Cdk5 Fosforlatigas Dopaminon D2-Receptoron kaj Atenuojn de Suba Signalo (2013)

Citaĵo: Jeong J, Park YU, Kim DK, Lee S, Kwak Y, kaj aliaj. (2013) Cdk5-Fosforilatoj de Dopamina D2-Ricevilo kaj mildigas laŭflue sinsekvon. PLoS ONE 8 (12): e84482. doi: 10.1371 / journal.pone.0084482

redaktanto: James Porter, Universitato de Norda Dakoto, Usono

Ricevita: Majo 20, 2013; Akceptita: Novembro 14, 2013; Eldonita: Decembro 31, 2013

Kopirajto: © 2013 Jeong et al. Ĉi tiu estas malferma-alira artikolo distribuita laŭ la kondiĉoj de la Krea Komunaĵo Atribuka Permesilo, kiu permesas senrestran uzadon, distribuadon kaj reprodukton en iu ajn rimedo, kondiĉe ke la originala aŭtoro kaj fonto estas akredititaj.

Financado: Ĉi tiu laboro estis subtenita de la subvencioj (NRF-2012R1A2A2A01012923 kaj NRF-2012R1A4A1028200) de la korea registaro (MSIP) kaj ankaŭ sub la kadro de programo de internacia kunlaboro administrita de NRF de Koreio (2012K2A1A2033117) kaj la Korea Brain Research Institute (KBRI). Baza Esplorprogramo de MSIP (2031-415). SKP estis ricevanto de la Nacia Alianco 2004 kaj 2006 por Esplorado pri Skizofrenio kaj Depresio (NARSAD) Young Investigator Awards. La financistoj havis neniun rolon en studdezajno, datumkolektado kaj analizo, decido eldoni, aŭ preparado de la manuskripto.

Konkurantaj interesoj: La aŭtoroj deklaris, ke ne ekzistas konkurencantaj interesoj.

Enkonduko

Dopamina signalado estas implikita en diversaj cerbaj funkcioj inkluzive de motora kunordigo, humora kontrolo kaj rekompenco [1]. Grava komponento de dopamina signalado en vertebruloj estas praktikita de striatal mezaj spongaj neŭronoj (MSN), kiuj selekteme esprimas subaron de dopaminaj riceviloj kaj ricevas dopaminergian enigon ĉefe de la ventra tegmentala areo (VTA) kaj substantia nigra.) [2]. Receptores de dopamina estas riceviloj kuplitaj al proteinoj G (GPCR) kun sep regadoj transmembrana kaj ili konsistas de du subtipos, D1-similaj kaj D2-similaj receptoroj, kiuj mediacias reciprokaj agoj en dopamina signalado [1]. Ekzemple, similaj dopilinaj receptoroj (D1, D1) aktivigas adenyil ciclazon per G_αs kaj pliigi la intraĉelan nivelon de cAMP, sed dopamina D2-similaj riceviloj (D2, D3, D4) malhelpas adenyilciklase tra G_αi kaj malpliigi la intraĉelan nivelon de cAMP [1], [3].

Inter dopaminaj receptoroj, la D2a receptoro (DRD2) estas implikita en la fiziopatologio de multoblaj gravaj psikiatriaj malordoj inkluzive de skizofrenio kaj drogodependeco. [4], tiel ke multaj kontraŭpsikotikaj medikamentoj almenaŭ parte celas DRD2. Estas ankaŭ sciate, ke la agado de DRD2 kongruas bone kun la kondutaj konsekvencoj de drogoj de misuzo en bestaj modeloj [5]. Antidepresivos kaj humura stabiligila efikeco ankaŭ estis ligitaj al ŝanĝoj en la ĉela surfaca esprimo de DRD2 aŭ laŭflua enmarŝa signalo mediaciita de PKA, ERK kaj GSK3. [1], [4], [6]. Malgraŭ ĉi tiuj kritikaj roloj por DRD2 en la cerbo, la detalaj reguligaj me thatanismoj kiuj asignas heterogenecon kaj kompleksecon al DRD2-aj proprietoj ne estas tute komprenitaj.

Konverĝantaj pruvoj indikas, ke multaj posttranslaj modifoj estas implikitaj en la agordado de la aktiveco de DRD2. Ampleksa glicosilado de DRD2 estis malkaŝita en fruaj fotokomisaj studoj [7], kaj disulfidliga formado ene de DRD2 ankaŭ estis identigita kiel grava modifo por ligando liganta [8]. Plue, fosforiligaj lokoj de DRD2 estis komence identigitaj de en vitro analizo kun radioizotopoj, provizante itinerojn por diversaj reguligaj vojoj mediaciitaj de diversaj kinazoj [9]. Efektive, proteina kinazo C (PKC) reguligas DRD2-mediaciitan mobilizon de intracelula kalcio kaj modulas la interrilatadon de DRD2 kun citooskeletaj proteinoj [10]. Fosforiligo per GPCR-kinozo 2 (GRK2) reguligas agonist-induktitajn resensibiligajn ŝablonojn de DRD2 [11].

