PSMC5, 19S Proteasomal ATPase, Regulas Kokainan Ago en la Kerno-Akuma (2015)

PLOJ Unu. 2015 majo 11; 10 (5): e0126710. doi: 10.1371 / journal.pone.0126710. eCollection 2015.

Ohnishi JH1, Ohnishi YN2, Nakamura T3, Ohno M4, Kennedy PJ5, Yasuyuki O6, Nishi Al7, Neve R8, Tsuzuki T4, Nestler EJ5.

abstrakta

ΔFosB estas stabila transskriba faktoro, kiu amasiĝas en la kerno accumbens (NAc), ŝlosila parto de la rekompencaj cirkvitoj de la cerbo, responde al kronika ekspozicio al kokaino aŭ aliaj drogoj de misuzo. Dum ΔFosB estas konata heterodimerigi kun Jun-familio por formi aktivan faktoron de transskriba komplekso, ĝis nun ne estis malferma esplorado de aliaj eblaj ligaj partneroj por ΔFosB en la cerbo. Ĉi tie, per uzo de gistaj du-hibridaj provoj, ni identigas PSMC5-ankaŭ konatan kiel SUG1, ATPase-entenanta subunuo de la 19S-proteasoma komplekso-kiel nova interaga proteino kun ΔFosB. Ni kontrolas tiajn interagojn inter endogena osFosB kaj PSMC5 en la NAc kaj montras, ke ambaŭ proteinoj ankaŭ formas kompleksojn kun aliaj kromatinaj reguligaj proteinoj asociitaj kun gena aktivigo. Ni plu montras, ke kronika kokaino pliigas nukleajn, sed ne citoplasmajn, nivelojn de PSMC5 en la NAc kaj ke troesprimo de PSMC5 en ĉi tiu cerba regiono antaŭenigas la lokomotorajn respondojn al kokaino. Kune, ĉi tiuj trovoj priskribas novan mekanismon, kiu kontribuas al la agoj de ΔFosB kaj, por la unua fojo, implikas PSMC5 en molekula kaj konduta plastikeco induktita de kokaino.

Citaĵo: Ohnishi YH, Ohnishi YN, Nakamura T, Ohno M, Kennedy PJ, Yasuyuki O, et al. (2015) PSMC5, 19S Proteasomal ATPase, Reguligas Kokainan Agon en la Nukleaj Akcioj. PLOS ONE 10 (5): e0126710. doi: 10.1371 / journal.pone.0126710

Akademia Redaktoro: James Edgar McCutcheon, Universitato de Leicester, UNITED KINGDOM

Ricevita: Decembro 10, 2014; Akceptita: Aprilo 7, 2015; Eldonita: Eble 11, 2015

Kopirajto: © 2015 Ohnishi et al. Jen artikolo pri malferma aliro distribuita sub la kondiĉoj de la Krea Komunaĵo Atribuka Permesilo, kiu permesas senrestran uzadon, distribuadon kaj reprodukton en iu ajn rimedo, kondiĉe ke la originala aŭtoro kaj fonto estas akredititaj

Datumoj Haveblo: Ĉiuj gravaj informoj estas en la papero.

Financado: Ĉi tiu laboro estis subtenita de subvencioj de la Naciaj Institutoj pri Sano, la Nacia Instituto pri Drogaj Misuzoj kaj de la Ishibashi-Fondaĵo kaj la Japana Societo por Akcelado de Scienco (KAKENHI-numeroj: 24591735, 26290064, 25116010). La financistoj ne havis rolon en studo-projektado, kolektado de datumoj kaj analizo, decido publikigi, aŭ preparado de la manuskripto.

Konkurantaj interesoj: La aŭtoroj deklaris, ke ne ekzistas konkurencantaj interesoj.

Enkonduko

ΔFosB, detranĉita produkto de FosB geno, apartenas al la Fos-familio de transskribaj faktoroj, kiuj ankaŭ inkluzivas c-Fos, plenlongan FosB, Fra-1, kaj Fra-2. ΔFosB, kiel aliaj Fos-proteinoj, heterodimerizas kun Jun-familio-proteino - c-Jun, JunB aŭ JunD - por formi aktivan AP-1 (aktiviganto-proteino-1) transkripciokomplekso, kiu induktas aŭ subpremas la esprimon de specifaj celaj genoj. [1,2].

Δ FosB montris ŝlosilan rolon en drogmanio [2]. Unike inter la proteinoj Fos-familio, ĝi akumuliĝas en nukleaj akciuloj (NAc) kaj aliaj rekompencaj cerbaj regionoj post ripetita administrado de drogoj pro ĝia alta nivelo de stabileco [3,4], kiu estas mediaciita per la manko de C-finaĵaj degronaj domajnoj kaj per fosforilado de pluraj proteinoj kinaseoj [5-7]. Tia indukto de ΔFosB en la NAc mezuras pliigajn kondutajn respondojn al drogoj misuzoj. Tiel, troekspreso de ΔFosB en ĉi tiu cerba regiono de plenkreskaj bestoj, ĉu per uzo de viralaj vektoroj aŭ neduciblaj bitransgenaj musoj, pliigas sentivecon de besto al la lokomotoraj kaj rekompencaj efikoj de kokaino kaj opiatoj same kiel instigo de besto por mem-administri. kokaino [7-11]. Aliflanke, troekspreso de regantaj negativaj antagonistoj de ΔFosB kaŭzas la kontraŭajn kondutajn fenotipojn [10-12].

Ni kaj aliaj antaŭe konfirmis, per uzado de ĝelŝanĝaj provoj, ke JunD kaj eble aliaj Jun-familiaj proteinoj estas la ĉefaj ligaj partneroj de ΔFosB en la cerbo in vivo [13-15]. Tamen ĝis nun ne estis malferma kaj senpartia takso de la ligaj partneroj de ΔFosB en cerbo. Ĉi tie, ni serĉis identigi novajn ligajn partnerojn por ΔFosB per uzo de feĉo du-hibridaj provoj [16,17]. Niaj datumoj malkaŝis, ke PSMC5, ankaŭ konata kiel SUG1, estas fortika partnero de ΔFosB ambaŭ in vitro kaj en la NAc in vivo, kie ĝi aliĝas al ΔFosB kiel parto de kompleksa transkripta aktiviga komplekso, kiu ankaŭ enhavas CBP (CREB liganta proteinon. ) kaj p300 — ambaŭ histona acetiltransferasoj (HAToj) —kiel BRG1 (proteino por remodelado de kromatino). Ni daŭrigas, ke kronika ekspozicio al kokaino ŝanĝas la nukleajn nivelojn de PSMC5, ATUN-enhavan subunecon de la proteasoma komplekso 19S, en la NAc kaj ke PSMC5 siavice regas kondutajn respondojn al kokaino.

