fonto
Grupo de Ĉela kaj Molekula Farmakologio, Sekcio de Farmakologio, Universitata Lernejo de Medicino, Murcio, Hispanio.
abstrakta
Kronika uzo de drogoj de misuzo profunde ŝanĝas stres-respondeman sistemon. Ripeta eksponiĝo al morfino kondukas al amasiĝo de la transskriba faktoro ΔFosB, precipe en cerbaj areoj asociitaj kun rekompenco kaj streso. La persistaj efikoj de ΔFosB sur celgenoj povas ludi gravan rolon en la plastikeco induktita de drogoj de misuzo. Lastatempa indico indikas ke stres-rilataj hormonoj (ekz., glukokortikoidoj, GC) povas indukti adaptiĝojn en la cerba stressistemo kiu verŝajne implikos ŝanĝon en genesprimo kaj transkripcifaktoroj. Ĉi tiu studo ekzamenis la rolon de GC en reguligo de FosB/ΔFosB en kaj hipotalamaj kaj eksterhipotalamaj cerbaj stressistemoj dum morfina dependeco. Por tio, esprimo de FosB/ΔFosB estis mezurita en kontrolo (sham-funkciigitaj) kaj adrenalectomigitaj (ADX) ratoj kiuj fariĝis dependaj de opiaĵoj post dek tagoj da morfina traktado. En ŝajn-funkciigitaj ratoj, FosB/ΔFosB estis induktita post kronika morfino-dono en ĉiuj cerbaj stresaj areoj esploritaj: kerno accumbens (ŝelo) (NAc), lita kerno de la stria terminalis (BNST), centra amigdalo (CeA), hipotalama paraventrikla kerno (PVN) kaj solergia nukleo (PVN) (NTS-A(2)). Adrenalektomio mildigis la pliigitan produktadon de FosB/ΔFosB observita post kronika morfina ekspozicio en NAc, CeA kaj NTS. Krome, ADX malpliigis esprimon de FosB/ΔFosB ene de CRH-pozitivaj neŭronoj de la BNST, PVN kaj CeA. Similaj rezultoj estis akiritaj en NTS-A(2) TH-pozitivaj neŭronoj kaj NAc-pro-dynorfin-pozitivaj neŭronoj. Ĉi tiuj datumoj sugestas, ke neŭroadaptado (taksita kiel amasiĝo de FosB/ΔFosB) al opiaĵoj en cerbaj areoj asociitaj kun streso estas modulita de GC, apogante la evidentecon de ligo inter cerbaj streshormonoj kaj toksomanio.
Enkonduko
Opiaj drogoj, kiel morfino, estas efikaj analgezikaj agentoj, kiuj estas uzataj por trakti multajn formojn de akra kaj kronika doloro. Tamen, gravaj malfavoraj efikoj kiel ekzemple toleremo kaj retiriĝo kontribuas al opiaĵdependeco kaj limigas ilian uzon. Plue, la nemedicina uzo de opiaĵoj (heroino, morfino) pliiĝis dum la lastaj jaroj. Kreskanta indico implikas diversajn mekanismojn de genreguligo (inkluzive de epigenetikaj, molekulaj, ĉelaj kaj cirkvitnivelaj efikoj) en la ŝanĝoj kiujn drogoj de misuzo induktas en la cerbo, indikante eblan terapian strategion por toksomanioterapio. [1]-[4].
Centra demando en la drogmaniokampo devis identigi proteinojn kiuj mediacias la transiron de akutaj ĝis longperspektivaj efikoj de tiuj medikamentoj. De speciala intereso en la studo de toksomanio estas la familio Fos de transkripcifaktoroj. Tiu familio inkludas c-Fos, Fra-1 kaj Fra-2, FosB kaj ΔFosB, stumpigitan splisvariaĵon de plenlonga FosB [5]. Kontraste al aliaj membroj de la familio Fos, ΔFosB estas modeste induktita en la cerbo post akra drog-administrado, sed pro ĝia nekutima longa duoniĝotempo ĝi daŭras dum semajnoj, eĉ monatoj, post la ĉesigo de drogo. Kiel rezulto, ΔFosB-niveloj iom post iom akumuliĝas kun ripeta drogekspozicio [6], [7], sugestante ke ΔFosB povus reprezenti mekanismon per kiu drogoj de misuzo produktas daŭrajn ŝanĝojn en gen-esprimpadrono longe post kiam la drogo estas retirita. [8].
Oni raportis, ke ripeta eksponiĝo al kokaino, amfetamino, cannabinoidoj aŭ morfino kondukas al pliigo de ΔFosB en cerbaj areoj rilataj al la pozitivaj plifortigaj efikoj de drogoj, kiel kerno accumbens (NAc), antaŭfronta kortekso kaj dorsa striato. Tiu pliiĝo estis proponita esti neŭroadaptado kiu kondukas al pliigita sentemo al drogoj de misuzo kaj vundebleco por evoluigi karakterizajn kondutojn de toksomanio. [9]-[13]. Ni lastatempe montris, ke thPliigo de FosB/ΔFosB-niveloj post kronika morfino-administrado estas ne nur limigita al la rekompenca sistemo, sed ankaŭ okazas en la cerba streĉa sistemo (kiu estis rilatita al la negativaj plifortigaj efikoj de drogoj), same kiel en la kerno de la soleca vojo-A2 noradrenergia ĉelgrupo (NTS-A2, la ĉefa noradrenergia sistemo nervoza la streĉa neŭrocirkvito) [14]. En konsoneco kun ĉi tiuj trovoj, pluraj formoj de kronika streso ankaŭ induktas ΔFosB en la NAc kaj aliaj cerbaj regionoj. [15], [16].
