5-sec-0.2-mA-Fußschock terminierte. Der ITI berechnete 120-Sekunden (Bereich 60 bis 180). Nach dem Training wurden die Mäuse vor dem Test für 10 min in ihre Käfige gestellt. Das Kurzzeitgedächtnis wurde unter Verwendung der gleichen Formel bewertet, die für das angstpotenzierte Schrecken verwendet wurde.

Schocksensibilisierung
Die Reaktionen auf die No-Cue-Bedingung während der Grundlinien- und Testsitzungen des Kurzzeitgedächtnisses wurden für jedes Tier gemittelt und die folgende Formel wurde zur Berechnung der Schocksensibilisierung verwendet:% Sensibilisierung = [(durchschnittliche Schreckreaktion während des Tests / durchschnittliche Schreckreaktion auf der Baseline- 1) × 100].

Cre-Rekombinase-vermittelte Wiederherstellung der Th-Genfunktion
Anästhesierte Mäuse mit Isofluran (1.5 – 5%) wurden in ein stereotaktisches Instrument (David Kopf Instruments, Tujunga, CA) gegeben. Zur Wiederherstellung der Th-Genfunktion im ventralen tegmentalen Bereich wurde rekombinantes AAV1-Cre-GFP-Virus (mit 1.2 × 1012-Partikeln / ml im Titer gemessen) bilateral in das ventrale Mittelhirn injiziert (Koordinaten in mm: 3.5 hinter Bregma, 0.5 lateral bis midline , 4.5 ventral bis Bregma; 0.5 μl / Hemisphäre). Zur spezifischen Wiederherstellung von BLA DA wurde das rekombinante CAV2-Cre-Virus (mit 2.1 × 1012-Partikeln / ml im Titer gemessen) bilateral injiziert (Koordinaten in mm: 1.5 hinter Bregma, 3.25 lateral bis midline, 5 ventral bis Bregma; 0.5 ul / hemisphere). . Detaillierte Beschreibungen beider viraler Vektoren wurden veröffentlicht (Hnasko et al., 2006; Zweifel et al., 2008). Die Viren wurden über einen Zeitraum von 10-min unter Verwendung einer 32-Spritzenadel (Hamilton, Reno, NV), die an einer Mikroinfusionspumpe (WPI, Sarasota, FL) befestigt war, injiziert.

Immunhistochemie
Nach der Anästhesie mit 50 mg / ml Natriumpentobarbital (0.2-0.3 ml / Tier) wurden die Mäuse mit Phosphat-gepufferter Salzlösung transkardial perfundiert, gefolgt von 4% Paraformaldehyd in Phosphat-gepufferter Salzlösung. Die präparierten Gehirne wurden über Nacht in 4% Paraformaldehyd nachfixiert, in 30% Saccharose in phosphatgepufferter Salzlösung tiefgefroren und anschließend in Isopentan schnellgefroren. Freischwimmende koronale Schnitte (30 μm) wurden entweder mit Maus-Anti-TH- (1: 1000, Chemicon) oder Kaninchen-Anti-TH (1: 2000, Chemicon) Antikörpern immungefärbt. Immunfluoreszenz wurde durch Verwendung von Cy2- oder Cy3-konjugierten sekundären IgG-Antikörpern (1: 200, Jackson ImmunoResearch) erreicht. Befleckte Schnitte wurden auf Dias montiert, mit Deckglas bedeckt und mit einem aufrechten Hellfeldmikroskop (Nikon) fotografiert.

Statistische Analysen
Die durchgeführten Analysen umfassten wiederholte Messungen und One-Way-ANOVA-, Fisher-Post-hoc- und Student-T-Tests, wie in den Ergebnissen angegeben. Die statistische Analyse wurde mit Statistica-Software (Statsoft, Tulsa, Oklahoma) durchgeführt.

Die Ergebnisse

DD-Mäuse haben eine intakte akustische Schreckreaktion und eine normale Vorimpulshemmung
Angstpotenziertes Aufschrecken erfordert intakte akustische Schreckreaktionen und sensomotorische Ansteuerung. Um zu bestimmen, ob die akustische Schreckreaktion in Abwesenheit von DA verändert wird, wurden die Antworten von DA-verarmten DD-Mäusen (18 auf 24 in Stunden nach L-Dopa) auf mehrere Dezibel-Tonpegel gemessen und mit Kontrollen verglichen (Abbildung 1A). Wiederholte Messungen ANOVA zeigte keinen Haupteffekt des Genotyps und keine signifikante Wechselwirkung zwischen Genotyp und Geräuschpegel.

