Sukero-Ingesto Induktas Rapidan AMPA-Receptor-Traktadon (2013)

J Neŭroscio. Aŭtoro manuskripto; havebla en PMC Oct 3, 2013.
Eldonita en fina redaktita formo kiel:
La fina redaktita versio de ĉi tiu artikolo de la eldonisto disponeblas senpage ĉe J Neurosci
Vidu aliajn artikolojn en PMC tio citas La artikolo eldonita.

abstrakta

La mekanismoj per kiuj naturaj rekompencoj kiel sukero influas sinaptan dissendon kaj konduton estas plejparte neesploritaj. Ĉi tie, ni esploras reguligon de nukleaj akcizaj sinapsoj per sukeroza konsumado. Antaŭaj studoj montris, ke AMPA-riceviloj estas ĉefa mekanismo por reguligi sinaptan forton, kaj tio en vitro, trafiko de AMPA-riceviloj enhavantaj la sublujon GluA1 okazas per du-paŝa mekanismo implikanta ekstrasinaptan kaj tiam sinaptan receptoron. Ni raportas, ke en rato, ripeta ĉiutaga ingestaĵo de 25% sukrosa solvo transitorie levita spontanea lokomotivo kaj potencigitaj akcentaj kernaj sinapsoj per aliĝo de Ca2+-permeseblaj AMPA-riceviloj (CPAR), kiuj enhavas GluA1-enhavantajn, GluA2-mankantajn AMPA-ricevilojn. Studoj pri elektrofiziologiaj, biokemiaj kaj kvantaj elektronaj mikroskopioj malkaŝis, ke trejnado de sakarozo (7 tagoj) induktis stabilan (> 24-horan) intraspinan populacion de GluA1, kaj ke en ĉi tiuj ratoj unu sola sakarosa stimulo rapide (5-min) sed transire (<24-horo) leviĝis GluA1 ĉe ekstrasinaptaj lokoj. CPAR-oj kaj dopaminaj riceviloj D1 necesis in vivo por levita lokomocio post ingesta sukroza. Signife, 7-taga protokolo de ĉiutaga ingestaĵo de 3% solvo de sakarino, ne-kaloria dolĉigilo, induktis sinaptan GluA1 simile al 25% sukrosa ingestaĵo. THese-trovoj identigas mult-paŝan GluA1-trafikon, antaŭe priskribitan en vitro, kiel mekanismo por akra regulado de sinaptia transdono en vivo per natura orosensora rekompenco. Trafikado estas stimulita per kemosensoria vojo, kiu ne dependas de la kaloria valoro de sukroso.

Enkonduko

Troa konsumo de sukero estas grava problemo pri publika sano (Hu kaj Malik, 2010), sed la mekanismoj per kiuj naturaj, orosensoriaj rekompencoj kiel ekzemple sukerozo reguligas sinaptan transdonon por influi konduton. Sinaptika plastikeco en la kerno accumbens, integra ero de cerbaj rekompencaj cirkvitojSesack and Grace, 2010), kontribuas al multaj formoj de motivita konduto, inkluzive de rekompenco-lernado (Tago kaj Carelli, 2007), respondoj al socia streso (LaPlant et al., 2010), kaj toksomaniologiaj patologioj (Luscher kaj Malenka, 2011). Ripeta ekspozicio al kokaino kaŭzas sinaptikan plastikecon en neŭronoj de la akciferoj kaj ventrala tegmenta areo (VTA) (Brebner et al., 2005; Grueter et al., 2010; Mameli et al., 2009; Pascoli et al., 2012; Thomas et al., 2001; Ungless et al., 2001). Sur plilongigita alira kokain-memadministrado sekvita de daŭrigita retiriĝo, sinapsoj estas potencigitaj per la aliĝo de Ca2+-permebla, GluA2-mankas AMPA-tipaj glutamataj riceviloj (CPARoj), kies signalado mediacias inkubadon de kokainaj avidoj (Conrad et al., 2008; McCutcheon et al., 2011a). Simile al kokaino, orosensoriaj rekompencoj kiel ekzemple sukerozo forte levas la akcizan dopaminon (Smith, 2004), sed orosensoria rekompenco de akcenta plastikeco ne estis esplorita.