Dependeco estas kompleksa malordo ĉar multaj faktoroj kontribuas al la disvolviĝo kaj bontenado de ĉi tiu neŭrologia malordo. Unu faktoro estas streso, kiu estis implikita en specifaj aspektoj de drogmanio [17]-[21]. Kaj la hipotalamo-hipofizo-adrena (HPA, la primara endokrina strespado) akso kaj la eksterhipotalama stressistemo (kiu konsistas el la plilongigita amigdalo kaj la NTS-A).2) estas malreguligitaj per kronika dono de medikamentoj kun dependeca potencialo [14], [22]. Krome, HPA-aksrespondo estas simila post kaj streĉaj stimuloj kaj akuta eksponiĝo al drogoj de misuzo [23], [24], kun levita kortikotropin-liberiga hormono (CRH), adrenokortikotropa hormono (ACTH), kaj glukokortikoidoj (GC) liberigo. Tlia respondo faciligas adaptadon al akutaj mediaj ŝanĝoj, sed ankaŭ povas konduki al kondutismaj patologioj dum kronikaj streskondiĉoj, kiel ekzemple toksomanio kaj depresio. [25]. Studoj ankoraŭ ne ekzamenis la rilaton inter GC kaj morfina dependeco-induktita FosB/ΔFosB-indukto en la cerba streĉa sistemo. Ni do taksis la influon de GC sur FosB/ΔFosB-esprimo post kontinua administrado de morfino en cerbaj stres-rilataj areoj. Por trakti ĉi tiun demandon, ni unue ekzamenis la efikojn de duflanka adrenalektomio (ADX) sur FosB/ΔFosB imunoreaktiveco (IR) en la ĉefaj kernoj de la streĉa sistemo en morfin-dependaj ratoj.
La agado de la cerba stressistemo estas mediaciita per kelkaj neŭrotransmisiloj/neŭromoduliloj. CRH estas la ĉefa neŭropeptido reguliganta la streĉan sisteman agadon kaj estis postulita ĝia kontribuo en kaj antaŭekzistanta vundebleco por uzi drogojn dependige kaj pli posta vundebleco al recidivo. [26]. min krome, abunda laboro subtenas la gravecon de la NTS-A2 nervozante la cerban streĉan sistemon en drogmanio kaj la pivota rolo de noradrenalino (NA) kiel neŭrotransmitor modulanta ĉi tiun neŭrocirkuiton. [27]. Finfine, granda indico indikas ke dinorfina esprimo estas aktivigita en la striato kaj amigdalo dum akra kaj kronika drogadministrado. [28]. Konsiderante ĉi tiujn faktojn, la sekva celo de ĉi tiu studo estis identigi la rolon de GC sur FosB/ΔFosB-esprimo en specifaj populacioj de la cerba streĉa sistemo dum morfina dependeco.
rezultoj
Efikoj de Adrenalektomio sur Korpa Pezo-Gaiĝo kaj Plasma ACTH kaj Kortikosterona Koncentriĝo en Morfin-dependaj Ratoj
Antaŭ ol plenumi la imunodetektajn provojn, ni taksis la efikecon de kronika traktado kun morfino. Por tiu celo, la pezo de bestoj estis registrita en la tago de enplantado de buletoj kaj en la tago de mortigo (tago 10). Dudirekta ANOVA rivelis signifajn ĉefajn efikojn al korpa pezo por adrenalektomio [F(1,47)
=13.24, p=0.0007), morfina traktado [F(1,47)=281.05, p<0.0001] kaj interagado inter ADX kaj morfina traktado [F(1,47)=4.13, p=0.0479]. Konforme al antaŭaj trovoj [29], [30], post hoc analizo indikis ke kaj ŝajnigaj kaj ADX-grupoj dependigitaj de morfino montris signife (p<0.001) pli malalta pezo (−13.75±5.0 g, n=12; 3.84±2.45 g, n=13, respektive) ol tio observita en ŝajnigaj kaj ADX-bestoj ricevantaj placebo-buletojn (44.58±1.7 g, n=12; 49.57±2.4 g, n=12, respektive), kiu estis atribuita al la reduktita manĝaĵo observita ĉe tiuj bestoj [29].
Por kontroli la efikecon de la adrenalektomio, hormonaj koncentriĝoj estis mezuritaj en plasmo. Dudirekta ANOVA ekzamenanta efikojn de adrenalektomio kaj morfino sur ACTH kaj kortikosterona plasmokoncentriĝo montris signifajn ĉefajn efikojn de adrenalektomio [ACTH: F(1,18)=68.12, p<0.0001; kortikosterono: F (1,45)=10.42, p=0.0023). Kiel atendite, tiu de Newman post hoc testo montrita (Fig. S1) ke en placebo (n=6)- kaj morfino (n=4)-ADX-ratoj-plasmokoncentriĝo de ACTH estis pli alta (p<0.001) kompare kun ŝajn-funkciigitaj bestoj por la du traktado taksita (placebo, n=6; kaj morfino, n=6). Neniuj modifoj estis observitaj en plasma kortikosterona koncentriĝo inter ADX-placebo (n=14) kaj ADX-morfino (n=13) traktitaj ratoj. Koncentriĝo de kortikosterono en ADX-morfino traktitaj ratoj estis signife (p<0.01) pli malaltaj ol tiuj viditaj en ŝajn-morfino (n=10) traktitaj ratoj. Neniuj signifaj ŝanĝoj estis viditaj en ŝajn-morfina grupo kompare kun ŝajn-placebo (n=12).
