DeltaFosB nerekte reguligas la aktivan aktivecon de Cck (2010)

Brain Res. 2010 Majo 6; 1329: 10-20.

Eldonita en linio 2010 March 11. doi: 10.1016 / j.brainres.2010.02.081

PMCID: PMC2876727

John F. Enwright, III,¹ Megan Wald,¹ Madison Paddock,¹ Elizabeth Hoffman,¹ Rachel Arey,² Scott Edwards,² Sade Spencer,² Eric J. Nestler,³ kaj Colleen A. McClung^{2, *}

Informo de aŭtoro ► Kopirajto kaj Permesila informo ►

La fina redaktita versio de la eldonisto de ĉi tiu artikolo haveblas ĉe Brain Res

Vidu aliajn artikolojn en PMC tio citas La artikolo eldonita.

abstrakta

Iuj de la gravaj ŝanĝoj biokemiaj, strukturaj kaj kondutoj induktitaj de kronika ekspozicio al drogoj de misuzo ŝajnas esti medikitaj de la tre stabila faktoro de transskribo ΔFosB. Antaŭa laboro montris, ke ΔFosB sobreexpremado en musoj por 2-semajnoj kondukas al pliigo en la esprimo de multaj genoj en striatumo, plej multaj el kiuj poste malpliiĝas laŭ sekvaj 8-semajnoj de ΔFosB-esprimo. Kurioze, granda nombro da ĉi tiuj genoj ankaŭ estis reguligitaj en musoj sobreexpremantaj la transskriban faktoron CREB. Neklare de ĉi tiu studo, tamen, ĉu baldaŭ ΔFosB reguligas ĉi tiujn genojn tra CREB. Ĉi tie ni trovas, ke 2-semajnoj de ΔFosB-sobreexpremo pliigas KREK-esprimon en striatumo, efiko kiu dispelas per 8-semajnoj. La frua indukto estas asociita kun pliigita KRE-ligilo al certaj celaj genro-iniciatintoj en ĉi tiu cerba regiono. Surprize, unu geno, kiu estis suspektata KREB-celo bazita sur antaŭaj raportoj, Cholecystokinin (Cck), ne estis kontrolita de CREB en striatum. Por plue enketi la reguligon de Cck sekvante ΔFosB-sobreexpremon, ni konfirmas ke mallongatempa ΔFosB-sobreexpremado pliigas ambaŭ Cck aktiveco de iniciatinto kaj genera esprimo. Ĝi ankaŭ pliigas ligantan aktivecon ĉe pozitiva KRE-binding ejo (KRE) en la Cck iniciatinto. Tamen, dum la CRE-ejo estas necesa por normala basala esprimo de Cck, ĝi ne estas postulita por ΔFosB-indukto de Cck. Kune kune, ĉi tiuj rezultoj sugestas, ke dum mallongatempa ΔFosB-indukto pliigas KREK-esprimon kaj aktivecon ĉe certaj genaj iniciatintoj, ĉi tiu ne estas la sola mekanismo per kiu genoj estas reguligitaj sub ĉi tiuj kondiĉoj.

Ŝlosilvortoj: kerno accumbens, transskribo, toksomanio

ENKONDUKO

Kronika ekspozicio al drogoj de misuzoj kaŭzas biokemiajn kaj strukturajn ŝanĝojn en pluraj cerbaj regionoj. Ĉi tiuj ŝanĝoj pensas impliki ŝanĝojn en genaj esprimaj profiloj en la mesolimbia sistemo. Ĉi tiu sistemo estas formita de neŭronoj dopaminérgicas kiu projektas de la zono tegmental ventral (VTA) en la midbrain al mezaj spinaj neŭronoj en la kerno accumbens (NAc) (ventral striatum) same kiel kelkaj aliaj cerbaj regionoj. Alteraciones en la agado de du transskribaj faktoroj, cAMP-responda elemento-liganta proteino (CREB) kaj ΔFosB (Fos familia familio proteino), estis proponitaj por mezuri multajn el la biokemiaj, strukturaj kaj kondutaj ŝanĝoj viditaj per kronika ekspozicio al drogoj de misuzo ( reviziita de Nestler, 2005).

KREB estas plene esprimita transskriba faktoro, kiu estas membro de la familio CREB / ATF. Kredaj homodimiloj ligas al variaĵoj de CRE-sekvenco (konsento: TGACGTCA) trovita en la iniciatintoj de multaj genoj. Fosforilacio de KREO (ĉefe en serine 133, kvankam aliaj retejoj estis identigitaj) povas esti stimulita per pluraj signaloj de akvofaloj, inkluzive tiujn tiujn malsupren de la riceviloj de dopamina (Cole et al., 1995). Sur fosforilacio ĉe la serina 133, CREB rekrutas la protektantan protekton KREB-ligantan protekton (CBP) aŭ rilatajn proteinojn kaŭzante pliigitan genan esprimon (reviziita de Johannessen et al., 2004). Kronika ekspozicio al opiaj aŭ psikostimulantaj drogoj de misuzo induktas transajn kreskojn en KREK-agado en la kerno accumbens (Barrot et al., 2002; Shaw-Lutchman et al., 2002, 2003), adapto pensis malpliigi la rekompencajn proprietojn de ĉi tiuj drogoj kaj kontribui al la negativa emocia stato de drogokaptado (Nestler, 2005).

LOnger-daŭraj adaptoj al drogoj de misuzo estas pensitaj esti interrompitaj parte de ΔFosB, tre stabila spliva varianto de FosB (Nestler et al., 1999; McClung et al., 2004; Nestler, 2008). La membroj de la familio Fos malpliigas kun membroj de la familio Jun por formi kompleksan protektanton 1 (AP-1) de protektilo activador. La kompleksaj transskriboj AP-1 ligas al variadoj de la elemento de respondo AP-1 (konsento: TGACTCA) por reguligi transskribon (reviziita de Chinenov kaj Kerppola, 2001). Dum akra ekspozicio al drogoj de misuzoj kondukas al la mallonga daŭra indukto (hrs) de Fos-familianoj (same kiel pliigita KREK-agado), ripetita droga ekspozicio kondukas al la amasigo de la tre stabila ΔFosB (Hope et al., 1994; Perrotti et al., 2008), kies esprimo persistas dum semajnoj.

Bi-transgénikaj musoj induceble sobreexpremantaj ĉu ΔFosB aŭ CREB en la plenkreska striatumo montras multajn el la biokemiaj kaj kondutaj fenotipoj viditaj en bestoj elmontritaj ree al psikostimulantoj aŭ aliaj drogoj de misuzo. ALa nalizo de genaj esprimoj ŝanĝas en ĉi tiuj transgenaj bestoj identigis multajn genojn reguligitaj per mallongatempa (2-semajnoj) sobreexpremado de ΔFosB, ŝanĝoj asociitaj kun kuncomitanta malpliigo en drogpunado. La ŝanĝoj en gen-esprimo kaj kondutra respondo kun mallongatempa ΔFosB estis rimarkinde similaj al tiuj, kiuj estas viditaj en bestoj sobreexpremantaj KRE por 2 aŭ 8-semajnoj (McClung kaj Nestler, 2003). En strikta kontrasto, longtempa sobreexpremado (8-semajnoj) de ΔFosB malpliigis esprimon de multaj el ĉi tiuj samaj genoj kaj kondukis al pliigo en drogpunprezento (Kelz et al., 1999; McClung kaj Nestler, 2003).

Unu geno identigita en ĉi tiuj studoj estas Cholecystokinin (Cck), neuropeptido produktita en pluraj cerbaj regionoj, inkluzive de la striatumo (Hokfelt et al., 1980). CCK povas moduli dopaminergian transdono (Vaccarino, 1992), estas implikita en drogpremado kaj plifortigo (Josselyn et al., 1996; Josselyn et al., 1997; Hamilton, et al., 2000; Beinfeld et al., 2002; Rotzinger et al., 2002), kaj estas induktita en la striatumo per kronika kokaino (Ding kaj Mocchetti, 1992). Aldone la Cck iniciatinto montriĝis respondema al ambaŭ KREK kaj AP-1-kompleksaj (Haun kaj Dixon, 1990; Deavall, et al., 2000; Hansen, 2001). Pro tio ke multaj el la genoj (inkluzive Cck) kiu montris pliigitan esprimon sekvantan ambaŭ KREB kaj mallongatempa ΔFosB-esprimo estis konataj aŭ suspektataj KREB-celo-genoj (McClung kaj Nestler, 2003), ni volis determini ĉu mallongatempa ΔFosB-esprimo kondukas al regulado de ĉi tiuj genoj (kun fokuso sur Cck) per la reguligo de CREB aŭ tra pli kompleksaj mekanismoj de genregregado.