Cyclin-dependa kinaso 5 (Cdk5) estas prolino-direktita serino / treonin kinazo kiu havas preferan agadon pro cerb-specifa esprimo de ĝiaj esencaj aktivigantoj, p35 kaj p39 [12]. Cdk5 estas implikita en diversaj procezoj de neŭronoj inkluzive de neŭrona migrado kaj aksona gvidado, kaj Cdk5 kaj p35 nulaj musoj montras difektojn en kortika tavolo. [13]. Lastatempe, oni montris, ke fosforilado de WAVE1 kaj epheksino de Cdk5 reguligas morfogenezon dendrita. [14]. Krome, Cdk5 ankaŭ reguligas surfacajn esprimajn nivelojn de la NMDA-receptoro, NR2B, kaj NR2A-mediaciitaj NMDA-fluoj [15], [16]. Estas notinde, ke pluraj indikaĵoj sugestas intiman rilaton inter Cdk5 kaj la dopamina sistemo. Cdk5 fosforiligas tirozinon hidroxilase (TH), reguligante ĝian stabilecon, kaj tiel konservante dopaminergian homeostazon [17]. En postsinaptaj neŭronoj, kiam la T75-restaĵo de dopamino kaj cikla-AMP-fosfoproteino-32kD (DARPP-32) estas fosforilita de Cdk5, ĝi povas deteni PKA-aktivecon kaj tiel antagonigi dopaminan mediada PKA-signalado de DRD1. [18]. Kurioze, kiam kokaino, nerekta agonisto de dopaminaj riceviloj, estas administrita kronike en ratoj, mRNA kaj proteina niveloj de Cdk5-pliiĝo en mezvundaj neŭronoj [19]. Kolektive, Cdk5 ŝajnas esti implikita en drog-induktitaj sinaptaj adaptoj. En ĉi tiu studo, ni montras funkcian interagon de DRD2 kaj Cdk5, kiu plue etendas la rolon de Cdk5 en dopamina signalado.

Materialoj kaj metodoj

Antikorpoj

Kontraŭ-kuniklaj serumoj kreskis kontraŭ peptidoj enhavantaj fosfo-serinon 321 (pS321) de la tria intracelula banto de DRD2 (D2i3). Phosphepeptide, CNPDpSPAKPEK (PEPTRON), estis uzita por krei peptid-konjugitan kolonon por afineco purigado (20401, PIERCE). Anti-pS321-antikorpo estis riĉigita per afiniga puriga sistemo sekvante la instrukcion de la fabrikanto. Purigita phospho-antikorpo estis konservita en PBS kun 0.1% natrita azido kaj 0.1% -gelatino. Kontraŭmaŝa kontraŭ-Cdk5-antikorpo (sc-249) kaj kontraŭ-kunikla anti-p35-antikorpo (sc-820) estis uzataj por la okcidenta pasto kaj imunocitoquímica de Cdk5 / p35. Anti-musa anti-GFP-antikorpo (sc-9996) estis uzita por la imunoprecipitación kaj okcidenta makulo de DRD2-GFP. Kontraŭ-kuniklaj kontraŭ-FLAG-antikorpoj (sc-807), kontraŭ-kuniklaj kontraŭ-HA-antikorpoj (sc-805), kontraŭ-musaj anti-GST-antikorpoj (sc-138) kaj kontraŭ-musaj anti-GAPDH-antikorpoj 32293) estis aĉetita de Santa Cruz Biotechnologies.

bestoj

La p35-knoka knabo estis afabla donaco de doktoro Katsuhiko Mikoshiba ĉe RIKEN Brain Science Institute en Japanio kaj uzata por primara neŭrona kulturo. Kombinaĵoj por genotipado estis 5′-GGTCTCCTCTTCTGTCAAGAAG, 5′-GCTCTGCTAGACACACTACTGTAC kaj 5′-TCCATCT GCACGAGACTAGT kiel antaŭe priskribita [20]. ICR-musoj kaj Sprague Dawley-ratoj estis uzataj por preparo de lisaj cerboj. Ĉiuj bestaj proceduroj estis aprobitaj de la Komitato pri Edukado kaj Uzo de Besta Instituto de Pohang-Universitato pri Scienco kaj Teknologio.

Konstrukcioj de plasmo

Humana DRD2-longa izoformo en EGFP-N1-plasmido-vektoro kaj la tria intracelula buklo de DRD2 (212-373-aminoakvaj restaĵoj inkluzive de la 29-kromaj aminoacidaj restaĵoj unika al DRD2-longa izoformo) en pFLAG-CMV-2-plasmido-vektoro. Homa Cdk5 estis enigita en vektora plasmida pCMV-HA kaj p35 homa estis enigita en vektora plasmido de pcDNA 3.1. Homa Cdk5 estis enmetita sub citomegaloviruso (CMV) reklamanto kune kun homa p35 en pcDNA 3.1-vektoro por fari duoblan esprimon konstrui (Cdk5 / p35) por imunocitoquímica, ricevila interniga analizo, [³⁵S] -GTP_γS-deviga analizo, radioligando-liga analizo kaj AMPam enzim-imunoenzelo.

En Vitro Kazaza analizo

IP-ligitaj en vitro La kinaza analizo estis plenumita kiel sekva. Unu tuta cerba cerbo estis lisita en 3 mL eritrocitoj lise-bufro (ELB) (50 mM Tris (pH 8.0), 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40) per 20-strekoj de Dounce homogeniganto por akiri homogenigajn cerbajn lizitajn . La lisatoj estis kovataj sur glacio por 30 min, sonicated, kaj centrifugis ĉe 16,000 × g por 10 min. La supernatantes estis inmunoprecipitados kun antikorpo anti-kuniklo anti-p35 por akiri kompleksan Cdk5 / p35 aktiva. Cdk5 / p35-komplekso kaj purigita GST-fuzia proteino estis miksita kun adenozina 5′-triposfato, [γ-³²P] (NEG-502H, PerkinElmer) kaj kovita en kinaza bufro (30 mM HEPES (pH 7.2), 10 mM MgCl₂, 0.2 mM DTT) por 1 h ĉe ĉambra temperaturo [18], [21]. Kompleksa purigata Cdk5 / p25 (14-516, Millipore) ankaŭ estis uzita por en vitro analizo de kinazo kiel priskribita supre. La 2 × specimeno-ŝparado-bufro estis aldonita al la reaga miksaĵo kaj kuiris je 100 ° C. La specimenoj tiam estis submetitaj al SDS-PAGE kaj la sekigita ĝelo estis taksita per aŭtoradiografio.

