(HUMANO) Kutimaj kaj Strukturaj Respondoj al Kronika Kokaino Postulas Nutraran Cirklon Envolvanta ΔFosB kaj Kalcian / Calmodulin-Dependan Proteinon Kinase II en la Nuklea Akumbens-Ŝelo (2013)

La transkripciebla faktoro BFosB kaj la cerba-riĉigita kalcio / calmodulina-dependa proteino kinaso II (CaMKIIα) estas induktitaj en la kerno accumbens (NAc) per kronika ekspozicio al kokaino aŭ aliaj psikostimulaj medikamentoj de misuzo, en kiuj la du proteinoj medias sensititajn respondojn. . Kvankam BFosB kaj CaMKIIα ambaŭ reguligas AMPA-glutamatan ricevilon esprimon kaj funkcion en NAc, dendrita spino-formado sur NAc-mezvundaj neŭronoj (MSNs), kaj lokomotora sentivigo al kokaino, ĝis nun oni rekte rekte ligis inter tiuj molekuloj. Ĉi tie, ni montras, ke ΔFosB estas fosforilita de CaMKIIα ĉe la proteina stabiliga Ser27 kaj ke CaMKII estas postulita por la kokain-mediaciita amasiĝo de ΔFosB en rato NAc.

Male, ni montras, ke ΔFosB estas ambaŭ necesa kaj sufiĉa por kokaina indukto de CaMKIIα gena esprimo en vivo, efiko selektema por D₁-tipaj MSN-oj en la subregiono de NAc-ŝelo.

Krome, indukto de dendritaj dornoj sur NAc-MSN kaj pliigita konduta reago al kokaino post NAc-troega esprimo de ΔFosB estas ambaŭ CaMKII-dependaj.

Gravas, ni montras por la unua tempo indukto de ΔFosB kaj CaMKII en la NAc de homaj kokainodependuloj, sugestante eblajn celojn por estonta terapema interveno. Ĉi tiuj datumoj establas ke BFosB kaj CaMKII okupiĝas pri ĉelo-speco kaj cerbo-regiono-specifa pozitiva furaĝo antaŭas, kiel ŝlosila mekanismo por reguligi la rekompenscirkvito de la cerbo en respondo al kronika kokaino.

Enkonduko

Pliigaj indicoj subtenas la vidpunkton, ke ŝanĝoj en gena esprimo kontribuas al mekanismoj de drogomanuo.Robison kaj Nestler, 2011). Unu grava mediaciisto de ĉi tiuj ŝanĝoj estas BFosB, Fos-familia transkripta faktoro (Nestler, 2008). Kronika administrado de preskaŭ ajna medikamentado de misuzo induktas longdaŭran amasiĝon de osFosB en nukleo accumbens (NAc), regiono líbica esenca por rekompencaj kondutoj. SUch-indukto prezentiĝas specifa al la klaso de NAc meza spina neŭrono (MSN) kiu esprimas D1-dopaminajn receptorojn. Induktebla troigita esprimo de FosB en ĉi tiuj MSC-tipo D1-NAc pliigas lokomotorajn kaj rekompencantajn respondojn al kokaino kaj morfino (Kelz et al., 1999; Zachariou et al., 2006), inkluzive de pliigita kokain-mem-administrado (Colby et al., 2003). Plie, genetika aŭ virusa blokado de reducesFosB-transcripta agado reduktas la rekompencajn efikojn de ĉi tiuj medikamentoj (Zachariou et al., 2006), indikante, ke ĉi tiu daŭra indukto de ΔFosB estas kritika mediaciisto de la daŭraj ŝanĝoj induktitaj en NAc de kronika drogo.

La nekutima stabileco de FosB (rilate al ĉiuj aliaj Fos-familiaj proteinoj) estas ambaŭ ena proprieto de la molekulo, pro la tranĉiĝo de degronaj domajnoj en tuta-longa FosB (Carle et al., 2007), kaj reguligita procezo. ΔFosB estas fosforilita en vitro kaj en vivo ĉe Ser27, kaj ĉi tiu reago plu stabiligas ΔFosB, ~ 10-obla, en ĉela kulturo kaj NAc en vivo (Ulery-Reynolds et al., 2009). Kvankam Ser27-Δ FosB pruvis esti substrato por kazeino kinazo-2 en vitro (Ulery et al., 2006), ĝia mekanismo de en vivo fosforilado restas nekonata.

Kalcio / calmodulin-dependa proteina kinaso II (CaMKII) estas tre-esprimita serino / treonin kinazo kies α kaj β-izoformoj formas dodecameric homo- kaj hetero-holoenzimoj en vivo, kaj estas esencaj por multoblaj formoj de neuroplasticeco (Lisman et al., 2002; Colbran kaj Brown, 2004). CaMKIIα estas induktita selekte en NAcŝelo per kronika anfetamino (Loweth et al., 2010), kaj farmakologia blokado de CaMKII-agado en NAc-ŝelo malaltigas kondutecan sensibiligon al anfetamino (Loweth et al., 2008) kaj kokaino (Pierce et al., 1998), dum viraŭsprimo de CaMKIIα en ĉi tiu NAc-subregiono plibonigas lokomotoran sentivigadon kaj memadministradon de anfetamino (Loweth et al., 2010). CaMKIIα povas influi rekompencajn kondutojn per modulado de AMPA-glutamat-receptoraj subunuoj (Pierce et al., 1998), ĉar CaMKIIα-agado delonge asociis kun AMPA-receptoro-funkcio kaj sinapta celado en pluraj formoj de neuroplasticeco (Malinow kaj Malenka, 2002).

Ĉi tiu literaturo montras plurajn paralelojn inter BFosB kaj CaMKII: ambaŭ estas necesaj kaj sufiĉaj por multoblaj kondutaj efikoj de drogoj de misuzo, ambaŭ superregas dendritajn spinojn en diversaj neuronaj ĉelaj tipoj. en vivo (Jourdain et al., 2003; Maze et al., 2010), kaj ambaŭ praktikas almenaŭ kelkajn el iliaj kondutaj efikoj per modulado de AMPA-receptoroj (Kelz et al., 1999; Malinow kaj Malenka, 2002; Vialou et al., 2010). Malgraŭ ĉi tiuj paraleloj, neniu funkcia ligo inter ΔFosB kaj CaMKII estas konata. Ĉi tie, ni establas reciprokan reguladon inter BFosB kaj CaMKII, kaj montras, ke la du proteinoj formas D1-specan MSN-specifan nutran antaŭan buklon en NAc-ŝelo, kiu estas induktita de kokaino kaj reguligas gamon de kokainaj respondoj. en vivo.

Iru al:

Materialoj kaj metodoj

Eksperimento 1: iTRAQ Proteomika Analizo de NAc-Ŝelo kaj Kerno Post Kokaina Traktado (Fig 1A)

Plenkreskaj (8-semajnoj) masklaj ratoj ricevis 20 mg / kg kokaino aŭ sala veturilo IP unufoje ĉiutage dum sep tagoj. 24 hr post la lasta injekto, NAcŝelo kaj kerno estis mikrodisektitaj (Fig 1A) kaj ekbruliĝis. iTRAQ-analizoj estis plenumitaj kiel antaŭe priskribita (Ross et al., 2004; Davalos et al., 2010).

figuro 1

Specifa ŝelo-indukto de CaMKII en NAc per kokaino

Eksperimento 2: Kvantumigado de Proteinaj Ŝanĝoj en Rata NAc-Kerno kaj Ŝelo Post Kokaina Traktado (Fig. 1B-D)

Plenkreskaj (8-semajnoj) masklaj ratoj estis donitaj 10 mg / kg kokaino aŭ sala veturilo IP unufoje tage dum sep tagoj en lokomotoraj registradaj ĉambroj. La respondoj de locomotor al sola injekto de kokaino (5 mg / kg IP) registris en tiuj bestoj traktitaj antaŭe kun kokaino (nomita "kronika") kaj parto de tiuj traktitaj kun salaj respondoj (nomitaj "akraj") kaj lokomotoroj al sala teorio. sola estis registrita en la ceteraj kronikaj sal-traktitaj bestoj (nomataj "salaj"). La lokomotoraj agadoj estis faritaj kiel priskribita (Hiroi et al., 1997). Mallonge, plenkreskaj viraj ratoj estis enmetitaj en malfermaj kampaj skatoloj de 18 ”× 24” PAS (San Diego Instruments) por 30-min-havaĵo, estis donitaj sola IP-injekto de salaj kaj kontrolitaj por plia 30-min, kaj ricevis sola IP-injekto de 5 mg / kg kokaino kaj kontrolata por 30 min.

Tuj post ĉi tiu fina injekto, ratoj estis senkapigitaj sen anestezo por eviti efikojn de anestezoj pri niveloj de neuronaj proteinoj kaj fosfostoj. La cerboj estis tranĉitaj en serio en matrico de 24 mm (Braintree Scientific) kaj la objektiva ŝtofo estis forigita en inhibidores de proteasa (Roche) kaj fosfatasa (Sigma Aldrich) fosilizado amortizita uzante truo de kalibro 1.2 por kerno NAc kaj truo de kalibro 14 de la resto. histo por NAcŝelo (Vidu Fig 1A) kaj tuj glaciigis sur seka glacio. Specimenoj estis homogenigitaj per malpeza sonikado en modifita RIPA bufro: 10-mM Tris-bazo, 150-m m-kloruro, 1-mM-EDTA, 0.1% -dodecil-sulfato, 1% Triton X-100, 1% -a natrio-desoksikolato, pH 7.4, proteasa kaj fosfatasa inhibidores kiel supre. Post aldono de Laemmli-bufro, proteinoj estis apartigitaj sur 4-15% poliacrilamaidaj gradeceloj (Criterion System, BioRad), kaj okcidenta makulo estis farita uzante la Odyssey-sistemon (Li-Cor) laŭ fabrikilaj protokoloj.

Eksperimento 3: Kvantumigado de Proteinaj Ŝanĝoj en Rata NAc-Kerno kaj Ŝelo Post Retiriĝo de Kokaino (Fig 1E)

Plenkreskaj (8-semajnoj) masklaj ratoj ricevis 10 mg / kg kokaino aŭ sala veturilo IP unufoje ĉiutage dum sep tagoj. 14 tagojn post la fina injekto, al bestoj traktitaj kun salaĵo ricevis alian salan injekton (nomita "salaĵo), kaj bestoj traktitaj kun kokaino ricevis alian salan injekton (nomita 14-taga retiro aŭ" 14d WD ") aŭ ununuran injekton de kokaino ( nomita "14d WD Chal" por defio). Unu horo post la fina injekto, bestoj estis senkapigitaj kaj okcidentaj obturiloj faritaj kiel en Eksperimento 2.

Eksperimento 4: Kvantumigado de Proteinaj Ŝanĝoj en Rata NAc-Kerno kaj Ŝelo Post Kokaina Mem-administrado (Fig. 2A-C)

Ratoj estis trejnitaj por mem-administri 0.5 mg / kg / infuzaĵo de kokaino en unu-sesaj sesioj sub fiksa proporcio 1-horaro dum naŭ tagoj. Post naŭ bazliniaj kunsidoj, la ratoj estis dividitaj en du grupojn ekvilibrigitaj per konsumado de kokaino dum la lastaj du sesioj. Unu grupo de ratoj estis permesita mem-administri kokainon (0.5 mg / kg / infuzaĵo) en unu-sesaj sesioj (mallonga aliro, ShA) dum la alia grupo de ratoj mem-administris kokainon en ses-hora sesioj (longa aliro, LgA ) dum dek pliaj tagoj (eskaladaj sesioj).