AMPA-riceviloj (AMPARoj) estas primaraj mediatoroj de ekscitita transdono de centra nerva sistemo, kaj ilia kontaktado kontribuas al diversaj neŭralaj procezoj, inkluzive lernadon kaj memoron (Nedelescu et al., 2010; Rumpel et al., 2005; Whitlock et al., 2006). AMPARoj estas kunmetitaj de kvar malsamaj subunuoj, GluA1-4. AMPARoj kun GluA2 estas Ca2+-impermebla kaj trafika konstante al sinapsoj, dum GluA2-mankas riceviloj (CPARoj), kiuj estas ĉefe GluA1-homomeroj, kondukas Ca2+ kaj elmontru internan rektigon. GluA1 spertas sinaptikan trafikon de aktiveco laŭ du paŝa vojo en kiu fosforilación de Ser 845 de proteino kinase dependanta de cAMP (PKA) kaj proteino kinase II de cGMP (cGKII) antaŭenigas akumulan receptoron ĉe ekstrasinaptaj lokoj en la plasmembrano (Esteban et al., 2003; Serulle et al., 2007; Sun et al., 2008; Sun et al., 2005). Post flanka disvastigo al la sinapso, fosforiligo de Ser 818 de PKC stabiligas AMPARojn ene de la sinapso (Boehm et al., 2006), ankrita al la postsinaptia denseco (Ehlers et al., 2007; Ho et al., 2006; Serulle et al., 2007). Ĉ2+/ calmodulin-dependa protein kinase II (CaMKII) fosforiligo de Ser 567 kaj Ser 831 ankaŭ kontribuas al sinaptika aliĝo kaj ekstrasinaptika celado (Lu et al., 2010; Roche et al., 1996) respektive. Tamen oni ne scias, ĉu en vivo aliĝo de CPARoj uzas ĉi tiujn rapidajn, mult-paŝajn mekanismojn priskribitajn en vitro.

Por esplori la mekanismojn, per kiuj orosensoriaj rekompencoj kiel ekzemple sakroso reguligas akcimajn sinapsiojn, ni uzis paradigmon de mallonga ingesta sukarozo kaj mezuris ŝanĝojn en sinaptika transdono en akciigaj neŭronoj. Ni observas, ke ripeta sukeroza ingesta potenco de akcensaj sinapsoj per aliĝo de CPARoj, kaj ke ĉe sukeroza trejnita besto, ununura sukroza stimulo sufiĉas por indiki rapidan GluA1-trafikon al ekstrasinaptaj lokoj. Ĉar sakarino, ne-kaloria dolĉigilo, induktita sinaptika kontrabandado simile al sukerozo, trafiko estas respondo al orosensoriaj anstataŭ kaloriaj vojoj. Plue, CPAR-blokado malhelpis altiro-induktitan de sukrozo de spontanea lokomotora agado en vivo, plue identigante akciigajn CPARojn kiel gravajn reguligilojn de respondoj al naturaj rekompencoj.

Materialoj kaj metodoj

Temoj kaj kirurgiaj procedoj

La subjektoj estis viraj Sprague-Dawley-ratoj (Taconic; kondutaj eksperimentoj) pezantaj 150-300-gramojn ĉe alveno kaj inaj E18 gravedaj Sprague-Dawley-ratoj (Taconic; ĉelkultiva eksperimentoj). La ratoj estis loĝigitaj 2 per kaĝo por kondutaj eksperimentoj sur 12h / 12h lumo-malluma ciklo (lumoj eksteren ĉe 18: 00) kaj havis aliron al manĝo kaj akvo. ad libitum ĉiam. Ĉiuj eksperimentaj proceduroj estis aprobitaj de la Komitato pri Instala Besto kaj Uzado de la Instituto de Medicino de la Novjorka Universitato kaj estis plenumitaj laŭ la "Principoj de Laboranta Besto-Prizorgado" (NIH-publikiga numero 85-23).