REZULTO

ΔFosB sobreexpremado transire kreskas nivelojn de CREB

Ni uzis Western blotting por esplori ĉu ΔFosB-sobreexpremado pliigas KREB-proteinajn nivelojn en la strio de musoj. Por ĉi tiu studo, ni uzis bi-transgénajn musojn (linio 11A) kiuj portas ambaŭ NSE-tTA-transgene kaj TetOp-ΔFosB-transgene. En foresto de doksikiklino, ĉi tiuj musoj montras fortikan kreskon en ΔFosB-esprimo en la dinorfinaj pozitivaj neŭronoj en striatumo (Kelz et al., 1999). Ĉi tiu metodo de sobreexpresanta ΔFosB estis vaste dokumentita kaj permesas region-specifan sobreexpremon, kiu paralelas la ΔFosB-indukon viditan en bestoj elmontritaj al kronika kokaino (Hope et al., 1994; Kelz et al., 1999). Ni trovis, ke en musoj 11A sobreexpremas ΔFosB, la protektaj niveloj de KRE estis signife reguligitaj post 2-semajnoj de esprimo kaj ĉi tiuj niveloj revenis al baza linio post 8-semajnoj de esprimo (Figuro 1A, n = 8). Por determini ĉu la ŝanĝoj en niveloj de CREB kun mallongperspektiva ΔFosB-troesprimo povus reproduktiĝi en alia sistemo, ni dumtempe troesprimis ΔFosB en ĉeloj PC12 kaj trovis, ke niveloj de CREB signife pliiĝis (p <0.05) kompare kun kontroloj (Figuro 1B, n = 4). Ĉi tiuj rezultoj pruvas, ke baldaŭ ΔFosB-esprimo pliigas klerajn proteinojn.

Kreskaj niveloj pliigas kun ΔFosB sobreexpremado. Okcidenta blota analizo de lizatoj de (A) muso striata el 11A-musoj el dox por 2 aŭ 8-semajnoj aŭ (B) La ĉeloj PC12 sobreexpremas ΔFosB. Datumoj en A estas montritaj kiel procentoŝanĝo en ekstere de dox komparita ...

Ambaŭ ΔFosB kaj CREB ligas al iniciatintoj de specifaj celaj genoj en la striatumo sekvanta mallongatempa ΔFosB sobreexpremado

Ni uzis ekzamenojn de striatalaj ŝtofoj de ChIP (kromromina imunoprecipitado) por determini ĉu ΔFosB aŭ CREB-ligilo okazis ĉe certaj cel-genaj iniciatintoj kaj se ĉi tiu ligado pliiĝis post mallongatempa ΔFosB sobreexpremado. Ni analizis ligadon ĉe la BDNF kaj Cck iniciatintoj, ĉar ambaŭ genoj estas tre reguligitaj post mallongatempa ΔFosB-sobreekspremado, KREK sobreekspremado aŭ kronika kokain-traktado (McClung kaj Nestler, 2003). Ni ankaŭ analizis ligadon ĉe la CDK5 iniciatinto, ĉar ĝi estas konata rekta celo de ΔFosB (Chen et al., 2000; Bibb et al., 2001; Kumar et al., 2005). Finfine ni mezuris ligon ĉe la prodinorfo iniciatinto, ĉar antaŭaj studoj trovis, ke ĝi povas esti ligita per ambaŭ ΔFosB kaj CREB sub malsamaj kondiĉoj (Andersson et al., 2001; Zachariou et al., 2006).

La analizo de la PIB estis realigita en striata de musoj 11A sobreexpremante ΔFosB por 2 semajnoj uzante antikorpoj kiuj rekonas CREB aŭ ΔFosB. Sub normalaj kondiĉoj, ni trovis ke ΔFosB ligas al la CDK5 kaj prodinorfo iniciatintoj, dum ne ekzistas detektebla ligo ĉe la BDNF or Cck iniciatintoj (tablo 1). Krome, ΔFosB sobreexpremado pliigis la ligadon de ΔFosB ĉe la CDK5 iniciatinto, sed ne ĉe la prodinorfo iniciatinto. Ni poste mezuris KREB-ligon ĉe ĉi tiuj iniciatintoj kaj trovis, ke CREB ligas al la CDK5, BDNF kaj prodinorfo iniciatintoj, sed ne al la Cck iniciatinto, en normala strio, kaj ke ΔFosB-sobreekspremado por 2-semajnoj pliigas KREK-ligon ĉe la BDNF kaj prodinorfo iniciatintoj, sed ne la CDK5 iniciatinto. Kune kune, ĉi tiuj rezultoj montras, ke ΔFosB kaj CREB ambaŭ povas ligi al certaj genaj iniciatintoj kiel ekzemple prodinorfo kaj CDK5, tamen, KREK-ligado estas specifa al aliaj iniciatintoj kiel ekzemple BDNF. Krome, ΔFosB sobreexpremado kondukas al pliigoj en ΔFosB-ligo ĉe certaj iniciatintoj, kiel oni atendus, sed ankaŭ al CREB-ligo al specifaj iniciatintoj, konforme kun la ΔFosB-mediated CREB-indukto observata ĉe ĉi tiu tempo.

Ligo de putaj regulaj proteinoj al diversaj iniciatintoj en musoj sobreexpremantaj ΔFosB dum du semajnoj.

Antaŭa laboro montris, ke ŝanĝoj en gen-esprimo induktita de longtempa ΔFosB-sobreexpremado estas asociitaj kun modifoj de cromatina, en aparta, acetilado de histone H3, ĉe specifaj genaj iniciatintoj (Kumar et al., 2005). Por determini, ĉu tio povus konsideri ŝanĝojn en geno-esprimo en sifreekspremado de ΔFosB, ni mezuras ligon de akonelata histone H3 (histona modifo asociita kun transskriba aktiva kromatino) aŭ metilada histone H3 (Lys9, histona modifo asociita kun transskriba senaga kromatino). Ni trovis, ke sobreexpremado de ΔFosB por 2-semajnoj rezultigis neniajn ŝanĝojn en ligado de acetila H3 ĉe iu ajn el la genaj iniciatintoj studitaj (tablo 1). Ni trovis signan malpliigon en la ligo de metilada histone H3 ĉe la prodinorfo iniciatinto, sed ne ligita al la Cck iniciatinto kaj neniu ŝanĝo en ligado ĉe la CDK5 kaj BDNF iniciatintoj, sugestante ke ĉi tio ne estas ĝenerala mekanismo per kiu ΔFosB, baldaŭ, reguligas genan esprimon. Ni estis surprizitaj kaj interesataj pri la fakto, ke ni ne trovis diferencojn en niaj projektoj de ĈIU, kiuj povus konsideri la pliigon Cck mRNA-esprimo en la musoj 11A sekvantaj 2-semajnojn de ΔFosB-esprimo kaj decidis plu esplori ĉi tiun mekanismon.

Mallongatempa $FosB pliigas Cck esprimo en multnombraj sistemoj

Microarray-karakterizado de bi-transgénaj 11A-musoj sobreexpremantaj ΔFosB en la striatumo trovis, ke Cck esprimaj niveloj pliigas sekvajn 2-semajnojn de sobreexpremado kaj poste laŭgrade malpliiĝas kun pli longaj periodoj de ΔFosB-esprimo (Figuro 2A, n = 3). Ni validigis ĉi tiun efikon por Cck Uzanta veran tempon PCR sur aparta grupo de bestoj ĉe 2 kaj 8 semajnoj kaj trovitaj rezultoj ĉe la du tempoj punktoj similas al la analizo de microarray (datumoj ne montritaj).

Mallongatempa sobreexpremado de ΔFosB pliigas Cck geno-esprimo. (A) Cck mRNA-esprimo en striatum sekvanta ΔFosB-sobreexpremon en 11A musoj por 1, 2, 4 aŭ 8 semajnoj. Analizo de Microarray estis farita sur striataj specimenoj kaj Cck niveloj ...

Plue esplori la kapablon de ΔFosB reguligi Cck esprimo, ni uzis PC12 ĉelojn transire transfektitaj per a Cck-luciferasa raportisto-plasmido kaj ĉu ΔFosB-esprimplamaĵo aŭ egala kvanto de pCDNA. Ambaŭ (n = 5-9) kaj tri (n = 11-13) tagoj de ΔFosB-sobreexpremado rezultigis signifan pliigon en Cck-luciferasa esprimo. Aldone, tri tagoj de ΔFosB-sobreexpremado rezultigis signife pli Cck-luciferasa indukto kompare al du tagoj de sobreexpremado (Figuro 2B). La sobreezpremado de ΔFosB ne induktis esprimon de senprofitema luciferasa konstruo (datumoj ne montritaj). Sub kuracaj kondiĉoj estis redukto Cck-luciferasa agado ŝajnigu. Ĉi tiuj rezultoj montras, ke mallongatempa ΔFosB-esprimo pliigas aktivecon de la Cck iniciatinto, kaj lasas sen respondi la mekanismon per kiu longtempa ΔFosB sobreexpremaspremas Cck esprimo.