Likva Kromatografio (LC) -Mas Spectrometry (MS) / MS-Analizo

La recombinanta GST-D2i3-proteino estis analizita per LC-MS / MS sekvante IP-ligitan. en vitro analizo de kinazo. Ni plenumis peptidan identigon de datumoj de LC-MS / MS per X !! Tandem (versio Dec-01-2008). Ĉiu RAW-datuma dosiero unue estis konvertita al mzXML uzante la trans-proteinan dukton (TPP; versio 4.3). MS / MS-scintigrafioj en la konvertitaj mzXML-oj estis submetataj al serĉado kontraŭ la datumbazo de proteina sekvenco de muso UniProt (liberigi 2010_07) inkluzive de GST-D2i3-sekvenco uzante X !! La toleremo estis fiksita al 3 Da por antaŭiraj jonoj kaj 2 Da por fragmentaj jonoj. Oni uzis enzimajn specifojn por la tripsino. Ŝanĝiĝemaj opcioj estis uzitaj por la carbamidometilado de cisteino (57.021 Da), la oksidado de metionino (15.995 Da), la hidrolizo de asparagino (0.987 Da) kaj la fosforilado de serino (79.966 Da).

Imunoprecipitación

Imunoprecipitación estis farita sur ĉelaj lizatoj en ELB-liza bufro. Kontraŭ-GFP-antikorpo estis aldonita al la lizatoj kaj kovita por 3 h ĉe 4 ° C. Imunokomplexoj estis purigitaj per proteino-A agarozo. La precipitoj estis kovataj per SDS-speca ŝarĝa bufro por 30-min ĉe 37 ° C, kaj submetitaj al SDS-PAGE kaj Western blot.

GST Pull-down Assay

10 µg de purigita GST kaj GST-D2i3 estis kovataj per rat cerbojita por 1.5 h ĉe 4 ° C. 30 µL de glutattion (GSH) -konjugita Sepharose 4B-bidoj (17-0756-01, GE Healthcare) ekvilibrigita kun liza bufro estis aldonita kaj kovis por aldona 1 h. Bidoj estis kolektitaj per centrifugado ĉe 2,000 ×g kaj lavis per liza bufro XNUM fojoj [22], [23]. Precipitaĵoj estis analizitaj per okcidenta makulaĵo uzante kontraŭ-Cdk5 kaj kontraŭ-p35-antikorpojn.

Immunocitoquímica

Transfected HEK 293 ĉeloj kaj striatal neŭronoj kulturitaj sur kovriloj estis lavitaj unufoje kun fosfata buffer salaĵo (PBS) kaj fiksitaj per mergado en malvarma 4% paraformaldehido / PBS por 30 min. Primara antikorpo diluis en la blokada solvo (2% ĉevalaj serumo kaj 1% Triton X-100 en PBS). Antilodoj anti-muso kunĝuligitaj de Alexafluor-647 (A20990, Invitrogen) kaj antikorpoj anti-kuniklo konjugitaj kun Alexafluor-568 (A11011, Invitrogen) estis uzitaj kiel malĉefaj antikorpoj. Hoechst estis uzita por nuklea makulado. Bildoj akiris per konfokala mikroskopo (Olympus, FluoView-1000).

Receptora Interna analizo

XN post hura transfekto, ĉeloj estis traktitaj per 24 µM ​​quinpirolo (Q1, Sigma) por 102-min kaj 30-min ĉe 90 ° C. Ĉeloj estis reusenditaj en 37 mL-malvarmaj PBS kaj 2 µL-alicotojn estis uzitaj por ĉiu reago. Medikamentoj estis faritaj en ĉambra temperaturo por 200 h ĉe la sekvaj koncentriĝoj; 3 nM [³H] -spiperono (NET-565, PerkinElmer), 3 µM ​​sulpirido (895, TOCRIS), 10 µM ​​haloperidol (H1512, Sigma). Hidrofoba [³H] -spiperono estis uzata por marki totalajn esprimitajn receptorojn kaj hidrofila sulpirido estis uzata por anstataŭi membranan ligitan receptoron [³H] -spiperonaj signaloj. Membranaj receptoraj signaloj estis kalkulitaj subtrahantaj intracelularajn receptaĵojn de la totalaj esprimitaj ricevilaj valoroj. Ĉeloj estis filtritaj sur GF / B (Millipore) filtrilo kaj lavis 3-fojojn per lavadĉifro (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Filtriloj estis sekigitaj kaj resta radioaktiveco estis mezurita per likva skintila batilo [24].

Preparado de Ĉela Membrano

Konfluaj ĉeloj en 100 mm-kultivaj pladoj post transfekto estis lavitaj per glacikapsa PBS kaj rikoltitaj en 1 mL HME-bufro (25 mM HEPES (pH 7.5), 2 mM MgCl₂, 1 mM EDTA). Homogeneizitaj lizatoj estis centrifugitaj kun 500 × g por 15-min kaj la supernaturoj estis poste centrifugitaj kun 36,000 × g por 30-min. Buletoj denove pendantaj en HME-bufro estis uzataj por provoj.

[³⁵S] -GTP_γS Binding Assay

Ĉelaj membranaj frakcioj estis antaŭ-kovataj kun 1 µM ​​quinpirolo (Q102, Sigma) en la analizo-bufro (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl₂, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA kaj 0.01 mM GDP) por 10 min. [³⁵S] -GTP_γS (NET-030H, PerkinElmer) estis aldonita al la fina koncentriĝo de 3 nM en 30 µL kaj plie kovis por 90 min. 170 µL de glacia malvarma bufro (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, kaj 0.1 mM GTP) estis aldonita por ĉesigi la reagon. Membranoj estis filtritaj sur GF / B-filtrilo (Millipore) kaj lavitaj 3-foje per lavado de bufro (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Filtriloj estis sekigitaj kaj radioaktiveco estis mezurita per la scintila kontilo [25], [26].