Sukrosa trejnado kaj lokomotoraj mezuroj

Ratoj estis transportitaj al la testĉambro 3 sinsekvaj tagoj por 2 h / tago en siaj hejmaj kaĝoj. En la kvara tago boteloj enhavantaj akvon aŭ 25% sukrozon estis enkondukitaj tra la kaĝo de la kaĝo por 5 min. Oni tiam pezis botelojn. Por ĉiuj eksperimentoj, ratoj estis postulataj por trinki almenaŭ 1 g da sukrozo dum la aliro de 5 min ene de 3 tagoj de la trejnado por esti inkluzivitaj en la studo; fakte ĉiuj ratoj plenumis ĉi tiun kriterion. Post forigo de boteloj, ratoj restis en la testĉambro por 30 min antaŭ transporto reen al la besta instalaĵo. En la tago de ofero, ratoj estis senkonsciaj de CO2, decapitado per gilotino, kaj specimenoj de histoj estis kolektitaj sur glacio. Por lokomotoraj eksperimentoj, ratoj estis metitaj en ĉambrajn mezurajn ĉambrojn (Accuscan, Columbus, OH) dum tuta 35-min. Post 15-min en la ĉambreto, botelo kun bidofluo estis enkondukita tra la supro de la ĉambro kaj stabiligita. La botelo estis forigita de la supro de la ĉambro post 5-min, kaj la ratoj restis en la ĉambro por plia 15-min post forigo de boteloj. Ĉi tiu procedo estis ripetita idente dum 7 sinsekvaj tagoj. Distanco veturita estis mezurita uzante la VersaMax-Sistemon (Accuscan, Columbus, OH), kiu monitoris la aktivecon de bestoj per krado de 16 × 16-infraruĝaj lumoj, kiuj trapasas la bestan kaĝon (42 × 42 × 30 cm) antaŭen kaj maldekstre dekstren. . Informoj pri trafa stato, skanita je 100-fojoj je sekundo, konserviĝis al disko. Aktiveco estis esprimita kiel ambulatoria distanco mezurita en cm dum 12 malsamaj 3-min-rubandoj en sesio de 35-min (la fina bin estis 2-min).

Sakarina trejnado

Por kompari gluA1-induktitan sukrozon kun la efikoj de sakarina ingestaĵo, plenkreskaj viraj ratoj 12 (250 g) estis en la besta instalaĵo en 12-horoj lumo / malhela ciklo. Ĉiuj ratoj tiam estis kutimitaj al la testĉambro per transportado al la testĉambro, lasitaj 2-horoj, kaj transportitaj reen al la besta instalaĵo. Unu la 4th-tagon (post 3-tagoj da kutimiĝo), al ratoj ricevis al ili boteloj kun aliro, akvo, sukerozo aŭ sakarino. 4-ratoj ricevis aliron al botelo enhavanta akvon ripozitan sur la supro de la kaĝo kun la spoto protrudanta en la kaĝon tra la kovrilo. Alira tempo estis 5 minutoj, tiam la botelo estis forigita, kaj post 15 min pliaj minutoj ratoj estis transportitaj reen al la besta instalaĵo. 4-ratoj ricevis aliron al 25% sukroza solvo kaj 4-ratoj ricevis aliron al 3% sakarina solvo (Sweet'n Low). Oni mezuris la volumenon de fluido konsumita. Ĉi tiu procedo estis ripetita dum 7-tagoj. En la 7-a tago de trinkado, tuj post forigo de boteloj, ratoj estis oferitaj kaj akcentita kerno estis rikoltita kaj GluA1-niveloj estis sonditaj de Western blot.