ΔFosB-sobreexpremado pliigas ligilon ĉe pozitiva KRE-liganta ejo en la Cck iniciatinto

Niaj analizoj trovis tion Cck esprimo pliiĝas post mallonga limigo ΔFosB-esprimo, tamen, niaj agordoj de ĈAPO trovis, ke nek CREB nek ΔFosB ligas al la Cck iniciatinto. Determini ĉu estas iuj ŝanĝoj en protekta ligo ĉe la Cck iniciatinto sekvanta ΔFosB sobreexpremon, ni uzis elektroforikan moveblecon-movadon (EMSA) kun sondado enhavanta la pozitivan ĉeestantan TTT-prezenton ene de la Cck iniciatinto. Uzante nukleajn ekstraktojn de striata de 11A musoj sobreexpremantaj ΔFosB por 2 semajnoj, ni trovis pliigon en ligado al la pozitiva CRE-ejo en la Cck iniciatinto (Figuro 3 A, C, n = 4). Kurioze, 11A musoj sobreexpremas ΔFosB por 8 semajnoj, kiuj montras malpliigon en Cck esprimo, ankaŭ montris pliigitan ligon ĉe ĉi tiu retejo (Figuro 3B, C, n = 4). Kiel komparo, ni ekzamenis kunligon al konsento, retejo en musoj, sobreexpremante ΔFosB por 2-semajnoj kaj trovis fortikan KRU-ligilon en striataj ekstraktoj, sed ne pliigo en ligado sekvanta ΔFosB-indukon (Figuro 3F, n = 4). Tiel, malgraŭ ΔFosB-induktita pliigo de totala KRE-niveloj viditaj en ĉi tiu tempo punkto, ĉi tiuj rezultoj estas konforme al niaj sistemoj de kontrolo de KIP, kiuj trovas, ke pliigita KRE-ligado ĉe iniciatintoj sekvantaj ΔFosB-sobreexpremado estas specifa al nur certaj genoj kaj ne estas tutmonda fenomeno . Determini ĉu CREB estas ligita al la Cck iniciatinto en nia EMSA-analitiko, ni realigis supershift-atestojn kun krea specifa antikorpo. En konsento kun niaj ekzamenoj de ĈIU, ni ne trovis ajnan ligon de CREB al Cck sondado enhavanta la pozitivan TTT-ejon en EMSA-atestoj, dum CREB signife ligis kaj supershift konsenton CRE-ejo (Figuro 3D, Kaj, n = 4). La ADN-liganta aktiveco ĉe la Cck iniciatinto ankaŭ ne estis tuŝita de antikorpo al ΔFosB (datumoj ne montritaj), sub kondiĉoj montritaj en pluraj antaŭaj studoj por bloki ΔFosB-ligilon al bona fide AP-1-ejoj (Hope et al., 1994a, 1994b; Chen et al., 1995, Hiroi et al., 1998). Ni ankaŭ plenumis ĉinajn ekzamenojn pri striata de 11A-bestoj sekvantaj 8-semajnojn de ΔFosB-esprimo kaj ankoraŭ ne trovas ligon de CREB aŭ ΔFosB ĉe la Cck iniciatinto (datumoj ne montritaj). Tiel, ΔFosB-esprimo kondukas al pliigo de protekta ligo ĉe la Cck iniciatinto post 2 kaj 8 semajnoj de esprimo; tamen, la identeco de ĉi tiuj faktoroj restas nekonata.

Proteino ligo ĉe la Cck iniciatinto. (A, B) Elektroforika movebleco ŝanĝu provo uzante la Cck KRE-ejo kiel striatal histo de bestoj sobreexpremantaj ΔFosB por 2-semajnoj (A) aŭ 8-semajnoj (B). En (A), konkurenco kun troa senlaborebla konkuranto ...

La pozitiva TTT-ejo en la Cck iniciatinto ne respondecas pri pliigita aktivulo

Pro tio, ke ni trovis pliigon en protektaj ligiloj uzante fragmenton de la Cck iniciatinto, kiu enhavas la pozitivan TTT-ejon de CRE, sekvante ΔFosB-sobreekspremadon, ni volis determini ĉu ĉi tiu retejo estas necesa por pliigi Cck esprimo sekvanta ΔFosB sobreexpremon. Por provi ĉi tiun eblon, ni transfectis PC12-ĉelojn per a Cck-luciferasa plásmido enhavanta ĝian nerompitan TTT-kredon aŭ unu enhavantan mutacion en la retejo, kiu malhelpi ajnan interagon kun CREB. Kurioze, la mutacio de la TTT-simila retejo malpliiĝis laŭbaze Cck aktiveco de iniciatinto de 32% (Figuro 4A, n = 9), sed ne influis la Cck indukto de iniciatinto per ΔFosB-troesprimo (Figuro 4B, n = 11-13). Ĉi tio sugestas ke, kvankam la Cck iniciatinto postulas nerompitan TTT-similan kredon por plena baza aktiveco, la pliigita aktiva aktivulo induktita de ΔFosB-sobreexpremado ne postulas la sekvencon de CRE.

la Cck-kiel CRE-ejo ne estas necesa por Cck indukto de ΔFosB. (A) Cck-luciferasa aktiveco estis mezurita 2-tagojn post transfekcio kun ĉu normala Cck-luciferazo aŭ unu en kiu la CRE-simila retejo estis mutaciita. * p <0.05 (B) Cck-luciferasa ...

cfos ligas al la Cck iniciatinto

Antaŭaj studoj trovis tion cfos mRNA pliigas kun mallonga limtempo ΔFosB-esprimo, tamen, post daŭrigita ΔFosB-esprimo, la kapablo de kokaina traktado por indukti cFos en striatumo estas reduktita (McClung kaj Nestler, 2003; Renthal et al., 2008). Sekve, eble eblas, ke cFos kontribuas al la pliigo Cck esprimo sekvanta mallongatempa ΔFosB-esprimo. Ni plenumis FIP-atestojn kun antikorpo specifa por cfos kaj mezuritaj cfos-ligiloj ĉe la Cck iniciatinto kun kaj sen baldaŭ ΔFosB-esprimo. Dum ni trovis, ke cfos ligas al la Cck iniciatinto, ĉi tiu ligo ne signife pliigis sekvan ΔFosB sobreexpreson (figuro 5, n = 5). Ĉi tio sugestas, ke cfos ligas la Cck iniciatinto, ĝi povas kontribui al la ĝenerala reguligo Cck esprimo, sed verŝajne ne implikas la reguligon de la Cck iniciatinto de ΔFosB.

cfos ligas al la Cck iniciatinto. Chromatin-immunoprecipitado-ekzamenoj estis faritaj per specifa antikorpo por cFos uzante striatan histo de ΔFosB sobreexpremanta musojn aŭ sur dox, aŭ post 2-semajnoj de dox-forigo. Reala tempo PCR-analizo estis ...

DISCUSO

Ĉi tiu studo konfirmas kaj ekspansiiĝas sur antaŭaj trovoj montrante, ke ΔFosB reguligas genan esprimon en la striatumo kaj ni trovas, ke ĝi tiel faras per multaj mekanismoj post mallonga esprimo. Ni montras, ke post 2 semajnoj de sobreexpremado, ΔFosB ligas rekte al la iniciatintoj en certaj genoj kaŭzantaj ŝanĝojn en esprimo (te CDK5). Krome, ĝi pliigas la protektajn nivelojn de CREB, efikon observitan en kleraj ĉeloj tiel kiel en striatumo, kaŭzante kreskantan KRU-ligon ĉe aliaj genaj iniciatintoj (te dinorfino kaj BDNF). En antaŭa studo, ni trovis, ke baldaŭ sobreexpremado de ΔFosB en striatumo kondukas al multaj el la samaj gen-esprimaj ŝanĝoj, kiuj troviĝas kiam CREB estas sobreexpremata, kaj kondukas al similaj kondutoj en kondukoj de preferoj de kokaino (McClung kaj Nestler, 2003). Tiel, la ĉeestanta trovo, ke ΔFosB kondukas al indukto de CREB, same kiel ligo de CREB al certaj genaj iniciatintoj, helpas klarigi kial tiom da el la genaj esprimaj ŝanĝoj estis dividitaj de ĉi tiuj du transskribaj faktoroj.