Materialoj kaj Metodoj

Legomaj du-hibridaj kribroj

MaV203-feĉaj ĉeloj (Invitrogen Life Technologies) estis kunfektitaj kun pDBLeu-pelado de malsamaj fragmentoj de la ΔFosB-proteino, kaj muso-cerba biblioteko estis subklonita en pPC86 (Invitrogen Life Technologies). Transformitaj ĉeloj estis kreskigitaj sur SC-mezo malhavante leucinon, triptofanon kaj histidinon, kaj enhavantan 10 mM de 3-aminotriazole. Ligado inter fragmentoj de FosB kaj kandidata partnero induktas tri raportistajn genojn (His3, Ura3Kaj LacZ), kaj la indukto igas transformilojn kapablaj pluvivi sub la kultivataj kondiĉoj. Pozitivaj klonoj estis testitaj per freŝaj pDBLeu-ΔFosB-fragmentoj per retransformaj provoj en MaV203-ĉeloj.

Ĉelaj linioj

Muso Neuro 2A neŭroblastomaj ĉeloj (ATCC) estis konservitaj en la minimuma esenca medio de Eagle (EMEM) (ATCC), kompletigita kun 10% feta bova serumo (FBS) je 37 ° C kaj 5% CO2. Rangaj 1A-ĉeloj estis donaco de Yusaku Nakabeppu (Fukuoka, Japanio) [18] kaj konservita en MEM (DMEM) de Dulbecco (Vivoteknologioj), suplementita kun 10% FBS ĉe 37 ° C kaj 5% CO2. Transfektado de ĉeloj kun plasmida DNA realiĝis per Efekteno (Qiagen) laŭ la instrukcioj de la fabrikanto.

PSMC5 kaj ΔFosB-konstruaĵoj

Pluraj mutantaj formoj de PSMC5, ĉiu FLAG-etikedita ĉe sia N-finaĵo, estis generitaj por uzo en imunoprecipitado aŭ viral-mediaciitaj genaj translokaj eksperimentoj. Ĉi tiuj inkluzivas: PSMC5-K196M, PSMC5-Δcoiled-coil-domajno (PSMC5-ΔCC, mankas aminoacidoj 27 – 68), PSMC5-NT (konsistanta el la N-fina fragmento de la proteino, aminoacidoj 1-151), -CT (konsistanta el la C-fina fragmento de la proteino, aminoacidoj 5) (vidu Fig 1). Ni ankaŭ utiligis N-finaĵojn MYC-etikeditajn formojn de sovaĝa speco ΔFosB same kiel ΔFosB kun mutacio en ĝia leŭkina-zipo-domajno (mutacio de aminoacidoj 182 al 205, kiu estas sciata forigi heterodimerigon kun proteinoj de Junaj familioj) [6].

bildeton
Fig 1. ΔFosB ligas al PSMC5 in vitro.

 

A. Skemo de ΔFosB, ΔFosB-LZM, en kiu la leŭkina zipperiodo estas mutaciita por forigi heterFosB-heterodimerigon kun Junaj proteinoj, kaj Δ2ΔFosB, kiu mankas la unuajn aminoacidojn 78 de la ΔFosB N-termino. B. Skemo de PSMC5, PSMC5-NT, kiu inkluzivas la unuajn 151 aminoacidojn de PSMC5, PSMC5-CT, al kiuj mankas la unuaj 235 aminoacidoj de PSMC5, kaj PSMC5-ΔCC, al kiuj mankas la regado en bobeno (aminoacidoj 28) . La AAA-domajno respondas al motivo, ATPases Asociitaj kun diversaj ĉelaj Aktivecoj, ĉeestantaj en multaj ATPases. C. 68 μg de pcDNA2.4-ΔFosB (stratoj 3.1 – 1) aŭ ΔFosB-LZM (strateto 4) estis ko-transfektitaj kun 5 μg de FLAG-etikeditaj PSMC2.4 aŭ diversaj forviŝantaj mutuloj en Neuro5a. Du tagojn post transfekcio, ĉeloj estis lisitaj kaj submetitaj al imunoprecipitado kun kontraŭ-FLAG-antikorpoj kaj tiam Okcidentaj makulitaj kun kontraŭ-ΔFosB aŭ kontraŭ-FLAG-antikorpoj. Notu, ke ΔFosB, sed ne ΔFosB-LZM, ligas forte al PSMC2 aŭ PSMC5-NT, sed ne al PSMC5-CT aŭ PSMC5-ΔCC. La datumoj montritaj en la figuro estis replikitaj trioble en ĉiu el tri apartaj eksperimentoj.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g001

bestoj

Naŭ ĝis 11-semajne-inaj C57BL / 6J masklaj musoj (La Jackson-Laboratorio) estis uzataj por ĉiuj eksperimentoj. Bestoj estis loĝigitaj sur 12-h lumo-malhela ciklo kun aliro al manĝo kaj akvo ad libitum kaj estis kutimitaj 1 semajnon antaŭ eksperimentado. Du reĝimoj de kuracado kun kokaino estis uzataj. Por studi la biokemiajn efikojn de kokaino, bestoj ricevis ĉiutage 7 dozon de kokaino (20 mg / kg) aŭ salo, kaj mortigis per decapitado 24 hr post la lasta injekto. Ĉi tio estas norma protokolo, kiu pruviĝis produkti multajn molekulajn kaj ĉelajn respondojn al la drogo [7]. Por studi la influon de PSMC5 en nukleaj akcentoj sur kondutaj respondoj al kokaino, ni uzis subpropran dozon de la drogo (7.5 mg / kg; vidu lokomotivan sentivigon sube) surbaze de la hipotezo ke PSMC5 volus, kiel ΔFosB, pliigi la sentivecon de besto al kokaino [8]. Ĉiuj eksperimentoj kun bestoj estis aprobitaj de la Institucia Komitato pri Prizorgado kaj Uzado de Bestoj ĉe Monto Sinajo.