Adrenalektomio Diference Malfortigas FosB/ΔFosB induktitan de Morfina Dependeco en la Subregionoj de Cerba Stressistemo
En kontrolbestoj (placebo-enplantitaj ratoj), malforta konstitua esprimo de FosB/ΔFosB-IR estis identigita en ĉiuj areoj de la stres-rilata cerba sistemo. Kronika morfina traktado rezultigis la aperon de FosB/ΔFosB en ĉiuj esploritaj cerbaj areoj. En la NAc (ŝelo), dudirekta ANOVA montris signifajn ĉefajn efikojn de adrenalektomio [F (1,16)=6.44, p=0.0220] kaj kronikaj morfintraktadoj [F(1,16)=19.98, p=0.0004]. La post hoc testo de Newman-Keuls montris (Fig. 2A–E) ke en morfin-traktataj ratoj estis signifa (p<0.01) pliiĝo en FosB/ΔFosB-esprimo. En morfin-dependaj ADX-ratoj, estis signifa (p<0.05) redukto en FosB/ΔFosB proteinesprimo en la NAc. Dudirekta ANOVA por BNST montris signifan ĉefan efikon de kronika morfina traktado [F(1,16)=48.92, p<0.0001]. Post hoc analizo rivelis pliiĝon (p<(Figuro 2F–J). Dudirekta ANOVA por FosB/ΔFosB en la CeA montris signifajn efikojn de adrenalektomio [F(1,15)=20.51, p=0.0004] kaj morfina antaŭtraktado [F(1,15)=27.52, p<0.0001]. Post ĉi tio testo montris signifan pliiĝon (p<0.01) en FosB/ΔFosB-niveloj en ŝajn-morfinaj ratoj kontraŭ ŝajn-placebo-ratoj, kiu estis mildigita (p<0.01) en la ADX-morfin-dependa grupo (Fig. 2K–O). Krome, ADX-placebo-pelitaj ratoj montris pli malaltajn nivelojn (p<0.01) de FosB/ΔFosB ol la ŝajna placebo-grupo.
Dudirekta ANOVA ekzamenanta la efikojn de adrenalektomio kaj morfino sur FosB/ΔFosB-esprimo en la PVN (parvoĉela subdivido) rivelis signifan efikon de morfina traktado [F(1,16)=16.31, p<0.0001]. Post ĉi tio analizo montris signifan (Fig. 3A–E) pligrandigi (p<0.05) en FosB/ΔFosB-IR en la PVN de ambaŭ ŝajn- kaj ADX-morfino traktitaj ratoj. En la NTS-A2 katekolaminergia ĉelgrupo, dudirekta ANOVA rivelis ĉefan efikon de morfina traktado [F(1,11)=76.33, p<0.0001]. Post ĉi tio analizo montris signifan (Figuro 3F–J) pliiĝo en FosB/ΔFosB-IR en la ŝajn-morfinaj ratoj kompare kun la ŝajn-placebo-grupo (p<0.001), kiu estis mildigita (p<0.05) en la ADX morfin-dependa grupo.
Kronika Morfina Ekspozicio Induktas FosB/ΔFosB-Esprimon en CRH-Neŭronojn en PVN, BNST kaj CeA. Influo de Glukokortikoidoj
Dudirekta ANOVA por FosB/ΔFosB-pozitivaj/CRH-pozitivaj neŭronoj en la BNST montris ĉefan efikon de adrenalektomio [F(1,20)=64.43, p<0.0001] kaj signifa interagado inter adrenalektomio kaj morfina traktado [F(1,20)=6.80, p=0.0169]. En la PVN, dudirekta ANOVA rivelis signifan ĉefan efikon de adrenalektomio [F(1,19)=11.35, p=0.0032]. Dudirekta ANOVA por FosB/ΔFosB-pozitivaj/CRH-pozitivaj neŭronoj en la CeA montris signifan ĉefan efikon de adrenalektomio [F(1,20)=106.85, p<0.0001], morfina traktado [F(1,20)=7.33, p=0.0136] kaj signifa interagado inter adrenalektomio kaj drogpretraktado [F(1,20)=7.07, p=0.0151]. Figuroj 4, , 5,5, ,66 Montru reprezentajn bildojn de BNST, PVN kaj CeA-sekcioj de ŝajnigaj aŭ ADX-kontroloj kaj morfin-dependaj ratoj. Post ĉi tio analizo rivelis, ke signifa nombro da FosB/ΔFosB-pozitivaj neŭronoj estis trovitaj kunesprimi CRH en la BNST (p<0.01; Fig. 4E), PVN (p<0.05; Fig. 6E) kaj CeA (p<0.01; Fig. 6E) en ŝajn-morfinaj ratoj komparite kun ŝajn-placebogrupo. Aldone, la nombro da FosB/ΔFosB-pozitivaj neŭronoj kunesprimantaj CRH en ADX-placebo-pelitaj ratoj kaj en morfin-dependaj ratoj estis signife pli malalta en la tri kernoj kompare kun la responda traktado en ŝajnbestoj, kiel montrite en Figuroj 4, , 5,5, ,66 (BNST: p<0.01 kontraŭ ŝajnigo plus placebo; p<0.001 kontraŭ ŝajnigo plus morfino; PVN: p<0.05 kontraŭ ŝajnigo plus placebo; p<0.001 kontraŭ ŝajnigo plus morfino; CeA: p<0.001 kontraŭ ŝajniga plus placebo kaj kontraŭ ŝajniga plus morfino).
Sur la BNST-nivelo, dudirekta ANOVA por la nombro da CRH-pozitivaj neŭronoj montris ke ekzistis ĉefa efiko de ADX [F(1,20)=103.92, p<0.0001] same kiel kronika morfino [F(1,20)=4.35, p<0.05]. Kiel montrite en tablo 1, Newman-Keuls post hoc testo rivelis ke ADX-placebo- kaj morfin-pelitaj ratoj montris pli malaltajn CRH-neŭronojn (p<0.001) ol la ŝajn-placebo aŭ morfin-dependaj grupoj. Ĉe la PVN, dudirekta ANOVA montris signifan efikon de adrenalektomio [F(1,19)=11.35, p=0.0032]. Dudirekta ANOVA por totalaj CRH-neŭronoj ĉe la CeA-nivelo rivelis signifajn efikojn de ADX [F(1,20)=240.09, p<0.0001] kaj ĉefa interago inter ADX kaj kronika morfino [F(1,20)=4.49, p=0.0467]. tablo 1 prezentas ke ekzistis signifa malkresko en CRH-neŭronoj ĉe la CeA de ADX-placebo- aŭ morfin-traktataj ratoj. tablo 1 ankaŭ montras ke kronika morfinekspozicio induktas altecon (p<0.05) de CRH-pozitivaj neŭronoj ĉe BNST kaj CeA-niveloj.