Cerbaj sekcioj estis prilaboritaj por imunohistoquímica kiel priskribita (Perrotti et al., 2004). Brains estis perfuzita 18-24 hr post la lasta ekspozicio al medikamento, rezultigante la degradadon de iu ajn longa longo FosB-proteino tiel ke ĉiu restanta imunoreateco reflektas ΔFosB. Ĉi tiu degenerado estis konfirmita per okcidenta ŝtopado, kiu montris neniun signifan makulon kun antikorpo direktita kontraŭ la C-finstacio de kompleta FosB kiu ne rekonas BFosB (datumoj ne montritaj). Post tranĉi en 35 µm-sekciojn, la nombro de ΔFosB-imunopozitivaj ĉeloj estis kvantigita de blindigita observanto en du sekcioj tra la NAc de ĉiu rato, kaj meznombraj valoroj per 40 × kampo tiam estis kalkulitaj per regiono por ĉiu besto. Ĉiu besto estis konsiderata individua observado por statistika analizo. Regionoj de intereso estis identigitaj per Paxinos kaj Watson (Paxinos kaj Watson, 2007).

Kvantorado de CaMKIIα-imunoreateco estis farita uzante Licor-sistemon kiel priskribita (Covington et al., 2009). Integritaj intensecoj de CaMKII kaj GAPDH estis determinitaj per Odyssey-programaro. Rezultoj estas prezentitaj kiel valoroj de intensa intenseco po mm² kaj estas prezentitaj kiel meznombro ± sem (n = 4-10 por grupo). Valoroj por GAPDH estis uzitaj kiel referenco por normaligi CaMKII-intensecon por tranĉaĵa dikeco kaj kondiĉoj.

figuro 2

Indukto de CaMKII en NAcŝelo de mem-administrantaj ratoj kaj homaj kokainodependuloj

Eksperimento 5: Kvantumigado de Proteinaj Niveloj en Koka-dependaj Homoj (Fig 2D)

proceduro

Postmortem homaj cerbaj ŝtofoj estis akiritaj de la Kebekia Memmortiga Brain-Banko (Douglas Mental Health University Institute, Montrealo, Kebekio, Kanado). La konservado de histo daŭris esence kiel priskribita (Quirion et al., 1987). Mallonge, post kiam eltirita, la cerbo estas metita sur malsekan glacion en Styrofoam-skatolo kaj rapidis al la kebekiaj servoj Suicide Brain Bank. Hemisferoj estas tuj apartigitaj per sagita kortego en la mezo de la cerbo, cerba tigo kaj cerebelo. Sangoj, pineala glando, koruso, plexuso, duono cerebelo, kaj duono cerba tigo estas kutime dissekcitaj de la maldekstra hemisfero, kiu poste estas tranĉita korase en 1 cm-dikaj tranĉaĵoj antaŭ frostiĝado. Ĉi-lasta duono cerebelo estas tranĉita sagittale en 1cm-dikajn tranĉaĵojn antaŭ frostiĝo. Ŝtofoj estas glaciigitaj en 2-metilbutano je −40 ° C por ~ 60 sek. Ĉiuj glaciitaj ŝtofoj estas tenataj aparte en molaj sakoj ĉe −80 ° C por longdaŭra stokado. Specifaj cerbregionoj estas dissekcitaj de glaciaj koronalaj tranĉaĵoj sur neoksidebla ŝtala telero kun seka glacio ĉirkaŭe por kontroli la temperaturon de la medio. Okcidenta makulo estis farita kiel priskribita en Eksperimento 2.

Kohorto

La kohorto estis kunmetita de 37-masklaj kaj 3 inaj subjektoj, kun aĝo inter 15-66-jaroj. Ĉiuj subjektoj mortis subite sen daŭrigita agonala ŝtato aŭ longedaŭra medicina malsano. Ĉiuokaze la kaŭzo de morto estis konstatita de la krimula oficejo de Kebekio, kaj toxicologia ekrano estis farita kun histoteknologioj por akiri informojn pri medikamento kaj kontraŭleĝa uzado de substanco dum morto. La subjektogrupo konsistis el 20-individuoj, kiuj plenumis la SCID-I-kriteriojn pri dependeca de kokaino. La kontrolgrupo konsistis el 20-subjektoj kun neniu historio de kokain dependeco kaj neniuj gravaj psikiatriaj diagnozoj. Ĉiuj subjektoj subite mortis pro kaŭzoj kiuj ne havis rektan influon sur cerba histo. Grupoj egalis meznombran aĝon de aĝo, malvarmiga malfruo kaj pH. Por ĉiuj subjektoj, psikologiaj nekropsioj estis faritaj kiel priskribita antaŭe (Dumais et al., 2005), ebligante al ni havi aliron al detalaj kazinformoj pri psikiatria kaj kuraca historio, kaj ankaŭ aliaj taŭgaj klinikaj kaj sociodemografiaj datumoj. Resume, trejnita intervjuisto kondukis la Strukturita Klinika Intervjuo por DSM-IV Psikiatriaj Malordoj (SCID-I) kun unu aŭ pli informantoj de la forpasinto. Panelo de klinikistoj reviziis SCID-I-taksojn, kazraportojn, notojn de medicinisto, kaj medicinajn registrojn por akiri interkonsentajn psikiatriajn diagnozojn.

Eksperimento 6: Kromatina Imunoprecipitación por Rata NAcFig. 3A-C)

Plenkreskaj (8-semajnoj) masklaj ratoj ricevis 10 mg / kg kokaino aŭ sala veturilo IP unufoje ĉiutage dum sep tagoj. XNUMHr post la lasta injekto, NAc-ŝelo kaj kerno estis mikrodisektitaj. Imunoprecipitación de Kromatino (ChIP) realigis kunigante punzonoj bilaterales de NAc de ŝelo aŭ kerno de sep ratoj por grupo en tutaj grupoj 24 (tuta de 14 bestoj, naĝejoj de kokaino 98, sala de akvo 7). Ŝtofoj estis krucigitaj, lavitaj kaj stokitaj ĉe −7 ° C ĝis kromatina tondado de sonikoj. Tegita kromatino estis kovata per nokto per antikorpoj antaŭe ligitaj al magnetaj bidoj (Dynabeads M-80, Invitrogen). Ne-imuna IgG estis uzata kiel kontrolo. Post inversa interligo kaj DNA-purigo, qPCR estis uzata por mezuri nivelojn de CaMKIIα-reklama DNA. Komenkoj estis desegnitaj por pligrandigi regionon enhavanta AP-280-interkonsenton sekvencon lokita ~ 1-bp antaŭ la transskriba komenco de la loko (Antaŭen: ACTGACTCAGGAAGAGGGATA; inversa: TGTGCTCCTCAGAATCCACAA).

figuro 3

Ĉela tipo- kaj regiono-specifa ΔFosB-indukto de CaMKIIα en vivo

Eksperimento 7: Mezurado de CaMKII-Transskribaĵo kaj Esprimo de Proteino kun Ĉelo-Specifaj xFosB-SuperkspresioFig 3D)

Masklaj bitransenaj musoj derivitaj de ĝi NSE-tTA (linio A) × TetOp-BfosB (linio 11) kaj NSE-tTA (linio B) × TetOp-FLAG-fosB (linio 11) musoj (Chen et al., 1998; Kelz et al., 1999; Werme et al., 2002; Zachariou et al., 2006) estis koncipitaj kaj kreskigitaj sur 100 µg / ml doxycycline por subpremi duringFosB-esprimon dum evoluo. Bat'oj estis dividitaj ĉe demetado: duono restis sur doksiciclino kaj duono estis ŝanĝitaj al akvo, kaj la bestoj estis uzataj 8 al 11 semajnojn poste kiam transkriba efikoj de BFosB estas maksimumaj (Kelz et al., 1999; McClung kaj Nestler, 2003). Por transkriba analizo, musoj rapide senkapigis, kaj cerboj estis forigitaj kaj metitaj sur glacion. Diseksoj de NAc estis prenitaj kun 14-mezurila nadla frapeto kaj rapide frostigita sur seka glacio ĝis RNA estis eltirita. La izolado de ARN, qPCR kaj analizo de datumoj estis faritaj kiel antaŭe priskribita (LaPlant et al., 2009). Mallonge, izolita RNA kun TriZol-reaga (Invitrogen), plue purigita per la RNAeasy mikrofono de Qiagen, kaj kontrolis kvaliton kun la Bioanalizilo de Agilent. Inversa transskribo estis farita per iScript (BioRad). qPCR estis plenumita per sistemo de PCR Applied Biosystems 7900HT RT kun la sekvaj ciklaj parametroj: 10 min je 95 ° C; 40-cikloj de 95 ° C por 1 min, 60 ° C por 30 sek, 72 ° C por 30 sek; gradigita hejtado al 95 ° C por generi distancajn kurbojn por konfirmo de unikaj PCR-produktoj. Immunohistochemical analizo de ΔFosB kaj CaMKIIα proteina esprimo estis elfarita kiel priskribita en Eksperimento 4.

Eksperimento 8: Efikoj de Intra-NAc D1 kaj D2-Dopaminaj Ricevilaj Antagonistoj en Kokao-Pruntedonitaj Proteinaj Ŝanĝoj (Fig. 3H)

Masklaj plenkreskuloj (8-semajnoj) ricevis 10 mg / kg kokaino aŭ sala veturilo ("veturilo" grupo) IP unufoje ĉiutage dum sep tagoj. 30 min antaŭ ĉiu kokaina injekto, ratoj estis IP administritaj aŭ la D1-receptoro antagonisto SCH 23390 (0.5 mg / kg, "D1 Ant" grupo), aŭ la D2 ricevilo antagonisto eticlopride (0.5 mg / kg, "D2 Formiko" grupo) , aŭ sala injekto (grupo "kokaino). NOMXO post la fina injekto, bestoj estis senkapigitaj kaj proteinoj kvantigitaj per okcidenta makulaĵo laŭ Eksperimento 2.

Eksperimento 9: Efikoj de AAV-mediada BFosB-Okspresigo sur Protein-EsprimoFig. 4 A-C)

Stereotaksa kirurgio okazis sur plenkreskaj viraj ratoj (8 semajnoj) por injekti AAV-GFP (verda fluoreska proteino) aŭ AAV-GFP-BFosB (Maze et al., 2010). La kalibraj de kalibraj 33 (Hamilton) uzis por ĉiuj kirurgioj, dum kiuj 0.5 µl de virus purificado de alta titolo estis infundita de formo bilateral en periodo de tempo 5 min, sekvita de plia periodo de ripozo de 5 min. Ĉiuj distancoj estas mezuritaj rilate al Bregma: 10 ° angulo, AP = + 1.7 mm, Lat = 2.5 mm, DV = −6.7 mm. 14 tagojn post kirurgio, al bestoj ricevis ununuran IP-injekton de 10 mg / kg kokaino en lokomotoraj observĉambroj por taksi la kondutajn efikojn de ΔFosB-troekspresado. Uste post tiu fina injekto, ratoj estis senkapigitaj laŭ Eksperimento 2, kaj histotipao estis farita sub fluoreskeca mikroskopa gvidado por akiri GFP-pozitivan NAc-histon. Okcidenta blotting tiam estis farita kiel per Eksperimento 2.

figuro 4

ΔFosB estas ambaŭ necesa kaj sufiĉa por kokain-mediaciita D1-receptoro-dependa CaMKIIα-indukto en NAc-ŝelo

Eksperimento 10: Efikoj de AAV-mediaciita ΔJunDekzemplera Troa sur Esprima Proteino Dependa De Kokaino (Fig. 4 D-F)

Stereotoksa injekto de AAV-GFP aŭ AAV-GFP-DJunD estis plenumita laŭ Eksperimento 8. NENIAM post tagoj post kirurgio, animaloj ricevis 14 mg / kg kokaino aŭ sala veturilo IP unufoje tage dum sep tagoj en lokomotoraj registradaj ĉambroj. Lokomotoraj respondoj al ununura injekto de kokaino (10 mg / kg IP) aŭ salaj estis registritaj. Huste post tiu fina injekto, ratoj estis senkapigitaj, ŝtofoj rikoltitaj, kaj okcidentaj miksaĵoj kiel Eksperimento 9.