Immunoprecipitation kaj Okcidenta blotado

Neŭro 2A-ĉeloj estis transformitaj per sovaĝaj aŭ mutantaj formoj de PSMC5. Du tagojn post la transfuzo, ĉeloj estis lavitaj en PBS, lisitaj en bufron RIPA (50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 0.25% natria deoksikolato, cockta inhibito 10 mM, natria butirato) . Lisatoj estis dividitaj kaj inkubitaj per aŭ neimuna IgG (Sigma) aŭ kontraŭ-FLAG-antikorpoj (Sigma) por 3 hr ĉe 4 ° C. Immunoprecipitation estis farita kun Proteino G bidoj (Invitrogeno) kiel priskribite [19]. Mallonge, imunoprecipititaj proteinoj estis submetitaj al SDS-PAGE kaj analizitaj de Western blotting uzante kontraŭ-FosB / ΔFosB antikorpon (Ĉela Signaligo-Teknologio) surbaze de eldonitaj protokoloj [7]. Por in vivo proteinaj ligaj provoj, ni uzis purigitajn nukleajn frakciojn el punk-diseksigitaj NAc de musoj post kronika kuracado kun kokaino (20 mg / kg IP ĉiutage dum 7 tagoj, kun musoj uzis 24 hr post la lasta injekto). Ko-imunoprecipitado el nukleaj frakcioj estis farita uzante la N-Kombinan Kompleksan Ko-IP-kiton (Aktiva motivo) sekvante la instrukciojn de la fabrikanto. La sekvaj antikorpoj estis uzataj: MYC aŭ ß-actin, Cell Signaling Technology (Danvers, MA), PSMC5 kaj histono H3, Abcam (Cambridge, MA), CBP, p300 kaj BRG1, Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), kaj FLAG M2, Sigma.

Immunohistoĥemio

Immunohistokemio estis farita laŭ publikigitaj proceduroj [20]. Musoj estis anestezitaj kaj perfuzitaj intrakardie kun 4% paraformaldehido en PBS. Cerbo estis krioprotektita kun 30% sukrozo, kaj tiam frostita kaj konservita ĉe -80 ° C ĝis uzo. Koronaj sekcioj (40 μm) estis tranĉitaj sur krioostato kaj pretigitaj por imunohistokemio. Senpagaj flotaj sekcioj estis antaŭ-inkubataj en blokanta bufro enhavanta 0.3% Triton kaj 3% normalan azenan serumon. Δ FosB estis detektita uzante kaprinan poliklonalan antikorpon levitan kontraŭ la N-fina porcio de la proteino (1 / 1000 Santa Cruz Biotechnology). PSMC5 estis detektita uzante kuniklokorpan antikorpon (1 / 100 Abcam, Cambridge, MA). Bildoj estis prenitaj per konfokala mikroskopo (60x-pligrandiĝo; Zeiss).

Lokomotora sentivigo

Ĉiuj musoj ricevis ĉiutagajn IP-injektojn de salo dum 3-tagoj por kutimigi ilin al la streĉado de la injektoj. Al la sekva tago, al musoj oni injektis IP kun salo aŭ sub-doza dozo de kokaino (7.5 mg / kg; vidu sub Bestoj supre) kaj estis metitaj tuj en novajn lokomotorojn. La lokomotora aktiveco de la musoj estis registrita uzante fotobotelan sistemon kiel ambulatoraj trabo por 30 min. Ĉi tiuj traktadoj estis ripetitaj ĉiutage dum 3-tagoj.

Transdono de genoj víricas

Ni uzis vaste eldonitajn metodojn por viral-mediata geno-translokado [7,8,11,19]. Mallonge, esprimo plasmidoj por PSMC5 aŭ por iuj el ĝiaj mutantoj (vidu PSMC5 kaj ΔFosB konstruaĵoj supre) estis subklonitaj al la bicistrona p1005 (+) HSV-plasmido esprimanta GFP sub la kontrolo de la CMV-iniciatinto, kaj PSMC5 aŭ ĝiaj mutantoj sub tiu de la IE4 / 5 iniciatinto. Sub ketamina (100 mg / kg) / xylazine (10 mg / kg) anestezio, musoj estis poziciigitaj en malgrand-bestan stereotaksan instrumenton, kaj la krania surfaco estis elmontrita. Tridek tri mezurilaj kudriloj estis uzataj por infandi 0.5 μl de HSV-vektoro en la NAc je 10 ° angulo (AP + 1.6; ML + 1.5; DV -4.4) kun rapideco de 0.1 μl / min. Bestoj ricevantaj HSV-injektojn estis permesitaj resaniĝi dum 2-tagoj post kirurgio antaŭ eksperimentado.

statistikoj

ANOVAs kaj studentaj t-testoj estis uzataj, korektitaj por multaj komparoj, kun signifo fiksita je p <0.05.

rezultoj

PSMC5: roman-liganta partnero de ΔFosB

Ni faris preliminajn eksperimentojn por identigi taŭgan fragmenton de ΔFosB kiu funkciis kiel logilo en feĉo du-hibridaj provoj sen aŭtomatigo de la sistemo. Holo-ΔFosB induktis raportan genan agadon por si mem, kiel faris la N-fina stacio 1-78 aminoacido fragmento de la proteino. Tamen, N-fina stacio detranĉis ΔFosB (Fig 1A), nomata Δ2ΔFosB, al kiu mankas la unuaj 78 aminoacidoj de la proteino, ne havis ĉi tiun efikon. Tial ni uzis Δ2ΔFosB kiel la bait-proteinon.

Por kribri eblajn kunligajn partnerojn, ni uzis musan cerban bibliotekon subklonitan en pPC86. Ni identigis 11-kandidatojn por ligaj partneroj. Kvankam ĉi tiuj proteinoj inkluzivas la konatajn heterodimerigajn partnerojn de osFosB, c-Jun kaj JunD (tablo 1), la plej ĝenerala kandidato de malproksime estis PSMC5. Tamen surprize, tio estis interesa trovo, ĉar PSMC5 estis montrita en unu sola raporto antaŭ jaroj ligante al c-Fos in vitro [21]. Tamen, ne ekzistas antaŭaj raportoj pri PSMC5-implikiĝo en kokaina agado. Tamen, pro la forto de la signalo de PSMC5 en la du-hibridaj testoj de la feĉo, ni celis plu studi eblajn interagojn ΔFosB-PSMC5.

bildeton
Tabelo 1. Rezultoj de Legomaj Du-Hibrida Kribrado kun Δ2ΔFosB.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.t001