Efikoj de Adrenalektomio sur FosB/ΔFosB en DYN-pozitivajn Neŭronojn en la NAc (Ŝelo)
Ni observis neniujn signifajn ŝanĝojn en la nombro da por-DYN-pozitivaj ĉeloj, kiuj kunesprimas FosB/ΔFosB en la NAc (ŝelo) post kronika morfina eksponiĝo (Figo. 7) koncerne la placebo-grupon. Dudirekta ANOVA por FosB/ΔFosB-pozitivaj/por-DYN-pozitivaj neŭronoj en la NAc(ŝelo) montris ĉefan efikon de ADX [F(1,19)=10.11, p=0.0049]. Kiel montrite en Fig. 7C, la nombro da FosB/ΔFosB-pozitivaj neŭronoj kiuj kunesprimas por-DYN en ADX morfin-dependaj ratoj estis signife (p<0.05) pli malalta koncerne la respondan traktadon en ŝajnbestoj. Kiel montrite en tablo 1, ADX induktis neniujn ŝanĝojn en totala por-DYN-ĉelo de la NAc (ŝelo).
Adrenalektomio Inhibas FosB/ΔFosB-induktitan de Morfina Dependeco en TH-Pozitivajn Neŭronojn en la NTS-A2 Noradrenergia Ĉela Grupo
Dudirekta ANOVA por FosB/ΔFosB-pozitivaj/TH-pozitivaj neŭronoj en la NTS-A2 montris ĉefan efikon de ADX [F(1,15)=64.86, p<0.0001], morfina traktado [F(1,15)=29.62, p<0.0001], kaj signifa interagado inter adrenalektomio kaj morfintraktado [F(1,15)=19.24, p=0.0005]. Newman-Keuls post hoc testo indikas, ke signifa nombro da FosB/ΔFosB-pozitivaj neŭronoj estis trovitaj kunesprimi TH en la NTS (p<0.001; Fig. 7F) ĉe ŝajn-morfinaj ratoj. Krome, la nombro da FosB/ΔFosB-pozitivaj neŭronoj kunesprimaj TH en ADX morfin-dependaj ratoj estis signife pli malalta (p<0.001) kompare kun la responda traktado en ŝajnbestoj, kiel montrite en Fig. 7F. Aliflanke, kiel montrite en tablo 1, ADX induktis neniujn ŝanĝojn en totalaj TH-pozitivaj neŭronoj en la NTS.
diskuto
La nunaj rezultoj indikis, por la unua fojo, ke cerba GC signalado modulis kronikan morfina administrado-induktitan FosB/ΔFosB-esprimon en la cerba stressistemo en region-specifa maniero.
Konverĝaj pruvlinioj indikas, ke streso pliigas riskon de dependigaj kondutoj [18]. Konstantaj streĉaj stimuloj ŝanĝas sintezon, esprimon kaj signaladon en stres-rilataj vojoj (ekz. CRH, GC, NA, ktp). Krome, drogoj de misuzo influas la streĉajn vojojn, kio rezultigas ŝanĝon de gena esprimo, kun signalaj efikoj al rekompenco kaj stres-rilataj molekuloj. [31]. Streso kaj misuzitaj medikamentoj dividas la kapablon ekigi imbrikitajn padronojn de neŭrona aktivigo ene de la centra nervosistemo, rezultigante la aktivigon de tuja genesprimo.
Estis vaste priskribite, ke toksomaniaj substancoj kaj kronikaj streĉaj stimuloj pliigas la esprimon de la transskriba faktoro ΔFosB en la ĉefaj kernoj implikitaj en siaj pozitivaj plifortigaj efikoj. [12], [13], [32], [33], kaj estis proponite, ke la persistaj efikoj de ΔFosB sur celgenoj povus ludi gravan rolon en la evoluo de adaptoj kiuj karakterizas toksomanion. [9], [34]. Tamen oni scias malmulte pri aŭ la esprimo de ΔFosB en la cerba streĉa sistemo post kronika administrado de drogoj de misuzo aŭ la molekulaj mekanismoj de morfin-elvokita ΔFosB-amasiĝo en stres-rilataj areoj.
En la nuna studo, ni esploris la implikiĝon de GC sur la morfino-induktita FosB / ΔFosB-esprimo en la hormona streĉa sistemo (HPA-akso), kiu estas kontrolita de CRH en la PVN, same kiel en la eksterhipotalamaj streĉaj sistemoj (kiuj inkluzivas la plilongigitan amigdalon; [35]), perita de CRH kaj aliaj stres-rilataj sistemoj (inkluzive de NA, kaj dinorfino; [19]).
Ni lastatempe pruvis, ke kronika administrado de morfino dum sep tagoj pliigis FosB/ΔFosB-esprimon en la plilongigita amigdalo, PVN kaj NTS-A.2 [14]. Konsekvence kun ĉi tiuj datumoj, nunaj rezultoj montras, ke kronika morfina administrado elvokis pliiĝon en FosB/ΔFosB en CeA, BNST kaj NAc(ŝelo) same kiel en la PVN kaj NTS-A.2. La etendita amigdalo estis asociita kun drogrekompenco. Fakte, ĉiuj gravaj drogoj de misuzo aktivigas dopaminergan dissendon de la VTA ĝis la NAc (ŝelo) kaj CeA. Tiu aktivigo kaj la sekvaj pozitivaj plifortikigaj efikoj de substancoj de misuzo pruviĝis esti rilataj al GC-agoj sur GR situanta en la VTA. [28]. Apogante ĉi tiun hipotezon, niaj rezultoj montras, ke FosB/ΔFosB-IR en la NAc (ŝelo) kaj la CeA estis mildigitaj en ADX-bestoj, kio povus indiki interparolon inter AP-1-transkripcifaktoroj kaj GR dum morfina dependeco. [36]. Kontraste al la observitaj efikoj de ADX sur FosB-esprimo en NAc kaj CeA, nunaj rezultoj sugestas, ke kronika morfino pliigis Fos/ΔFosB-esprimon en la PVN kaj BNST en GC-sendependa maniero.