Figure 1
DA ist entscheidend für das Erlernen von angstpotenziertem Schrecken. A, Akustische Schreckreaktion der Kontroll- (n = 10, schwarze Quadrate) und DD-Mäuse (n = 10, offene Quadrate) auf unterschiedliche Schallintensitäten. Antworten werden in willkürlichen Einheiten gemeldet. B, Präpulshemmung wurde bei 3 verschiedenen Präpulsintensitäten in Kontroll- (n = 10, schwarze Balken) und DD-Mäusen (n = 10, offene Balken) getestet. Sternchen bezeichnen p < 0.05, ANOVA mit wiederholten Messungen. C, Schematische Darstellung des 7-Tage-Angst-potenzierten Schock-Paradigmas. An den Basislinien- und Testtagen erhielten die Mäuse 10 Präsentationen von No-Cue (40 ms lange Präsentation eines 105-dB-Schockimpulses) und 10 Präsentationen von Cue-Versuchen (10-s-Licht-Cue, das gleichzeitig mit dem Schreckimpuls endet) in Pseudozufall bestellen. An den Trainingstagen erhielten die Mäuse 10 Paarungen des 10-Sekunden-Lichtsignals, das gleichzeitig mit einer 0.5-Sekunden-Dauer und einem 0.2-mA-Fußschock endete. Das Lernen wurde an Testtagen als Prozentsatz der Potenzierung bei Cue-Versuchen im Vergleich zu No-Cue-Versuchen bewertet. D, DD-Mäuse (n = 10, offene Balken), denen L-Dopa 3 Stunden nach dem Training (Tag 2 und 4) verabreicht wurde, lernten nicht (Test 1 und 2). Als jedoch DD-Mäuse unmittelbar nach dem Training (Tag 6) injiziert wurden, zeigten sie einen signifikanten Angst-potenzierten Schreck (Test 3). Sternchen bezeichnen p < 0.05, ANOVA mit wiederholten Messungen. E, Messungen der Schockreaktivität während Trainingseinheiten (Kontrolle n = 10, schwarze Balken; DD n = 10, offene Balken). Antworten werden in willkürlichen Einheiten gemeldet. F, Schematische Darstellung des 3-tägigen angstpotenzierten Schockparadigmas, das verwendet wird, um den kritischen Zeitraum zu bestimmen, in dem DA wichtig ist. Alle 30 Cue-Schock-Paarungen wurden an einem Trainingstag verabreicht und DD-Mäuse wurden sofort, 1 Stunde oder 3 Stunden nach dem Training mit L-Dopa behandelt. G, Nur Kontroll- (n = 8, durchgehende schwarze Balken, C) und DD-Mäuse, denen unmittelbar nach dem Training (n = 7, vertikale Streifen, 0 h) injiziert wurde, zeigten am Testtag einen angstpotenzierten Schreck. Dieses Ausmaß an angstpotenziertem Erschrecken war signifikant höher als das, das bei den DD-Mäusen beobachtet wurde, denen L-Dopa 1 Stunde (n = 6, diagonale Streifen) oder 3 Stunden (n = 6, offene Balken) nach dem Training verabreicht wurde. Sternchen bezeichnen p < 0.05 im Vergleich zum Ausgangswert, Fisher post-hoc. Alle angegebenen Werte sind Mittelwerte ± SEMDA-verarmter DD, und Kontrollmäuse wurden auch in einem Präpulsinhibitionsparadigma getestet, das üblicherweise verwendet wird, um Defizite im sensomotorischen Gating zu erkennen. Die Präpulshemmung war bei DD-Mäusen verstärkt ( 1B ; ANOVA mit wiederholten Messungen, Genotyp: F1, 18 = 5.37; p < 0.05; es wurde kein signifikanter Genotyp durch Interaktion auf Präpulsebene nachgewiesen). Diese Daten weisen darauf hin, dass DD-Mäuse keine Defizite bei Schreckreaktionen oder Abnahmen sensomotorischer Gating-Mechanismen aufweisen, während sie sich in einem DA-erschöpften Zustand befinden, und validieren ihre Verwendung in angstpotenzierten Schreckexperimenten.

Dopamin ist zu einem kritischen Zeitpunkt für das Erlernen des angstpotenzierten Schreckens notwendig

Um festzustellen, ob DA zum Erlernen einer Cued-Angst-Konditionierungsaufgabe erforderlich ist, wurden DD- und Kontrollmäuse einem 7-tägigen angstpotenzierten Schreckparadigma unterzogen (Abbildung 1C). DD-Mäuse wurden in einem DA-verarmten Zustand trainiert und getestet. Beim Testen 24 Stunden nach dem Training zeigten Kontrollmäuse nach einer einzelnen Trainingseinheit einen durch Angst verstärkten Schrecken, der bei DD-Mäusen nicht beobachtet wurde ( 1D ; ANOVA mit wiederholten Messungen, Genotyp, F1, 18 = 7.4590, p < 0.05). Selbst nach einer zusätzlichen Trainingseinheit zeigten DD-Mäuse kein durch Angst verstärktes Schrecken, während Kontrollmäuse weiterhin robustes Lernen zeigten. Interessanterweise zeigten DD-Mäuse bei Verabreichung von L-Dopa unmittelbar nach dem Training an Tag 6 einen angstpotenzierten Schreck, der signifikant höher war als der Ausgangswert (einfache ANOVA F1, 18 = 9.1999, p < 0.01) und sich nicht von den Kontrollwerten unterschied ( Abbildung 1D). Die Schockreaktivität an den Trainingstagen für DD- und Kontrollmäuse unterschied sich an keinem Trainingstag signifikant zwischen den Genotypen, was darauf hinweist, dass das Lerndefizit bei DD-Mäusen nicht auf eine Unfähigkeit zurückzuführen war, den Fußschock zu spüren (Abbildung 1E). Um das kritische Zeitfenster zu charakterisieren für die DA-Wirkung variierte eine zusätzliche Studie den Zeitpunkt der L-Dopa-Verabreichung. DD- und Kontrollmäuse erhielten eine Trainingseinheit bestehend aus 30 Lichtschock-Paarungen (Abbildung 1F) und erhielten dann eine Injektion von L-Dopa entweder sofort, 1 Stunde oder 3 Stunden nach dem Training, und sie wurden 24 Stunden später getestet. DD-Mäuse, denen unmittelbar nach dem Training injiziert wurde, zeigten am Testtag einen robusten, durch Angst verstärkten Schrecken, ähnlich dem der Kontrollen, während die DD-Mäuse, denen L-Dopa 1 Stunde oder 3 Stunden nach dem Training injiziert wurde, kein Lernen zeigten (Abbildung 1G; ANOVA mit wiederholten Messungen; Behandlung × Sitzung F3, 23 = 5.1032, p < 0.01). Diese Daten weisen darauf hin, dass DA innerhalb eines endlichen Zeitraums zum Lernen in einem angstpotenzierten Schockparadigma notwendig ist. DA ist jedoch für die Expression von Cued-Fear-Erinnerungen nicht erforderlich, da DD-Tiere immer in Abwesenheit von DA getestet wurden. Außerdem beeinträchtigt das Fehlen von DA die Schockreaktivität nicht.