Unue, por konfirmi la fizikan interagadon inter ΔFosB kaj PSMC5, ni faris in vitro kunmunoprecipita eksperimentojn. Ni trovis ke etikedo FLAG-PSMC5 (Fig 1B), transformita en Neuro 2A-ĉelojn, efike tirita malsupren ΔFosB (Fig 1C). Due, por identigi la regionon en PSMC5 kiu respondecas pri ĝia ligado al ΔFosB, ni generis plurajn FLAG-etikeditajn PSMC5-mutulojn (Fig 1B) kaj ripetis la ko-imunoprecipita eksperimento. ΔFosB estis efikigita efike kun la aminoacidoj N-finaĵoj 151 de PSMC5 (PSMC5-NT), sed ne kun la C-fina 172 aminoacida fragmento de la proteino (PSMC5-CT) (Fig 1C). PSMC5, kiu mankis sian bobenan domajnan bobenon (PSMC5-ΔCC), ankaŭ ne efikas en precipitado de ΔFosB. Ĉi tiuj trovoj sugestas, ke PSMC5 ligas ΔFosB per ĝia regado de bobeno-bobeno (aminoacidoj 27-68). Plie, FLAG-etikedita PSMC5 ne precipitis mutan formon de ΔFosB kun mutaciita leŭkina zipo-domajno (ΔFosB-LZM) (Fig 1C), indikante ke ΔFosB aŭ ligas PSMC5 tra ĉi tiu regado aŭ, pli probable, ke ΔFosB-heterodimerigo bezonas por PSMC5-ligado.

PSMC5-ΔFosB ligita en NAc post kronika kokaina administrado

Surbaze de ĉi tiuj trovoj in vitro, ni studis ĉu PSMC5-niveloj en la NAc estas ŝanĝitaj en respondo al kronika administrado de kokaino. Ni trovis per subcelula frakciado kaj okcidenta blotado, ke kronika kokaino pliigas nukleajn nivelojn de PSMC5 en ĉi tiu cerba regiono sen ŝanĝo en citoplasmaj niveloj (Fig 2A). Ĉi tiu efiko ne estis vidita post unuopaj dozoj de kokaino (datumoj ne montritaj). Ni poste ekzamenis la lokalizon de PSMC5 kaj ΔFosB en NAc per konfokula imunofluoreskenta mikroskopo. Ni analizis musojn 24 hr post la lasta ripetita dozo de kokaino, tempa punkto kiam ΔFosB estas la sola detektebla FosB genprodukto (vidu Nestler 2008). Ni trovis fortan imunoreaktivecon de PSMC5 en la NAc, inkluzive de forta nuklea signalo. ~ 85% de ΔFosB + kernoj ko-makulitaj por PSMC5 (Fig 2B). Aldone, ni plenumis ko-imunoprecipitajn eksperimentojn sur NAc-eltiraĵoj kaj trovis, ke post kronika kuracado kun kokaino, ΔFosB estis efikita efike per kontraŭ-PSMC5-antikorpo (Fig 2C). En kontrasto, analizo de drogaj naivaj NAc (post ripetaj salaj injektoj) rivelis neniun detekteblan ΔFosB-malsupren (datumoj ne montritaj). Ĉi tiuj datumoj konformas al niaj trovoj en ĉela kulturo kaj konfirmas, ke ΔFosB kaj PSMC5 interagas en la NAc in vivo.

bildeton
Fig 2. PSMC5-regulado en musa NAc.

 

A. Okcidenta blotado de nukleaj kaj citosolaj frakcioj de NAc de musoj ĉiutage traktataj per salo aŭ kokaino (20 mg / kg) dum 7 tagoj, kun bestoj analizitaj 24 hr post la lasta injekto. Kokaino pliigas nukleajn sed ne citosolajn nivelojn de PSMC5. Histono H3 kaj ß-aktino, kiuj ne estis trafitaj de kokaino, estis uzataj kiel ŝarĝaj kontroloj. Datumoj estas meznombro ± SEM (n = 8-10 / grupo, * p <0.05). B. Kunlokigo de endogena PSMC5 (verda) kaj ΔFosB (blua) en NAc de musoj traktataj kronike kun kokaino kiel en AC Nukleaj lisatoj de muso NAc post kronika kokaina traktado estis submetitaj al imunoprecipitado kun kontraŭ-PSMC5-antikorpo aŭ musa IgG kiel kontrolo , kaj tiam Western makuliĝis per kontraŭ-FosB / ΔFosB antikorpo. La figuro montras interagojn PSMC5-ΔFosB en la NAc in vivo. Datumoj en B kaj C estis kopiitaj trioble en ĉiu el tri apartaj eksperimentoj.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g002

PSMC5 plibonigas ΔFosB-esprimon in vitro

Ĉar PSMC5 estas konata membro de la proteasoma komplekso, ni testis ĉu ĝi reguligas ΔFosB-nivelojn per Rato 1A-ĉeloj. La troa ekspreso de PSMC5 ne efikis sur bazaj niveloj de ΔFosB, sed kaŭzis malgrandan sed signifan plibonigon de ΔFosB-indukto post seruma stimulado de la ĉeloj (Fig 3A). Simila tendenco estis vidita por plenlonga FosB sed la efiko ne atingis statistikan signifon. Aliflanke, forigo de endogena PSMC5-esprimo en Rato 1A-ĉeloj, atingita per uzo de siRNAoj, kiuj celas PSMC5, ne influis bazajn ΔFosB-nivelojn, sed forte inhibiciis indFosB-indukton per stimula serumo (Fig 3B). Similaj efikoj estis viditaj por plenlonga FosB. Ĉi tiuj datumoj sugestas, ke PSMC5 ne antaŭenigas la proteasoman degeneron de ΔFosB, kiel eble atendus kerna subuneco de la proteazomo, sed anstataŭe necesas por maksimuma amasiĝo de FosB genaj produktoj in vitro, eble tra stabiligado de la proteinoj.

bildeton
Fig 3. PSMC5-reguligo de FosB / ΔFosB-esprimo en Rato 1A-ĉeloj.

 

A. Rato 1A-ĉeloj estis transfektitaj per 4 μg de PSMC5 aŭ kontrola DNA. Troesprimo de PSMC5 havis neniun efikon sur bazaj esprimaj niveloj de proteino FosB aŭ ΔFosB kiel determinita de okcidenta blotado, sed produktis malgrandan sed signifan pliiĝon en la indukto de ΔFosB per seruma stimulo (F (2,21) = 9.75, p = 0.001). B. Rato 1A-ĉeloj estis transfektitaj kun 5 pmol de aŭ el du siRNA-oj aŭ miksita RNA (kontrolo). Ambaŭ siRNAs efike malpliigis PSMC5-proteinajn nivelojn kompare kun kontrolaj kondiĉoj (siRNA # 1, 23 ± 5% de kontrolo; siRNA # 2, 18 ± 6%; p <0.05; n = 4). PSMC5-knokaŭto havis neniun efikon al bazaj niveloj de FosB aŭ butFosB sed atentigis la indukton de FosB kaj ΔFosB per seruma stimulo (FosB: F (2,6) = 20.99, p = 0.002; ΔFosB: F (2,6) = 22.83 , p = 0.002).