La indukto de KREO per ΔFosB estas interesa, ĉar ĝi montris, ke drogoj de misuzo induktu ŝanĝojn en serineaj niveloj de KREO 133-fosforilataj (Mattson et al., 2005) kaj pliigi CRE-amasigitan transskribon (Barrot et al., 2002; Shaw-Lutchman et al., 2002, 2003), sen ŝanĝi ĝeneralajn nivelojn de CREB. Eblas, ke ŝanĝoj en KREKaj niveloj povus esti transitaj, kaj, sekve, facile maltrafitaj en aliaj studoj. En niaj manoj, ni vidis kokainon-induktitajn kreskojn en CREB-mRNA en apartaj eksperimentoj, tamen, ĉi tiu efiko estas tre varia (observo ne eldonita). Pro tio ke ambaŭ ĉeloj transgénicas 11A kaj la ĉeloj PC-12 montras la indukon de KREB post la sobreexpremo de ΔFosB, ĉi tio sugestas, ke CREB efektive induktas ΔFosB (aŭ celon de ΔFosB), provizante ankoraŭ alian mekanismon por klarigi ŝanĝojn en geno inducitaj de drogoj esprimo.

Surprize, ni trovis, ke nek CREB nek ΔFosB ligas al la Cck eĉ iniciatinto Cck esprimo estas klare reguligita post mallongatempa ΔFosB-esprimo. Cck estas abunda neuropeptido esprimita en la VTA kaj NAc (Hokfelt et al., 1980) kaj verŝajne partoprenas pri kondutaj respondoj al drogoj de misuzo (Josselyn et al., 1996; Josselyn et al., 1997; Hamilton, et al., 2000; Beinfeld et al., 2002; Rotzinger et al., 2002). En ĉelaj kulturaj ekzamenoj, la Cck iniciatinto estis vaste karakterizita kaj montrita esti respondema al CREB kaj AP-1-membroj de la familio (reviziita de Hansen, 2001). Haun kaj Dixon (1990) montris, ke AP-1-kompleksoj povas ligi al la Cck CRE-simila loko en vitro, kaj ĝi poste montris, uzante ĉeloj neuroblastoma SK-N-MC, ke la mutacio de la TTT-simila retejo reduktis respondon al sobreexpremita cFos / cJun (Rourke et al., 1999). Efektive ni ankaŭ trovos pliigitaj Cck aktiveco de iniciatinto (figuro 2) kaj ligi ĉe aŭ ĉirkaŭ la CRE-simila elemento (figuro 3) sur sobreexpremado de ΔFosB, alia AP-1-membro-familio, sed ni trovas neniun rektan ligon de ΔFosB al la Cck iniciatinto en vivo or en vitro, eĉ sur ĝia sobreexpremado.

Multobla laboro pruvis rolon por KREK en la reguligo de Cck aktiveco de iniciatinto. La Cck CRE-simila loko konserviĝas trans vertebruloj (Hansen, 2001) kaj, en iuj ĉelaj kleraj ekzamenoj, ambaŭ KREK kaj AP-1-kompleksaj ligo al ĉi tiu retejo kaj estas necesaj por Cck aktiveco de iniciatinto (Haun kaj Dixon, 1990; Deavall, et al., 2000; Hansen, 2001). Aldone, pluraj konataj aktivuloj de Cck esprimo (inkluzive de bFGF, PACAP, peptonoj kaj senpolarigo) estis agnoskitaj tra CREB (Hansen, et al., 1999; Deavall, et al, 2000; Bernard, et al., 2001; Gevrey, et al., 2002; Hansen, et al., 2004). Nia Cck-luciferasa raportisto geno-datumoj subtenas esencan rolon por la CRE-simila loko en reguligo de Cck aktiva iniciatinto, pro tio ke la mutacio de ĉi tiu retejo reduktas basal Cck aktiveco de iniciatinto kaj Cck-luciferasa esprimo induktita de VP16-CREB, konstitute aktiva formo de CREB, perdiĝas kiam ĉi tiu retejo estas mutata (ne eldonita). Tiel, ni estis surprizitaj trovi, ke CREB ne ŝajnas ligi al la Cck iniciatinto en striatalaj ekstraktoj aŭ ĉe baseline aŭ al mallongatempa ΔFosB-sobreexpremado kiam kreskaj niveloj kreskas. Ĉi tio argumentas, ke niveloj de KREO en si mem ne estas la sola faktoro en determini la kvanton de ligado ĉe ĉi tiu retejo, kaj ĉi tio estas subtenata de la laboro de aliaj (Cha-Molstad, et al., 2004). Pro tio ke la iniciatintoj de aliaj, antaŭe identigis CREB-celajn genojn, kiel ekzemple BDNF kaj prodinorfo, ligis CREB, ni estas certaj pri nia trovo, ke CREB ne estas ligita al la Cck iniciatinto en striataj nukleaj ekstraktoj. Krome, la indukto de Cck-luciferasa agado de ΔFosB ne dependas de la nerompita Krea-ejo, sugestante ke ΔFosB ne reguligas Cck esprimo reguligante la rektan ligon de CREB al la Cck iniciatinto.

Nia nekapablo por detekti CREB interaganta kun la Cck iniciatinto estas subtenata Renthal et al. (2009), kiu uzis sistemon de blato-blato por rigardi tutmondajn ŝanĝojn en fosforita KREO (pCREB) kaj ΔFosB-ligado en striatumo post kronika kokain-ekspozicio. En ĉi tiuj eksperimentoj, DNA-proteinoj-kompleksoj estis senunkaptitaj kun ΔFosB aŭ pCREB-antikorpoj kaj la precipitata ADN, post etikedo, estis hibrigita al iniciatinto-microarray. Dum multaj antaŭe karakterizitaj CREB-celaj genoj estis identigitaj kun ĉi tiu aliro (ekz. BDNF, prodynorfino), Cck ne estis identigita. Krome, ĝi pruvis, ke la ligado de CRE al konsento CRE-ejo varias multe inter kleraj ĉeloj (Cha-Molstad, et al., 2004). Ĉiuj antaŭaj studoj, kiuj trovis KREB-interagojn kun la Cck iniciatinto estis efektivigita en ĉelo-kulturo (ne cerbo, de kiu derivas niaj EMSA kaj ChIP-specimenoj) kaj uzis gel-ŝanĝajn ekzamenojn por enketi protein-DNA-interagojn. Dum EMSA povas taksi la potencialon de faktoro por ligi sin al sekvenco de ADN, la ekzamenoj de la sistemo de kontrolo de ekrano provizas romanon rigardi ĉi tiujn interagojn en vivo. Krome, multe da la datumoj pruvas aŭ indukadon de Cck aktivisto aŭ KREB-ligo al la Cck iniciatinto estis akirita de ĉeloj, kiuj estis stimulitaj de faktoroj kiel peptonoj (Bernard et al., 2001), senpolarigo (Hansen, et al., 2004), aŭ diverso de aktivigiloj de intracelular signaling-akvofaloj inkluzive de CAMP kaj ERK (Hansen et al., 1999). En niaj eksperimentoj, la sola "stimulo" uzata estis la sobreexpremado de ΔFosB, kio sufiĉas por indukti Cck esprimo. Kune kune, ĉi tio sugestas, ke la kapablo de CREB ligi al (kaj eble reguligi) la Cck iniciatinto tre dependas de la ĉelo kaj aktivigo de apartaj signaloj. Aldone, la Cck Kreza elemento de iniciatinto (almenaŭ en ĉeloj PC12 ne helpitaj kaj en striato de la muso) ne estas rekta celo de KREB aŭ ΔFosB. Kurioze, la reguligo de FosB esprimo de CREB estas ankaŭ specifa al ĉelo kaj la tipo de stimulo. Studo de Andersson et al. trovis ke injekto de CREB kontraŭzensaj oligonucleotidoj en muso striato parte malhelpis la indukadon de FosB sekvanta administra kokaino (Andersson et al., 2001). Tamen, ili ankaŭ trovis, ke la kapablo de L-Dopa indukti FosB esprimo en 6-OHDA-lesioned striatum ne estis influita de la ĉeesto de CREB kontraŭzensaj oligonucleotidoj.