Radiolig Binding Assay

Preparitaj ĉelmembranoj estis kovataj de 0.01 nM [³H] -spiperono (NET-565, PerkinElmer) kaj kreskantaj koncentriĝoj de quinpirolo (Q102, Sigma) por 30-min en la analizo-bufro (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl₂, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA). Membranoj estis filtritaj sur GF / B-filtrilo (Millipore) kaj lavitaj 3-foje per lavado de bufro (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). La reago finiĝis per rapida filtrado tra filtriloj GF / C. Resta radioaktiveco estis mezurita per likva skintila kontilo [27]-[29].

AMP Immunoassay

Transfected HEK 293 ĉeloj estis pretratita kun 10 µM ​​rolipram (R6520, Sigma) por 1 h, kaj poste traktita kun 0.1 µM ​​forskolino (F6886, Sigma) kaj kreskantaj koncentriĝoj de quinpirole (Q102, Sigma) por 30 min. Primaraj kulturitaj striataj neŭronoj estis traktitaj per 10 µM ​​rolipram por 1 h, kaj tiam 1 µM-dopamino por 1 h [22]. Ĉelaj lisatoj estis preparitaj kun niveloj de 0.1 M HCl kaj cAMP estis detektitaj per cAMP-enzimakunaj ilaro (Sapphire Bioscience) sekvante la instrukcion de la produktanto.

Primara Kultura Striatala Neŭrono

Striatal areo estis izolita de la musa embrio cerbo (E15). Dissecita ŝtofo disiĝis en minimumaj esencaj medioj (MEM) (11095, Invitrogen) enhavantaj 0.25% tripsinon (T4549-100, Sigma) kaj 0.1% DNase I por 6-min ĉe 37 ° C. Ĉeloj estis re-pendigitaj en la tegaĵo (MEM kun 0.01 M HEPES (pH 7.4) kaj 10% (vol / vol) ĉeval-serumo (16050-122, GIBCO)). Neŭronoj estis kultivitaj por 7-tagoj en vitro (DIV 7) en MEM kun suplemento B27 (17504-044, Invitrogen) antaŭ ol esti aplikita al AMAMP-enzimaj imunanalizoj.

rezultoj

Cdk5 Fosforiligas Seran 321 en la Tria Intracelula Buklo de DRD2 en vitro

Por identigi novajn substratojn Cdk5, ni faris sisteman serĉadon uzante (S / T) PX (K / H / R) kiel la Cdk5-agnoskaj interkonsentaj sekvencoj. [30] kaj identigis DRD2 kiel kandidata substrato. La interkonsenta sekvenco, inkluzive de serino 321, situas en la tria intracelula banto de DRD2 (D2i3) kie diversaj reguligaj me haveanismoj estis implikitaj [3], [10], [11]. La vico estas evolue konservita en DRD2 en vertebruloj, kio implicas funkcian gravecon de la restaĵo (Fig. 1A).

malŝarĝo:      

• PPT

  PowerPoint diapozitivoj

• PNG

  pli granda bildo (2.08MB)

• TIFF

  originala bildo (4.36MB)

Figuro 1. Cdk5 fosforila serino 321 en la tria intracelula banto de DRD2 in vitro.

(A) Aminacida sekvencalineado montranta konservitajn regionojn de la DRD2 de diversaj specioj (ombritaj). La potenciala fosforiliga loko de Cdk5 estas indikita de asterisko. (B) IP-ligitaj en vitro _ kinase_ analitiko kun rekombinantaj GST-D2i3 kaj GST-D2i3-mutantaj proteinoj. Kompleksa Cdk5 / p35 riĉigita de muskola ekstrakto de kontraŭ-p35-imunoprecipitaĵo estis uzata por kinazaj reagoj. Aŭtoradiografio de fosforilaj proteinoj estas montrita kune kun Coomassie brila blua makulado de la sama ĝelo. Sago-pinto indikas radioaktivan signalon responda al GST-D2i3 kaj malfermita sago indikas radioaktivajn signalojn de p35. (C) MS / MS-spektro de la fosforila peptida fragmento de D2i3. La teoriaj fragmentaj skemoj estas montritaj sub la spektro. Inter ĉiuj fragmentaj jonoj, la detektitaj jonoj kaj b-jonoj estas indikitaj en la spektro. Ili₆ kaj y₇ jonoj forte indikas la fosforiladon de serino 321. (D) In vitro Provo de kinazo kun kompleksa purigita Cdk5 / GST-p25 uzante GST-D2i3 kaj GST-D2i3-mutantajn proteinojn. Fosforaj proteinoj estis montritaj en aŭtoradografio, kune kun la brila blua makulo de Coomassie. Sago-pinto indikas radioaktivan signalon responda GST-D2i3 kaj malferma klingkodo indikas radioaktivajn signalojn el GST-p25.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g001