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g003

ΔFosB kaj PSMC5 formas kompleksojn kun CBP, p300, kaj BRG1 en NAc

Por pli bone kompreni la transkripciomekanismojn per kiuj PSMC5 povus influi ΔFosB-funkcion, ni esploris eblajn kromajn kunigajn partnerojn por la du proteinoj en la NAc sub kronikaj traktitaj kun kokaino. Ekzistas unu raporto, ke PSMC5 ligas al CBP - HAT - kaj pliigas histonan H3-acetiladon ĉe la proksimuma iniciatilo de MHC-II en HeLa-ĉeloj [22]. Plie, musoj, kiuj mankas en CBP, montras reduktitan kondutan sentivecon al kokaino same kiel reduktitan histonan acetiladon ĉe FosB iniciatinto [23]. Ni do testis, ĉu PSMC5 povus ligi kun ΔFosB kiel parto de kompleksoj, kiuj ankaŭ enhavas CBP kaj eble aliajn transkripciajn aktivulojn.

Ni unue pruvis, ke ΔFosB efike detruis ambaŭ CBP kaj p300, rilatan HAT, en Neuro2A-ĉeloj (Fig 4A). En kontrasto, la mutanta leŭkina zipo-formo de ΔFosB, kiel atendite, ne elmontris ĉi tiun aktivecon. Simile, PSMC5 efike faligis CBP kaj p300 (Fig 4B). Interese, ĉi tiu efiko ankaŭ estis vidita por PSMC5-ΔCC, kiu ne faligis ΔFosB, indikante ke PSMC5 interagas kun CBP kaj p300 per aliaj domajnoj de la proteino kaj sendepende de sia ligado al ΔFosB.

bildeton
Fig 4. ΔFosB kaj PSMC5 interagas kun CBP, p300, kaj BRG1 in vitro kaj in vivo.

 

A. Neuro2A-ĉeloj transfektiĝis kun 2.4 μg de MYC-etikeditaj ΔFosB aŭ MYC-etikeditaj ΔFosB-LZM. Ĉelaj eltiraĵoj estis imunoprecipititaj kun kontraŭ-CBP aŭ kontraŭ-p300-antikorpoj, kaj precipitaĵoj estis okcidentaj makulitaj kun la sama antikorpo aŭ kun kontraŭ-MYC-antikorpo. Ambaŭ CBP kaj p300 interagas kun ΔFosB kaj tiaj interagoj postulas nerompitan leucinan zipperon. B. Neuro2A-ĉeloj transfektiĝis kun 2.4 μg de FLAG-etikeditaj PSMC5 aŭ FLAG-etikeditaj PSMC5-ΔCC. Ĉelaj eltiraĵoj estis imunoprecipititaj kun kontraŭ-CBP aŭ kontraŭ-p300-antikorpoj, kaj precipitaĵoj estis okcidentaj makulitaj kun la sama antikorpo aŭ kun kontraŭ-FLAG-antikorpo. Ambaŭ CBP kaj p300 interagas kun PSMC5 kaj tiaj interagoj ne bezonas la CC-domajnon. C. Nukleaj lysatoj de musa NAc post kronika kuracado kun kokaino estis submetitaj al imunoprecipitado kun kontraŭ-CBP aŭ kontraŭ-p300-antikorpoj. Posta Okcidenta blotado de rezultaj precipitaĵoj kun kontraŭ-FosB / ΔFosB-antikorpo montris endogenajn interagojn inter ΔFosB kaj CBP / p300. D. Alikotoj de la samaj nukleaj lisatoj estis submetitaj al imunoprecipitado kun kontraŭ-BRG1 aŭ kontraŭ-PSMC5-antikorpo, sekvita de Okcidenta blotado de precipitaĵoj kun kontraŭ-FosB / ΔFosB aŭ kontraŭ-BRG1-antikorpoj. La rezultoj montras endogenajn interagojn inter ΔFosB kaj BRG1, kaj BRG1 kaj PSMC5. E. Schema ilustrado de transkripta aktivada komplekso kunmetita de ΔFosB: JunD-heterodimeroj interagantaj kun CBP / p300, BRG1, kaj PSMC5.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g004

Por konfirmi, ke ĉi tiuj interagoj okazas ankaŭ en vivo, ni administris kokainon kronike por indukti ΔFosB kaj nukleajn PSMC5-nivelojn, tiam imunoprecipititajn NAc-ekstraktojn kun kontraŭ-CBP aŭ kontraŭ-p300-antikorpoj. Konsekvenca kun niaj ĉelkultivaj datumoj, imunoprecipitado de CBP aŭ p300 efike elprenis ΔFosB (Fig 4C). Ni testis, ĉu BRG1, kerna subuneco de la SWI-SNF-kromodinamika komplekso, povus ankaŭ ligi al ΔFosB kaj PSMC5, surbaze de nia pli frua trovo, ke BRG1 estas varbita al iuj ΔFosB-celaj genoj koncerte kun ilia aktivigo en NAc post kronika kokaino [24]. Ni konstatis, ke imunoprecipitado de BRG1 elprenis ΔFosB en NAc-eltiraĵoj, kaj ke imunoprecipitado de PSMC5 same koprecipita endogena BRG1 (Fig 4D). Kunigitaj, ĉi tiuj rezultoj sugestas, ke ΔFosB-PSMC5 formas kompleksojn en NAc, kiuj ankaŭ inkluzivas CBP / p300 kaj BRG1 (Fig 4E).

La troa ekspreso de PSMC5 pliigas lokomotivajn respondojn al kokaino

La elstara ligado de PSMC5 kun ΔFosB en NAc instigis nin esplori ĉu pliigi PSMC5-nivelojn en ĉi tiu cerba regiono reguligas kondutajn respondojn al kokaino. Ni generis vektoron de Herpes Simplex Virus (HSV), kiu tro esprimas aŭ sovaĝan specon PSMC5 aŭ unu el ĝiaj mutantoj kaj validigis la vektorojn en NAc in vivo (Fig 5A). Viral-mediacia esprimo de PSMC5 predominas en la ĉela kerno (Fig 5B). Musoj tro elpremantaj sovaĝ-specan PSMC5 ne montris ŝanĝitajn respondojn al komencaj dozoj de kokaino, sed montris pliigitan lokomotivan aktivadon en respondo al ripetitaj kokainaj dozoj kompare al GFP-esprimantaj kontrolaj musoj. En kontrasto, musoj tro esprimantaj mutan formon de PSMC5, kiu mankas sian domajn bobenojn (PSMC5-ΔCC) ne montris ĉi tiun efikon (Fig 5B). Interese, troa ekspreso de PSMC5-K196M, kiu malhavas la ATPase-aktivecon de la sovaĝa proteino, ankaŭ potencis la lokomotorajn respondojn de kokaino.

bildeton
Fig 5. La troa ekspreso de PSMC5 en NAc pliigas lokomotivajn respondojn al kokaino.