Ĉar CREB kaj ΔFosB ŝajnas nerekte reguligi la Cck iniciatinto kaj ŝanĝoj en cromatina strukturo estis dokumentitaj en respondo al diversaj stimuloj kiuj induktas ΔFosB (Tsankova et al., 2004; Kumar et al., 2005; Renthal et al., 2008), ni rezonis, ke ΔFosB eble nerekte moduli aktivan aktivon ŝanĝante la strukturon de kromatina. Tamen, en musoj sobreexpremantaj ΔFosB por 2 semajnoj, ne estis ŝanĝo en histone H3-acetilacio ĉe la Cck iniciatinto (tablo 1). Ĉi tio estas subtenata de la datumoj de ChIP-blato Renthal et al. (2009), kiu raportis nenian ŝanĝon en acetila H3-ligado ĉe la Cck iniciatinto en musoj elmontritaj al kronika kokaino. Ekde la Cck iniciatinto estas aktiva en la strio, ne atendis aŭ observis neniun subpreman metila histon H3-ligilon. Kurioze, ni ankaŭ ne vidis ŝanĝon pro ΔFosB sobreexpremado en acetila H3-ligado ĉe la BDNF iniciatinto (kiu faris spektaklon pliigis CREB-ligilon) aŭ ĉe la CDK5 kaj prodinorfo iniciatintoj (kiuj montris pliigita ΔFosB-ligilon). Pro tio ke ekzistas multe da histoneaj modifoj asociitaj al ŝanĝoj en aktivado (reklamita de Rando kaj Chang, 2009), verŝajne aliaj kromaj modifoj, kiuj asocias kun indukado de ĉi tiuj genoj. Ajna modifo de cromatina, kvankam ofte progresema de la nivelo de aktivulo, eble ne ŝanĝiĝas dum la aktivigo de aparta geno. En estonta laboro, estus interese rigardi aliajn eblajn ŝanĝojn en cromatina strukturo ĉirkaŭ la Cck iniciatinto sekvanta ΔFosB sobreexpremon. Interesa, kronika kokaino (verŝajne tra ΔFosB-indukto) montris indukti esprimon de sirtuin 1 kaj 2, klaso III-histone-diakalklasoj, kiuj ŝajnas ŝanĝi al neŭtrala fiziologio, ERK-signalo kaj kondukaj respondoj al kokaino (Renthal et al., 2009). Indukto de histone-diakselaso havus la kapablon samtempe reguligi la esprimon de granda nombro da genoj tra tutmondaj ŝanĝoj en kromatina strukturo.

Unu ebla kandidato implikita Cck Reguligo sekvanta ΔFosB-sobreexpremado estis la AP-1-membro-familio cFos. Esprimo de cFos estas reguligita de CREB (Sheng et al., 1990; Impey et al., 2004), kaj cSa sobreexpremado (konordanta kun sobreexpremado de ĝia deviga kompaniano cJun) pliigas Cck aktiveco de iniciatinto (Rourke et al., 1999). Sekve, pliigitaj KRE-niveloj pro mallongatempa ΔFosB-sobreekspremado povus pliigi cFos-nivelojn kaj rezultigas pliigitan ligon al la Cck CRE-simila loko. cfos mRNA estas induktita en musoj post du semajnoj de ΔFosB sobreexpremado (McClung kaj Nestler, 2003) kaj malpliiĝis en musoj elmontritaj al kronika kokaino aŭ longtempa ΔFosB sobreexpremado (Renthal et al., 2008). Jen ni trovas, ke cfos ligas rekte al la Cck iniciatinto en striatala histo, tamen, ΔFosB sobreexpremado ne signife pliigas ligilon. Ĉi tio sugestas, ke dum cfos povus esti implikitaj reguligi Cck esprimo ĝenerale, ŝanĝo en ligado de cFos sole ne estas probable la mekanismo per kiu ΔFosB reguligas Cck esprimo. Eblas, tamen, ke ΔFosB povas indukti aŭ post-tradukajn ŝanĝojn en cFos (ekz. Ŝanĝita fosforilado) aŭ indukti la esprimon de liganta kunulo (kiel ekzemple cJun) aŭ kun-aktiviga proteino. Tamen, pro la nerompita TTT-ejo (kiu antaŭe estis montrita kiel liganta ejo por AP-1-kompleksoj, vidu Haun kaj Dixon, 1990) ne estas postulita por pliigita Cck aktiva iniciatinto vidita per ΔFosB-sobreexpremado (kiel taksita en niaj raportaj genaj eksperimentoj), ĝi signifas, ke aliaj trans-agantaj faktoroj ankaŭ reguligas ΔFosB.

la Cck Promesila fragmento uzita en niaj luciferasa raportisto genaj eksperimentoj enhavas konservitan Sp1-ligilon kaj E-skatolon (reviziita de Hansen, 2002). En aparta, E-boxaj sekvencoj montris ligi multajn transskribajn faktorojn (reviziitaj de Forrest kaj McNamara, 2004). Uzante PC12-ĉelojn, ni vidis, ke la mutacio de la E-skatolo malpliiĝas Cck aktivulo, sed ne ŝanĝas la respondon de la iniciatinto al ΔFosB (datumoj ne montritaj). Kurioze, a Cck-luciferasa raportisto enhavanta mutaciojn en ambaŭ la TTT-ejo kaj E-skatolo havas neniujn detektindajn bazajn aktivecojn kaj ne respondas al ΔFosB-sobreexpremado (nepolita observo). Alia ebla interulo de ΔFosB-ago sur la Cck iniciatinto estas ATF, iuj formoj de kiuj estas konataj esti induktitaj per striatumo per kronika psikostimulanta ekspozicio (Green et al., 2008). Tamen, ni trovis neniun indikon por ΔFosB-indukado de ĉi tiuj ATF (datumoj ne montritaj), kaj ATFs ne atendus ligi al la mutata CRE-simila loko sur la Cck iniciatinto.

Unu rimarkindaĵo de ĉi tiu studo estas, ke ni uzas sistemon bi-transgénico sobreexpresi ΔFosB kaj do oni devas esti konservativa en desegnado paralelaj inter ĉi tiu paradigma kaj administrado de kronika kokaino. Tamen, la transgenaj musoj 11A donas la solan ŝancon rigardi la specifajn efikojn de ΔFosB en la striatumo, pro tio ke sobreexpremado estas limigita al ĉi tiu cerba regiono (Chen et al., 1998), dum administrado de kokaino ŝanĝas en ampleksa vario de aliaj cerbaj regionoj, kiuj eble nerekte efikas la strionon. Plie, pluraj studoj dokumentis similajn kondutojn kaj molekulajn fenotipojn en la musoj 11A kompare al ne transgénikaj bestoj traktataj per kronika kokaino (Kelz et al., 1999; McClung kaj Nestler, 2003; Renthal et al., 2009). Aldone, Bibb et al. (2001) raportis similajn nivelojn de striatuloj Cdk5 mRNA kaj protekta indukto en ĉi tiu sama 11A-streĉiĝo kiam oni komparas al kokain-traktataj, ne-transgénaj littermatoj, same kiel similaj ŝanĝoj en la CDK5-celoj, p35 kaj DARPP-32.

En konkludo, ni trovas, ke mallonga-tempo ΔFosB-esprimo kondukas al la indukado de genoj en la striatumo per multaj mekanismoj. Ĉi tiuj inkluzivas rektajn iniciatintojn, indukadon de CREB-proteino kaj aktiveco, kromromina modifo, krom al vojoj ankoraŭ por esti determinitaj.

PROPERIĜOJ EXPERIMENTAL

bestoj

Malnovaj transgenaj 11A-bestoj (NSE-tTA x TetOP-ΔFosB) estis uzataj en ĉi tiu studo kaj karakterizas Kelz et al., 1999. Por sobreexpremi ΔFosB, musoj estis forigitaj de doksikiklino inter 3 kaj 6-semajnoj de aĝo, dum kontrolo de musoj estis subtenita sur doksikiklino. Ĉiuj musoj estis grupigitaj kaj tenataj sur 12: 12 malpeza / malluma ciklo, lumoj ĉe 7-am kaj malŝaltas ĉe 7-pm, kun ad lib aliro al manĝo kaj akvo. Ĉiuj musaj eksperimentoj plenumis la protokolojn aprobitajn fare de la besto prizorgita kaj uzis komitaton de The University of Texas Southwestern Medical Center en Dallas.

Raportoj kaj esprimaj plásmidoj

La silvestre (WT) Cck promotor-luciferasa raportisto estis preparita per enmeto de proksimume 200 bp-PCR-fragmento en la pGL3-luc vector (Promega). Ĉi tiu fragmento estis akirita de muso genomika DNA (primers: 5 'TATCCTCATTCACTGGACAC 3' supre, kaj 5 'TACCTTTGGATGGGGAAATCG 3' sube) kaj komence enmetita en pGEM-T Facila vektoro (Promega, #A1360). La iniciatila fragmento estis tiam klonita en la Kpn1 / Xho1-limiga enzimo-ejoj de pGL3-luc.

Krei la CRE-punkton-mutacion en la Cck iniciatinto, mutagena enkonduko direktita kontraŭ antaŭe raportita CRE-simila ejo (sencokondukilo: 5'CGTGTCCTGCTGGACTGAGCTCGCACTGGGTAAACA 3 ', kontraŭsensa enkonduko: 5'CTGTTTACCCAGTGCGCGCTGAGTCCAGCAGGACACG 3') estis uzita en kombinaĵo kun la Stratag . Ĉi tio konvertas la raportitan CRE-similan retejon (ACTGCGTCAGC) al ACTGAGCTCC. Ĉiuj raportaj plasmidoj estis konfirmitaj per DNA-sinsekvado. La esprimo Plasmido de ΔFosB enhavas plenan sekvencon de osFosB enigita en la multoblan klonan lokon de pCDNA 3.1 kaj estis priskribita antaŭe (Ulery kaj Nestler, 2007).