Pluraj neŭrotransmisiloj de la cerba stresa sistemo, kiel CRH, NA kaj DYN, estis rilataj al la aversivaj statoj karakterizaj de la toksomanioprocezo. [35], [37]-[39]. Nunaj trovoj montris, ke kronika morfina ekspozicio elvokis signifan pliiĝon en Fos/ΔFosB-esprimo ene de CRH-enhavantaj neŭronoj en la BNST, CeA kaj PVN. La Fos-familio de transkripcifaktoroj povas agi ĉe cikla AMP-responda elemento (CRE) ejoj [40]. Konsiderinda indico indikas ke ΔFosB povas funkcii kiel aŭ transskriba represoro aŭ aktiviganto [40], [41]. Gkvankam tiu CRH-geno havas CRE-ĉeftemon en sia reklamantosekvenco, oni povus proponi, ke FosB/ΔFosB amasiĝo en CRH-neŭronoj povas peri la morfin-induktitajn ŝanĝojn en CRH-niveloj, kiel raportite por kokainefikoj. [42], precipe en la CeA kaj la BNST, kie, por la unua fojo, ni raportis plibonigon en la nombro da CRH-pozitivaj neŭronoj dum morfina dependeco. Apogante tiun hipotezon, pliiĝo en CRH-mRNA-niveloj estis priskribita en la CeA post kronika dono de morfino. [43]. Tamen, la nombro da CRH-pozitivaj neŭronoj estis senŝanĝa en la PVN post kronika morfina terapio. Tiuj rezultoj estas laŭ antaŭaj trovoj montrantaj ke kronika morfinekspozicio ne stimulas ŝanĝojn en la PVN CRH hnRNA. [44]. Ĉar PVN CRH-esprimo estas malsupren-reguligita fare de GC [45], kaj donita tiun nunan verkon kaj aliajn [29], [44] montris, ke kronika opiaĵo-ekspozicio ne modifis kortikosterona liberigon, ŝajnas logike, ke kronika morfino-administrado ne ŝanĝis la nombron da CRH-ĉeloj.
Ekstercentra administrado de kortikosterono pliigas CRH-mRNA-esprimon en la CeA kaj BNST [46], [47]. Plie, ADX malpliigis CRH-esprimon en la CeA [48], [49]. Sekve, ni observis, ke la pliiĝo de la nombro da CRH-neŭronoj en la BNST kaj CeA dum morfina dependeco estis aboliciita post adrenalektomio. Konsiderante ke la pliiĝo de Fos/ΔFosB ene de CRH-neŭronoj dum morfina dependeco estis mildigita en ADX-bestoj, oni povus sugesti rolon por Fos/ΔFosB en la reguligo de CRH-esprimo de GC en la etendita amigdalo. Aliflanke, estas bone konata ke GC negative reguligas la esprimon de CRH-geno en la PVN. [45]. En konsento, nunaj datumoj klare montris, ke adrenalektomio abolis la pliiĝon de Fos/ΔFosB-IR en CRH-enhavantaj neŭronoj dum morfina dependeco en ĉi tiu kerno.
En ĉi tiu studo, imunokemiaj datumoj rivelis, ke kronika morfina traktado signife pliigis makuladon por Fos/ΔFosB en la NTS-A.2, kiu estis malpliigita sekvante ADX. Kiam ni ekzamenis la specifajn neŭrajn populaciojn, kiuj esprimis FosB/ΔFosB, ni trovis fortikan kreskon de Fos/ΔFosB-IR ene de TH (la imposto-limiga enzimo en katekolamina sintezo)-pozitivaj neŭronoj. NA pruviĝis ludi ĉefan rolon en toksomanio [50]. En antaŭa laboro, kronika morfina eksponiĝo elvokis plibonigon en TH-niveloj en la NTS-A2 [14], [29]. Estas konata ke TH-geno havas AP-1-ejon en sia reklamanto [51]. Niaj rezultoj povus sugesti, ke FosB/ΔFosB estas implikita en opiaĵ-induktita pliigo de TH-niveloj en la NTS-A.2. Cerbotrunko noradrenergic-ĉelgrupo esprimas altajn nivelojn de GC-receptoroj (GR). Estis montrite ke GC havas cedeman rolon en noradrenergia neŭrodissendo [29], [30], [52]. Sekve, administrado de GR-antagonistoj influis plurajn aspektojn de NA-agado, inkluzive de TH-aktivigo kaj neŭrona agado. [30]. Nunaj rezultoj montris ke, sekvante ADX, estis malkresko en TH-pozitivaj ĉeloj esprimantaj FosB/ΔFosB en la NTS-A.2. Konsiderite, ke adrenalektomio blokis la pliiĝon en TH-proteinniveloj en la NTS-A2 dum morfina dependeco [29], kaj ke GRE/AP-1-ejo estis priskribita en la TH-genreklamanto [53], niaj datumoj povus indiki ΔFosB kiel peranto en la efikoj de GC sur noradrenergia agado en la NTS-A.2 dum dependeco de opiaĵoj.