Por taksi la kapablon de Cdk5 fosforili D2i3, ni faris IP-ligitan en vitro Analizoj de kinazo uzante kompleksan kompleksan Cdk5 / p35 riĉigita de lisato de muskolo per p35-imunoprecipitaĵo kun purigitaj rekombinantaj GST-D2i3 (aminoacidrestaĵoj 212-373) proteinoj kiel substratoj. Ni observis fosforiligajn signalojn en la purigitaj GST-D2i3 kaj GST-D2i3 S297A-proteinoj, sed la signalo signife malpliiĝis per GST-D2i3 S321A (Fig. 1B). Por plui kontroli fosforiladon de serino 321 en la GST-D2i3, ni faris LC-MS / MS-analizon de la specimenoj de IP-ligitaj. en vitro Provoj de kinazo uzante spektrogramon de masoj LTQ XL. Konsekvence, fosfopeptidoj respondantaj al la maso de fosfoserina 321-peptidoj estis reakiritaj (Fig. 1C). Konsiderante ke la datuma-dependanta akiro dum LC-MS / MS-analizo tendencas detekti abundajn proteinojn en la specimeno [31], ĉi tiuj datumoj sugestas ke la serina 321-restaĵo estas la domina fosforiliga ejo de Cdk5 en la regiono D2i3. Pruvi rektan fosforiladon de serino 321 en la GST-D2i3 de Cdk5, en vitro La kinaza analizo uzis komplekson purigitan Cdk5 / GST-p25 kun purigitaj rekombinaj GST-D2i3-proteinoj. Ni identigis gravan signalon de fosforilado en la GST-D2i3 kiu forestis en la GST-D2i3 S321A (Fig. 1D). Prenitaj kune, ĉi tiuj rezultoj indikas, ke la restaĵo D2i3 S321 estas preferinda celo por fosforilado per mediadita Cdk5.

Cdk5 Fosforiligas Seran 321 en la Tria Intracelula Buklo de DRD2 en Ĉeloj

Por identigi la fosforiladon de serino 321, ni levis specifan antikoron por fosfo-serino 321 (pS321). Specimenoj de la IP-ligitaj en vitro La kinaza analizo estis analizita per okcidenta imitaĵo uzante kontraŭ-pS321-antikorpon. Makuladoj montris distingan bandon en la kinaza reago, kiu dependis de GST-D2i3 (Fig. 2A). Por kontroli la eblan fosforiladon de serino 321 en DRD2 per Cdk5 en ĉeloj, kontraŭ-GFP-imunoprecipitoj de HEK 293-ĉeloj esprimantaj DRD2-GFP kaj DRD2 S321A-GFP kun aŭ sen HA-Cdk5 kaj p35 estis analizitaj per okcidenta pasto per anti-GFP kaj antikorpoj anti-pS321. Karakterizaj striaj bandaj signaloj de kontraŭ-GFP-antikorpoj, kiujn oni scias, ke estas kaŭzitaj de troa glukozilado de DRD2, estas observitaj nur en ĉeesto de DRD2-GFP, kaj kontraŭ-pS321-antikorpoj detektis similajn DRD2-signalojn nur kun esprimo de Cdk5 / p35Fig. 2B) [7]. Por plu kontroli la fosforilado de serino 321 per Cdk5, D2i3 (FLAG-D2i3) kaj mutanta formo de D2i3 (FLAG-D2i3 S321A) estis. FLAG-D2i3 kaj FLAG-D2i3 S321A esprimita kun aŭ sen HA-Cdk5 kaj p35 en HEK 293 ĉeloj estis analizitaj per SDS-ĝelo moviĝeblo ŝanĝi teston. Grava ŝanĝo de moviĝeblo dependanta de Cdk5 estis observita por FLAG-D2i3, sed ne por FLAG-D2i3 S321A (Fig. 2C). Ni ankaŭ taksis la nivelon de fosforilado de DRD2 ĉe Ser321 post agonisma stimulo. Ĉeloj de HEK 293, esprimantaj komplekson DRD2-GFP kaj Cdk5 / p35, estis stimulitaj per quinpirolo, kaj kontraŭ-GFP-immunoprecipitoj de la ĉelaj lisatoj estis analizitaj per okcidenta antidio kun anti-GFP kaj anti-pS321. Ni trovis, ke la Cdk5-mediada fosforilado de DRD2 ĉe Ser321 ne estis influita de agonisma stimulo, kiu aspektas malsama de GRK- kaj PKC-mediaciita fosforilado (Fig. 2D) [32], [33]. Kune, ĉi tiuj rezultoj indikas, ke Cdk5 povas fosforigi la serinon 321-restaĵon de DRD2 en la ĉela medio.

malŝarĝo:      

• PPT

  PowerPoint diapozitivoj

• PNG

  pli granda bildo (1.92MB)

• TIFF

  originala bildo (3.5MB)

Figuro 2. Cdk5 fosforiligas serinon 321 en la tria intracelula banto de DRD2 en ĉeloj.

La mediado de Cdk5-fosforilado de serino 321 estis analizita uzante kontraŭ-pS321-antikorpon. (A) Specimenoj de IP-ligitaj en vitro Analizo de kinaza uzanta GST-D2i3-proteinoj estis analizita per okcidenta blotado (WB) kun indikitaj antikorpoj. Sago-sagoj indikas GST-D2i3. (B) DRD2-GFP kaj DRD2 S321A-GFP estis esprimitaj kun aŭ sen HA-Cdk5 kaj p35 en HEK 293 ĉeloj. Kontraŭ-GFP-imunoprecipitoj estis analizitaj per okcidenta blotado uzante kontraŭ-GFP kaj kontraŭ-pS321-antikorpojn. La krampo indikas signalojn de DRD2 kaj malferma sago indikas specifajn signalojn de la kontraŭ-GFP-imunoprecipitoj. '% input' estas% volumo de totala lisato por IP-reago. Malfortaj endogenaj Cdk5-signaloj estis indikitaj per asteriskoj. (C) elmopola movo analizo. HEK 293-ĉeloj, kiel indikis, estis analizitaj per okcidenta makulaĵo. (D) Transfected HEK 293 ĉeloj estis traktita kun quinpirole kaj anti-GFP immunoprecipitates estis analizitaj per okcidenta blot kun anti-GFP kaj anti-pS321 antikorpoj. Malferma sago indikas specifajn signalojn de kontraŭ-GFP-imunoprecipitoj.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g002