 

A. Reprezenta transgen-esprimita per HSV en meza NAc. AC, antaŭa komisuro. NAc-kernaj kaj ŝelaj subregionoj notiĝas sur la figuro. B. Reprezentaj pli altaj pligrandigoj (60x) de imunohistoochememia makulo de PSMC5 en NAc-neŭronoj post injekto HSV-PSMC5 montrante, ke la proteino estas ĉefe nuklea kiel markita de DAPI-makulo. C. Musoj ricevis duflankajn HSV-injektojn en NAc sekvitajn per ĉiutagaj IP-injektoj de sublimaj dozoj de kokaino (7.5 mg / kg). Lokomotoraj respondoj montras kiel respondo al la unua kaj lasta el 3 ĉiutagaj dozoj de la drogo. Troesprimo de PSMC5 aŭ PSMC5-K196M pliigas lokomotorajn respondojn al ripeta kokaino, efiko ne vidata kun PSMC5-ΔCC. Ne estis signifa efiko de la transgenoj sur lokomotoraj respondoj al komencaj kokainaj dozoj. ANOVA F (3,125) = 4.163, * p <0.05 per la posthoc-testo de Dunnett.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g005

diskuto

La rezultoj de la nuna studo rivelas novan mekanismon per kiu ΔFosB mediadas siajn efikojn sur la cerbo kaj novan mekanismon implikitan en kokaina agado. Per uzo de nepreciza alproksimiĝo, feĉo du-hibridaj provoj, ni identigis PSMC5 kiel novegan ligan partneron por ΔFosB. Ni validigis ĉi tiun trovon ambaŭ en kultivitaj ĉeloj in vitro kaj en la NAc in vivo per pruvo de fortika ligado PSMC5-osFosB. Grave, nukleaj niveloj de PSMC5 estas induktitaj en NAc per kronika administrado de kokaino. Ni montris plue, ke PSMC5-ΔFosB-ligado okazas koncerte kun pluraj aliaj transkripciaj aktivigaj proteinoj, nome CBP kaj p300 (du HAToj) kaj BRG1 (ŝlosila konsistento de SWI-SNF-kromodinaj kompleksoj). Kune, niaj trovoj subtenas la hipotezon, ke PSMC5 estas parto de la transkripta aktivada komplekso, kiu estas varbita al almenaŭ certaj ΔFosB-induktitaj genoj dum kurso de kronika administrado de kokaino (Fig 4E). Konsekvenca kun ĉi tiu hipotezo estas la aldona konstato, ke troekspresio de PSMC5 en NAc, same kiel la troekspreso de ΔFosB mem, antaŭenigas kondutajn respondojn al kokaino. Estus interese en estontaj studoj sekvi ĉi tiujn en vivo observojn kun karakterizado de PSMC5-ΔFosB-HAT-BRG1-interagoj per uzo de in vitro-raportistoj.

La implikiĝo de PSMC5 en kokaina agado estas tute nova. Identigita komence kiel membro de granda familio de ATPaseoj kiuj enhavas la proteasomon, PSMC5 estis montrita tra la jaroj interagi kun pluraj transskribaj faktoroj, inkluzive de c-Fos, p53, nukleaj hormonaj riceviloj, kaj konsistigantoj de la baza transkripta komplekso [25], tamen, malmultaj funkciaj studoj estis faritaj tra la jaroj [26]. Ĝia plej bona agado estas antaŭenigi la agadon de MYC-transskribaj faktoroj en kulturitaj ĉeloj [27]. La impliko de PSMC5 en transskribaj mekanismoj sugestis eblan rolon por ubbiquitination-proteasomal-agado en la regulado de gena transskribo, sed la implikiĝo de PSMC5 en tia regulado restas preskaŭ ne kontrolita ĝis nun [28,29].

Tre malmulte oni scias pri PSMC5-funkcio en cerbo. Pli frua studo pruvis ĝeneraligitan esprimon de mRNA de PSMC5 tra cerbo [30], sed ĝia funkcia agado restis neludita. Niaj trovoj nun instigas pliajn esplorojn de ĉi tiu interesa proteino por pli bone kompreni ĝian rolon en reguligado de gena transskribo kaj ĝian rilaton al ubiquitination-proteasomal funkcio en cerbo. La ligado de PSMC5 al ΔFosB estas mediaciita per la bobena regado de PSMC5. Plie, la kapablo de PSMC5 antaŭenigi lokomotorrespondojn al kokaino, dum ĝi bezonas la regadon de la bobeno-bobeno, ne bezonas la aktivecon ATPase, kiu estas esenca al la proteino. Ĉi tiuj rezultoj levas la eblecon, ke almenaŭ en nia sistemo, la ĉefa agado de PSMC5 povus esti mediata per ĝia ligado al ΔFosB kaj aliaj transkripciaj reguligaj proteinoj kaj ne per ĝia proteasoma rilata agado per si. Plia laboro necesas por rekte testi ĉi kaj alternativajn eblecojn. La hipotezo, ke viral-media troa ekspresado de PSMC5 pliigis lokomotorrespondojn al kokaino per interagoj kun ΔFosB estas plaŭdinda, malgraŭ la uzo de 3-taga kokain-reĝimo, ĉar oni scias, ke estimindaj niveloj de ΔFosB akumuliĝas en cerbo en ĉi tiu tempo [3].

La aktualaj trovoj plue substrekas la utilecon uzi senpartiajn kaj malfermajn eksperimentajn alirojn en studado de la molekula bazo de cerba regulado. Nia komenca atento al PSMC5 baziĝis nur sur ĝia eminenta ligado al ΔFosB en feĉo du-hibridaj provoj, tamen ĝi ŝajnas esti grava ero de transkripciaj ŝanĝoj, kiuj estas rekrutitaj en NAc per ripetita kokaina administrado. Pli bona kompreno de la detalaj mekanismoj, per kiuj nukleaj niveloj de PSMC5 estas induktitaj de kokaino kaj, laŭ kiu, PSMC5 tiam kontribuas al transkopiaj aktivaj kompleksoj induktitaj de kokaino estas la fokuso de nunaj esploroj. Dume, nia feĉo du-hibrida provo rivelis plurajn aldonajn putativajn ligajn partnerojn de ΔFosB (tablo 1) kiuj nun ankaŭ garantias rektan ekzamenon en kokainaj modeloj. Kune, ĉi tiu laboro kontribuas al kreskanta kompreno de la kompleksaj molekulaj mekanismoj per kiuj kokaino ŝanĝas NAc-funkcion.

