Ανίχνευση μοριακών μεταβολών σε ενεργοποιημένους με μεθαμφεταμίνη νευρώνες που εκφράζουν Fos από ένα ραχιαίο ραβδωτό μόσχευμα αρουραίου χρησιμοποιώντας διαλογή κυττάρων που ενεργοποιείται με φθορισμό (FACS) (2013)

Η μεθαμφεταμίνη και άλλα φάρμακα ενεργοποιούν ένα μικρό ποσοστό όλων των νευρώνων στον εγκέφαλο. Αναπτύξαμε προηγουμένως μια μέθοδο που βασίζεται στη διαλογή κυττάρων ενεργοποιημένων με φθορισμό (FACS) για τον χαρακτηρισμό μοριακών αλλαγών που προκαλούνται επιλεκτικά σε ενεργοποιημένους νευρώνες που εκφράζουν τον δείκτη νευρικής δραστηριότητας Fos. Ωστόσο, αυτή η μέθοδος απαιτεί συγκέντρωση δειγμάτων από πολλούς αρουραίους. Τώρα περιγράφουμε μια τροποποιημένη μέθοδο που βασίζεται σε FACS για τον χαρακτηρισμό μοριακών αλλαγών σε ραχιαίους ραβδωτούς νευρώνες που εκφράζουν Fos από έναν μόνο αρουραίο χρησιμοποιώντας μια στρατηγική πολυπλεξίας προ-ενίσχυσης.

Η ανοσοϊστοχημεία των Fos και NeuN (ένας νευρωνικός δείκτης) υποδεικνύει ότι το 5-6% των νευρώνων του ραχιαίου ραβδωτού σώματος ενεργοποιήθηκαν 90 λεπτά μετά από οξείες ενέσεις μεθαμφεταμίνης (5 mg/kg, ενδοπεριτοναϊκή), ενώ λιγότερο από 0.5% των νευρώνων ενεργοποιήθηκαν με ενέσεις φυσιολογικού ορού.

Χρησιμοποιήσαμε FACS για να διαχωρίσουμε τους σημασμένους με NeuN νευρώνες σε νευρώνες θετικούς και Fos αρνητικούς και αξιολογήσαμε την έκφραση mRNA χρησιμοποιώντας RT-qPCR από μόλις πέντε θετικούς σε Fos νευρώνες. Η μεθαμφεταμίνη προκάλεσε 3-20 φορές αυξήσεις στα άμεσα πρώιμα γονίδια του τόξου, homer-2, c-fos, fosB και των ισομορφών του (ΔfosB και μια νέα ισομορφή ΔfosB-2) σε Fos-θετικούς αλλά όχι Fos-αρνητικούς νευρώνες. Η άμεση πρώιμη γονιδιακή επαγωγή mRNA ήταν 10 φορές χαμηλότερη ή απουσίαζε όταν αξιολογήθηκε σε μη ταξινομημένα δείγματα από μεμονωμένα ομογενοποιήματα ραχιαίου ραβδωτού σώματος. Η τροποποιημένη μέθοδός μας καθιστά εφικτή τη μελέτη μοναδικών μοριακών αλλαγών σε νευρώνες που ενεργοποιούνται από φάρμακα ή συνθήματα που σχετίζονται με ναρκωτικά σε πολύπλοκα μοντέλα εθισμού.

Η μεθαμφεταμίνη και άλλα φάρμακα ενεργοποιούν ένα μικρό ποσοστό όλων των νευρώνων στον εγκέφαλο. Εδώ αναφέρουμε μια βελτιωμένη μέθοδο για τον χαρακτηρισμό μοριακών αλλαγών που προκαλούνται επιλεκτικά σε ενεργοποιημένους νευρώνες που εκφράζουν τον δείκτη νευρικής δραστηριότητας Fos. Χρησιμοποιήσαμε FACS μαζί με στοχευμένη προενίσχυση PCR για να αξιολογήσουμε την οξεία επαγόμενη από μεθαμφεταμίνη έκφραση γονιδίου από μόλις 5 νευρώνες που εκφράζουν Fos από ένα ραχιαίο ραβδωτό σώμα μεμονωμένου αρουραίου. Η μεθαμφεταμίνη προκάλεσε 3-20 φορές αυξήσεις των άμεσων πρώιμων γονιδίων (IEG) στους θετικούς στο Fos αλλά όχι στους αρνητικούς στο Fos νευρώνες. Η προενίσχυση στοχευμένης PCR καθιστά εφικτή τη μελέτη μοναδικών μοριακών αλλαγών σε νευρώνες που ενεργοποιούνται από φάρμακα ή συνθήματα που σχετίζονται με φάρμακα σε πολύπλοκα μοντέλα εθισμού.

Δημοσιεύθηκε το 2013. Αυτό το άρθρο είναι έργο της κυβέρνησης των Η.Π.Α. και αποτελεί δημόσιο τομέα στις ΗΠΑ.