Kompleksa Cdk5 / p35 kaj DRD2 estas Fizike Asociitaj

Ni esploris la potencialan fizikan interagadon inter la komplekso Cdk5 / p35 kaj DRD2, ĉar oni scias, ke multaj Cdk5-substratoj estas fizike asociitaj kun kompleksa Cdk5 / p35. [23], [34], [35]. Unue, la GST tirado-eksperimento estis farita. Purigita recombinanta GST-D2i3-proteino estis kovata per rat cerbojitaj lizato kaj GST tiesdifektiloj estis analizitaj por okcidenta makulo. Kiel montrite en Fig. 3A, endogenaj Cdk5 kaj p35 estis identigitaj en la deklivaj precipitoj, indikante fizikan interagon inter DRD2 kaj la Cdk5 / p35-komplekso (Fig. 3A). Plie, HA-Cdk5 kaj p35 estis detektitaj en la kontraŭ-GFP-imunoprecipitoj de HEK 293-ĉelaj lisatoj esprimantaj DRD2-GFP kaj Cdk5 / p35 (Fig. 3B). Krome, ni faris immunocytochemical-analizon kaj observis ke DRD2-GFP, HA-Cdk5 kaj p35 montras signifajn kun-lokalizajn signalojn ĉe la membraneca areo de HEK 293 ĉeloj (Fig. 3C, supraj paneloj). Ni ankaŭ esploris kunlokadon de DRD2 kaj Cdk5 / p35 en la neŭrona kunteksto. Konsekvence, DRD2-GFP ankaŭ montris signifan kunlokadon kun endogena Cdk5 kaj p35 en la kultitaj striataj neŭronoj (DIV7), plue subtenante funkciajn ligojn inter DRD2 kaj Cdk5 / p35 (Fig. 3C, malsupraj paneloj). La rezultoj indikas, ke DRD2 kaj Cdk5 / p35 povas formi kompleksan kaj tiel subtenas la nocion, ke DRD2 estas fiziologia substrato de Cdk5.

malŝarĝo:      

• PPT

  PowerPoint diapozitivoj

• PNG

  pli granda bildo (3.91MB)

• TIFF

  originala bildo (5.35MB)

Figuro 3. Cdk5 / p35 povas formi komplekson per DRD2.

(A) TIG-malkaŝa analizo uzante purigitan recombinantan GST-D2i3-proteinon kun rato cerba ekstrakto. GST-ties precipitoj estis submetitaj al okcidentaj analizoj. "Bido" indikas la ekproceson sen GST-proteinoj. (B) Imunoprecipitación de kompleksa DRD2 kaj Cdk5 / p35. Kontraŭ-GFP-IP de lizatoj de transfektitaj ĉeloj estis submetita al okcidentaj antidio. La krampo indikas signalojn de DRD2 kaj malferma sago indikas specifajn signalojn de la kontraŭ-GFP-imunoprecipitoj. Tro-elmetita blot por enigoj ankaŭ estas montrita dekstre. (C) Imunocitokemiaj analizoj de DRD2 kaj Cdk5 / p35. Ĉeloj de HEK 293 esprimantaj DRD2-GFP kaj Cdk5 / p35 estis makulitaj per kontraŭ-Cdk5 kaj kontraŭ-p35-antikorpoj (Supraj paneloj). DRD2-GFP estis esprimita sole en la kleraj striataj neŭronoj kaj makulita per kontraŭ-Cdk5 kaj kontraŭ-p35-antikorpoj (Pli malaltaj paneloj). Hoechst estis uzita por nuklea makulado. La skala stango estas 5 µm. Ĉiuj bildoj estis akiritaj uzante konfokan mikroskopion (Olympus, FluoView-1000).

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g003

Cdk5-mediaciita Fosforilado de DRD2 Akcelas Ricevilan Aktivecon

Estis raportite ke fosforilado modulas kritikajn ecojn de GPCRoj kiel ekzemple G-proteina kuplado, ricevila internigo, intraĉela lokaligo, kaj asocio kun modulilaj proteinoj [9], [11], [24]. AGonist-induktita ricevila enmetiĝo estas kritika reguliga procezo de signala transdukto. Ni enketis Cdk5-mediaciitan moduladon de DRD2-internaligo. La ĉeloj de HEK 293, kiuj esprimas DRD2-GFP kaj DRD2 S321A-GFP kun aŭ sen Cdk5 / p35, estis kovataj de 1 µM-quinpirolo por indukti internigon de DRD2 stimulita de agonisto.Fig. 4A). [³H] -spiperonaj signaloj de esprimantaj ĉeloj DRD2-GFP estis signife reduktitaj ĉe 30 min-quinpirol-traktado kaj reakiritaj ĉe 90 min. Interese, [³H] -spiperonaj signaloj de esprimantaj ĉeloj DRD2-GFP kaj Cdk5 / p35 ankaŭ estis reduktitaj ĉe 30 min-quinpirol-traktado sed ne rekuperitaj ĉe 90 min (Fig. 4A, dua sekcio). Aliflanke, [³H] -spiperonaj signaloj de esprimantaj ĉeloj DRD2 S321A-GFP reduktis je 30 min kaj reakiris je 90 min, sendepende de la kun-esprimo kun Cdk5 / p35. Antaŭaj studoj montris, ke la internigita DRD2 recikligas reen al la plasmomembrano post daŭrigita agonista stimulo. [11]. TŜajnas, ke la mediado de Cdk5-fosforilado de DRD2 estas implikita en resensibiligaj procezoj post agonisto-induktita DRD2-internaligo.

malŝarĝo:      

• PPT

  PowerPoint diapozitivoj

• PNG

  pli granda bildo (387KB)

• TIFF

  originala bildo (1.31MB)

Figuro 4. Fosforilación mediada por Cdk5 mildigas la esprimon de la surfaco de DRD2 kaj la señalización sube.