D1R ist für angstpotenziertes Schrecken erforderlich

Um zu erforschen, welche DA-Rezeptoren für Angst-potenzierte Schrecken notwendig sind, analysierten wir zunächst D1R-KO-Mäuse. D1R KO- und Kontroll-Wildtyp (WT)-Mäuse wurden auf mehreren Ebenen der Schreckimpulsintensität getestet, wie für DD-Mäuse beschrieben (Abbildung 2A). Es gab bei keinem der getesteten Geräuschpegel einen signifikanten Unterschied zwischen D1R KO- und WT-Mäusen, was darauf hindeutet, dass D1R KO-Mäuse eine intakte akustische Schreckreaktion haben. In Übereinstimmung mit früheren Studien haben wir eine intakte Präpulshemmung bei D1R-KO-Mäusen beobachtet (Ralph-Williams et al., 2002). Beim Test im 7-tägigen angstpotenzierten Schockparadigma zeigten D1R-KO-Mäuse an keinem der Testtage Lernen (Abbildung 2B; ANOVA-Genotyp mit wiederholten Messungen × Testtag F3, 48 = 6.28; p < 0.01), wohingegen WT Mäuse hatten an den Testtagen 2 und 3 einen signifikanten Angst-potenzierten Schreck (p < 0.05 und p < 0.01, Kontrollgrundlinie gegenüber Test 2 bzw. 3, Fisher post-hoc). D1R-KO-Mäuse hatten an allen drei Trainingstagen eine größere Schockreaktivität als WT (Abbildung 2C; ANOVA mit wiederholten Messungen, Genotyp F1, 16 = 10.18; p < 0.01; kein signifikanter Genotyp × Trainingstag wurde beobachtet). Obwohl D1R-KO-Mäuse im Vergleich zu WT-Mäusen erhöhte Reaktionen auf Fußschocks zeigen, haben sie somit selbst nach 3 Tagen Training einen durch Angst potenzierten Schreck signifikant beeinträchtigt. Diese Daten weisen auf eine Lernbehinderung bei D1R-KO-Tieren hin und implizieren das D1R bei der Vermittlung der Wirkungen von DA bei hinweisabhängiger Angstkonditionierung. Fig. 2 D1R-KO-Mäuse weisen eine signifikante Lernbeeinträchtigung auf. A, Akustische Schreckreaktion von D1R WT (n = 9, schwarze Quadrate) und KO (n = 9, offene Quadrate) Mäuse. B, Ergebnisse eines 7-tägigen angstpotenzierten Schreckparadigmas mit D1R-Mäusen. D1R WT-Mäuse (n = 9, durchgehende schwarze Balken), aber nicht D1R KO-Mäuse (n = 9, offene Balken), zeigten am Testtag 3 einen durch Angst verstärkten Schrecken. Sternchen bezeichnen p < 0.01, Vergleich von KO mit WT, Fisher nach hoc. C, Messungen der Stoßreaktivität. D1R KO-Mäuse (n = 9, offene Balken) reagieren stärker auf Fußschocks als WT (n = 9, ausgefüllte Balken). Sternchen bezeichnen p < 0.05, ANOVA mit wiederholten Messungen. Alle angegebenen Werte sind Mittelwerte ± SEM. Für Schreckreaktionen und Schockreaktivität sind die Zahlen in willkürlichen Einheiten angegeben.

Angstpotenzierte Schrecken sind in D2R KO-Mäusen intakt, erfordern jedoch andere D2-ähnliche Rezeptoren

Um herauszufinden, ob D2-ähnliche Rezeptoren für ein angstpotenziertes Aufschrecken erforderlich sind, wurden D2R KO- und WT-Mäuse der Schreckreaktion und angstpotenzierten Schreckversuchen unterzogen. WT- und D2R-KO-Mäuse weisen bei allen getesteten dB-Pegeln äquivalente Startreaktionen auf, was darauf hinweist, dass D2R-KO-Mäuse eine intakte akustische Schreckreaktion aufweisen (Abbildung 3A). Ähnlich wie D1R-KO-Mäuse haben wir beobachtet, dass D2R-KO-Mäuse eine intakte Vorimpulshemmung aufweisen (Ralph-Williams et al., 2002). Bei einem Test mit dem 7-Tag-Angstpotenzielles Aufrührungsparadigma zeigten sowohl WT- als auch D2R-KO-Mäuse an allen 3-Testtagen (Fig. 3B) ein angstpotenziertes Aufschrecken bei Äquivalenten. Die Schockreaktivität unterschied sich zwischen den Gruppen nicht (Fig. 3C). Diese Daten zeigen an, dass D2R nicht erforderlich ist, um das Angstpotenzielle zu lernen.