Eksperimento 11: En Vitro Proteinaj kinazaj testojFig. 5A-D)

Recombinante CaMKIIα kaj ΔFosB estis purigitaj de insektaj ĉeloj (Brickey et al., 1990; Jorissen et al., 2007), kaj estis efektivigitaj testoj de proteina kinazoColbran, 1993), kiel antaŭe priskribite. Mallonge, CaMKII estis antaŭkuba sur glacio kun 2.5 µM ​​(aŭ indikita koncentriĝo) de ΔFosB, 1 mM Ca²⁺, 40 mM Mg²⁺, 15 µM ​​calmodulino, kaj 200 mM HEPES pH 7.5. Fosforilado estis komencita per aldono de 200 µM ​​ATP kun aŭ sen [γ-³²P] ATP kaj permesis procedi por 10 min ĉe ĉambra temperaturo (Fig 5A & B) aŭ 2 min sur glacio (Fig 5C & D). Produktoj estis solvitaj per okcidenta pasto.Fig 5A & B) aŭ per aŭtoradiogramo kaj scintila kalkulado (Fig. B-D).

figuro 5

BFosB estas potenca substrato por CaMKIIα

Eksperimento 12: Identigo de Ser27 ΔFosB-Fosforilado (Fig 5E)

In vitro provoj de kinazo estis faritaj kiel per Eksperimento 11, proteinoj estis apartigitaj per SDS-PAGE, kaj bandoj korespondantaj al ΔFosB estis tranĉitaj kaj submetitaj al tandema amasa spektrometrio. La m / z asignoj de la respondaj jonoj fragmentoj en ĉiuj paneloj estas markitaj supre de jonoj bekoj. Ne ĉiuj fragmentaj jonoj estas markitaj pro spacaj limoj. Enerale, la teksto por la fragmentaj jonaj etiketoj estas nigra koloro escepte kiam ili rekte konfirmas aŭ aldonas pruvojn al la ĉeesto de la fosforilaj lokoj de intereso, en kies kazo ili estas markitaj per ruĝa. Indico por produktoj de fragmentoj de kolumnoj estas prezentitaj en la sekvenca legado de la fosfopéptido kun la detektita loko de fosforila restaĵo indikita per ruĝa kun ununura aminoacida letero. La nombra priskribo de la observitaj fragmentaj jonoj ankaŭ estas markita sur la peptida vico kiel b kaj y jonoj. La zoom-faktoroj por la sekcioj de la m / z akso por montri la malpli intensan fragmentiĝon jonoj estas markitaj ĉe la supro de ĉiu fragran masaj spektroj. La fragmentaj jonoj montritaj en la panelo H konfirmas la ĉeeston de la isoformo fosforilita de Ser27, tamen, en miksaĵo de aliaj fosforilaj izoformoj ĉe lokoj Ser28, Ser31, Ser34 kaj Thr37. La ĉeesto de jonoj pa5, pa5-P, pb5 kaj pb5-P unike konfirmas la fosforiladon de la restaĵo Ser27.

Eksperimento 13: Kvantumo de Ser27-fosforilado (Fig. 5F)

Normaj peptidoj estis dizajnitaj imitante la fosfon kaj nefosfajn formojn de Ser27 ΔFosB. Post sintezo kaj purigo, ĉiu "peza" idiotipa peptido estis solvita en 50 / 50-acetonitrilo / akvo-bufro kaj sendata por analizo de aminoacidoj por determini absolutan koncentriĝon sur la sinteza peptida akcia solvo. Ĉiu peza peptido tiam estis rekte enmetita en la spektrometron de masoj 4000 QTRAP (MS) por determini la plej bonan kolisionan energion por fragmentado de MS / MS kaj du al kvar MRM-transiroj. Poste, la belaj "pezaj" peptidoj estis submetitaj al LCMS sur la 4000 QTRAP por certigi peptidan apartigon. La instrumento estis prilaborita per triobla kvarpupolo, kun Q1-a sur la specifa antaŭulo m / z-valoro (Q1 ne skananta), kaj Q3 agordas la specifan m / z valoron respondan al specifa fragmento de tiu peptido. En la MRM-reĝimo, serio de unuopaj reagoj (antaŭiraj / fragmentaj jonaj transiroj kie la kolisioprofundo estas agordita por optimumigi la intensecon de la fragmentaj jonoj de intereso) estis mezuritaj sinsekve, kaj la ciklo (kutime 1-2 sek) la tuta tempo de la HPLC-apartigo. MRM-transiroj estis determinitaj de la MS / MS-spektroj de la ekzistantaj peptidoj. Du transiroj por peptido, respondaj al alta intensa fragmento jonoj, estis tiam elektitaj kaj la kolizio energio optimumigita por maksimumigi signalan forton de MRM-transiroj uzante aŭtomatan softvaron. Punkoj rezultantaj el normaj peptidoj kaj ΔFosB-specimenoj eksponitaj al CaMKII aŭ kontrolo tiam estis komparitaj por determini la absolutan abundon de ĉiu peptida formo en la reago. Datumanalizo pri LC-MRM-datumoj estas farita uzante AB Multiplikan 1.1-programon.

Eksperimento 14: Indukto de ΔFosB en CaMKII-Orekspresiga MusojFig 5G & H)

Transgenaj musoj sobreexpresan T286D CaMKII (Mayford et al., 1996; Kourrich et al., 2012) kaj kompare kun naturaj specimenoj, kiam mankis doksiklinio por permesi transgenan esprimon. Plenkreskaj musoj estis administritaj de 20 mg / kg kokaino aŭ sala IP unufoje ĉiutage por 14-tagoj. XNUMHr post la fina injekto, bestoj estis senkapigitaj kaj imunohistoquímica kaj kvantoro de ΔFosB-esprimo estis faritaj kiel en Eksperimento 4.

Eksperimento 15: Efikoj de mediadero de VS-mediado de BFosB-troigado kaj CaMKII-inhibicio ĉe dornoj dendríticas de NAcFig. 6A-E)

Plenkreskaj viraj musoj (8 semajnoj) estis stereotakse injektitaj en NAc kun HSV-GFP, HSV-GFP-ΔFosBOlausson et al., 2006), HSV-GFPAC3I, aŭ HSV-GFPAC3I-ΔFosB. En ĉi tiuj konstruoj, AC3I, peptid-bazita inhibitoro de CaMKII-agado, estas kunfandita al la C-finajxo de GFP. GFPAC3I estis klonita per PCR uzante la pMM400-vektoron enhavanta GFPAC3I kiel ŝablono kun la jenaj manlibroj: GFP-AC3I-F: 5 'CC GCTAGC GCCGCCACC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT 3' (clampNheIKozakmet); GFP-AC3I-R: 5 'CC TCCGGA TTACAGGCAGTCCACGGCCT 3' (clampBspEIstop). La rezulta PCR-produkto estis enmetita en la vektorojn de p1005 + kaj p1005 + -Δ FosB uzante lokojn NheI kaj BspEI. La konstruo estis validigita per sekvencado. Stereotoksaj koordinatoj estis: 10 ° angulo, AP = + 1.6 mm, Lat = + 1.5 mm, DV = −4.4 mm (Barrot et al., 2002). Perfuzo kaj cerba dividado estis plenumitaj laŭ Eksperimento 4.

Spina analizo estis farita kiel priskribita (Christoffel et al., 2011). Mallonge, segmentoj dendríticos 50-150 µm for de la soma estis elektitaj hazarde el HSV-infektitaj ĉeloj, kiuj esprimas GFP. Bildoj estis akiritaj en konfokala LSM 710 (Carl Zeiss) por morfologia analizo uzante NeuronStudio kun la radia radia algoritmo. NeŭruronStudio klasifikas dornojn kiel maldikajn, fungojn, aŭ stumpecajn bazitajn sur la sekvaj valoroj: (1) aspekta proporcio, (2) kapo al kola rilato, kaj (3) kapa diametro. Dornoj kun kolo povas esti klasifikitaj kiel maldikaj aŭ fungoj, kaj tiuj sen signifa kolo estas klasifikitaj kiel stumpaj. Dornoj kun kolo estas markitaj kiel maldikaj aŭ fungoj bazitaj sur kapa diametro.

figuro 6

Blokado de CaMKII-agado malhelpas la morfologiajn kaj kondutajn efikojn de FosB en NAc

Eksperimento 16: Efikoj de mediadero de HSV-Superoperacio de FOSB xFosB kaj CaMKII-inhibicio ĉe respondoj al kokaino (Fig. 6F)

Plenkreskaj viraj musoj estis injektitaj kun virusoj laŭ Eksperimento 15, kaj lokomotoraj respondoj al ununura 5 mg / kg injekto de kokaino estis mezurita kiel per Eksperimento 9. Lokomotoraj datumoj estas esprimitaj kiel totala trapafado super 30 min post kokaina injekto.

Kromaj Informoj

Loĝejo pri Bestoj

Masklaj ratoj Sprague Dawley (250-275; Charles River Laboratories) estis loĝataj. Musoj de okdek semajnoj C57BL / 6J (La Laboratorio Jackson) estis loĝataj kun maksimumo de kvin bestoj por kaĝo. Ĉiuj bestoj estis kutimitaj al la bestan facilecon por ≥10 semajnoj antaŭ eksperimentaj manipuladoj kaj loĝigitaj en klimatkontrolitaj ĉambroj (1-23 ° C) en 25-hura lumo / mallumo-ciklo (lumoj ĉe 12: 7 AM) kun aliro al manĝaĵo kaj akvo ad libitum. Eksperimentoj estis faritaj laŭ gvidlinioj de la Societo por Neŭroscienco kaj la institucia komitato pri uzado de bestoj (IACUC) ĉe Monto Sinajo.

drogoj

Medikamentoj estis administritaj IP kaj dissolvitaj en sterila salo, inkluzive de kokaino (5-20 mg / kg por 10 µl por musoj, per 1 ml por ratoj, NIDA) kaj SCH 23390 aŭ eticloprido-kloriduro (0.5 mg / kg por 1 ml, Tocris) . Por stereotoksaj kirurgioj, musoj estis anestezitaj per "koktelo" de ketamino (100 mg / kg) kaj xilazino (10 mg / kg) (Henry Schein) en sterila salo.

Antikorpoj

CaMKIIα (totala): Upstate 05-532, 1: 5,000

CaMKII-phospho-Thr286: Promega V111A, 1: 1,000

BFosB (totala): Ĉela Signalo 5G4, 1: 250

BFosB phospho-Ser27: Phosphosolutions, 1: 500

GluA1 (totala): Abcam, Ab31232, 1: 1,000

GluA1 phospho-Ser831: Millipore N453, 1: 1,000

GluA1 phospho-Ser845: Chemicon Ab5849, 1: 2,000

GluA2: Millipore 07-598, 1: 2,000

NR2A: Sigma HPA004692, 1: 2,500

NR2B: Millipore Ab1557P, 1: 1,000

Statistikaj Analizo

Ĉiuj statistikaj analizoj estis faritaj uzante la programan pakon Prism 6 (GraphPad). Stud-t-testoj estis uzitaj por ĉiuj paraj saĝaj komparoj (indikitaj en Rezultoj kie t valoro estas donita), kaj unudirekte ANOVAoj estis uzitaj por ĉiuj multoblaj komparoj (indikitaj en rezultaj sekcio kie F valoro estas donita).