Kulturo de ĉeloj kaj transfekcioj de ADN

Rataj feokromocitomaj ĉeloj (PC12) estis konservitaj en la meza F-12 de Dulbecco modifita Aglo, kompletigita kun 10% ĉevala serumo, 5% feta bova serumo, kaj 1% penicilino / streptomicino je 37 ° C kaj 5% CO₂. Ĉeloj estis transfektitaj per elektroporado uzante BTX 360 elektroporator (350V, 0 omo, kaj 850 μF) en 800 μL la fosfato de Dulbecco bufrita sala en 4 mm interspacaj kuvetoj kun 10 μg de la raportisto kaj 5 μg de la esprimo konstrukcio. Malplena vektora plasmido (pCDNA) estis uzata por normaligi totalajn kvantojn de DNA. Post transfekcio, la ĉeloj kreskis sur 35 mm kolagen-tegitaj pladoj dum la indikitaj tempoj.

Luciferase-atestoj

Du aŭ tri tagojn post transfekcio, ĉeloj estis lavitaj 3 fojojn en la fosfata bufro de Dulbecco salita, lizita (uzante 25 mM glicilglicinon, 15 mM MgSO₄, 4 mM EGTA, 1% Tritono X-100, pH 7.8, 1 mM DTT), kolektitaj kaj liberigitaj per centrifugado. 30 μL de lizato kombinis kun 140 μL luciferasa assay buffer (25 mM glycylglycine, 15 mM MgSO₄, 4 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM ATP, 1 mM-potasia fosfato, 1 mM-coenzima A, pH 7.8). Luminescence-aktiveco estis mezurita uzante FLX-800-micro-fluoreskantan leganton post aŭtomatigita injekto de 40 μL 1 mM luciferin per puto. La aktiveco de Luciferasa estis normalata al tuta proteina enhavo kiel determinita per BioRad-proteino-provo.

Elektroŝanĝebla movebleco

Nukleaj ekstraktoj de duflanka tranĉaĵoj de striatumo de bi-transgénikaj 11A musoj (kiuj konservis sur aŭ ekstere doksikiklino por 2 aŭ 8-semajnoj) (McClung kaj Nestler, 2003) preparis laŭ Huang kaj Walters (1996). ³²P-etikeditaj duobla strandaj oligonucleotido-sondoj estis pretaj uzante la protokolon de Promega Gel Shift Assay-protokolo (#E3300) kaj sondoj purigitaj per Roche Quick Spin-Kolumnoj. La konsentaj CRE kaj AP-1-sondaj sekvencoj estis de Promega (#E328A kaj E320B, respektive) kaj la Cck KRE-sekvencoj estis (Cck-CRE-senso: CTAGCGAGCTCTGGACTGCGTCAGCACTGGGTGCA; Cck-CRE kontraŭsenso: CCCAGTGCTGACGCAGTCCAGAGCTCGCTAGCTTT).

Ligaj reagoj kaj electroforesis estis faritaj per modifoj de la proceduro de la Promega Gel Shift Assay (#E3300). 50,000-CPM de etikedita sondado estis kombinita kun 10 μg striatala nuklea ekstrakto. Malvarma konkuranto DNA aŭ antikorpoj estis aldonitaj antaŭ la enkonduko de la radiofelitaj sondoj. Por supershift-eksperimentoj, 2 μg de CREB-antikorpo (Upstate Biotechnology # 06-083) estis uzata. Reagoj estis electroforesitaj sur geometroj 4-poliacrilamida, sekigitaj, kaj elmontritaj al filmo (uzante intensigajn ekranojn por 1-horo al 2-tagoj).

Senmoviĝado

Por ĉeloj PC12, 35 mm-platoj da transfektitaj ĉeloj estis lavitaj en glacia malvarmo de fosfata bufro de Dulbecco kaj lisatoj estis preparitaj en glacia malvarma RIPA-liza bufro (50 mM Tris pH 7.4, 5 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% senoksikolato, 1 % Triton X-100, 0.1% natria dodecilsulfato) enhavanta proteazajn inhibilojn. Post sonado, malplenigo kaj Bradford-proteina analizo, lisatoj estis plene denaturigitaj kaj 50 μg de ĉiu specimeno estis elektroforeitaj sur 10% SDS-poliakrilamidaj ĝeloj. Proteinoj estis translokigitaj al PVDF-membrano, blokitaj dum 1 horo en 3% sengrasa seka lakto en salo tris-bufro enhavanta 0.1% de Tween-20 (TBS-T-lakto), kaj esploritaj dum la nokto je 4 ° C kun primaraj antikorpoj (CREB- Upstate Biotechnology numero 06-083, uzata ĉe 1: 1,000; GAPDH- Sigma # G8795, uzata ĉe 1: 80,000) diluita en lakto TBS-T. Post multnombraj lavoj en TBS-T, makuloj estis sonditaj dum unu horo ĉe ĉambra temperaturo per alkalaj fosfataz-konjugitaj duarangaj antikorpoj (Sigma) diluitaj 1: 5,000 en TBS-T-lakto. Post multnombraj lavoj en salo tris-bufrita, la kolora reago estis plenumita laŭ la instrukcioj de BioRad (# 170-6432). Membranoj estis sekigitaj subite, skanitaj per plata skanilo kaj densitometrio farita per ImageJ (vidu sube).

Por striataj ekstraktoj, Okcidentaj blotaj ekzamenoj estis efektivigitaj kiel eldonitaj antaŭe (Hope et al., 1994). La tezo estis forigita de senkapitigitaj musoj, metita sur glacio kaj sekcita sur cerba matrico je dikeco de 1-mm. Tisaj punĉoj estis tiam prenitaj kaj frostigitaj ĉe -80 ° C ĝis uzataj. La histo estis sonita sur glacio en modifita detergento bazita bufro enhavanta ambaŭ fosfatase kaj protease-inhibidores (Roche, Sigma). Post sonication, specimenoj estis nedeatigitaj en bolanta akvo kaj centrifugis ĉe 15,000xg por 15-minutoj; supernatante estis poste kolektita kaj pretigita; La koncentriĝaj kvantoj de proteinoj tiam estis kvantigitaj per Bradford-provizo (Bio-Rad). Specimenoj estis kuritaj per 10% acrylamida / bisacrylamida ĝelo, translokigitaj al PVDF-membrano, blokita en 5-% lakto kaj kovrita kun primaraj antikorpoj (Anti-CREB, Upstate, Lake Placid, NY). Blotoj poste estis vidigitaj per sistemo de chemiluminesko (Pierce). Ĉiuj specimenoj estis normaligitaj al GAPDH (Fitzgerald, Concord, MA). Normaj kurboj estis kuritaj por certigi, ke ni estas en la lineara gamo de la provizo.

Analizo de densitometrio

Por PC12-immunoblots, densitometria analizo estis farita per ImageJ kun rodbard-kalibro. Duona fono signalo estis forigita de ĉiu mezuro kaj la proporcio de KREB al GAPDH-signalo estis kalkulita por ĉiu specimeno. Por striataj immunoblots kaj EMSA-analizo, Scion Image 1.62c estis uzata kun fono-subtraho.

Senromprecipigo de kromatina (ChIP)

Ĉefaj ekzamenoj estis plenumitaj laŭ la metodoj de Tsankova et al. (2004) kaj Kumar et al. (2005). Nelonge, duflankaj striataj specimenoj de 11A-musoj konservitaj sur aŭ for de doksiciklino estis retligitaj kun 1% formaldehido kaj retligado estis estingita kun glicino (fina koncentriĝo de 0.125 M). Ĉi tiuj specimenoj estis el tutaj cerbaj tranĉaĵoj prenitaj sur la nivelo de la kerno accumbens kun la kortekso forigita. Kromatino estis tondita al ĉirkaŭ 0.2 ĝis 1 kb-fragmentoj per sonado, malplenigita per proteina G-bidoj (Thermo Scientific numero 22852), kaj enigitaj specimenoj frostigitaj je -80 ° C. Inter 60 kaj 100 μg da kromatino estis uzata por ĉiu precipitaĵo. 5-10 μg de ĉiu primara antikorpo estis uzata (CREB: Upstate Biotechnology # 06-863, ΔFosB: Santa Cruz Biotechnology # SC-48x, acetilizita H3: Upstate Biotechnology numero 06-599, metiligita H3 (LYS9): Ĉela Signala Teknologio, cFos: Santa Cruz Biotechnology # SC-7202x). Antikorpaj kromatinaj kompleksoj estis imunoprecipititaj kun proteino G plus bidoj laŭ la instrukcioj de fabrikado (Thermo Scientific numero 22852). Post inversa retligo de enigoj kaj precipitaj specimenoj, ĉiu specimeno estis submetita al kvanta PCR (qPCR). La uzo de ĉiuj ĉi tiuj antikorpoj por ChIP estis vaste validigita (Tsankova et al., 2004; Kumar et al., 2005; Renthal et al., 2009).