(A) DRD2-surfaca esprimo mezurita per [³H] -spiperona deviga testo. Transfektitaj HEK293-ĉeloj estis stimulitaj per 1 µM-quinpirolo por la indikita tempo kaj rikoltita, sekvita de 3 nM [³H] -spiperona kuracado dum 3 h. Radioaktiveco estis mezurita kaj surfacaj signaloj kalkulitaj. Eraraj stangoj reprezentas averaĝan ± SE (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01; Unudirekta ANOVA kun Dunnett post hoc-testo: komparu ĉiujn kolumnojn kontraŭ kontrolkolono). (B) [³⁵S] -GTP_γS deviga analizo. Ĉelaj membranoj estis preparitaj de la ĉeloj, kiel indikis. Membranaj preparoj estis kovataj de 1 µM ​​quinpirolo sekvata de 3 nM [³⁵S] -GTP_γS por 90 min. Eraraj stangoj reprezentas averaĝan ± SE (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001; Unudirekta ANOVA kun Bonferroni post hoc-testo: komparu ĉiujn parojn de kolumnoj). (C) Kvinpirole-konkuranta [³H] -spiperona deviga testo. Membranaj preparoj de transfektitaj ĉeloj estis kovataj de 0.01 nM [³H] -spiperono kaj kreskantaj koncentriĝoj de kvinpirolo dum 30 min. Senlinia regreso estis akirita de GraphPad. Eraraj stangoj indikas averaĝan ± SE (n = 3). (D) cAMP-enzimaj imunoanalizoj en transfektitaj HEK 293-ĉeloj. Transfektitaj ĉeloj estis pretraktitaj kun 10 µM rolipramo dum 1 h, kaj poste kun-traktataj kun 0.1 µM forskolino kaj kreskantaj koncentriĝoj de kvinpirolo dum 30 min. Senlinia regreso estis akirita de GraphPad. Eraraj stangoj reprezentas averaĝan ± SE (n = 4; ** p <0.01; duvostaj t-estoj). (E) Kulturaj striatalaj neŭronoj de sovaĝa tipo kaj p35-knoka embrioj (DIV 7) estis traktitaj per 10 µM ​​rolipram por 1 h sekvita de 1 µM-dopamino por 1 h. Erarmatenoj reprezentas meznombro ± SE (n = 4; **p<0.01; duvostaj t-estoj).

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g004

Ni plue taksis eblan ŝanĝon de agonist-stimulita G-proteino kunigilo al DRD2 asociita kun Cdk5-mediaciita fosforilación uzante³⁵S] -GTP_γS deviga analizo [25], [26]. DRD2-GFP kaj DRD2 S321A-GFP kun aŭ sen Cdk5 / p35 estis esprimitaj en ĉeloj HEK 293. Membranoj estis preparitaj kaj stimulitaj per 1 µM ​​quinpirolo kaj plue permesis [³⁵S] -GTP_γS aliĝo. DRD2-GFP kaj Cdk5 / p35 esprimanta ĉelmembrano montriĝis signife difektita [³⁵S] -GTP_γS-ligado kompare kun ĉiuj aliaj ĉelaj membranoj (Fig. 4B). Ĉi tiuj rezultoj indikas, ke mediadita fosforilado de Cdk5 malaltigas-reguligas ligadon de proteino G stimulita de agonisto ĉe DRD2.

Plie, quinpirole-konkurencanta [³H] -spiperonaj ligadaj testoj estis faritaj por esplori ĉiun eblan ŝanĝon en agonisto-afineco ĉe DRD2 per Cdk5-mediaciita fosforilado. Konkura ligado de [³H] -spiperono post traktado de kreskantaj koncentriĝoj de quinpirolo al la membrana preparo de transfektita estis mezurita. Konkurencanta ligado de quinpirolo kaj [³H] -spiperono ĉe DRD2-GFP kaj DRD2 S321A-GFP faris similan logK_i valoroj (−9.789 por DRD2-GFP; −9.691 por DRD2 S321A-GFP), indikante ke la afineco de ligando al DRD2 ne estas signife influita de Cdk5-mediaciita fosforilado ĉe DRD2 (Fig. 4C).

Cdk5-mediaciita Fosforilado Malsupre reguligas la DRD2-cAMP-Signalan padon

Poste, ni esploris, ĉu la modifo de DRD2 de Cdk5 influas laŭflue signalojn. Ni kontrolis DRD2-mediaciitan inhibicion de forskolin-stimulita cAMP produktado de adenylyl-ciklaso en la ĉeloj esprimantaj DRD2-GFP kaj DRD2 S321A-GFP uzante cAMP-enzimajn imunanalizon. DRD2-esprimantaj ĉeloj montris malkreskajn nivelojn de cAMP responde al quinpirolo laŭ dozo-dependa maniero. Notinde, kun-esprimo de Cdk5 / p35 signife reduktis la maksimuman inhibicion de cAMP-formado (Fig. 4D, maldekstra panelo). Aliflanke, en la esprimantaj ĉeloj DRD2 S321A-GFP, la cAMP-formadoj efike malhelpis kiel respondo al traktado kun quinpirol, sendepende de la esprimo de Cdk5 / p35 (Fig. 4D, dekstra panelo). Ĉi tiuj rezultoj indikas, ke la mediado de Cdk5-fosforilado de DRD2 mildigas la inhibician agadon de DRD2 sur la laŭflankaj AMAM-signala vojo. Por plue konfirmi la fenomenojn en pli fiziologia signifo, ni uzis primarajn kulturajn neŭronojn el knokaŭtaj embrioj mankantaj en p35, esenca Cdk5-aktivigilo. Primaraj kulturitaj striataj neŭronoj estis traktitaj kun 1 µM-dopamino kaj analizitaj per cAMP-enzimakunimuno. Neŭronoj de p35-nodokontaj musoj montris reduktitajn cAMP-nivelojn kompare kun sovaĝaj neŭronoj kiam stimulitaj kun dopamino (Fig. 4E). Taken kune, ni finis ke Cdk5-mediaciita fosforilado de DRD2 rezultigas malkreskon en la inhibicia tono sur la cAMP-vojo praktikita de DRD2.