Iru al:

rezultoj

Kronika Kokaino Indukas CaMKII en la NAc-Ŝelo

Multaj studoj indikis, ke MSN-oj en la NAcŝelo havas malsamajn biokemiajn kaj fiziologiajn respondojn al kronika ekspozicio al medikamentoj de misuzo.Kourrich kaj Thomas, 2009; Loweth et al., 2010) kaj ke la du subregionoj regule diferencas kondutojn pri serĉado de drogoj (Ito et al., 2004). Determini la diferencajn efikojn de kokaino sur la proteinaĵoj de NAc-ŝelo vs. kerno, ni uzis multiplexed isobara etikedado (iTRAQ) kaj tandemo maso spektroskopio (MS / MS). Plenkreskaj viraj ratoj estis injektitaj IP kun kokaino (20 mg / kg) aŭ salaj ĉiutagaj por 7-tagoj; 24 hr post la lasta injekto, NAcŝelo kaj kerno estis mikrodisektitaj (Fig 1A) kaj ekbruliĝis. Proteinoj en ĉi tiuj specimenoj tiam estis kvantigitaj uzante iTRAQ. Ĉiuj kvar CaMKII-izoformoj montris grandajn pliiĝojn en esprimo post kokain-kuracado, kiuj estis specifaj al NAkŝelo kompare kun kerno. Pluraj proteinfosfatasoj, inkluzive de PP1-katalizaj kaj reguligaj subunuoj kaj PP2A, kiuj antaŭe estis asociitaj kun diversaj CaMKII-substratoj en aliaj sistemoj (Colbran, 2004), sekvis similan skemon. Ĉi tiuj rezultoj havigis novan senpartian pruvon, ke la signa irado de CaMKII estas elstare reguligita de kokaino en NAc specife laŭ konko.

Por validigi ĉi tiun trovon pli kvante, ni traktis ratojn kiel antaŭe kun kokaino (laŭ ŝanĝiĝantaj dozoj) aŭ salaj kaj mezuritaj respondoj de lokomotoro al kokaino (5 mg / kg) aŭ sala provo de dozo. Ripeta ekspono al 10 mg / kg kokaino rezultigis la tipan padronon de lokomotora sentivigo (Fig 1B). Pliaj studoj kun ĉi tiu dosiga reĝimo rivelis, per uzo de okcidenta ŝtopilo, ke ripetita kokaino induktas CaMKIIα elekte en NAcŝelo 24 hr post la fina injekto de kokaino (Fig. 1C kaj D; p = 0.0019; F = 7.943; df = 29). Krome, fosforilado de la kanona CaMKII-substrato Ser831 de la GluA1-subunuo de la AMPA-receptoro estis signife pliigita en NAc-ŝelo kaj ne kerno (p = 0.0261; F = 4.208; df = 28), dum CaMKIIα Thr286-autofosforilado havis fortan sed ne signifa tendenco al indukto en ŝelo nur (Fig 1D). Pluraj aliaj glutamataj receptoroj ne tuŝis. Kontraste al ĉi tiuj mezuroj de CaMKII, la samaj histoŝtonoj montris indukton de ΔFosB en ambaŭ konko (p = 0.0260; F = 4.189; df = 29) kaj kerno (p = 0.0350; F = 3.807; df = 29) de la NAc (Fig. 1C kaj D), kongrua kun antaŭaj trovoj (Perrotti et al., 2008).

Ĉar pluraj antaŭaj studoj de reguligo de kokaino de AMPA-riceviloj analizis bestojn post ~ 14-tagoj da forigo de kronika kokaino (vidu Diskuton), ni ripetis ĉi tiujn biokemiajn analitojn je ĉi tiu momento. Ni trovis, ke 14-tagojn post la fina injekto de kokaino, ΔFosB restas alta en NAc (p = 0.0288; F = 4.258; df = 22), dum nek CaMKII nek fosforilado de GluA1 Ser831 restas pliiĝintaj (Fig 1E). Tamen, 1 hr post ununura 10 mg / kg defias dozon da kokaino, niveloj de totala CaMKII (p = 0.0330; F = 3.947; df = 26) kaj de GluA1 Ser831 (p = 0.0213; F = 4.509; df = 27) Fosforilado estas ambaŭ levita al grado simila al tiu trovita post komenca kronika kokaino.Fig 1E). Ĉi tiuj datumoj indikas, ke NAcŝelaj neŭronoj estas preparitaj por CaMKII-indukto dum plilongigitaj periodoj de abstinado, eble per rekta formiĝo de la CaMKII-gena iniciatinto (vidu Diskuton). Plie, la fakto ke isFosB-indukto estas pli konstanta ol CaMKII-indukto sugestas la ekziston de aldonaj mekanismoj, ĉu kromatina-bazitaj aŭ alie, kiuj praktikas "bremson" sur CaMKII-regulado, kiel kovras en la Diskuto.

Por plifirmigi ĉi tiujn observojn, ni esploris modelojn de mem-administrado de kokaino, kiuj implikas volanan konsumadon de drogoj. Plenkreskaj viraj ratoj ricevis mallongan aŭ longan aliron al kokaino; kiel atendis (Ahmed kaj Koob, 1998), nur longaj aliraj kondiĉoj kaŭzis kreskantan mem-administradon de la medikamento (Fig 2A). ΔFosB estis induktita al pli granda amplekso de longa vs. mallonga aliro al kokaino en ambaŭ NAcŝelo (p = 0.0011; F = 11.12; df = 17) kaj kerno (p = 0.0004; F = 13.86; df = 17). En kontrasto, CaMKIIα estis induktita en NAc-ŝelo nur per longa aliro al kokaino (Fig. 2B kaj C; p = 0.0236; F = 4.957; df = 16). Estas interese kompari la averaĝan ĉiutagan konsumon de kokaino ĉe mallongaj aliraj animaloj (~ 12 mg / kg IV), long-aliraj animaloj (~ 70 mg / kg IV), kaj eksperimentaj bestoj (10 mg / kg), kaj demandu kial ĉi-lasta provokas fortan indukton de ΔFosB kaj CaMKII dum mallonga aliro ne faras. Ĉi tiu discrepancia estas probable pro diferencoj en la maksimumaj niveloj de kokaino (eksperimenta administrita kokaino ricevas kiel ununura bolo IP, dum mem-administrita kokaino estas liverata per multoblaj IV-dozoj), aŭ per diferencoj en longo de ekspozicio al 7. administrado, 19-tagoj por mem-administrado).

Malgraŭ la granda literaturo pri BFosB kaj CaMKII en kokaina agado, ekzistas neniuj studoj de ĉi tiuj proteinoj en homaj kokainaj uzantoj. Ĉi tie, ni prezentas la unuajn indicojn, ke niveloj de ambaŭ BFosB (p = 0.0316; t = 1.921; df = 34) kaj CaMKII (p = 0.0444; t = 1.755; df = 32) estas pliigitaj en NAc de dependaj de kokaino homoj (Fig 2D, tablo 1). Ĉi tiuj datumoj indikas, ke nia ekzameno de ΔFosB kaj CaMKII-indukto de kokaino en ronĝulo NAc estas klinike grava por homa kokaindependeco.

tablo 1

Karakterizado de specimenoj de homaj kokaindictuloj kaj egalaj kontrolaj grupoj

ΔFosB reguligas CaMKII-Transskribon Selective en D1-Tipaj MSN-oj de NAc-Ŝelo

La trovo ke ambaŭ CaMKII kaj ΔFosB estas superregataj de kokaino en la rodulo NAc kondukis nin determini ĉu ΔFosB povus reguligi transskribon de la CaMKII-geno. Ni antaŭe raportis CaMKIIα kiel ebla celo por ΔFosB en neatingebla mikroarray-analizo de NAc.McClung kaj Nestler, 2003), sed ĉi tiu trovo ne plu estis validigita en tiu studo. Ni unue uzis kvantan KIP (qChIP-ĈIP sekvita de kvanta PCR) por determini ĉu ΔFosB ligas al la geno CaMKIIα-reklamanto en NAc de plenkreskaj masklaj ratoj, kaj trovis rimarkinde, ke ĉi tiu ligo estas signife pliigita per kronika administracio de kokaino. p = 0.0133; t = 2.901; df = 12), sed ne la kerno, subregiono (Fig 3A). Por plue kompreni la mekanismojn ligitajn al ĉi tiu subregiona-specifa diferenco en ΔFosB-ligilo al la CaMKIIα-reklamanto, ni uzis qChIP por karakterizi la staton de histonaj modifoj ĉe ĉi tiu genoma regiono. Antaŭaj studoj montris kokokindon de H3-acetilado ĉe la CaMKIIα-reklamanto en totala musmuzina NAcWang et al., 2010). En kontrasto, ni trovis, ke kokaino malpliigas H3-acetiladon ĉe CaMKIIα-reklama selektema en NAc-kerno.Fig 3B; p = 0.0213; t = 2.726; df = 10), sen ŝanĝo en ŝelo, kongrua kun subregionaj specifaj kromatinaĵoj krom ΔFosB-ligado. qChIP por la subprema marko, dimethylated H3 lisin 9 (H3K9me2), rivelis tendencojn por malpliiĝo en kaj la konko kaj kernaj subregionoj (Fig 3C).

Determini ĉu ΔFosB reguligas CaMKIIα-transskribon en vivo, ni uzis du bitransenajn musliniojn, kiuj indukteble troigus FosB specife en D1 vs. MSN de tipo D2 en maniero kontrolita de administrado de doxiciclina en trinkebla akvo (Chen et al., 1998; Kelz et al., 1999; Werme et al., 2002). Plenkreskaj viraj musoj, kiuj sobreexpresan ΔFosB nur en D1-specaj MSNoj, signife pliigis nivelojn de CaMKIIα-mRNA en NAc (p = 0.0337; t = 1.996; df = 13), efiko ne vidata en musoj supereksprimanta ΔFosB ĉefe en D2-tipaj MSN.Fig 3D). La pliiĝo de CaMKIIα-mRNA, induktita per esprimo de ΔFosB en D1-tipaj MSN, akompanis akompananta pliiĝo de CaMKIIα-proteino en ambaŭ NAc-ŝelo (p = 0.0030; t = 3.578; df = 14) kaj kerno (p = 0.0392) = 2.275; df = 14; Figoj 3E kaj F). Ĉi tiuj datumoj montras, ke ΔFosB kapablas estigi genan esprimon de CaMKIIα en MSN de tipo D1 en ambaŭ subregionoj, kvankam Figuro 3B sugestas, ke mediataj kromataj ŝanĝoj en kokaino ĉe la reklamanto CaMKIIα (ekzemple reduktita acetilado) malhelpas ΔFosB superreguligi CaMKII en la kerna subregiono post kokaino.