Niveloj de protekta ligo ĉe ĉiu geno-iniciatinto de intereso estis determinitaj per mezurado de la kvanto de asociita DNA fare de qPCR (Aplikita Biosistemoj (ABI) Prism 7700, Foster City, CA). Enkonduko aŭ tuta DNA (neimunoprecipitata) kaj senunprecigita DNA estis plifortigita trioblige ĉe la ĉeesto de SYBR Green (Aplikitaj Biosistemoj, CA). Ct-valoroj de ĉiu specimeno estis akiritaj per la Sekureca Detektilo 1.1-softvaro. Relativa kvantigo de ŝablono DNA estis farita per la metodo ΔΔCt (Tsankova et al., 2004). Komputiloj uzitaj: BDNF-iniciatinto 4: CTTCTGTGTGCGTGAATTTGCT; AGTCCACGAGAGGGCTCCA CDK5-iniciatinto: GCTGAAGCTGTCAGGAGGTC; GTGCCCCGCTCTTGTTATTA Cck-iniciatinto: CTTGGGCTAGCCTCATTCACTG; TTAAATAGCTCCTCCCGGTTCG Prodynorphin-iniciatinto: GGCTTCCTTGTGCTTCAGAC; GCGCTGTTTGTCACTTTCAA.

Statistika analizo

Ĉiuj datumoj estas prezentitaj kiel rimedoj ± norma eraro de la meznombro. Statistika diferenco estis determinita de la du-vosta testo de Studento (p <0.05). Kiam multaj komparoj estis faritaj, p-valoroj estis ĝustigitaj per Bonferroni-korekto.

Dankoj

Ni ŝatus danki Will Renthal kaj Arvind Kumar por helpebaj diskutoj. Ni ankaŭ ŝatus danki al NIDA financi ĉi tiujn eksperimentojn.

Piednotoj

Malgarantio de Eldonisto: Ĉi tio estas PDF-dosiero de unita manuskripto, kiu estis akceptita por publikigado. Kiel servo al niaj klientoj ni provizas ĉi tiun fruan version de la manuskripto. La manuskripto suferas kopion, kompostadon kaj revizion de la rezultanta pruvo antaŭ ol ĝi estas publikigita en ĝia fina maniero. Bonvolu noti, ke dum la procezo de produktado povas malkovri erarojn, kiuj povus influi la enhavon, kaj ĉiujn laŭleĝajn malvirtojn, kiuj aplikeblas al la ĵurnalo.

Terminoj de klasifiko:

Sekcio: #1 Ĉela kaj Molekula Biologio de Nervaj Sistemoj

Referencoj

Andersson M, Konradi C, Cenci MA. La respondo de cAMP-elemento-liganta proteino estas postulita por dopamina-dependa geno-esprimo en la nerompita sed ne la dopamina-servata strio. J Neurosci. 2001; 21: 9930-43. [PubMed]
Barrot M, Olivier JD, Perrotti LI, DiLeone RJ, Berton O, Eisch AJ, Impey S, Storm DR, Neve RL, Yin JC, Zachariou V, Nestler EJ. KREKAJ aktiveco en la kerno konsumanta ŝelon kontrolas gatadon de kondutaj respondoj al emociaj stimuloj. Proc Natl Acad Sci Usono A. 2002; 99: 11435-40. [PMC libera artikolo] [PubMed]
Beinfeld MC, Connolly KJ, Pierce RC. La kuracado de kokainoj pliigas ĉielcokokinin ekstracelular (CCK) en la kerno, kiu konsistas el vekiĝaj libere movantaj ratoj, efikon plibonigita en ratoj, kiuj kondukas al kokaino. J Neurochem. 2002; 81: 1021-7. [PubMed]
Bernard C, Sutter A, Vinson C, Ratineau C, Chayvialle J, Kaptist-Mordaj Peptoj stimulas intestinalon de klecstokinina genetika trakcio per ciklaj adenosina monofosfato respondo elemento-ligantaj faktoroj. Endokrinologio. 2001; 142: 721-9. [PubMed]
Bibb JA, Chen J, Taylor JR, Svenningsson P, Nishi A, Snyder GL, Yan Z, Sagawa ZK, Ouimet CC, Nairn AC, Nestler EJ, Greengard P. Efektoj de kronika ekspozicio al kokaino estas reguligitaj per la neŭreala proteino Cdk5. Naturo. 2001; 410: 376-80. [PubMed]
Cha-Molstad H, Keller DM, Yochum GS, Impey S, Goodman RH. Ĉela-specifa ligo de la transskriba faktoro CREB al la cAMP-responda elemento. Proc Natl Acad Sci Usono A. 2004; 101: 13572-7. [PMC libera artikolo] [PubMed]
Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Kaj, Espero BT, Nestler EJ. Reguligo de delta FosB kaj FosB-similaj proteinoj per elektrokonvulsiva preno kaj kokainaj traktadoj. Mol Pharmacol. 1995; 48: 880-9. [PubMed]
Chen J, Kelz MB, Zeng G, Sakai N, Steffen C, Shockett PE, Picciotto MR, Duman RS, Nestler EJ. Transgenaj bestoj kun induktebla, celata gen-esprimo en cerbo. Mol Pharmacol. 1998; 54: 495-503. [PubMed]
Chen J, Zhang Y, Kelz MB, Steffen C, Ang ES, Zeng L, Nestler EJ. Indukto de klinina-dependa kinase 5 en la hipocampo per kronikaj elektrokonvulsaj atakoj: rolo de ΔFosB. J Neurosci. 2000; 20: 8965-71. [PubMed]
Chinenov Y, Kerppola TK. Fermu renkontiĝojn de multaj specoj: Meze-Junaj interagoj, kiuj medias transskribajn reguligajn specifecojn. Onkogeno. 2001; 20: 2438-52. [PubMed]
Cole RL, Konradi C, Douglass J, Hyman-SE. Adaptiĝo neuronal al anfetamina kaj dopamino: molekulaj mekanismoj de prodynorphin-genreguligo en rata striatumo. Neŭrono. 1995; 14: 813-23. [PubMed]
Deavall DG, Raychowdhury R, Dockray GJ, Dimaline R. Kontrolo de CCK-gena transskribo de PACAP en STC-1-ĉeloj. Am J Physiol Gastrointest Hepato Physiol. 2000; 279: G605-12. [PubMed]
Ding XZ, Mocchetti I. Dopaminergic reguligo de cholecystokinin mNA-enhavo en rato striatum. Brain Res Mol Brain Res. 1992; 12: 77-83. [PubMed]
Forrest S, McNamara C. Id-familio de faktoroj de transskribo kaj formado de vazulado. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2004; 24: 2014-20. [PubMed]
Gevrey JC, Cordier-Bussat M, Némoz-Gaillard E, Chayvialle JA, Abello J. Kunmeto de ciklaj AMP- kaj kalcio-dependaj proteinoj kinasoj por transskriba aktivigo de cholecystokinin-geno per proteinoj hidrolizitaj. J Biol Kem. 2002; 277: 22407-13. [PubMed]
Green TA, Alibhai IN, Unterberg S, Neve RL, Ghose S, Tamminga CA, Nestler EJ. Indukto de aktivigaj transskribaj faktoroj (ATFs) ATF2, ATF3, kaj ATF4 en la kerno konsumas kaj ilia reguligo de emocia konduto. J Neurosci. 2008; 28: 2025-32. [PubMed]
Hamilton ME, Redondo JL, Freeman AS. Superfluo de dopamino kaj kolecystokinin en rato-kerno konsumas en respondo al akra droga administrado. Sinapso. 2000; 38: 238-42. [PubMed]
Hansen TV, Rehfeld JF, Nielsen FC. Mitogen-aktivigita proteina kinazo kaj proteina kinazo A-signalaj vojoj stimulas kolecistokininan transskribon per aktivigo de cikla adenosinuso 3 ', 5'-monofosfata respondelemento-deviga proteino. Mol Endocrinol. 1999; 13: 466-75. [PubMed]
Hansen TV, Nielsen FC. Reguligo de neŭtrala genro-transskribo. Skandalo J Clin Lab Invest Suppl. 2001; 234: 61-7. [PubMed]
Hansen-TV. Elektra transskribo de Cholecystokinin: elementoj de iniciatinto, faktoroj de transskribo kaj vojoj de señalización. Peptidoj. 2001; 22: 1201-11. [PubMed]
Hansen TV, Rehfeld JF, Nielsen FC. KCl kaj forskolin sinergie reguligas cholecystokinin-genan esprimon per koordinata aktivigo de CREB kaj la kun-aktiviganto CBP. J Neurochem. 2004; 89: 15-23. [PubMed]
Haun RS, Dixon JE. Transskriba plibonigilo esenca por la esprimo de la rato-kolecokokinina geno enhavas sekvencon identan al la-296-elemento de la homa c-fos-geno. J Biol Kem. 1990; 265: 15455-63. [PubMed]
Hiroi N, Marek GJ, Brown JR, Ye H, Saudou F, Vaidya VA, Duman RS, Greenberg ME, Nestler EJ. Esenca rolo de la geno fosB en molekulaj, ĉelaj kaj kondukaj agoj de kronikaj elektrokonvulsaj atakoj. J Neurosci 1998. 1998; 18: 6952-62. [PubMed]
Hokfelt T, Rehfeld JF, Skirboll L, Ivemark B, Goldstein M, Markey K. Evidenteco por kunvivado de dopamino kaj CCK en meso-limbaj neŭronoj. Naturo. 1980; 285: 476-8. [PubMed]
Hope BT, Kelz MB, Duman RS, Nestler EJ. Kronika elektrokonvulsiva preno (ECS) traktado rezultas en esprimo de longdaŭra AP-1-komplekso en cerbo kun ŝanĝita komponado kaj karakterizaĵoj. J Neurosci. 1994; 14: 4318-28. [PubMed]
Hope BT, Nye HE, Kelz MB, Self DW, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, Duman RS, Nestler EJ. Indukto de longdaŭra AP-1-komplekso kunmetita de ŝanĝitaj Fos-similaj proteinoj en cerbo per kronika kokaino kaj aliaj kronikaj traktadoj. Neŭrono. 1994; 13: 1235-44. [PubMed]
Huang KX, Walters JR. Dopaminergic regulado de AP-1-transskriba faktoro DNA-liganta aktivecon en rata striatumo. Neurokienco. 1996; 75: 757-75. [PubMed]
Impey S, McCorkle SR, Cha-Molstad H, Dwyer JM, Yochum GS, Boss JM, McWeeney S, Dunn JJ, Mandel G, Goodman RH. Difinante la CREB-regulon: genoman analizon de transskriba faktoro reguligaj regionoj. Ĉelo. 2004; 119: 1041-54. [PubMed]
Johannessen M, Delghandi MP, Moens U. Kion ĝi igas CREB sur? Ĉela signalo. 2004; 16: 1211-27. [PubMed]
Josselyn SA, Vaccarino FJ. Kontraŭaj efikoj de CCK (A) kaj CCK (B) antagonistoj pri la disvolviĝo de kondiĉita aktiveco en ratoj. Behav Pharmacol. 1996; 7: 505-512. [PubMed]
Josselyn SA, De Cristofaro A, Vaccarino FJ. Evidenteco por kontribuanto de CCK (A) en la akiraĵo de kondiĉita aktiveco produktita de kokaino en ratoj. Brain Res. 1997; 763: 93-102. [PubMed]
Kelz MB, Chen J, Carlezon WA, Jr., Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR , Nestler EJ. Esprimo de la faktoro de transskribo deltaFosB en la cerbo kontrolas sentivecon al kokaino. Naturo. 1999; 401: 272-6. [PubMed]
Kumar A, Choi KH, Renthal W, Tsankova NM, Theobald DE, Truong HT, Russo SJ, Laplant Q, Sasaki TS, Whistler KN, Neve RL, Self DW, Nestler EJ. Chromatin-remodelado estas ŝlosila mekanismo sub la kokaino-induktita plastikeco en striatumo. Neŭrono. 2005; 48: 303-14. [PubMed]
Mattson BJ, Bossert JM, Simmons DE, Nozaki N, Nagarkar D, Kreuter JD, Espero BT. La fosforilado de kroc-induktita de kokaino en nukleaj konsumantoj de kokain-sentivaj ratoj estas ebligita per plibonigita aktivigo de ekstracelular signalo-rilata kinase, sed ne proteino kinase A. J Neurochem. 2005; 95: 1481-94. [PubMed]
McClung CA, Nestler EJ. Reguligo de gen-esprimo kaj kokaino rekompencas de CREB kaj DeltaFosB. Nat Neurosci. 2003; 6: 1208-15. [PubMed]
McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ. DeltaFosB: molekula ŝaltilo por longtempa adapto en la cerbo. Brain Res Mol Brain Res. 2004; 132: 146-54. [PubMed]
Nestler EJ, Kelz MB, Chen JS. ΔFosB: molekula mediatoro de longtempa neŭtrala kaj kondutodaleco. Brain Res. 1999; 835: 10-17. [PubMed]
Nestler EJ. Ĉu ekzistas komuna molekula vojo por toksomanio? Nat Neurosci. 2005; 8: 1445-9. [PubMed]
Nestler EJ. Transskribaj mekanismoj de toksomanio: rolo de DeltaFosB. Philos Trans R Soc Lond B Mallonga Priskribo: Biol Sci. 2008; 363: 3245-55. [PMC libera artikolo] [PubMed]
Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Mazeo I, Yazdani S, Elmore RG, Knapp DJ, Selley DE, Martin BR, Sim-Selley L, Bachtell RK, Self DW, Nestler EJ. Distingaj ŝablonoj de DeltaFosB-indukto en cerbo per drogoj de misuzo. Sinapso. 2008; 62: 358-69. [PMC libera artikolo] [PubMed]
Forĵeti OJ, Chang HY. Genomaj larĝaj vidoj de cromatina strukturo. Annu Rev Biochem. 2009; 78: 245-71. [PMC libera artikolo] [PubMed]
Renthal W, Carle TL, Mazeo I, Covington HE, 3rd., Truong HT, Alibhai I, Kumar A, Montgomery RL, Olson EN, Nestler EJ. Delta FosB mezigas epigenetic desensitization de la c-fos geno post kronika anfetamina ekspozicio. J Neurosci. 2008; 28: 7344-9. [PMC libera artikolo] [PubMed]
Renthal W, Kumar A, Xiao G, Wilkinson M, Covington HE, 3rd, Mazeo I, Sikder D, Robison AJ, LaPlant Q, Dietz DM, Russo SJ, Vialou V, Chakravarty S, Kodadek TJ, Stack A, Kabbaj M, Nestler EJ. Genoma-larĝa analizo de cromatinreguligo per kokaino montras rolon por sirtuins. Neŭrono. 2009; 62: 335-48. [PMC libera artikolo] [PubMed]
Rotzinger S, Bush DE, Vaccarino FJ. Cholecystokinin-modulado de mesolimbic dopamine-funkcio: reguligo de motivita konduto. Pharmacol Toxicol. 2002; 91: 404-13. [PubMed]
Rourke IJ, Hansen TV, Nerlov C, Rehfeld JF, Nielsen FC. Negativa kunlaboro inter apudmetita E-skatolo kaj cAMP / TPA-respondaj elementoj en la kolektokinina geno-iniciatinto. FEBS-Lito. 1999; 448: 15-8. [PubMed]
Shaw-Lutchman TZ, Barrot M, Wallace T, Gilden L, Zachariou V, Impey S, Duman RS, Storm D, Nestler EJ. Regiona kaj ĉela mapeado de CRE-amasigita transskribo dum naltrexone-precipitigita morfina izoliteco. J Neurosci. 2002; 22: 3663-3672. [PubMed]
Shaw-Lutchman TZ, Impey S, Storm D, Nestler EJ. Reguligo de CRE-amasigita transskribo en musa cerbo per anfetamino. Sinapso. 2003; 48: 10-7. [PubMed]
Sheng M, McFadden G, Greenberg ME. Membrana senpolarigo kaj kalcio induktas c-fos-transskribon per fosforilado de transskriba faktoro CREB. Neŭrono. 1990; 4: 571-82. [PubMed]
Tsankova NM, Kumar A, Nestler EJ. Histona modifoj ĉe genaj iniciatintoj en rato hipocampo post akraj kaj kronikaj elektrokonvulsivaj atakoj. J Neurosci. 2004; 24: 5603-10. [PubMed]
Ulery PG, Nestler EJ. Reguligo de DeltaFosB-transskriba agado per Ser27-fosforilado. Eur J Neurosci. 2007; 25: 224-30. [PubMed]
Vaccarino FJ. Nukleoj akompanas dopamin-CCK-interagojn en psikostimulantaj rekompencoj kaj rilataj kondutoj. Neurosci Biobehav Rev. 1992; 18: 207-14. [PubMed]
Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchmann T, Berton O, Sim-Selley LJ, DiLeone RJ, Kumar A, Nestler EJ. ΔFosB: Esenca rolo por ΔFosB en la kerno konsumas en morfina ago. Naturo Neurosci. 2006; 9: 205-11. [PubMed]