Figure 3
D2R-KO-Mäuse haben einen intakten angstpotenzierten Schreck. A, Akustische Schreckreaktion von D2R WT (n = 8, schwarze Quadrate) und KO-Mäuse (n = 8, offene Quadrate). B, Ergebnisse eines 7-tägigen angstpotenzierten Schreckparadigmas mit D2R-Mäusen. Sowohl WT- (n = 8, ausgefüllte Balken) als auch KO-Mäuse (n = 8, offene Balken) zeigten signifikante Ausmaße an durch Angst potenziertem Erschrecken. C, Messungen der Schockreaktivität während des Trainings (WT, n = 8, ausgefüllte Balken; KO, n = 8, offene Balken). D-, WT- und D2R-KO-Mäuse (jeweils n = 11) wurden dem 3-tägigen Furcht-potenzierten Schock-Paradigma unterzogen. D2R-KO-Mäusen wurde Eticloprid (0.5 mg/kg) vor dem Training verabreicht und zeigten beim Testen keinen durch Angst verstärkten Schrecken. Sternchen bezeichnen p < 0.01, KO versus WT, Fisher post-hoc. Alle angegebenen Werte sind Mittelwerte ± SEM. Für Schreckreaktionen und Schockreaktivität werden Reaktionen in willkürlichen Einheiten angegeben. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Verabreichung von D2-ähnlichen Antagonisten, entweder systemisch oder direkt in die Amygdala, konditionierte Angst beeinträchtigt (Guarraci et al., 2000; Greba et al., 2001; Ponnusamy et al., 2005). Um die Diskrepanz zwischen ihren Ergebnissen und unseren zu untersuchen, wurde D2R-KO-Mäusen der D2R-ähnliche Antagonist Eticloprid (0.5 mg/kg; ip verabreicht) vor dem Training im 3-tägigen angstpotenzierten Schreckparadigma verabreicht. Beim Test 24 Stunden nach dem Training zeigten Vehikel-injizierte WT-Mäuse einen robusten Angst-potenzierten Schreck, während Eticloprid-injizierte D2R-KO-Mäuse kein Lernen zeigten (Abbildung 3D; wiederholte Messungen ANOVA-Genotyp × Tag F1, 20 = 7.5698, p < 0.05). . Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass zusätzlich zum D1R ein Mitglied der D2-ähnlichen Familie von DA-Rezeptoren, aber nicht der D2R, für angstpotenzierten Schreck wesentlich ist.

Das Kurzzeitgedächtnis ist bei DD- und D1R-KO-Mäusen beeinträchtigt

DA ist innerhalb einer Stunde nach dem Training erforderlich, um Angst-potenzierten Schrecken zu lernen. In diesen Experimenten wurde das Langzeitgedächtnis für angstpotenzierten Schrecken 24 Stunden nach dem Training untersucht. Wir wollten testen, ob DA auch für das Kurzzeitgedächtnis erforderlich ist. DD-Tiere und Kontrollen wurden einem 2-Tage-Paradigma unterzogen, bei dem das Kurzzeitgedächtnis 10 Minuten nach dem Training getestet wurde (4A). Am Testtag wurden die Schocksensibilisierung und das Kurzzeitgedächtnis bewertet. Das Kurzzeitgedächtnis wurde als cue-abhängige Zunahme der Startle-Reaktionen definiert, während die Schocksensibilisierung eine kontextabhängige Potenzierung der akustischen Startle-Reaktion nach einem vom Cue unabhängigen Fußschock ist (McNish et al., 1997; Richardson, 2000; Risbrough et al., 2008). DD-Mäuse hatten eine signifikant geringere Schocksensibilisierung als Kontrollen (4B, p <0.05; Student-t-Test). In ähnlicher Weise zeigten Kontrollmäuse ein robustes Kurzzeitgedächtnis, das bei DD-Mäusen nicht vorhanden war (4B, p <0.05, DD gegen Kontrolle, Student-t-Test). Diese Daten legen nahe, dass DA für das Kurzzeit- und Langzeitgedächtnis eines angstpotenzierten Schreckens erforderlich ist. Darüber hinaus ist DA für das kontextabhängige Lernen von Angst notwendig, wie durch Schocksensibilisierung untersucht. Diese Daten untermauern auch die frühere Schlussfolgerung, dass DA in einer kritischen Phase für die Stabilisierung der angstkonditionierenden Gedächtnisspur erforderlich ist. Abbildung 4: Kurzzeitgedächtnis und Schocksensibilisierung hängen von DA ab. A, Design des Verhaltensparadigmas. Am Tag 1 wurden Grundlinien-Schreckreaktionen erhalten. Am Tag 2 erhielten die Mäuse alle 30 Cue-Schock-Paarungen und wurden dann vor dem Testen für 10 Minuten in ihren Heimkäfig zurückgebracht. B: Kontrollmäuse (n = 10, schwarze Balken) weisen im Vergleich zu DD (n = 10, offene Balken) eine signifikant höhere Schocksensibilisierung und einen durch Angst potenzierten Schreck auf. Sternchen bezeichnen p <0.05; Studententest. C-, WT- (n = 7, schwarze Balken) und D1R KO- (n = 7, offene Balken) Mäuse weisen eine intakte Schocksensibilisierung auf. Nur WT haben während des Kurzzeitgedächtnistests einen durch Angst potenzierten Schreck. Sternchen bezeichnen p <0.05, KO gegen WT; Studententest. D, WT-Mäuse (n = 8, schwarze Balken) haben eine signifikant höhere Schocksensibilisierung als D2R KO (n = 8, offene Balken). Das Ausmaß der Angst-Potenzierung ist bei WT- und D2R-KO-Mäusen ähnlich. Sternchen bezeichnen p <0.05, KO gegen WT; Studententest. Alle angegebenen Werte sind Mittelwerte ± SEM. Um zu untersuchen, welche Rezeptorsubtypen die Rolle von DA im Kurzzeitgedächtnis und bei der Schocksensibilisierung vermitteln, wurden D1R- und D2R-KO-Mäuse im gleichen Paradigma wie DD-Mäuse getestet. D1R-KO-Mäuse hatten signifikant geringere Werte für das Kurzzeitgedächtnis als WT-Mäuse (4C, p <0.05; Student-t-Test); Es gab jedoch keinen signifikanten Unterschied zwischen dem Grad der Schocksensibilisierung bei D1R KO und Kontrollmäusen, was darauf hinweist, dass das kontextabhängige Lernen intakt war. D2R-KO-Mäuse hatten signifikant geringere Schocksensibilisierungsgrade als WT (4D, p <0.05; Student-t-Test), es gab jedoch keinen signifikanten Unterschied zwischen WT- und KO-Mäusen im Kurzzeitgedächtnis.