diskuto

Ni identigis DRD2 kiel nova substrato de Cdk5. La fosforilado ŝajnas malsupren reguligi la surfacan esprimon de DRD2 per influo de la sorto de DRD2 post receptora internigo tiel reduktante DRD2 G_i-kuŝo kaj laŭflua vojeto de cAMP. Ĉar la fosforila restaĵo S321 ekzistas ambaŭ en longaj kaj mallongaj izoformoj de DRD2, la mekanismo proponita en ĉi tiu studo povas esti ĝenerala reĝimo de regulado en signal-mediada DRD2..

DRD2 en mezvundaj neŭronoj ne nur estis konsiderata grava subtipo de ricevilo de dopamino sed ankaŭ estis rekonita pro ĝia susceptibilidad al ŝanĝoj en havebleco responde al mediaj stimuloj. Desensibilización induktita de agonista kaj resensibilización de DRD2 estis vaste studita [11], [24]. Aparte, kelkaj studoj montris, ke la efikoj de kronika psikosimulanto-ekspozicio, kiel kokaino kaj anfetamino, kiuj levas la eksterĉelan nivelon de dopamino en la stria sinapso, estas akompanitaj de dinamikaj ŝanĝoj de DRD2 postinaptike. [36]. Efektive, oni scias, ke kronaj konsumantoj de kokaino reduktis la nivelojn de DRD2 en la stria areo, kaj la disponeblo de DRD2 en la kerno accumbens (NAcc) montras negativan rilaton kun la kondutoj kaj plifortigo de drogoj en musoj. [37]-[39]. Ĉi tiuj rezultoj indikas, ke la funkcio de DRD2 estas tre sentema al adapta aŭ kompensiva regulado responde al diversaj stimuloj inkluzive de kronika drogo. Niaj rezultoj montras, ke la S321-restaĵo en la tria intracelula banto de DRD2 povas esti fosforilita de Cdk5, kio rezultigas malpliiĝon de inhibicia influo de DRD2 sur la cAMP-vojo. Ĉi tiu interago proponas novan reguligan mekanismon asociitan kun Cdk5 en dopaminokeptivaj neŭronoj, kiuj povus esti ligitaj al la dinamika naturo de DRD2-surfaca havebleco.

Oni notu, ke oni scias ke Cdk5 estas ŝlosila komponanto en mediacio de adaptaj ŝanĝoj de la neŭrona medio. Ekzemple, strukturaj kaj funkciaj alteriĝoj de dendritaj dornoj en la neŭronoj de la limcika cirkvito estas unu el la konsekvencoj de ripeta psikostimulanta ekspozicio. [40]. Ĉi tiuj ŝanĝoj estas akompanitaj de diversaj molekulaj ŝanĝoj inkluzive de la indukto de cAMP-responda elemento-liganta proteino (CREB) kaj ΔFosB, transkriptaj faktoroj kiuj elmontras daŭran reguladon responde al kronika kokaina administrado. [41], [42]. Gravas, Cdk5 estas celo de ΔFosB [19], kaj multaj kritikaj eroj implikitaj en dendrita spino dinamiko, kiel PSD-95, p21-aktivigita kinase (PAK), β-catenin, kaj spinofilino, estis raportitaj kiel Cdk5 substratoj [43]-[46]. Konsekvence, genetikaj aŭ farmaciaj manipuladoj de Cdk5-agado provokas ŝanĝojn de dendrita spino-morfologio kaj kondutaj respondoj al kokaino, implicante kritikajn rolojn por Cdk5 en la molekulaj kaj morfologiaj ŝanĝoj de mezolimbaj dopaminaj cirkvitoj. [47], [48]. Niaj rezultoj montras, ke DRD2 estas nova celo de Cdk5, provizas plian komprenon pri la adaptaj ŝanĝoj de la dopamina sistemo responde al kronikaj medikamentaj ekspozicioj pro la posta upFosB-mediado supren-reguligo de Cdk5 povas indukti tonikan pliiĝon en la fosforilado de DRD2. . Plie, DRD2 efektive influas multajn ĉelajn procezojn, inkluzive reguladon de cAMP kaj MAP-kinazaj vojoj kaj laŭflua transskriba okazaĵoj. [42], [49]. Tiel, la rezultoj en ĉi tiu studo eble ne nur prezentas rektan reguladon de DRD2 fare de Cdk5 sed ankaŭ provizas novan scion pri la adapta respondo de dopamina sistemo al kronika drogo.

Aŭtoro Kontribuoj

Koncipita kaj desegnita la eksperimentojn: JJ YUP DH SKP. Efektivigis la eksperimentojn: JJ YUP DKK YK. Analizis la datumojn: JJ YUP DKK SL YK SAL HL YSG DH SKP. Kontribuantaj reakciantoj / materialoj / analizo-iloj: YHS. Skribis la artikolon: JJ SKP.