Ĉar niaj transgenaj musaj datumoj indikis, ke ΔFosB-indukto de CaMKII-gena esprimo estas specifa al D1-tipaj MSN-oj en NAc, ni poste serĉis determini ĉu kokaino-dependa suprenreguligo de CaMKII postulas aktivigon de la receptoro de dopamina D1. Plenkreskaj viraj ratoj ricevis kronikan kokainon aŭ salo kiel antaŭe, sed 30 minutojn antaŭ ĉiu injekto, ratoj en la kokaina grupo ricevis IP-injekton de salo, la D1-antagonisto SCH 23390 (0.5 mg / kg), aŭ la D2-receptorantagonisto eticlopride (0.5 mg / kg). Bestoj estis analizitaj 24 horojn post la lasta injekto de kokaino. Okcidenta blotado malkaŝis, ke la antagonisto D1, sed ne la D2, tute blokis la pliiĝon per kokaino en ΔFosB (p <0.0001; F = 18.96; df = 18), kiel antaŭe raportite (Nye et al., 1995), same kiel en CaMKII (p = 0.0005; F = 10.99; df = 18; Fig. 3G kaj H). Ĉi tiuj datumoj subtenas la hipotezon, ke kokaino engaĝas ΔFosB-mediaciita pliiĝo de CaMKII-gena esprimo specife en D1-specaj MSNoj de NAcŝelo. En estontaj studoj estus grave montri rekte ĉi tiun specifan ĉelan efikon de kokaino sur CaMKII-esprimo ene de ĉi tiu cerba regiono.

BFosB estas ambaŭ Necesa kaj Sufiĉa por Kokaina Indukto de CaMKII en NAc Shell

Por kompletigi la uzon de bitransgeniaj musoj, ni poste studis la rolon de ΔFosB en mediacio de kokin-indukto de CaMKIIα per uzo de vir-mediaciita genetika transporto en ratoj. Ni bilateralmente injektas adeno-asociitajn virajn (AAV) partiklojn en NAcŝelon de plenkreskaj viraj ratoj (kie ŝeleto povas esti selekteme celataj) por sobreexpresar ΔFosB plus GFP aŭ GFP nur. La bestoj tiam ricevis ununuran IP-injekton de 10 mg / kg kokaino. La bestoj tro supertempa ΔFosB / GFP elmontris pliigitan lokomotoran respondon kompare kun bestoj tro troekspresantaj GFP sole (Fig 4A). Huste post la ununura injekto de kokaino, GFP-pozitiva NAc-histo estis ekstermita de ĉi tiuj bestoj per dissekcio sub fluoreska lumo. Okcidenta makulo de ĉi tiu histoFig. 4B kaj C) malkaŝis fortan troekspresadon de ovFosB kaj ankaŭ gravan pliiĝon de totala proteino CaMKIIα kompare kun GFP-bestoj (p = 0.0070; t = 2.894; df = 30), simila al la inducción vidita per kronika administracio de kokaino. Krome, CaMKIIα aŭtofosforilado ĉe Thr286 (indika de enzimaj aktivigoj) pliigis per troekspresado de ΔFosB (p = 0.0330; t = 2.243; df = 28), same kiel fosforilado de la CaMKII-substrato, Ser831 de GluA1 (p = 0.0540; t = 2.012; df = 28), denove imitante la agojn de kronika kokaino (Fig. 1C kaj D). Tkune, ĉi tiuj datumoj provizas pliajn pruvojn, ke la esprimo de BFosB en NAk-ŝelo sufiĉas por lokomotora sentivigo al kokaino kaj por CaMKII-indukto kaj aktivigo en ĉi tiu subregiono.

Ni uzis similan alproksimiĝon por determini ĉu ΔFosB ankaŭ estas necesa por kokain-mediaciita indukto de CaMKIIα en la NAc-ŝelo. AAV kutimis sobreexpresar senpintigita JunD-proteino, nomata ΔJunD, kiu estas negativa reguligilo de ΔFosB-transskribo-aktivigo (Winstanley et al., 2007) plus GFP aŭ GFP sole. Du semajnojn poste, kiam transgena esprimo estas maksimuma, bestoj ricevis kokainon (10 mg / kg) aŭ sala tagon por 7-tagoj, kaj testis lokomotorajn respondojn al koka-defio (5 mg / kg) 24 h post la lasta kronika injekto.Fig 4D). ΔJunDekzpresado malhelpis lokomotivan sentivigon al kokaino, kaj ankaŭ malhelpis CaMKIIα-indukton kaj aktivigon en NAcŝelo (Fig. 4E kaj F; p = 0.0437; F = 2.997; entute df = 38), indikante, ke ΔFosB-transcripta agado estas necesa por koksima-mediaciita indukto de CaMKIIα en ĉi tiu subregiono. Interese, ni trovis, ke DJunD reduktis nivelojn de ΔFosB sub salaj kaj kokainaj traktataj kondiĉoj (p = 0.0004; F = 8.110; df = 35), levante la novan eblon ke ΔFosB dependas de AP-1-agado por siaj propraj niveloj de esprimo.

CaMKII-Fosforilatoj ΔFosB ĉe Ser27

uzante en vitro Provoj de proteina kinazo, ni determinis, ke purigita ΔFosB estas fortika substrato por CaMKIIα. Inkubacio de Liaj₆-ΔFosB kun CaMKIIα kaj ATP kaŭzis suprenan ŝanĝon en elektroforeteca movebleco de ΔFosB (Fig 5A); la pluraj rezultaj bandoj sugestis plurajn lokojn de fosforilado. Simila en vitro provoj de kinazo uzante [γ-³²P] ATP montris enkondukon de radiotribuita fosfato en la movitajn (FosB-bandojn (Fig 5B), montrante rektan fosforiladon de la proteino. Ni generis fosfor-specifan antikoron al la antaŭe karakterizita Ser27 de ΔFosB (Ulery et al., 2006). Kvankam ĉi tiu antikorpo ne produktas signalon kontraŭ cerbaj eltiroj, kiuj enhavas N FosB (datumoj ne montritaj), Ser27, ni povis detekti Ser27-fosforiladon en la en vitro Kazaĵa analizo uzanta CaMKII (Fig 5B). Kinetikaj analizoj de la CaMKII-fosforilado de ΔFosB indikas, ke ĝi estas potenca substrato por la kinazo (Fig 5C), kun ŝajna K_M de 5.7 ± 2.0µM kaj K_CAT de 2.3 ± 0.3min^-1. Ĉi tiuj rezultoj estas kompareblaj al multaj bone karakterizitaj en vivo substratoj de CaMKII (Colbran kaj Brown, 2004). Aldone, ni determinis, ke CaMKII fosforiligas ΔFosB kun estequiometría de 2.27 ± 0.07 mol / mol (Fig 5D), indikante ke estas almenaŭ tri lokoj de CaMKII-fosforilado ene de la Lia₆-Δ FosB-proteino, en konsento kun Fig 5A.

Por esplori individuajn lokojn de fosforilado, ni uzis MS-analizon de specimenoj el nia en vitro analizo de kinazo. Fig 5E montras FosB-fosforiladon ĉe la antaŭe karakterizita Ser27 kaj ĉe pluraj aldonaj ejoj (datumoj ne montritaj). Donita la antaŭa funkcia karakterizado de Ser27, ni enfokusigis ĉi tiun lokon generante etikedajn sintezajn peptidojn imitantaj la fosfon kaj nefosfajn ŝtatojn de Ser27, tiam uzataj konataj kvantoj de ĉi tiuj peptidoj kiel normoj en MRM-analizo de ΔFosB antaŭ kaj post en vitro fosforilado de CaMKII. Posta kvantumado (Fig. 5F) konfirmas, ke Ser27 estas potenca substrato por CaMKII. Ĉi tiuj rezultoj indikas, ke inter multaj fosforilitaj restaĵoj ene de ΔFosB, Ser27 estas aparte efika substrato por CaMKII.

CaMKII Medias Konsumon de Kokaino de BFosB en la NAc-Ŝelo

Ĉar CaMKII povas fosforili ΔFosB en vitro ĉe ejo, kiu rimarkinde plibonigas ĝian stabilecon en vitro kaj en vivo (Ulery et al., 2006; Ulery-Reynolds et al., 2009), ni determinis ĉu CaMKII-agado kontrolas inFosB-nivelojn en NAc en vivo. Por trakti ĉi tiun demandon, ni unue uzis linion de muso tro-ekspresante sendependan mutacian kalcion de CaMKIIα (T286D) en pluraj cerbaj regionoj inkluzive de NAc (Mayford et al., 1996; Kourrich et al., 2012). Ni injektis plenkreskajn plenkreskajn virojn mutaciajn kaj sovaĝajn tipojn kun 20 mg / kg kokaino aŭ sala fojo ĉiutage por 14-tagoj, kaj poste analizis la bestojn unu tagon post la fina injekto. Ni trovis ke bazaj niveloj de FosB estis pliigitaj en la mutaciaj bestoj en NAc-ŝelo (p = 0.0001; F = 9.207; df = 37), sed ne kerno (Fig. 5G kaj H). Surprize, dependa indukto de kokaino de ΔFosB estis blokita en la mutaciaj bestoj en ambaŭ ŝelo kaj kerno, sugestante ke, kvankam CaMKII povas rekte reguligi BFosB-stabilecon en NAc-ŝelo, ĝi ankaŭ povas esti kontraŭflue de ΔFosB en kokain-aktivigitaj vojoj en ambaŭ NAc-regionoj. .

CaMKII-Aktivaĵo estas Bezonata por ΔFosB-mediaciita de Struktura kaj Konduta plasticeco

Kokaina indukto de dendritaj dornoj sur NAc-MSN-oj estas unu el la plej taŭgaj adaptiĝoj al ĉi tiu cerba regiono, establitaj de drogoj, kaj tiaj spina indukto estis rilata al sentivigitaj kondutaj respondoj al la drogo.Robinson kaj Kolb, 2004; Russo et al., 2010) kaj raportita esti selektema por D1-specaj MSNoj (Lee et al., 2006). Ni pruvis lastatempe ke kokaina indukto de dendritaj dornoj en NAc dependas de ΔFosB kaj ĝia laŭflua transskriba programo (Maze et al., 2010). Kvankam ekzistas ampleksa literaturo pri la implikiĝo de CaMKII en dendrita spina morfologio kaj indukto en aliaj cerbaj regionoj kaj eksperimentaj sistemoj (Jourdain et al., 2003; Penzes et al., 2008; Okamoto kaj aliaj, 2009), ĝia rolo en NAc MSN-spina formado ne estis studita. Tial, ni determinis ĉu CaMKII-agado estas bezonata por ΔFosB-mediaciita indukto de MSN dendrita dornoj uzante HSV-mediaciitan sobreespresion de la CaMKII-inhibitiva peptido AC3I kunfandita al GFP, konstruo antaŭe montrita malhelpi CaMKII-agadon en vivo (Zhang et al., 2005; Klug et al., 2012). Virusa troesprimo de ΔFosB en NAc-ŝelo de plenkreskaj musoj induktis signifan kreskon en MSN-dendrita spina denseco (p <0.0001; F = 8.558; df = 59; Fig. 6A kaj B) kiel antaŭe raportite (Maze et al., 2010), kaj ĉi tiu pliiĝo estis pelita ĉefe de maldikaj (p = 0.0027; F = 5.319; df = 59) kaj stumpaj (p = 0.0378; F = 2.988; df = 59) spino-tipoj (ambaŭ opiniis nematuraj dornoj) (Fig. 6C-E). Neniu efiko estis vidita sur pli maturaj spongoj en fungoj. Tamen, kiam GFP-AC3I estis kunekprimita, ΔFosB-indukto de dornoj estis tute nuligita (Fig. 6A-E), indikante ke CaMKII-agado necesas por ΔFosB-indukto de dendritaj dornoj en NAcŝelo.