Die Wiederherstellung der DA in der basolateralen Amygdala reicht aus, um ein Kurzzeitgedächtnis zu ermöglichen

Die basolaterale Amygdala ist entscheidend für den Erwerb von Queue-abhängigem Angstgedächtnis (Maren, 2003; Maren und Quirk, 2004; Sigurdsson ua, 2007). Darüber hinaus gibt es Hinweise darauf, dass DA eine wichtige Rolle bei der Erleichterung der basolateralen Amygdala-Funktion spielt (Rosenkranz und Grace, 2002; Bissiere ua, 2003; Marowsky ua, 2005). Um herauszufinden, ob eine DA in der basolateralen Amygdala für angstpotenzierte Schrecken erforderlich ist, wurden DD und Kontrollmäuse bilateral einen CAV2-Cre-Vektor in die basolaterale Amygdala injiziert (Abbildung 5A). Dieser Vektor wird retrograd von der Injektionsstelle zu DA-Neuronen transportiert, wo er die Th-Genaktivität wiederherstellt (Hnasko et al., 2006). Die Immunhistochemie ergab, dass TH in der basolateralen Amygdala von CAV2-Cre-injizierten DD-Mäusen vorhanden ist (Abbildung 5J), aber im dorsalen Striatum und im Nucleus accumbens nicht vorhanden war (Abbildung 5G). TH wurde hauptsächlich in einer kleinen Anzahl von Neuronen in den kaudalen Teilen des ventralen tegmentalen Bereichs wiederhergestellt (Abbildung 5D). In den injizierten DD-Mäusen befanden sich pro 10-µm-Abschnitt typischerweise weniger als 30-TH-positive Zellen, was mit der geringen Anzahl von in der Literatur berichteten Amygdala-projizierenden DA-Neuronen übereinstimmt (Ford et al., 2006; Lammel et al. 2008; Margolis et al., 2008).

Figure 5
Regionenspezifische Wiederherstellung der endogenen TH-Expression in DD-Mäusen. A: Schematische Darstellung der Injektionskoordinaten für Rettungsexperimente der basolateralen Amygdala (BLA). DD (n = 7) und Kontrollmäuse (n = 7) wurden bilateral mit CAV2-Cre-Vektoren (0.5 ul / Hemisphäre) in die BLA injiziert. B, schematische Darstellung der Injektionskoordinaten für Rettungsversuche im ventralen tegmentalen Bereich (VTA). AAV1-Cre-GFP wurde bilateral (0.5 ul / Hemisphäre) in die VTA von DD (n = 7) und Kontrollmäusen (n = 10) injiziert. Zahlen angepasst von Paxinos und Franklin, 2001. CE, Vergleich der TH-Färbung in koronalen Schnitten (4 × -Vergrößerung), die den ventralen Mittelhirn der Virus-injizierten WT-Kontrolle, BLA-injizierten DD und VTA-injizierten DD zeigt. C, TH-Immunhistochemie im Kontroll-Mittelhirn zeigt das Vorhandensein von DA-Neuronen in der VTA und der Substantia nigra pars compacta (SNpc; durch einen Pfeil angedeutet). D, BLA-gerettete DD-Mäuse hatten eine geringe Anzahl von TH-positiven Neuronen in der VTA. Einfügung ist eine 40-Vergrößerung der geschachtelten Region, die den TH-Ausdruck im Soma und in den Prozessen zeigt. E, VTA-gerettete DD-Mäuse hatten überwiegend TH-Expression in der VTA. Beachten Sie das Fehlen von TH-Färbung in SNpc (angezeigt durch Pfeil). F – H, Koronalschnitt (4 × -Vergrößerung) aus WT-Virus injizierten Kontrollen, BLA-retteten und VTA-geretteten DD-Mäusen, die die TH-Expression im dorsalen Striatum und im Nucleus accumbens zeigen. F, WT-Virus injizierte Kontrollen haben eine TH-Expression im gesamten Rückenbereich (angezeigt durch Pfeil) und im ventralen Striatum. Es wurde keine TH-Expression im Striatum von BLA-geretteten DD-Mäusen nachgewiesen. H, VTA-gerettete DD-Mäuse haben im Nucleus accumbens eine TH-Expression, wobei im dorsalen Striatum (durch einen Pfeil angezeigt) nur eine geringe Verfärbung vorliegt. I – K, koronaler Schnitt (10 × Vergrößerung) zeigt die TH-Expression in der BLA von mit Virus injizierten WT-Kontroll-, BLA-rescued- und VTA-rescued DD-Mäusen.