DYN estis postulita kiel ebla celgeno de ΔFosB [54], [55]. Niaj rezultoj montras, ke kronika morfinekspozicio ne signife ŝanĝis FosB/ΔFosB-esprimon ene de por-DYN-esprimantaj neŭronoj en la NAc (ŝelo.). Koncerne al ΔFosB-reguligo de DYN-esprimo, Zachariou et al [33] raportis malgrandan sed signifan malkreskon de DYN-mRNA-niveloj en la NAc de ΔFosB-troesprimantaj musoj, tiel postulante ke tiu transkripcifaktoro malhelpas DYN-esprimon. El niaj datumoj, oni ne povas konkludi, ke kronika morfino modifas DYN-esprimon per agado de FosB/ΔFosB, ĉar niaj rezultoj estis akiritaj ĉe la proteina nivelo.
Estis postulite ke DYN/kappa opioida sistemo ŝajnas indukti por-depresivajn-similajn ŝtatojn kiuj implikas elementojn de malemo. Tiu malema respondo povas impliki reciprokajn interagojn kun NAc, DA kaj la eksterhipotalama CRH-sistemo [35]. Tamen, malmulto estas konata ĉirkaŭ ebla GC-reguligo de DYN-esprimo en la NAc. Oni proponis, ke ΔFosB en la NAc, parte per la subpremo de DYN-esprimo, pliigas la sentemon al la rekompencaj efikoj de morfino kaj kokaino kaj kondukas al fortikeco al streso. [9], [33]. Niaj datumoj subtenas rolon por GC en reguligado de la pozitivaj plifortigaj efikoj de morfino peritaj de la mezokortikolimbic DA-sistemo, ĉar la nombro da FosB/ΔFosB/pro-DYN-pozitivaj neŭronoj malpliiĝas en la NAc de ADX-ratoj. Ĉi tiuj efikoj povus esti mediataj rekte de GR, kiuj ĉeestas tra la mezolimba rekompenca vojo, aŭ nerekte per CRH-projekcioj ekestantaj de la CeA kaj/aŭ la BNST al la VTA kaj NAc, kiuj estas subaktivigitaj dum morfina dependeco en ADX-ratoj.
Resume, ĉi tiu studo pruvas, ke GC estas kritike implikita en la amasiĝo de FosB/ΔFosB en la cerbaj stressistemoj post kronika morfina eksponiĝo, kio povus rezultigi daŭrajn ŝanĝojn de gen-esprimo en stres-rilataj areoj. La nunaj trovoj ankaŭ indikas, ke FosB / ΔFosB povas kontribui al la GC-dependaj ŝanĝoj sur cerba streĉa sistemo-plastikeco dum opiaĵdependeco. Pliaj studoj estas necesaj por determini la intraĉelajn mekanismojn per kiuj kronikaj opiaĵoj induktas FosB/ΔFosB en elektitaj stres-rilataj regionoj, same kiel la mekanismon kiu respondecas pri la subpremado de morfin-induktita FosB/ΔFosB-esprimo de GC.
metodoj
Materialoj
Kortikosterono kaj kolesterolo estis aĉetitaj de Sigma Chemical Co. (St Louis, MO, Usono). Peletoj de kortikosterono estis faritaj de d-ro Márton Vajna, (Fako de Apoteko-Administracio, Universitato de Apoteko, Universitato Semmelweis, Budapeŝto, Hungario). Pellets de morfina bazo (Alcaliber Laboratorioj, Madrido, Hispanio) aŭ laktozo (kontrolo) estis preparitaj en la Fako de Apoteko kaj Farmacia Teknologio (Lernejo de Apoteko, Granado, Hispanio). Pentobarbitalo estis aĉetita de Hospira (Hoofddorp, Nederlando). Ketamina klorhidrato kaj ksilazino estis aĉetitaj de Labs. Merial (Liono, Francio) kaj Labs. Calier (Barcelono, Hispanio), respektive.
bestoj
Masklaj Sprague-Dawley-ratoj (220–240 g komence de la eksperimento; Harlan, Barcelono, Hispanio) estis loĝigitaj en paroj en kaĝoj (longo, 45 cm; larĝo, 24 cm; alteco, 20 cm) ĉe alveno en ĉambro kun kontrolita temperaturo (22±2 °C) kaj humideco (50 H±10 %) kaj norma aliro al akvo; Harlan Interfauna Ibérica, Barcelono, Hispanio). Bestoj estis adaptitaj al norma 12 h lum-malluma ciklo (lumoj: 08 h 00 min –20 h 00 min) dum 7 tagoj antaŭ la komenco de la eksperimentoj. Ĉiuj kirurgiaj kaj eksperimentaj proceduroj estis faritaj laŭ la Directiva Konsilio de Eŭropaj Komunumoj de la 24-a de novembro 1986 (86/609/EEC), kaj estis aprobitaj de la lokaj Komitatoj por esploro pri bestoj (REGA ES300305440012). La studo estis aprobita de la bioetika komitato de la Universitato de Murcia (RD 1201/2005) kaj Ministerio de Ciencia kaj Teknologio (SAF/FEDER 2009-07178), Hispanio.
Adrenalectomio
Ratoj estis duflanke adrenalektomigitaj kaj kortikosterona buleto estis enplantita por certigi malaltajn sed stabilajn nivelojn de GC. [29]. Ratoj estis duflankaj adrenalektomigitaj (ADX) per dorsaliro sub 90 mg/kg ketamina klorhidrato kaj 8 mg/kg xylazin (ip) anestezo, kaj enplantitaj subkutane (sc) kun malrapide liberigaj kortikosteronaj buletoj ĉe kirurgio. La konsisto de steroidaj buletoj (25 mg kortikosterono plus 75 mg kolesterolo) estis elektita por disponigi stabilan kortikosteronkoncentriĝon egalrilatantan al ĉirkaŭdia nadiro ĝis 20 d post enplantado. [56]. ADX-ratoj kun kortikosterona anstataŭaĵo (ADX kaj plie kortikosterono) ne muntas defi-induktitan pliiĝon de plasmokortikosterono [56]. Post kirurgio, ADX kaj plie kortikosterona ratoj havis liberan elekton trinki izotonan salokon (0.9% NaCl) por anstataŭigi malplenigitan natrion sekundaran al la perdo de aldosterono pro adrenalektomio. Kontrolratoj estis submetitaj al la sama kirurgia proceduro (falsaĵo) sen adrena ekstermo. Sham kaj ADX plus kortikosterona ratoj estis permesitaj renormaliĝi post kirurgio dum 5 d antaŭ la morfindependa proceduro. Sukcesa duflanka adrenalektomio estis konfirmita per plasmokoncentriĝo de kortikosterono kaj ACTH kaj per postmortema ekzameno de la ADX-bestoj.