Elektrofisiologio

Ratoj estis trejnitaj sukerose kiel priskribite supre en klaraj plastaj kaĝoj kaj, post forigo de boteloj en la tago 7, estis anestezitaj per ketamina (100 mg / kg ip) kaj xilazino (10 mg / kg ip) kaj transcardiale perfuzigitaj kun malvarma salo (eksperimentoj de MEPSC) aŭ tuj decapita (eksperimentoj pri ĝustigo). La cerbo estis rapide forigita en artefaritan cerebrospinalan fluidaĵon (ACSF) konsistis el jenaj (en mM): por mEPSC-eksperimentoj: NaCl (118), KCl (2.5), CaCl2 (3), MgCl2 (1), NaHCO3 (26), NaH2PO4 (1), D-glukozo (10), osmolareco alĝustigita al 325 mOsm kaj aerigita de 95% O2/ 5% CO2 (pH 7.4); por rektigaj eksperimentoj: 75-sukerozo, 87 NaCl, 2.5 KCl, 1.25 NaH2PO4, 0.5 CaCl2, 7 MgCl2 6 H2O, 25 NaHCO3, 10 dextroso, burĝonita kun 95% O2 / 5% CO2 (pH 7.4). Koronaj tranĉaĵoj (300μm dikaj) enhavantaj la kernon acumbens estis tranĉitaj en glacia malvarma ACSF uzante vibrotomon (Leica, VT1200S) kaj konservis mergon en ACSF (ACSF, en mM: 124 NaCl, 2.5 KCl, 1.25 NaH2PO4, 2.5 CaCl2, 1.5 MgSO4 7H2O, 26 NaHCO3, kaj 10 dekstrozo) dum <30 min; poste konservita en tranĉa preinkubatoro ĉe ĉambra temperaturo dum almenaŭ 1 horo por permesi resaniĝon. Por mEPSC-eksperimentoj: ununura tranĉaĵo tiam estis transdonita al registradkamero en kiu ĝi estis tenita subakvigita per nilona reto je 32 ° C per enreta solva hejtilo kaj regilo TC324B (Warner Instruments, CT). La ĉambro estis kontinue trafluata de ACSF kun konstanta rapideco de 2 ml / min. Mezaj dornaj neŭronoj el la kerna regiono de la kerno accumbens estis identigitaj sub vida gvido per videomikroskopio kun transruĝa diferenciala interfero (Hamamatsu C5405) kun vertikala mikroskopo Olympus BX50WI ekipita kun 40x longa labordistanco akvomergia celo. Flikaj elektrodoj (4-6 MΩ) plenigitaj per intraĉela pipeta solvo konsistanta el (en mM): CsCl (145), HEPES (10), EGTA (0.5), kaj MgATP (5). Osmolareco estis alĝustigita al 290 mOsm kun sakarozo, kaj pH estis alĝustigita al 7.4 kun CsOH. Miniaturaj ekscitaj post-sinaptaj fluoj (mEPSCoj) estis registritaj ĉe ĉeesto de bicukulino (10μM) kaj tetrodotoksino (1μM) per amplifilo Axopatch 200B (Molekulaj Aparatoj, CA) kaj ciferecigitaj de Digidata 1322A (Molekulaj Aparatoj, CA). Por rektigaj eksperimentoj: tranĉaĵoj estis transdonitaj al la registradkamero kaj perfuzitaj (2.0-2.5 ml min-1) kun oksigenita ACSF ĉe 33-35 ° C enhavanta 50 μm-pictotoxinon por izoli EPSCojn. Somataj tut-ĉelaj registradoj estis faritaj el kernaj regionaj mezaj sponaj neŭronoj en tensio-krampo kun multiclamp 700B-amplifilo (Molekulaj Aparatoj) uzante IR-DIC-video-mikroskopion. Diakaj pipetoj (4-6 MΩ) estis plenigitaj kun intracelula solvo (en mM: 125 Cs-gluconato, 2 CsCl, 5 TEA-Cl, 4 Mg-ATP, 0.3 GTP, 10 fosfokreatino, 10 HEPTA, 0.5 XXUM -3.5). Datenoj estis filtritaj je 314 kHz, ciferecigitaj je 2 kHz, kaj analizitaj kun Clampfit 10 (Molekulaj Aparatoj). Ekstelula stimulo (10-0.01 ms, 1 – 5 μA, 150 Hz) estis aplikita per malgranda vitra bipola elektrodo 0.2 – 0.05 mm de la registra elektrodo. Post ~ 0.5 min de basregistrado, solvo enhavanta Naspm (10 μM) perfuziĝis en la banejon dum 200 min. Ŝanĝoj en EPSC-amplekso estis mezuritaj antaŭ kaj post drog-aplikiĝo ĉe tenado de potencialoj de −10, −70, −50, 30, + 0, + 20 kaj + 40 mV. La indekso de ĝustigo (ir) estis kalkulita korektante ajnajn eblajn movojn en inversa potencialo kaj kalkulis el la sekva ekvacio: ir = (I-70 / 70) / (I+ 40 / 40), kie I-70 kaj I+ 40 Estas la EPSC-ampleksoj registritaj ĉe −70 mV kaj + 40 mV respektive.