Basolaterale Amygdala-injizierte Mäuse wurden einem 3-tägigen Angst-potenzierten Schock-Paradigma unterzogen. Das Kurzzeitgedächtnis und die Schocksensibilisierung wurden 10 Minuten nach dem Training bewertet, und das Langzeitgedächtnis für durch Angst verstärkten Schreck wurde 24 Stunden nach dem Training bewertet (Abbildung 6A). Interessanterweise wurde bei basolateralen Amygdala-injizierten DD-Mäusen nur das Kurzzeitgedächtnis wiederhergestellt. Die Niveaus des Kurzzeitgedächtnisses waren die gleichen wie bei den Kontrollen, jedoch waren die Niveaus des Langzeitgedächtnisses (p < 0.05; Student's t-Test) und der Schocksensibilisierung (p < 0.05; Student's t-Test) signifikant niedriger als bei den Kontrollen. Während des Trainings waren die Niveaus der Schockreaktivität zwischen den Gruppen gleich (Kontrolle: 1613 ± 333 gegenüber BLA-gerettetem DD: 1758 ± 260). Diese Daten deuten darauf hin, dass DA-Projektionen zur basolateralen Amygdala, die hauptsächlich vom kaudalen Aspekt des ventralen Tegmentalbereichs ausgehen, für den kurzfristigen Erwerb des Cued-Fear-Gedächtnisses ausreichen, DA-Projektionen zu anderen kortikalen oder limbischen Gehirnbereichen jedoch wahrscheinlich wesentlich sind kontextuelles Lernen und langfristige Stabilisierung der Angstgedächtnisspur. Abbildung 6: Basolaterale Amygdala (BLA)-gerettete DD-Mäuse haben das Kurzzeitgedächtnis wiederhergestellt, während ventral-tegmentale (VTA)-gerettete DD-Mäuse das Lernen vollständig wiederhergestellt haben. A, virusinjizierte WT-Kontrollmäuse (n = 7) und BLA-gerettete DD-Mäuse (n = 7) wurden dem 3-tägigen Angst-potenzierten Schock-Paradigma unterzogen. Links: Die Schocksensibilisierung ist bei BLA-geretteten Mäusen signifikant geringer. Das mittlere Kurzzeitgedächtnis (STM) wurde bei BLA-geretteten Mäusen auf Kontrollniveaus wiederhergestellt. Rechts: Das Langzeitgedächtnis (LTM), bewertet 24 Stunden nach dem Training, fehlt bei BLA-geretteten Mäusen. B, Ergebnisse von WT-Kontroll- (n = 10) und VTA-geretteten DD-Mäusen (n = 7) im 3-tägigen angstpotenzierten Schreckparadigma. Links: Die Schocksensibilisierung in VTA-geretteten DD-Mäusen unterschied sich nicht signifikant von der Kontrolle. Mitte und rechts, die Niveaus des STM- und LTM-Gedächtnisses waren die gleichen wie bei der Kontrolle in VTA-Rettungsmäusen. Sternchen bezeichnen p < 0.05, Rescue versus Control, Student's t-Test. Alle angegebenen Werte sind Mittelwerte ± SEM

Die Wiederherstellung von TH in den ventralen tegmentalen DA-Neuronen ist für das Lernen ausreichend

Es gibt zwei große DA-Schaltkreise, die vom ventralen Mittelhirn ausgehen. der mesostriatale Kreislauf, der hauptsächlich aus der Substantia nigra pars compacta stammt, und der mesocorticolimbische Kreislauf, der hauptsächlich aus dem ventralen Tegmentbereich stammt. Die mesocorticolimbische Schaltung erstreckt sich weit in Gehirnkerne, von denen bekannt ist, dass sie für die konduktionsabhängige Angstkonditionierung wichtig sind, einschließlich der basolateralen Amygdala (Bjorklund und Dunnett, 2007; Lammel et al., 2008). Zu untersuchen, ob eine vollständigere Wiederherstellung der mesokortikolimbischen DA für Langzeitgedächtnis und Schocksensibilisierung erforderlich ist; DD und Kontrollmäuse wurden bilateral ein AAV1-Cre-GFP-Vektor in den ventralen Tegmentbereich injiziert, um das endogene Th-Gen spezifisch zu aktivieren (Abbildung 5B).

Die Immunhistochemie wurde verwendet, um zu ermitteln, welche DA-Neuronen und welche Ziele die TH-Expression wiederhergestellt hatten. Bei nicht geretteten DD-Mäusen fehlt die TH-Färbung (Hnasko et al., 2006). Die Immunhistochemie ergab, dass die Wiederherstellung von TH in ventralen tegmental injizierten DD-Mäusen für das ventrale tegmentale Gebiet und seine Ziele hochspezifisch war (Abbildung 5E, H, K). Im dorsalen Striatum gab es nur wenige TH-Färbungen, ein Hauptziel von DA-Neuronen, die von der Substantia nigra pars compacta ausgehen (Abbildung 5H), während der Nucleus accumbens und die basolaterale Amygdala eine robuste TH-Expression aufwiesen (Abb. 5H, K).

Ventrale tegmentale Mäuse mit Gebietsinjektion wurden demselben 3-Tag-Angstpotenziösen-Paradigma wie basolaterale, mit Amygdala injizierte Mäuse ausgesetzt (Abbildung 6B). Die Schocksensibilisierung, das Kurzzeitgedächtnis und das Langzeitgedächtnis wurden auf die Kontrollstufen der ventralen tegmentalen DD-Mäuse mit injiziertem Gebiet wiederhergestellt. Die Schockreaktivität während des Trainings war zwischen den Gruppen gleich (Kontrolle: 1653 ± 268 vs. VTA-gerettete DD: 1602 ± 198). Diese Daten legen nahe, dass DA-Projektionen aus dem ventralen Tegmentbereich für die Bildung von Kurzzeit- und Langzeit-Angst-Gedächtnis sowie kontextabhängiger Schocksensibilisierung ausreichen.