Drogo-Traktado kaj Eksperimenta Proceduro
Kvin tagojn post kirurgio, ratoj estis enplantitaj sc kun du 75 mg morfinaj buletoj sub malpeza etera anestezo. Kontrolratoj ricevis placebo-buletojn enhavantajn laktozon. Ĉi tiu proceduro pruviĝis produkti konsekvencajn plasmajn morfinkoncentriĝojn komenciĝantajn kelkajn horojn post la enplantado de la buletoj kaj plenan retirsindromon post akra injekto de opioidaj antagonistoj. [57]. Dependeco de morfino estas atingita 24 horojn post enplantado de buletoj kaj restis konstanta dum 15 tagoj. [58]. Dek tagojn post la enplantado de morfino aŭ placebo-buletoj, ratoj estis oferitaj. La kvar eksperimentaj kondiĉoj esploritaj por HPA-aksa agado (plasma koncentriĝo de kortikosterono kaj ACTH), FosB/ΔFosB-esprimo, CRH-esprimo, DYN-esprimo, TH-esprimo kaj FosB/ΔFosB-esprimo en CRH-, DYN- kaj TH-pozitivajn neŭronojn estis: (i) sham-placebo; (ii) ŝajn-morfino; (iii) ADX-placebo; (iv) ADX-morfino. La plipeziĝo de la ratoj estis kontrolita dum kuracado por certigi, ke la morfino liberiĝis ĝuste el la buletoj, ĉar oni scias, ke longdaŭra morfina traktado induktas malpliiĝon de korpa plipeziĝo kaŭzita de pli malalta kaloria konsumo. [29].
Cerba Perfuzo kaj Sekcio
Ratoj estis profunde anestezitaj kun superdozo de pentobarbitalo (100 mg/kg ip) kaj perfuzitaj transkarde kun salo sekvante per fiksaĵo enhavanta paraformaldehido (4% paraformaldehido en 0.1 M borata bufro, pH 9.5). Post forigo de la trapenetritaj cerboj, ili estis fiksitaj en la sama fiksilo dum 3 h kaj stokitaj je 4 °C en PBS enhavanta 10% sakarozon ĝis koronaj sekcioj (30-µm dikeco) estis tranĉitaj rostrokaŭde sur frosta mikrotomo (Leica, Nussloch, Germanio). La atlaso de Paxinos kaj Watson (2007) [59] kutimis identigi malsamajn cerbregionojn de ratoj: NAc (ŝelo), BNST, PVN, CeA kaj NTS-A2 (figuro 1). La sekcioj estis krioprotektitaj kaj stokitaj je −20 °C ĝis uzo.
FosB/ΔFosB Imunohistokemio
Sekcioj estis prilaboritaj por imunohistokemio kiel priskribite fare de Núñez et al [29]. Mallonge, post blokado kun 0.3% H2O2 kaj 2% normala kapra serumo (Sigma, Usono) histosekcioj estis kovataj en primara kontraŭ-FosB/ΔFosB antiserumo (kuniklo policlona, #sc-48, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, Usono; 1;![[proporcio]](http://www.ncbi.nlm.nih.gov/corehtml/pmc/pmcents/x2236.gif)
1000). La primara antikorpo uzata en ĉi tiu studo ne diskriminacias inter FosB kaj ĝia stabila splisa varianto ΔFosB. Ripeta eksponiĝo al FosB-induktantaj stimuloj pruviĝis malsensibiligi akutan FosB-indukteblecon [15], [40], [60]. Tial diferencoj inter FosB/ΔFosB-makulado en morfin-pretraktitaj kaj ne-antaŭtraktitaj ratoj povas esti interpretitaj kiel ĉefe reflektantaj diferencojn en ΔFosB-amasiĝo. Antigenoj estis bildigitaj per konvencia avidin-biotin-imunoperoksida protokolo (Vectastain ABC Elite Kit; Vector Laboratories, Burlingame, CA, Usono). 3,3′-diaminobenzidina tetrahidroclorido (DAB; Sigma, Usono) reago estis intensigita kun nikel-amonia sulfato. Sekcioj estis muntitaj sur krom-alumaj gelatin-tegitaj lumbildoj, senakvigitaj kaj kovritaj.
Duobla markado Imunohistokemio de FosB/ΔFosB-imunoreaktivaj Nukleoj kaj CRH-, TH- kaj DYN-pozitivaj Neŭronoj
Por duobla etikedado de FosB/ΔFosB-TH, histosekcioj de ĉiu rato en ĉiu traktada grupo estis prilaboritaj por imunoreaktiveco de FosB/ΔFosB uzante DAB-nikelan intensigon kaj tiam TH estis malkaŝita uzante DAB-kromogenon nur. FosB / ΔFosB imunokolorigo estis farita kiel priskribite antaŭe. Post la makulado de FosB/ΔFosB, sekcioj estis lavitaj en PBS, traktitaj per 2% normala kapra serumo kaj poste kovataj dum la nokto kun la kuniklopoliklona kontraŭ-TH-antikorpo (AB152, Chemicon, Usono; 1).6000) ĉe ĉambra temperaturo. La samaj imunohistokemiaj proceduroj priskribitaj supre estis sekvitaj. La TH-antikorp-peroksidaza komplekso estis evoluigita en DAB. La sekcioj estis muntitaj sur krom-alumajn gelatenajn tegitajn lumbildojn kaj kovris.