Subcelular-frakcio kaj Okcidenta blotado

Akciuloj estis kolektitaj sur glacio kiel priskribite supre. Kiam kerno kaj ŝelo estis diseksitaj aparte, disiĝo estis konfirmita provante sinaptosomajn frakciojn por dopamina β-hidroksilase, enzimo trovita en la finaĵoj de axonoj al la ŝelo sed ne la kerno (Sesack and Grace, 2010). Tutaj ĉeloj, sinaptosomaj kaj PSD-frakcioj prepariĝis kiel priskribite antaŭe (Jordan et al., 2004). Sinaptosomaj buletoj estis resuspendigitaj en 200 μl 25 mM Tris kun 1% Triton X-100, rampitaj je 4 ° C por 30-min, kaj centrifugitaj al 13,800 × g por 15-min en mikrocentrifuĝo al pelaj PSD-oj. La buleto enhavanta krudajn PSD-ojn estis resendita en 25 mM Tris kun 2% SDS. Frakcioj estis analizitaj per Western blot sur SDS-PAGE-ĝeloj kiel priskribite antaŭe (Jordan et al., 2004). La jenaj antikorpoj estis uzataj: dopamina β-hidroksilase (1: 1,000, Abcam), GluA1 (1: 1,000, Millipore), fosforo-Ser 845 GluA1 (1: 1,000, Millipore), GluA2 (1) (1,000: 1, Sigma).

Elektronika mikroskopo

En la tago de rikolto de histoj (tago 7 de sukerosa trejnado), ratoj de 3-testaj grupoj (Akvo, Sukroso / Akvo, Sukroso; 3-ratoj / testo-grupo) estis metitaj en lokomotorajn mezurajn ĉambrojn por 15-min; je 15-min botelo estis enkondukita tra la ĉambra supro. Ratoj en la Akvo-grupo ricevis akvon, ratoj en la ucrosa grupo ricevis 25%-sukerozon, ratoj en la grupo Sukrozo / Akvo, kiuj konsumis 25%-sukrozon dum 6-tagoj, ricevis akvon. Ratoj estis profunde anestezitaj kun Nembutal (50 mg / kg ip) kaj transcardiale perfuzigitaj kun fosfato 0.1 M fosfato (pH 7.4) enhavantaj 4% paraformaldehido kaj 0.1% glutaraldehido kun rapideco de 50 ml / min dum la unua 3-min, tiam je la unua 20-min, tiam je la unua 7-min. kurzo de XNUMX ml / min por la sekva XNUMX-min. Ŝtofo estis preparita por postmetita imunogold (PEG) etikedado kaj bildoj estis kaptitaj kiel priskribite antaŭe (Nedelescu et al., 2010). Imunolabeloj estis klasifikitaj laŭ sia pozicio rilate al la PSD ĉe asimetriaj sinaptaj juntoj kiel "fendoj", "proksime al PSD" (ene de 1 PSD larĝeco de la PSD), "ĉe PSD", "intraspinaj", aŭ "ekstrasinaptaj membranoj." De ĉiu besto, 93-sinapsoj estis specimenoj el la kerno de la akciuloj. Hazarda specimenado estis certigita analizante ĉiujn unuajn 93-hazarde renkontitajn sinapsojn dum ni balais sisteme tra la krado, kaj kolektis la saman nombron de sinapsoj de ĉiu el la tri bestoj, kiuj ricevis identajn antaŭ mortemajn traktadojn. Du specoj de kvantigo estis faritaj. Unu estis taksi la nivelon de imunoreaktiveco de GluR1, kalkulante la nombron de PEG-eroj okazintaj ĉe diskretaj funkciaj domajnoj de la spino. La alia estis taksi la proporcion de sinapsoj etikeditaj ĉe la PSD per iuj nombroj de PEG-eroj. Eĉ sinapsoj etikeditaj per nur 1 PEG-ero estis konsiderataj etikeditaj, bazitaj sur pli frua laboro montranta specifecon de la proceduro GluR1-PEG (Nedelescu et al., 2010). Traktado efikoj sur la proporcio kaj nivelo de GluR1-imunolabelado estis analizitaj per unudirekta ANOVA kun planitaj post-hoc komparoj (Fisher's LSD). Por forigi eksperimentajn flekseblecojn, la datumoj estis tri-blindigitaj: unu eksperimentisto faris sakrosan trejnadon kaj konservis rekordojn de la bestoj en la tri provaj grupoj, dua eksperimentisto kreis la elektronajn mikrografojn kaj atribuis novan alfanumerikan kodon al ĉiu mikrografo kaj konservis la kodon sigelita. , kaj tri pliaj eksperimentistoj skanis la mikrografojn kaj kvantigis PEG-erojn. Post kiam PEG-kvantigo estis kompleta, la eksperimentistoj kunvenis por riveli la identecojn de ĉiu mikrografo.