Diskussion

Diese Ergebnisse zeigen, dass eine DA für die konditionierte Angst-Konditionierung erforderlich ist, gemessen am angstpotenzierten Schrecken. DD-Mäuse zeigten kein angstpotenziertes Aufschrecken, es sei denn, DA wurde unmittelbar nach dem Training wiederhergestellt. DD-Mäuse haben auch ein Kurzzeitgedächtnis und eine Schocksensibilisierung. Wichtig war, dass die Präpulsinhibierung bei DA-verarmten DD-Mäusen nicht geringer war, was darauf hindeutet, dass das sensoromotorische Gating in Abwesenheit von DA nicht verringert wird. Frühere Forschungen haben gezeigt, dass Psychostimulanzien, die die DA-Übertragung verbessern, die Vorimpulshemmung senken können (Schwarzkopf ua, 1992; Bubser und Koch, 1994; Ralph ua, 1999; Swerdlow ua, 2006; Doherty ua, 2007) und andere haben gezeigt, dass die pharmakologische Inhibierung von Dopaminrezeptoren die Präpuls-Inhibierung verbessert (Schwarzkopf et al., 1993; Depoortere et al., 1997). In Übereinstimmung mit diesen Befunden wiesen DD-Mäuse einen geringen, aber signifikanten Anstieg der Vorimpulshemmung gegenüber Kontrollmäusen auf. Frühere Studien haben auch gezeigt, dass eine pharmakologische Hemmung von DA-Rezeptoren die akustische Schreckreaktion reduzieren kann (Davis und Aghajanian, 1976; Schwarzkopf et al., 1993). Dopamin-abgereicherte DD-Mäuse hatten die akustischen Schreckreaktionen nicht wesentlich verändert; Es bestand jedoch ein Trend zu reduzierten Reaktionen im Vergleich zu Kontrollen, insbesondere bei hohen Stimulusintensitäten, die mit früheren Berichten übereinstimmen (Schwarzkopf et al., 1993).

Die hier präsentierten Daten zeigen eindeutig, dass DA für das Wiederauffinden oder Ausdruck eines Cue-abhängigen Angstgedächtnisses nicht wichtig ist, da DD-Mäuse während der Testsitzung kein DA benötigen, um ein angstpotenziertes Aufschrecken auszudrücken, das zuvor durch Injektion von L-Dopa unmittelbar danach erhalten wurde Ausbildung. Darüber hinaus sprechen unsere Experimente gegen die Notwendigkeit einer DA für die anfängliche Stimulusverarbeitung während des Trainings, da DD-Mäuse während aller Trainingseinheiten an Dopamin abgenutzt waren. Stattdessen legen unsere Daten nahe, dass DA für die frühe Stabilisierung der Gedächtnisspur notwendig ist, da DD-Mäuse kein Kurzzeitgedächtnis ausdrücken und Langzeitgedächtnis nur sichtbar ist, wenn L-Dopa sofort gegeben wird, nicht jedoch 1 hr Ausbildung. Vermutlich stabilisiert die Injektion von L-Dopa in DD-Mäuse unmittelbar nach dem Training die Gedächtnisspur, sodass sie in eine Langzeitform gelangen kann. Aversive Stimuli bewirken einen anhaltenden Anstieg der DA-Spiegel in Gehirnregionen, die für die Angstkonditionierung entscheidend sind, die eine solche Stabilisierung des Angstgedächtnisses ermöglichen würde (Abercrombie et al., 1989; Kalivas und Duffy, 1995; Doherty und Gratton, 1997; Inglis und Moghaddam. 1999). In Übereinstimmung mit unseren Daten haben andere gezeigt, dass Manipulationen der DA-Funktion nach dem Training das angstbedingte Gedächtnis verändern (Bernaerts und Tirelli, 2003; Lalumiere ua, 2004; LaLumiere ua, 2005).

Unsere Ergebnisse zeigen, dass mehrere Subtypen des DA-Rezeptors für angstpotenzierte Schrecken erforderlich sind. D1R KO-Mäusen fehlt das Kurzzeit- und Langzeitgedächtnis für angstpotenzierte Schrecken, was eine entscheidende Rolle für diesen Rezeptor-Subtyp bei der Vermittlung der Auswirkungen von DA beim steuerrelevanten Angstlernen nahelegt. Interessanterweise war das kontextabhängige Angstlernen in D1R KO-Mäusen intakt. Diese Daten bestätigen andere Studien, die zeigen, dass D1R-artige Antagonisten das durch Anzeichen konditionierte Angstlernen abschwächen, ohne die Schocksensibilisierung zu beeinflussen, und zeigen, dass die pharmakologischen Manipulationen in diesen Experimenten für D1R spezifisch waren (Lamont und Kokkinidis, 1998; Guarraci et al., 1999). . Diese Daten stimmen auch mit Studien überein, die eine entscheidende Rolle für den D1R in anderen Cue-abhängigen Lernparadigmen zeigen (Smith et al., 1998; Eyny und Horvitz, 2003).

D2R KO hatte ein intaktes angstpotenziertes Schrecken, aber es fehlte an Schocksensibilisierung. Greba et al. (2001) haben gezeigt, dass der intra-Amygdalar-Antagonismus von D2R zu einer Beeinträchtigung der Schocksensibilisierung und zu Angstpotenzierung des Schreckens geführt hat, ohne dass der Grundriss oder die Reaktionen auf einen Fußschock beeinträchtigt werden. Die Aktivierung von D2R führt zur Induktion einer Langzeitpotenzierung in der BLA, die vermutlich für ein angstpotenziertes Aufschrecken des Gedächtnisses von entscheidender Bedeutung ist (Bissiere et al., 2003). Unsere Daten zeigen, dass D2R nicht für das steuerrelevante Angstlernen erforderlich ist, sondern dass dieser DA-Rezeptor-Subtyp für die kontextabhängige Schocksensibilisierung wichtig ist. Das systemische Injizieren von D2R-KO-Mäusen mit dem D2-ähnlichen Antagonisten Eticlopride vor dem Training verhinderte angstpotenziertes Schrecken; Daher ist es wahrscheinlich, dass andere D2R-artige Rezeptoren, die ebenfalls durch Eticloprid inhibiert werden, für das angstpotenzierte Aufschrecken kritisch sind (Sigala et al., 1997; Bernaerts und Tirelli, 2003; Laviolette et al., 2005; Swant und Wagner) 2006). Daher können Beeinträchtigungen beim steuerrelevanten Lernen, die durch D2-artige Antagonisten in früheren Studien verursacht wurden, diesen Medikamenten zugeschrieben werden, die andere Mitglieder der D2R-Familie hemmen.