Por la duobla etikedado de FosB/ΔFosB-CRH kaj FosB/ΔFosB-pro-DYN, la procezo estis la sama kiel priskribita antaŭe por FosB/ΔFosB-TH. Por detekti DYN-esprimantajn neŭronojn en la NAc, proceduro de retrovo de antigenoj estis aplikata per kovado de cerbaj sekcioj en citrata bufro (10 mM Citra Acido, 0.05% Tween 20, pH 6.0) je 60 °C dum 20 minutoj antaŭ la blokado. La primara kontraŭ-CRH kuniklo-antiserumo estis afable disponigita fare de Wylie W. Vale (The Salk Institute, La Jolla, CA, Usono), kaj estis uzita ĉe 1500 diluo dum 72 h je 4 °C. La primara antikorpo por-DYN estis aĉetita de Neuromics (# GP10110, Neuromics, Edina, MN, Usono) kaj diluita 12000 (72 h, 4°C).
Bilda Analizo
Bildoj estis kaptitaj per Leica mikroskopo (DM 4000B; Leica) konektita al vidbenda kamerao (DFC290, Leica). FosB/ΔFosB-pozitivaj ĉelkernoj estis nombritaj per komputila bilda analizsistemo (QWIN, Leica). La limoj de la NTS-A2, BNST, CeA, NAc (ŝelo) kaj la parvoĉela subsekcio de la PVN estis skizitaj kaj la nombro da pozitivaj profiloj estis registrita. La nombro da atomprofiloj FosB/ΔFosB ene de la limoj de ĉelgrupoj de intereso estis nombrita duflanke en kvar ĝis kvin sekcioj de ĉiu rato kaj averaĝita por akiri ununuran valoron por ĉiu rato. Por eviti observanbiason, ĉiuj sekcioj estis kvantigitaj fare de blindigita enketisto. Totalaj kalkuloj por malsamaj cerbaj regionoj estas esprimitaj kiel meznombro ± SEM.
Kvantigo de TH-, CRH- kaj DYN-pozitivaj Ĉeloj kaj FosB/ΔFosB Duoblaj Makulitaj Profiloj
Pozitivaj nukleoj por FosB/ΔFosB imunoreaktiveco estis detektitaj uzante la saman konvencian lummikroskopion priskribitan supre, kaj kalkulitaj je x40 pligrandigo. FosB/ΔFosB-pozitivaj CRH, TH aŭ DYN-ĉeloj estis identigitaj kiel ĉeloj kun brunaj citosolaj kuŝejoj por CRH-pozitiva, TH-pozitiva kaj DYN-pozitiva makulado kaj blua/malhela nuklea makulado por FosB/ΔFosB. Kvadrata kampo (195 µm) estis supermetita al kaptita bildo por uzi kiel referencan areon. La nombro da duoble-etikeditaj neŭronoj observitaj duflanke estis nombrita en kvar ĝis kvin sekcioj de ĉiu besto en la PVN, BNST kaj CeA por CRH-neŭronoj, NTS por TH-neŭronoj kaj NAc por DYN-neŭronoj. La pozitivaj ĉeloj CRH, TH kaj DYN sen videbla kerno (FosB/ΔFosB-negativaj CRH, TH aŭ DYN-ĉeloj) ankaŭ estis inkluditaj en la analizo.
Radioimunoŝanĝo
Sango estis kolektita en glacimalvarmigitajn tubojn enhavantajn 5% EDTA kaj tiam estis centrifugata (500 g; 4°C; 15 min). Plasmo estis apartigita, dividita en du alikvotojn kaj stokita je −80 °C ĝis analizita por kortikosterono aŭ ACTH. Plasma koncentriĝo de kortikosterono kaj ACTH estis kvantigita uzante specifajn kortikosteronon kaj ACTH-antikorpojn por ratoj ([125mi]-CORT kaj [125I]-ACTH RIA; MP Biomedicals, Orangeburg, NY, Usono). La sentemo de la analizo estis 7.7 ng/mL por kortikosterono kaj 5.7 pg/mL por ACTH.
Statistika Analizo
Datumoj estas prezentitaj kiel meznombro ± SEM kaj estis analizitaj per la statistika pakaĵo GraphPad Prism (San-Diego, CA, Usono). Datumoj estis analizitaj per dudirekta analizo de varianco (ANOVA) kun traktado (placebo, morfino) kaj kirurgio (sham, ADX) kiel sendependaj variabloj. La Newman-Keuls post hoc testo estis uzata por individuaj grupaj komparoj. Diferencoj kun ap<0.05 estis konsideritaj signifaj.
Subtenanta Informon
Figuro S1
Efikoj de adrenalektomio (ADX) sur plasmaj ACTH (A) kaj kortikosterona (B) koncentriĝoj en kontroloj kaj en morfin-traktataj bestoj. Kirurgia ADX pliigis ACTH-nivelojn kaj en placebo- kaj en morfin-traktataj ratoj, dum malpliigis plasma kortikosterona koncentriĝo en morfin-traktataj ratoj. Datenoj reprezentas la meznombran ± SEM de plasmaj ACTH kaj kortikosterona niveloj en ratoj antaŭtraktitaj kun placebo aŭ morfino dum 10 tagoj. ***p<0.001 kontraŭ ŝajn-placebo; ++p<0.01, +++p<0.001 kontraŭ ŝajn-morfino.
(TIF)
Dankojn
Ni dankas al D-ro Márton Vajna kaj Anna Földes, de Semmelweis-Universitato (Budapeŝto, Hungario) pro preparado de kortikosterona buletoj.