Kanula enplantado kaj intrakraniaj injektoj

Intrakrania injekto estis uzata por liveri Naspm kaj APV al la kerno de la akciigilo. Por enplantado de kanulo, kiel priskribite antaŭe (Carr et al., 2010), ratoj estis profunde anestezitaj kun ketamina (100 mg / kg ip) kaj xilazino (10 mg / kg ip) kaj injektitaj post-operacie kun la analgesika benamino (1 mg / kg subkutana). Ratoj estis stereotakse enplantitaj kun du 26-kalibraj gvidaj kanulaĵoj (PlasticsOne, Roanoke, VA) bilateralmente en la kerno de accumbens kun koordinatoj: 1.6 mm antaŭaj al bregma; 2.9 mm flankaj al la sagata suturo, bekoj angulaj 8 ° al la mezlinio, 5.6 mm ventral al krania surfaco. Kannuloj estis tenitaj modloko per dentokrusto kaj estis konservita patenteco kun stilita okludado. Por intrakraniaj injektoj, Naspm kaj APV-solvoj estis ŝarĝitaj en du 30 cm-longojn de PE-50-tuboj ligitaj ĉe unu fino al 25-µl Hamilton-siringoj plenigitaj kun distilita akvo kaj ĉe la alia fino al 31-kalibraj injektaj kanulaoj, kiuj etendis 2.0 mm preter la enplantitaj gvidiloj. La seringoj estis muntitaj sur la ĝemelaj teniloj de mikrofitilo de Harring 2272-mikrolitro, kiu liveris la 0.5 μl-injektajn volumojn dum 100-sekundo. Minuton post la kompletigo de injektoj, injektaj kanuletoj estis forigitaj de gvidiloj, anstataŭis stiletojn, kaj bestoj estis enmetitaj en lokomotor-testajn ĉambrojn por sukeroza trejnado. Post besta ofero, kriogenaj cerbaj sekcioj estis analizitaj por lokalizado de kanulo; 2 el 15-bestoj estis ekskluditaj de la studo pro malĝusta lokigo de kanulo.

Statistika analizo

Unudirekta ANOVA sekvita de Fisher post-hoc testoj estis uzata por elektronika mikroskopio, imunokitokemio kaj biotinilaj eksperimentoj. La provoj de du-vostaj Studentoj estis uzataj por elektrofiziologio. Por sukeroza hiperaktiveco-eksperimentoj, dudirekta ANOVA estis uzita, sekvita de Fisher post hoc testoj.

REZULTO

Karakterizado de sukureca ingesta paradigmo

Ni uzis paradigmon pri ingesta sukeroza por esplori la efikojn de natura aŭ orosensoria rekompenco sur sinapsa transdono (Figuro 1A). Plenkreskaj viraj ratoj estis transportitaj al testĉambro en tri sinsekvaj tagoj. En la kvara tago (unua tago de trejnado), la ratoj estis lokitaj en lokomotora mezurĉambro. Post 15 minutoj da mezurado de lokomotora agado en la ĉambro, boteloj enhavantaj aŭ akvon (por Akvaj bestoj) aŭ 25% sukrosan solvon (por sukeroraj bestoj) estis enkondukitaj en la mezuraj ĉambroj tra truoj en la kovrilo de la ĉambro. La boteloj estis forigitaj post 5-minutoj kaj lokomotora agado estis mezurita dum pliaj 15-minutoj antaŭ ol bestoj estis resenditaj al hejmaj kaĝoj. Ni ripetis ĉi tiun procedon por 7 sinsekvaj tagoj. En iuj eksperimentoj, sukroza trejnado estis etendita al 8th tago. Ĉi tiu mallonga, senkontesta aliro al tre plaĉa solvo permesis al ni esplori ambaŭ akrajn kaj akumulajn efikojn de sukera konsumado, ĉar bestoj fidinde imbibis sukerozon vigle dum la alira fenestro ene de tri tagoj de trejnado (Figuro 1B). Ĉi tiuj eksperimentaj kondiĉoj ebligis la komparon de testaj grupoj tuj post ĉeso de ingestaĵo. Nia kriterio por inkludo en la studo estis, ke ratoj komencas konsumi almenaŭ unu gramon da sukrozo dum la alira periodo ene de tri tagoj de la komenca trejnado; neniuj bestoj estis ekskluditaj de la studo surbaze de ĉi tiu kriterio.

figuro 1  

Ripeta ingesta sukero kaŭzas transirajn altojn de spontanea lokomocio.