Die selektive Wiederherstellung von endogenem TH speziell im ventralen Tegmentbereich führte zu einer Wiederherstellung des Lernens bei DD-Mäusen. Die Immunhistochemie zeigte, dass TH in wichtigen limbischen Kernen wie dem Nucleus accumbens und der basolateralen Amygdala wieder hergestellt wurde, nicht aber im dorsalen Striatum. Darüber hinaus gab es in der Substantia nigra pars compacta nur sehr wenige TH-positive Neuronen. Diese Daten zeigen, dass die DA aus ventralen tegmentalen Neuronen des Nervensystems wichtig für die konditionierte Angst- und Kontextangst ist.

Mäuse mit selektiver Wiederherstellung der DA in der basolateralen Amygdala drückten das Kurzzeitgedächtnis aus, nicht jedoch das Langzeitgedächtnis oder die Schocksensibilisierung. Frühere Studien haben gezeigt, dass DA die Amygdala-Funktion durch Veränderungen des GABAergen Hemmtonus erleichtert und dieser Effekt entweder durch D1R oder D2R (Bissiere et al., 2003; Kroner et al., 2005; Marowsky et al., 2005) vermittelt wird. Die hier vorgelegten Daten zeigen, dass die DA in der basolateralen Amygdala für den Erwerb des Kurzzeitgedächtnisses für angstpotenzierte Schrecken von entscheidender Bedeutung ist, für die Langzeitstabilität des Gedächtnisses jedoch nicht ausreicht. Die Wiederherstellung des Kurzzeitgedächtnisses wird durch eine kleine Anzahl von basolateralen, Amygdala-projizierenden DA-Neuronen vermittelt, die aus dem ventralen Tegmentbereich stammen. Eine weiter verbreitete Wiederherstellung von endogenem TH in ventralen tegmentalen DD-Mäusen mit geretteten Bereichen führte zu einem intakten Kurzzeit- und Langzeitgedächtnis. Daher ist es wahrscheinlich erforderlich, dass TH für andere mesocorticolimbische Schaltungen wiederhergestellt wird, um ein Langzeitgedächtnis für angstpotenzierte Schrecken aufzubauen. Frühere Studien legen nahe, dass der Nucleus accumbens und der präfrontale Kortex auch wichtige Ziele von DA während der Angstkonditionierung sein können (Kalivas und Duffy, 1995; Murphy et al., 2000; Pezze et al., 2003; LaLumiere et al., 2005; Laviolette et al., 2005; Floresco und Tse, 2007). Daher ist es möglich, dass eine DA-Signalisierung entweder im Nucleus accumbens oder im präfrontalen Kortex zur Bildung des Langzeitgedächtnisses erforderlich ist.

Zusammenfassend wurde in unserer Studie eine Kombination aus genetischen Mausmodellen, Pharmakologie und regionenspezifischer Funktionsrettung verwendet, um zu zeigen, dass DA für das angstpotenzierte Aufschrecken erforderlich ist, eine auf Cue-abhängige Angstkonditionierungsaufgabe. Diese Ergebnisse unterstreichen eine wichtige Rolle für diesen Neurotransmitter außerhalb der Belohnungsverarbeitung. Darüber hinaus zeigt unsere Studie einen Bedarf an DA, das auf mehrere DA-Rezeptoren gleichzeitig in mehreren Hirnregionen für eine anregungsabhängige Angstkonditionierung wirkt. Kürzlich durchgeführte Studien haben gezeigt, dass DA-Neuronen der ventralen tegmentalen Area in ihren molekularen und physiologischen Eigenschaften je nach Zielort signifikant variieren (Ford et al., 2006; Margolis et al., 2006; Bjorklund und Dunnett, 2007; Lammel et al., 2008; Margolis et al., 2008). Die von uns durchgeführten Experimente, bei denen das Th-Gen in DA-Neuronen, die auf die basolaterale Amygdala projizieren, selektiv reaktiviert wurde, zeigen, dass es sich um eine kleine, ausgewählte Population von ventralen tegmentalen Neuronen handelt, und nicht um Kollateralen von DA-Neuronen, die in andere Gehirnregionen projizieren. Unsere Daten, zusammen mit Studien, die die Heterogenität von DA-Neuronenpopulationen belegen, unterstreichen die Notwendigkeit, die Rolle jedes dieser diskreten DA-Schaltkreise zu verstehen. Die Erweiterung des Wissens über die vielen Verhaltens- und physiologischen Funktionen von DA auf das Lernen in Bezug auf Angst kann zu einem besseren Verständnis vorwiegender Angststörungen führen, wie etwa posttraumatische Belastungsstörungen, Zwangsstörungen und generalisierte Angststörungen.

Anerkennungen

Diese Untersuchung wurde teilweise durch den öffentlichen Gesundheitsdienst, den National Research Service Award, T32 GM07270, des Nationalen Instituts für Allgemeinmedizin und des National Institute of General Medical Institutes der NIH, 4 R25 GM 058501-05, unterstützt. Wir danken Ilene Bernstein, Lisa Beutler, Charles Chavkin und Larry Zweifel für hilfreiche Kommentare zum Manuskript, Albert Quintana für Hilfe zur Histologie und Valerie Wall für die Erhaltung der Mauskolonien. Wir danken auch Dr. Miguel Chillon (Vektorproduktionseinheit von CBATEG an der Universitat Autonoma von Barcelona) für CAV2 und Matthew While für AAV1-Virus.

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