Ni poste uzas la samajn viralajn ilojn por determini ĉu Aktiveco de CaMKII estas bezonata por efikoj de BFosB sur konduta sentemo al kokaino. Huste post la injekto viral en ŝelon NAk, bestoj ricevis ununuran injekton de 72 mg / kg kokaino kaj ilia lokomotora agado estis registrita. Kiel antaŭe montrite kun pli etendita AAV-troekspresado de ΔFosB (Fig 4A), Peranto de sobreexpresión de HSV de ΔFosB pliigis la sentivecon locomotora al la kokaino (p = 0.0002; F = 8.823; df = 37; Fig. 6F). Kiel kun indukto de dendritaj dornoj, inhibicio de CaMKII-agado per kunpresio de GFP-AC3I tute blokis la ΔFosB-mediaciitan kreskon de kokaina sentemo, indikante ke CaMKII-agado necesas por ΔFosB-induktitaj ŝanĝoj en la kondutaj efikoj de FosB.

Iru al:

diskuto

La nuna studo priskribas novajn antaŭenigajn meanismojn, kie kokaino induktas ΔFosB en NAc, kiu superreguligas transskribon de la CaMKIIα-geno selekteme en NAcŝelo.. CaMKIIα poste fosforiligas kaj stabiligas ΔFosB kondukante al pli granda ΔFosB-akumulado kaj al plia CaMKIIα-indukto.Fig. 6G). La ko-intensigaj niveloj de la du proteinoj dum kronika ekspozicio al kokaino tiam kontribuas esence al sentivigaj kondutaj respondoj al la drogo. Ĉi tio estas aparte alloga hipotezo, ĉar ambaŭ osFosB kaj CaMKII pruvis ĉiun postulon esti postulata por pliigi kondutajn respondojn al kokaino. (Pierce et al., 1998; Peakman et al., 2003), kaj ni reproduktas ĉi tiun trovon por ΔFosB en NAc-ŝelo specife uzante viralan alproksimiĝon (Figoj 4 kaj Kaj 66).

Kvankam transgena troekspresado en F-tipo D1 povas funkciigi CaMKII-indukton en ambaŭ NAkŝelo kaj kerno de kokain-naivaj bestoj, en la kunteksto de kokaino, amasiĝo de endogena BFosB, kiu okazas en ambaŭ subregionoj, pelas indukton de CaMKII specife en NAcŝelo. . Ĉi tiu diferenco povus rilati al la pli altaj niveloj de BFosB induktita en nia bitransgenika modelo, tamen, ĝi povus ankaŭ reflekti la kapablon de kokaino diferencie ŝanĝi la CaMKIIα-reklamanton en ŝelo. vs. kernaj MSN-oj por antaŭenigi ΔFosB-ligadon en la unua aŭ ekskludi ĝin en ĉi-lasta subregiono. Fakte niaj datumoj de ChIP, kiuj montras deacetilación de histonas mediada por kokaino en la iniciatinto de la geno CaMKIIα nur en la kerno de NAc, ili apogas la eblan tantiemon de mekanismo cromatina. En harmonio kun ĉi tiu hipotezo, ovFosB-troega esprimo en D1-speciĝaj MSN povis peli CaMKIIα-indukton en NAc-kerno en foresto de kokaino (Fig. 3F), sugestante ke ekzistas aktivaj modifoj de la CaMKIIα-reklamanto kiu malhelpas ĉi tiun indukton dum kronika kokain-ekspozicio. Regulado de la kromatena pejzaĝo ĉe la CaMKII-reklamanto ankaŭ povus klarigi kial CaMKII estas induktita per defia dozo de kokaino en NAc-ŝelo de kronikaj kokain-retiriĝantaj ratoj (Fig 1E) sed ne de drog-naivaj bestoj (Fig 1D). Ĉi tio povus reprezenti efekton de "geno primigenio" de eticFosB.Robison kaj Nestler, 2011), kaj eble tiel estos unu molekula mekanismo de la kovado de avido de kokaino (Pickens et al., 2011). Tamen, por ke ĉi tiu kromatina ŝanĝo kaŭziĝu ligita al kovado de avido, ĝi devus pliigi dum tempo. Estos interese determini ĉu ĉi tiu estas la kazo, kaj studi ĉu aliaj genoj montras ΔFosB-dependan, regionan-specifan reguladon per kokaino. Ankaŭ gravas noti, ke la buklo antaŭenirita ni priskribas ne kondukas al senfina amasiĝo de CaMKII aŭ ΔFosBFig 1E); malkovri la molekulan "bremson" respondecan de ĉi tio estas grava celo de estontaj studoj.

La konataj funkcioj de ΔFosB kaj CaMKII en pluraj eksperimentaj sistemoj kaj cerbaj regionoj konverĝas je multaj niveloj (Fig. 6F). Ambaŭ molekuloj estas intime ligitaj al dendrita spina kresko: CaMKII interagas kun la aktoritokseleto (Okamoto kaj aliaj, 2009), reguligas spino-grandeconMatsuzaki et al., 2004), kaj estas ambaŭ necesa kaj sufiĉa por pluvokvanto-induktita pliigoj en filopodo kaj sinapsoj nombro en hipocampo organotípica tranĉaĵaj kulturoj (Jourdain et al., 2003), wHile BFosB estas ambaŭ necesa kaj sufiĉa por kokain-induktita dendricia spino formado en NAc MSNs (Maze et al., 2010). Plie, ambaŭ molekuloj estis asociitaj kun regulado de AMPA-glutamataj receptoroj. CaMKII ne reguligas totalajn nivelojn de AMPA-receptoraj subunuoj, sed pelas la enmeton de AMPA-riceviloj en sinapsojn kaj pliigas AMPA-kanalan konduktecon per fosforilado de GluA1 ĉe Ser831 en hipokampaj piramidaj neŭronoj en kulturo kaj en vivo (reviziita en (Malinow kaj Malenka, 2002; Colbran kaj Brown, 2004)). Tia pli granda trafiko de GluA1 al la sinapsoj ankaŭ estis implikita en kronika kokaina agado (Boudreau kaj Lupo, 2005). Krome, kondutaj respondoj al AMPA-ricevila aktivigo en NAc estas plifortigitaj de kaŝa subpremo de CaMKIIα en D1 dopamina receptor-dependa maniero (Kantisto et al., 2010). Longtempa speco de D1-specifa troega esprimo de osFosB induktas GluA2-transskribon en NAc (Kelz et al., 1999), kiu amortizas AMPA-respondojn mediaciitaj per GluA1, dum ni montras ĉi tie ke pli mallonga daŭro BFosB-sur-esprimo - kaj ankaŭ pli mallongan tempon elkaŝa kokaino - ne efikas sur ĉi tiu subunuo (Fig 1). Tamen, ni trovis ĵus ke mallongdaŭra xFosB-sur-esprimado tamen malpliigas respondojn de AMPA en D1-specaj MSN-oj en NAc (Grueter et al., 2013). Ĉi tiuj datumoj sugestas temporalmente malsamaj mekanismoj kiu povus konstitui serion de tempo-dependaj de neuroadaptaciones al la kokaino kiu subyacen al malsamaj aspektoj de la progreso de la toksomanio ankoraŭ ne bone komprenita. Ĉe konduta nivelo, kaj CaMKII kaj ΔFosB estas bezonataj por lokomotora sentivigxo al kokaino (vidu supre), kaj ambaŭ estas bezonataj por daŭrigita kokainfabrikado en ronĝuloj (Colby et al., 2003; Wang et al., 2010), sugestante ke la du proteinoj estas gravaj por kaj mallongaj kaj longperspektivaj kondutaj adaptiĝoj al drogo-ekspozicio, kvankam per parte distingaj fundamentaj mekanismoj. Supozeble, ΔFosB kaj CaMKII reguligas tiajn kompleksajn kondutajn adaptiĝojn tra ŝanĝoj en NAc-sinapta funkcio, kvankam multe da plia laboro estas bezonata por rekte ligi sinapajn fenomenojn al kondutaj ŝanĝoj.

La Holoenzimo CaMKII samtempe interagas kun diversaj proteinoj asociitaj kun sinapsoj (Robison et al., 2005) kiuj supozeble reguligas ĝian celadon al la postsinapta denseco (PSD), fenomeno sugestita kiel grava por sinapta plasticeco. Aparte, la interago de CaMKII kun la GluN2B-subunuo de la NMDA-speca glutamata ricevilo lastatempe montris reguligi kaj sinaptan plasticecon kaj lernadon (Halt et al., 2012). Dum la peptida AC3I imitas la aŭtomatan domajnan areon de CaMKII, kaj tiel malhelpas enziman aktivecon, ĝi ankaŭ blokas multoblajn interagojn proteino-proteino (Strack et al., 2000; Robison et al., 2005). Tiel, la kondutaj kaj morfologiaj efikoj de HSV-GFP-AC3I raportitaj ĉi tie povus okazi per reduktita fosforilado de CaMKII-celproteinoj, ŝanĝoj en CaMKII-celado, aŭ ŝanĝo en la proponita struktura rolo de CaMKII ĉe sinapsoj (Lisman et al., 2002).

La limigo de la proponita buklo -FosB-CaMKII al la NAcŝelo estas speciala noto, ĉar lastatempa laboro montris plurajn fiziologiajn diferencojn inter la NAcŝelo kaj kerno responde al kokaina administrado, nocio konfirmita de niaj senantaŭjuĝaj datumoj iTRAQ (Tabelo S1). . MSN-oj en NAc-ŝelo montras depresion en pafadkapablo post kronika kokaino daŭranta de semajnoj, dum kernaj MSNoj de la samaj bestoj montras pasintan (1-3-tagon) pliiĝon en pafadkapacito, kiu revenas al bazaj niveloj ene de 2 semajnoj (Kourrich kaj Thomas, 2009). Krome, multaj sinaptaj proteinoj estas diference reguligitaj en NAcŝelo vs. kerno de bestoj eksponitaj al kronika kokaino, inkluzive de GluA2 (Knackstedt et al., 2010). Kiel kronika anfetamino instigas CaMKIIα specife en NAc-ŝelo (Loweth et al., 2010), ne estas surprize, ke ni trovas similan efikon kun kokaino. Tamen, kiel ΔFosB estas induktita en kaj la NAc-ŝelo kaj kerno de kronika kokaino (Perrotti et al., 2008), kaj ĉar ni montras, ke CaMKIIα-indukto en ŝelo dependas de BFosB, niaj trovoj provizas novajn pruvojn pri diversaj transskribaj mekanismoj ĉe la reklama CaMKIIα inter ĉi tiuj du subregionoj, kiuj respondecas pri la elektema indukto de CaMKIIα en ŝelo.

Multe da lastatempaj laboroj temigis delinigadon de diferencoj inter MSN-oj de D1- kaj D2-tipo. Kvankam ambaŭ D1 kaj D2-riceviloj estas implikitaj en la rekompencaj efikoj de kokaino (Mem, NENIU), Lastatempa laboro montras, ke optogenetika aktivigo de MSX de tipo D1 pliigas kondutajn respondojn al kokaino, dum aktivado de MSN D2-tipo havas la kontraŭan efikon (Lobo et al., 2010). Laŭ tiaj trovoj, muskoduloj D1-riceviloj mankas akirado de mem-administrado de kokaino.Caine et al., 2007), dum D2-forpunktoj ne estas (Caine et al., 2002). La administrado de D1-agonisto rekte en NAc deĉenigas konduton serĉantan kokainon en renovigaj paradigmoj (Mem, NENIU). Interese, ĉi tiu efiko postulas D1-ricevilon-dependajn pliiĝojn en CaMKII-agado en la NAcŝelo, sed ne kerno (Anderson et al., 2008), rezulto kiu konvenas bone kun la buklo D1- kaj ŝelo-specifa ΔFosB-CaMKII proponita ĉi tie.