Dankojn

Ĉi tiu laboro estis subtenita de subvencioj de la Nacia Instituto pri Drogaj Misuzoj kaj de la Ishibashi Fundamento kaj la Japana Societo por Promocio de Scienco (KAKENHI-numeroj: 24591735, 26290064, 25116010).

Aŭtoro Kontribuoj

Konceptis kaj desegnis la eksperimentojn: YHO YNO EJN. Faris la eksperimentojn: YHO YNO PJK RN. Analizis la datumojn: YHO YNO EJN. Kontribuitaj reagiloj / materialoj / analizaj iloj: TN MO OY AN RN TT. Verkis la paperon: YHO EJN.

Referencoj

  1. 1 Morgan JI, Curran T (1995) Tuj-fruaj genoj: dek jaroj plu. Tendencoj Neŭroscio 18: 66 – 67. pmid: 7537412 doi: 10.1016 / 0166-2236 (95) 80022-t
  2. 2 Nestler EJ (2008) Transkripciaj mekanismoj de toksomanio: rolo de deltaFosB. Philos Trans R Soc London B Biol Sci 363: 3245 – 3255. doi: 10.1098 / rstb.2008.0067. pmid: 18640924
  3. Vidi Artikolon
  4. PubMed / NCBI
  5. Google Scholar
  6. Vidi Artikolon
  7. PubMed / NCBI
  8. Google Scholar
  9. Vidi Artikolon
  10. PubMed / NCBI
  11. Google Scholar
  12. Vidi Artikolon
  13. PubMed / NCBI
  14. Google Scholar
  15. Vidi Artikolon
  16. PubMed / NCBI
  17. Google Scholar
  18. Vidi Artikolon
  19. PubMed / NCBI
  20. Google Scholar
  21. Vidi Artikolon
  22. PubMed / NCBI
  23. Google Scholar
  24. Vidi Artikolon
  25. PubMed / NCBI
  26. Google Scholar
  27. Vidi Artikolon
  28. PubMed / NCBI
  29. Google Scholar
  30. Vidi Artikolon
  31. PubMed / NCBI
  32. Google Scholar
  33. Vidi Artikolon
  34. PubMed / NCBI
  35. Google Scholar
  36. Vidi Artikolon
  37. PubMed / NCBI
  38. Google Scholar
  39. Vidi Artikolon
  40. PubMed / NCBI
  41. Google Scholar
  42. Vidi Artikolon
  43. PubMed / NCBI
  44. Google Scholar
  45. Vidi Artikolon
  46. PubMed / NCBI
  47. Google Scholar
  48. Vidi Artikolon
  49. PubMed / NCBI
  50. Google Scholar
  51. Vidi Artikolon
  52. PubMed / NCBI
  53. Google Scholar
  54. Vidi Artikolon
  55. PubMed / NCBI
  56. Google Scholar
  57. Vidi Artikolon
  58. PubMed / NCBI
  59. Google Scholar
  60. Vidi Artikolon
  61. PubMed / NCBI
  62. Google Scholar
  63. Vidi Artikolon
  64. PubMed / NCBI
  65. Google Scholar
  66. Vidi Artikolon
  67. PubMed / NCBI
  68. Google Scholar
  69. Vidi Artikolon
  70. PubMed / NCBI
  71. Google Scholar
  72. Vidi Artikolon
  73. PubMed / NCBI
  74. Google Scholar
  75. Vidi Artikolon
  76. PubMed / NCBI
  77. Google Scholar
  78. Vidi Artikolon
  79. PubMed / NCBI
  80. Google Scholar
  81. Vidi Artikolon
  82. PubMed / NCBI
  83. Google Scholar
  84. Vidi Artikolon
  85. PubMed / NCBI
  86. Google Scholar
  87. Vidi Artikolon
  88. PubMed / NCBI
  89. Google Scholar
  90. 3 Hope BT, Nye HE, Kelz MB, Self DW, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, et al. (1994) Indukto de longdaŭra AP-1-komplekso kunmetita de ŝanĝitaj Fos-similaj proteinoj en cerbo per kronika kokaino kaj aliaj kronikaj traktadoj. Neŭra 13: 1235 – 1244. pmid: 7946359 doi: 10.1016 / 0896-6273 (94) 90061-2
  91. 4. Hiroi N, Brown J, Haile C, Ye H, Greenberg ME, Nestler EJ (1997) FosB-mutaciaj musoj: Perdo de kronika kokaina indukto de Fos-rilataj proteinoj kaj pliigita sentemo al la psikomotoraj kaj rekompencaj efikoj de kokaino. Proc Natl Acad Sci Usono 94: 10397-10402. pmid: 9294222 doi: 10.1073 / pnas.94.19.10397
  92. 5 Uleria PG, Rudenko G, Nestler EJ (2006) Reguligo de ΔFosB-stabileco per fosforilado. J Neŭroscio 26: 5131 – 5142. pmid: 16687504 doi: 10.1523 / jneurosci.4970-05.2006
  93. 6 Carle TL, Ohnishi YN, Ohnishi YH, Alibhai IN, Wilkinson MB, Kumar A, et al. (2007) foresto de konservita C-fina degron-domajno kontribuas al la unika stabileco de ΔFosB. Eur J Neurosci 25: 3009 – 3019. pmid: 17561814
  94. 7 Robison AJ, Vialou V, Mazei-Robison M, Feng J, Kourrich S, Collins M, et al. (2013) Kondutaj kaj strukturaj respondoj al kronika kokaino postulas nutrad-antaŭan buklon implikantan ΔFosB kaj CaMKII en la ŝelo de la kerno. J Neurosci 33: 4295 – 4307 doi: 10.1523 / JNEUROSCI.5192-12.2013. pmid: 23467346
  95. 8 Kelz MB, Chen J, Carlezon WA Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, et al. (1999) Esprimo de la transskriba faktoro ΔFosB en la cerbo regas sentivecon al kokaino. Naturo 401: 272 – 276. pmid: 10499584
  96. 9 Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW (2003) ΔFosB plibonigas stimulon por kokaino. J Neŭroscio 23: 2488 – 2493. pmid: 12657709
  97. 10 McClung CA, Nestler EJ (2003) Reguligo de gena esprimo kaj kokaina rekompenco de CREB kaj DFosB. Nat Neurosci 11: 1208 – 1215. pmid: 14566342 doi: 10.1038 / nn1143