Ni antaŭe raportis, ke Ser27 en ΔFosB povas esti fosforilita de kazeino kinazo-2 (Ulery et al., 2006), tamen, ni establas ĉi tie, ke CaMKII fosforiligas ΔFosB ĉe ĉi tiu kaj aliaj lokoj kun multe pli granda kinetiko kaj stoechiometrio kaj povas reprodukti la pli altan videblan M_r observita por FosB (Fig 5A) kun kokaino en vivo (Nestler, 2008). Ni jam scias, ke Ser27-fosforilado pliigas stabilecon de ΔFosB kaj transskriba agado (Ulery et al., 2006; Ulery kaj Nestler, 2007; Ulery-Reynolds et al., 2009). Estontaj laboroj nun fokusos sur la identigo kaj la funkciaj sekvoj de novaj lokoj de BFosB-fosforilado indikitaj de la nuna studo.

La buklo antaŭenirita priskribita ĉi tie provizas kredeblan novan meanismon, per kiu ripeta administrado de kokaino pelas progresajn anomaliojn en la NAc. Kiel tia, ĉi tiu biokemia vojo povas provizi gravan celon por estonta terapema interveno en dependaj malsanoj. Ĉar CaMKII estas ĉie kaj bezonas multajn bazajn neŭronajn kaj kondutajn funkciojn, rekta uzo de CaMKII-inhibitoroj estis evitita kiel toksomanioterapio. Niaj datumoj sugestas, ke pli subtila celado de la mekanismo de CaMKII-indukto, kiu estas specifa al individua ĉela tipo kaj subregiono de la cerbaj rekompensaj cirkvitoj, povus provizi terapian celon, kiu evitus la komplikaĵojn de sistema CaMKII-inhibicio.

Iru al:

Dankoj

Ĉi tiu laboro estis subtenita de subvencioj de la Nacia Instituto pri Drogusuzado (EJN), NIDA-Yale-Proteomika Centro DA018343 (AJR kaj EJN), kaj Hartwell Foundation (AJR). La aŭtoroj ŝatus danki Gabby Rundenko pro la malavara donaco de purigita BFosB kaj Roger Colbran por la malavara donaco de purigita CaMKIIα.

Iru al:

Referencoj

1. Ahmed SH, Koob GF. Transiro de modera al troa konsumado: ŝanĝo en hedona fiksita punkto. Scienco. 1998: 282: 298-300. [PubMed]
2. Anderson SM, Fama KR, Sadri-Vakili G, Kumaresan V, Schmidt HD, Baskazo CE, Terwilliger EF, Cha JH, Pierce RC. CaMKII: biokemio-ponto interliganta la sistemojn dopaminas kaj glutamatojn en serĉado de kokaino. Nat Neurosci. 2008: 11: 344-353. [PubMed]
3. Boudreau AC, Wolf ME. Konduteca sentemo al kokaino estas asociita kun pliigita AMPA-surfaca esprimo en la kerno accumbens. J Neurosci. 2005: 25: 9144-9151. [PubMed]
4. Brickey DA, Colbran RJ, Fong YL, Soderling TR. Esprimo kaj karakterizado de la alfa-subunuo de Ca2 + / kalmodulino-dependa proteina kinaso II uzante la baculovirusan esprimsistemon. Biochem Biophys Res Commun. 1990: 173: 578-584. [PubMed]
5. Caine SB, Negus SS, Mello NK, Patel S, Bristow L, Kulagowski J, Vallone D, Saiardi A, Borrelli E. Rolo de dopamina D2-similaj riceviloj en kokainfabrikado: studoj kun D2-receptoro mutaciaj musoj kaj nova D2-ricevilo antagonistoj. J Neurosci. 2002: 22: 2977-2988. [PubMed]
6. Caine SB, Thomsen M, Gabriel KI, Berkowitz JS, Oro LH, Koob GF, Tonegawa S, Zhang J, Xu M. Manko de mem-administrado de kokaino en dopamina D1-ricevilo knokaŭtaj musoj. J Neurosci. 2007: 27: 13140-13150. [PMC libera artikolo] [PubMed]
7. Carle TL, Ohnishi YN, Ohnishi YH, Alibhai EN, Wilkinson MB, Kumar A, Nestler EJ. Proteasome-dependaj kaj-sendependaj mekanismoj por FosB-malstabiligo: identigo de FosB-diakonaj domajnoj kaj implicoj por DeltaFosB-stabileco. Eur J Neurosci. 2007: 25: 3009-3019. [PubMed]
8. Chen J, Kelz MB, Zeng G, Sakai N, Steffen C, Shockett PE, Picciotto MR, Duman RS, Nestler EJ. Transgenaj bestoj kun induktebla, celata gen-esprimo en cerbo. Mol Pharmacol. 1998; 54: 495-503. [PubMed]
9. DJ Christoffel, Ora SA, Dumitriu D, Robison AJ, Janssen WG, Ahn HF, Krishnan V, Reyes CM, Han MH, Ables JL, Eisch AJ, Dietz DM, Ferguson D, Neve RL, Greengard P, Kim Y, Morrison JH , Russo SJ. IkappaB kazino reguligas socian malvenkon de sinstraj kaj kondutaj plastoj. J Neurosci. 2011: 31: 314-321. [PMC libera artikolo] [PubMed]
10. Colbran RJ. Inaktivigo de Ca2 + / calmodulin-dependa proteina kinazo II per baza aŭfosforilado. J Biol Chem. 1993: 268: 7163-7170. [PubMed]
11. Colbran RJ. Protein fosfatazo kaj kalcio / calmodulin-dependa proteina kinazo II-dependa sinapta plasticeco. J Neurosci. 2004: 24: 8404-8409. [PubMed]
12. Colbran RJ, Brown AM. Protein kinazo II de kalcio / calmodulin-dependa kaj sinapta plasticeco. Curr Opin Neurobiol. 2004: 14: 318-327. [PubMed]
13. Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW. Striatal ĉela specifa troega esprimo de DeltaFosB plibonigas instigon por kokaino. J Neurosci. 2003: 23: 2488-2493. [PubMed]
14. Covington HE, 3rd, Maze I, LaPlant QC, Vialou VF, Ohnishi YN, Berton O, Fass DM, Renthal W, Rush AJ, 3rd, Wu EY, Ghose S, Krishnan V, Russo SJ, Tamminga C, Haggarty SJ, Nestler EJ. Agoj antidepresivos de inhibidores de la histona desacetilasa. J Neurosci. 2009: 29: 11451-11460. [PMC libera artikolo] [PubMed]
15. Davalos A, Fernandez-Hernando C, Sowa G, Derakhshan B, Lin MI, Lee JY, Zhao H, Luo R, Colangelo C, Sessa WC. Kvanta proteomiko de caveolin-1-reguligitaj proteinoj: karakterizado de polimerazo i kaj transskribaĵa faktoro / CAVIN-1 EN endoteliaj ĉeloj. Mol Cell Proteomics. 2010: 9: 2109-2124. [PMC libera artikolo] [PubMed]
16. Dumais A, Lesage AD, Alda M, Rouleau G, Dumont M, Chawky N, Roy M, Mann JJ, Benkelfat C, Turecki G. Faktoroj pri risko por memmortigo en majora depresio: kazo-kontrolo de impulsemaj kaj agresemaj kondutoj en viroj. Am J Psikiatrio. 2005: 162: 2116-2124. [PubMed]
17. Grueter BA, Robison AJ, Neve RL, Nestler EJ, Malenka RC. BFosB diferencigas modulan kernon de rekta kaj nerekta vojo. Proc Natl Acad Sci Usono. 2013 en gazetaro. [PMC libera artikolo] [PubMed]
18. Halto AR, Dallapiazza RF, Zhou Kaj, Stein IS, Qian H, Juntti S, Wojcik S, Brose N, Silva AJ, Infero JW. CaMKII-ligado al GluN2B estas kritika dum memoro-firmiĝo. EMBO J. 2012; 31: 1203-1216. [PMC libera artikolo] [PubMed]
19. Hiroi N, Brown JR, Haile CN, Ye H, Greenberg ME, Nestler EJ. Mutantaj musoj FosB: perdo de kronika kokaina indukto de proteinoj rilataj al Fos kaj pliigita sentemo al psikomotoraj kaj rekompencaj efikoj de kokaino. Proc Natl Acad Sci Usono A. 1997; 94: 10397-10402. [PMC libera artikolo] [PubMed]
20. Ito R, Robbins TW, Everitt BJ. Diferenciala kontrolo de kokana-serĉanta konduto de kerno akumulas kernon kaj obuson. Nat Neurosci. 2004: 7: 389-397. [PubMed]
21. Jorissen HJ, Ulery PG, Henry L, Gourneni S, Nestler EJ, Rudenko G. Dimerizado kaj DNA-devigaj trajtoj de la transkripta faktoro DeltaFosB. Biokemio. 2007: 46: 8360-8372. [PubMed]
22. Jourdain P, Fukunaga K, Muller D. Kalcio / calmodulin-dependa proteina kinaso II kontribuas al aktivec-dependa filopodia kresko kaj spino-formado. J Neurosci. 2003: 23: 10645-10649. [PubMed]
23. Kelz MB, Chen J, Carlezon WA, Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann-AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, DJ Surmeier, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR, Nestler EJ. Esprimo de la transkripciebla deltaFosB en la cerbo kontrolas sentemon al kokaino. Naturo. 1999: 401: 272-276. [PubMed]
24. Klug JR, Mathur BN, Kash TL, Wang HD, Matthews RT, Robison AJ, Anderson ME, Deutch AY, Lovinger DM, Colbran RJ, Winder DG. Genetika Inhibicio de CaMKII en Dorsal Striatal Medium Spiny Neurons Reduktas Funkciajn Excitatory Sinapses kaj Enhances Intrinsic Excitability. PLoS Unu. 2012: 7: e45323. [PMC libera artikolo] [PubMed]
25. Knackstedt LA, Moussawi K, Lalumiere R, Schwendt M, Klugmann M, Kalivas PW. Formskulado de formorto post memmastrumado de kokaino instigas glutamaterigan plasticecon deteni kokanan serĉadon. J Neurosci. 2010: 30: 7984-7992. [PMC libera artikolo] [PubMed]
26. Kourrich S, Thomas MJ. Similaj neŭronoj, kontraŭaj adaptiĝoj: psikosimulanta sperto ŝanĝas diference la pafadajn trajtojn en akcumbenaj kerno kontraŭ obusoj. J Neurosci. 2009: 29: 12275-12283. [PMC libera artikolo] [PubMed]
27. Kourrich S, Klug JR, Mayford M, Thomas MJ. AMPAR-Sendependa Efiko de Striatal alphaCaMKII Antaŭenigas la Sentimigon de Kokaina Rekompenco. J Neurosci. 2012: 32: 6578-6586. [PMC libera artikolo] [PubMed]
28. LaPlant Q, Chakravarty S, Vialou V, Mukherjee S, Koo JW, Kalahasti G, Bradbury KR, Taylor SV, Maze I, Kumar A, Graham A, Birnbaum SG, Krishnan V, Truong HT, Neve RL, Nestler EJ, Russo SJ . Rolo de nuklea faktoro kappaB en ovara hormone-mediada streĉiteco-hipersensibileco en inaj musoj. Biol Psikiatrio. 2009: 65: 874-880. [PMC libera artikolo] [PubMed]
29. Lee KW, Kim Y, Kim AM, Helmin K, Nairn AC, Greengard P. Formado dendrítica de kolumno vertebral induktita de la kokaino en D1 kaj D2 kiu enhavas mezajn ricevilojn de dopaminas en kancero. Proc Natl Acad Sci Usono A. 2006; 103: 3399-3404. [PMC libera artikolo] [PubMed]
30. Lisman J, Schulman H, Cline H. La molekula bazo de CaMKII-funkcio en sinapta kaj konduta memoro. Nat Rev Neurosci. 2002: 3: 175-190. [PubMed]
31. Lobo MK, Covington HE, 3rd, Chaudhury D, Friedman AK, Sun H, Damez-Werno D, Dietz DM, Zaman S, Koo JW, Kennedy PJ, Mouzon E, Mogri M, Neve RL, Deisseroth K, Han MH, Nestler EJ. Ĉel-specifa perdo de BDNF-signalado imitas optogenetikan kontrolon de kokainkompenso. Scienco. 2010: 330: 385-390. [PMC libera artikolo] [PubMed]
32. Loweth JA, Baker LK, Guptaa T, Guillory AM, Vezina P. Inhibicio de CaMKII en la kerno accumbens ŝelo malpliiĝas plibonigita anfetamino en ratoj sentivigitaj. Neurosci Lett. 2008: 444: 157-160. [PMC libera artikolo] [PubMed]
33. JA Loweth, Kantisto BF, Baker LK, Wilke G, Inamino H, Bubula N, Aleksandro JK, Carlezon WA, Jr, Neve RL, Vezina P. Transiga troekspresado de alfa-Ca2 + / calmodulin-dependa proteina kinaso II en la kerno accumbens plibonigas konduteman respondon al anfetamino. J Neurosci. 2010: 30: 939-949. [PMC libera artikolo] [PubMed]
34. Malinow R, Malenka RC. AMPA-ricevilnomilado kaj sinapta plasticeco. Annu Rev Neurosci. 2002: 25: 103-126. [PubMed]
35. Matsuzaki M, Honkura N, Ellis-Davies GC, Kasai H. Struktura bazo de longdaŭra potencigo en ununuraj dendritaj dornoj. Naturo. 2004: 429: 761-766. [PubMed]
36. Mayford M, Bach ME, Huang YY, Wang L, Hawkins RD, Kandel ER. Kontrolo de memoro-formado per reguligita esprimo de CaMKII-transgeno. Scienco. 1996: 274: 1678-1683. [PubMed]
37. Maze I, Covington HE, 3rd, DM Dietz, LaPlant Q, Renthal W, Russo SJ, Mekanika M, Mouzon E, Neve RL, Haggarty SJ, Ren Y, Sampath SC, Hurd YL, Greengard P, Tarakhovsky A, Schaefer A, Nestler EJ. Esenca rolo de la histona metiltransferase G9a en kokain-induktita plasticeco. Scienco. 2010: 327: 213-216. [PMC libera artikolo] [PubMed]
38. McClung CA, Nestler EJ. Reguligo de gen-esprimo kaj kokaino rekompencas de CREB kaj DeltaFosB. Nat Neurosci. 2003; 6: 1208-1215. [PubMed]
39. Nestler EJ. Revizio. Transkripciaj mekanismoj de dependeco: rolo de DeltaFosB. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2008: 363: 3245-3255. [PMC libera artikolo] [PubMed]
40. Nye HE, Hope BT, Kelz MB, Iadarola M, Nestler EJ. Farmakologiaj studoj pri reguligo de indukta antigena indukto per kokaino en striato kaj kerno accumbens. J Pharmacol Exp. 1995: 275: 1671-1680. [PubMed]
41. Okamoto K, Bosch M, Hayashi Y. La roloj de CaMKII kaj F-actino en la struktura plasticeco de dendritaj dornoj: potenciala molekula identeco de sinapta etikedo? Fiziologio (Bethesda) 2009; 24: 357-366. [PubMed]
42. Olausson P, Jentsch JD, Tronson N, Neve RL, Nestler EJ, Taylor JR. DeltaFosB en la kerno accumbens reguligas manĝ-plifortigitan instrumentan konduton kaj instigon. J Neurosci. 2006: 26: 9196-9204. [PubMed]
43. Paxinos G, Watson C. La rato cerbo en stereotoksaj koordinatoj. 6th Eldono. Amsterdamo; Boston: Akademia Gazetaro / Elsevier; 2007.
44. Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, Chao J, Duman C, Steffen C, Monteggia L, Allen MR, Stock JL, Duman RS, McNeish JD, Barrot M, Self DW, Nestler EJ , Schaeffer E. Induktebla, cerba region-specifa esprimo de superreganta negativa mutanto de c-Jun en transgenaj musoj malpliigas sentemon al kokaino. Brain Res. 2003: 970: 73-86. [PubMed]
45. Penzes P, Cahill ME, Jones KA, Srivastava DP. Konvertaj signaloj de CaMK kaj RacGEF kontrolas strukturon kaj funkcion dendríticos. Tendencoj Ĉelo Biol. 2008: 18: 405-413. [PubMed]
46. Perrotti LI, Hadeishi Y, Ulery PG, Barrot M, Monteggia L, Duman RS, Nestler EJ. Indukto de deltaFosB en rekompencaj cerbaj strukturoj post kronika streso. J Neurosci. 2004: 24: 10594-10602. [PubMed]
47. Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Mazeo I, Yazdani S, Elmore RG, Knapp DJ, Selley DE, Martin BR, Sim-Selley L, Bachtell RK, Self DW, Nestler EJ. Distingaj ŝablonoj de DeltaFosB-indukto en cerbo per drogoj de misuzo. Sinapso. 2008; 62: 358-369. [PMC libera artikolo] [PubMed]
48. Pickens CL, Airavaara M, Theberge F, Fanous S, Hope BT, Shaham Y. Neŭrobiologio de la kovado de drogovorto. Tendencoj Neurosci. 2011: 34: 411-420. [PMC libera artikolo] [PubMed]
49. Pierce RC, Rapida EA, Reeder DC, Morgan ZR, Kalivas PW. Duaj senditoj de kalciaj mediaciuloj modulas la esprimon de konduteca sentemo al kokaino. J Pharmacol Exp. 1998: 286: 1171-1176. [PubMed]
50. Quirion R, Robitaille Y, Martial J, Chabot JG, Lemoine P, Pilapil C, Dalpe M. Homa cerbo-receptoro autoradiografio uzante tutajn hemisferajn sekciojn: ĝenerala metodo kiu minimumigas histotekojn. Sinapsoj. 1987: 1: 446-454. [PubMed]
51. Robinson TE, Kolb B. Struktura plastiko asociita kun ekspozicio al medikamentoj de misuzo. Neŭrofarmakologio. 2004; 47 (Suppl 1): 33-46. [PubMed]
52. Robison AJ, Nestler EJ. Transkriptaj kaj epigenetaj mekanismoj de dependeco. Nat Rev Neurosci. 2011: 12: 623-637. [PMC libera artikolo] [PubMed]
53. Robison AJ, Baza MA, Jiao Y, MacMillan LB, Carmody LC, Bartlett RK, Colbran RJ. Multivalentaj interagoj de kalcina / calmodulina-dependa proteina kinaso II kun la postsinaptaj densecaj proteinoj NR2B, densin-180 kaj alfa-actinin-2. J Biol Chem. 2005: 280: 35329-35336. [PubMed]
54. Ross PL, Huang YN, Marchese JN, Williamson B, Parker K, Hattan S, Khainovski N, Pillai S, Dey S, Daniels S, Purkayastha S, Juhasz P, Martin S, Bartlet-Jones M, He F, Jacobson A, Pappin DJ. Multiplexed protein quantitation en Saccharomyces cerevisiae uzanta amin-reaktivan isobaric-markanta reactivos. Mol Cell Proteomics. 2004: 3: 1154-1169. [PubMed]
55. Russo SJ, Dietz-D, Dumitriu D, Morrison JH, Malenka RC, Nestler EJ. La dependigita sinapso: mekanismoj de sinapta kaj struktura plasticeco en kerno accumbens. Tendencoj Neurosci. 2010: 33: 267-276. [PMC libera artikolo] [PubMed]
56. Mem DW. En: La Receptores de Dopamina. Neve KA, redaktoro. Novjorko: Humana Press; 2010. pp. 479-524.
57. Kantisto BF, Loweth JA, Neve RL, Vezina P. Transira transvi-vireca pliiĝeksprimo de alfa-kalcia / calmodulin-dependa proteina kinazo II en la kerno accumbens ŝelo kaŭzas longdaŭran funkcian superregadon de alfa-amino-3-hidroxil-5 Riceviloj de metil-4-isoxazol-propionato: dependeco de dopamina-tipo-1-ricevilo kaj proteina kinaso. Eur J Neurosci. 2010: 31: 1243-1251. [PMC libera artikolo] [PubMed]
58. Strack S, McNeill RB, Colbran RJ. Mekanismo kaj regulado de kalcina / calmodulina-dependa proteina kinazo II celanta al la NR2B-subunuo de la N-metil-D-aspartato-ricevilo. J Biol Chem. 2000: 275: 23798-23806. [PubMed]
59. Ulery-Reynolds PG, Kastelo MA, Vialou V, Russo SJ, Nestler EJ. Fosforilado de DeltaFosB peras sian stabilecon en vivo. Neŭroscienco. 2009: 158: 369-372. [PMC libera artikolo] [PubMed]
60. Ulery PG, Nestler EJ. Reguligo de DeltaFosB-transskriba agado per Ser27-fosforilado. Eur J Neurosci. 2007; 25: 224-230. [PubMed]
61. Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ. Reguligo de stabileco de DeltaFosB per fosforilado. J Neurosci. 2006: 26: 5131-5142. [PubMed]
62. Vialou V, et al. DeltaFosB en certaj rekompensaj cirkvitoj peras resilancon al streso kaj antidepresiaj respondoj. Nat Neurosci. 2010: 13: 745-752. [PMC libera artikolo] [PubMed]
63. Wang L, Lv Z, Hu Z, Sheng J, Hui B, Suno J, Ma L. Kronika koka-induktita H3-acetilado kaj transskriba aktivigo de CaMKIIalpha en la kerno accumbens estas kritika por instigo de medikamenta plifortigo. Neuropsikofarmacologio. 2010: 35: 913-928. [PMC libera artikolo] [PubMed]
64. Werme M, Messer C, Olson L, Gilden L, Thoren P, Nestler EJ, Brene S. Delta FosB reguligas radojn. J Neurosci. 2002: 22: 8133-8138. [PubMed]
65. Winstanley-CA, LaPlant Q, Theobald DE, Verda TA, Bachtell RK, Perrotti LI, DiLeone RJ, Russo SJ, Garth WJ, Mem-DW, Nestler EJ. La inducción por DeltaFosB en la ŝelo orbitofrontal medias la toleron al la disfunción cognitiva induktita de kokaino. J Neurosci. 2007: 27: 10497-10507. [PubMed]
66. Zachariou V, Bolanos-CA, Selley-DE, Theobald D, MP de Cassidy, Kelz MB, Shaw-Lutchman T, Berton O, Sim-Selley LJ, Dileone RJ, Kumar A, Nestler EJ. Esenca rolo por DeltaFosB en la kerno accumbens en morfina ago. Nat Neurosci. 2006: 9: 205-211. [PubMed]
67. Zhang R, Khoo MS, Wu Y, Yang Y, Grueter CE, Ni G, Prezo EE, Jr, Thiel W, Guatimosim S, Kanto LS, Madu EC, Shah AN, Vishnivetskaya TA, Atkinson JB, Gurevich VV, Salama G, Lederer WJ, Colbran RJ, Anderson ME. La inhibo de Calmodulin kinase II protektas kontraŭ strukturaj kormalsano. Nat Med. 2005: 11: 409-417. [PubMed]