  98. 11 Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, et al. (2006) ΔFosB: Necesa rolo por ΔFosB en la kerno akcenta en morfina ago. Naturo Neŭroscio 9: 205 – 211. pmid: 16415864 doi: 10.1038 / nn1636
  99. 12 Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, et al. (2003) Inducibla, cerba regiono specifa esprimo de reganta negativa mutanto de c-Jun en transgenaj musoj malpliigas sentivecon al kokaino. Cerbo Res 970: 73 – 86. pmid: 12706249 doi: 10.1016 / s0006-8993 (03) 02230-3
  100. 13 Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y, et al. (1995) Reguligo de delta FosB kaj FosB-similaj proteinoj per elektrokonvulsivaj prenoj kaj kokainaj traktadoj. Mol Pharmacol 48: 880 – 889. pmid: 7476919
  101. 14 Hiroi N, Marek GJ, Brown J, Ye H, Saudou F, Vaidya VA, et al. (1998) Esenca rolo de la geno fosB en molekulaj, ĉelaj, kaj kondutaj agoj de elektrokonvulsivaj prenoj. J Neŭroscio 18: 6952 – 6962. pmid: 9712664
  102. 15 Perez-Otano I, Mandelzys A, Morgan JI (1998) MPTP Parkinsonismo estas akompanata de persista esprimo de proteino D-FosB-simila en dopaminergiaj vojoj. Mol Brain Res 53: 41 – 52. pmid: 9473580 doi: 10.1016 / s0169-328x (97) 00269-6
  103. 16 Ma J, Ptashne M (1988) Konvertanta eŭkariota transkripta inhibilo en aktivigilon. Ĉelo 55: 443 – 446. pmid: 3180218 doi: 10.1016 / 0092-8674 (88) 90030-x
  104. 17 Chien CT, Bartel PL, Sternglanz R, Kampoj S (1991) La du-hibrida sistemo: metodo por identigi kaj kloni genojn por proteinoj, kiuj interagas kun proteina intereso. Proc Natl Acad Sci Usono 88: 9578 – 9582. pmid: 1946372 doi: 10.1073 / pnas.88.21.9578
  105. 18 Nakabeppu Y 1, Oda S, Sekiguchi M (1993) Proliferativa aktivigo de kvietaj Rat-1A-ĉeloj de delta FosB. Mol Cell Biol 13: 4157 – 4166. pmid: 8321220
  106. 19 Scobie KN, Damez-Werno D, Sun H, Shao N, Gancarz A, Panganiban CH, et al. (2014) Esenca rolo de poli (ADP-ribosil) atio en kokaina ago. Proc Natl Acad Sci Usono 111: 2005 – 2010. doi: 10.1073 / pnas.1319703111. pmid: 24449909
  107. 20 Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S, et al. (2008) Distingaj padronoj de ΔFosB-indukto en cerbo per drogoj de misuzo. Sinapso 62: 358 – 369. doi: 10.1002 / syn.20500. pmid: 18293355
  108. 21 Wang WL, Chevray PM, Nathans D (1996) Mamula Sug1 kaj c-Fos en la nuklea 26S proteazomo. Proc Natl Acad Sci Usono 93: 8236 – 8240. pmid: 8710853 doi: 10.1073 / pnas.93.16.8236
  109. 22 Koues OI 1, Dudley RK, Truax AD, Gerhardt D, Bhat KP, McNeal S, et al. (2008) Regularo de acetilado ĉe la ĉefa histokompatebla kompleksa klaso II proksimuma iniciatilo de la proteasoma 19S ATPase Sug1. Mol Cell Biol 28: 5837 – 5850. doi: 10.1128 / MCB.00535-08. pmid: 18662994
  110. 23 Levine AA, Guan Z, Barco A, Xu S, Kandel ER, Schwartz JH (2005) CREB-liganta proteino kontrolas respondon al kokaino per acetilaj histonoj ĉe la fosB-iniciatanto en la musa striatumo. Proc Natl Acad Sci Usono 102: 19186 – 19191. pmid: 16380431 doi: 10.1073 / pnas.0509735102
  111. 24 Kumar A, Choi KH, Renthal W, Tsankova NM, Theobald DEH, Truong HT, et al. (2005) Kromatina remodelado estas ŝlosila mekanismo sub la kokain-induktita plastikeco en striato. Neŭra 48: 303 – 314. pmid: 16242410 doi: 10.1016 / j.neuron.2005.09.023
  112. 25. St-Arnaud R (1999) Duoblaj funkcioj por transskribaj reguligistoj: mito aŭ realo. J Cell Biochem Suppl 32/33: 32–40. doi: 10.1002 / (sici) 1097-4644 (1999) 75: 32+ <32 :: aid-jcb5> 3.0.co; 2-x
  113. 26 Ferrell K, Wilkinson CRM, Dubiel W, Gordon C (2000) Reguligaj subunuaj interagoj de la proteazomo 26S, kompleksa problemo. Tendencoj Biochem Sci 25: 83 – 88. pmid: 10664589 doi: 10.1016 / s0968-0004 (99) 01529-7
  114. 27 von der Lehr N, Johansson S, Larson LG (2003) Impliko de la ubiquitina / proteasoma sistemo en mikrokregula transskribo. Ĉela Ciklo 2 – 5: 403 – 407. doi: 10.4161 / cc.2.5.484
  115. 28 Geng FQ, Wenzel S, Tansey WP (2012) Ubiquitin kaj proteasomoj en transskribo. Annu Rev Biochem 81: 177 – 201. doi: 10.1146 / annurev-biochem-052110-120012. pmid: 22404630
  116. 29 Collins GA, Tansey WP (2006) La proteazomo: utila ilo por transskribo? Curr Op Genet Dev 16: 197 – 202. pmid: 16503126
  117. 30. Sun DH, Swaffield JC, Johnston SA, Milligan CE, Zoeller RT, Schwartz LM (1997) Identigo de filogenetike konservita Sug1 CAD-membro de la familio, kiu diference esprimiĝas en la musa nerva sistemo. Dev Neurobiol 33: 877–890. doi: 10.1002 / (sici) 1097-4695 (199712) 33: 7 <877 :: aid-neu2> 3.0.co; 2-5