Ni observis, ke en la daŭro de tri tagoj de trejnado, sukeros-bestoj konsumis signife pli sukrozan solvon ol akvaj bestoj konsumis akvon (Figuro 1B). Plie, kvankam neniuj signifaj diferencoj en spontana lokomocio estis observitaj dum trejnaj tagoj 1-6 (datumoj ne montritaj), ni observis signifan alton de totala distanco veturita en sukero-bestoj kompare al akvaj bestoj en la tri minutoj post forigo de boteloj en la tago 7 (Figuro 1D), kaj ĉi tiu diferenco ankaŭ ĉeestis en tago 8 (Figuro 1E). Neniuj diferencoj en tuta distanco veturita inter bestoj de akvo kaj sukerozo estis observitaj en la tri minutoj antaŭ la enkonduko de boteloj en iu ajn el la testaj tagoj (Figuro 1C), sugesti altan lokomotivon estis akra respondo al sukeroza ingestaĵo specifa al la sukroza trejnita rato, prefere ol kondiĉita respondo al la lokomotora ĉambro. Konforme al ĉi tiu ebleco, estis grava pozitiva korelacio inter la kvanto de sukerozo konsumita kaj la tuta distanco trairita (Figuro 1F). Ne estis diferenco en bestaj pezoj inter la Sukroza kaj Akva grupoj antaŭ aŭ post la 7-tagoj de trejnado (datumoj ne montritaj).

Sukero ingesta induktas CPAR-aliĝon

Sukrosa trejnado kaŭzis transiran alton de lokomotivo en la fina trejnadotago. Por determini, ĉu ĉi tiu konsekvenco de sukera ingeso estis akompanata de elektrofisiologiaj ŝanĝoj en la kerno accumbens, regiono kiu reguligas rekompencan konduton, ni preparis tranĉaĵojn de nukleo accumbens tuj post la forigo de boteloj en la tago 7 kaj registris de neŭronoj de la kerno akcenta (Figuro 2A). La kerna subregiono estis implikita en lokomotoraj respondoj al rekompencaj stimuloj (Sesack and Grace, 2010). Ni trovis, ke kaj la amplekso kaj la ofteco de spontaneaj miniaturaj ekscitataj postsinaptaj fluoj (mEPSCoj) estis signife pli grandaj en la kerno de akcinaj bestoj de sukosoj kompare al akvaj bestoj (Figuro 2B). Ĉi tio pruvis, ke ripetita sukeroza konsumo povus pozitive reguligi sinaptikan transdonon en la kernon de la kerno accumbens. Por determini ĉu CPAR-aliĝo ludis rolon en potencigo post sukerozo, ni determinis rektajn indicojn por akcentaj kernaj neŭronoj per mezurado de EPSCoj ĉe malsamaj membranaj potencialoj (Figuroj 2C, 2D kaj 2E). CPAR-oj interne rektigas ĉe depolarigitaj potencialoj pro endogena poliamida blokado. Ni observis signifan rektigon en registradoj de neŭronoj de sukosaj bestoj, kiel indikite per nelinieco en la rilato I / V, kompare kun Akvaj bestoj (Figuro 2E), aldone al signifa kresko de ĝustiga indekso (Figuro 2F).

figuro 2  

Accumbens-kernaj sinapsoj estas potencigitaj post ripetita sukera ingeso.

Por konfirmi alton de CPAR-niveloj per alia metodo, ni registris de akcentaj kernaj neŭronoj post la inkludo de la specifa CPAR-blokanto, 1-Naphthylacetyl spermine (Naspm) en la bano. Ni trovis, ke Naspm signife malpliigis EPSC-amplekson en registradoj de neŭronoj de sukero sed ne Akvaj bestoj (Ciferoj 3A – C). Plie, post Naspm-kuracado, la I / V-rilato en neŭronoj de sukero-bestoj fariĝis lineara, reflektante la inhibicion de CPARoj en sukero-bestaj sinapsoj, dum neniu signifa efiko sur la I / V-rilato estis observita post Naspm-traktado en neŭronoj de Akvaj bestoj (Cifroj 3D). Ĉi tiuj rezultoj pruvas, ke ripetita ingesta sukrozo induktas la aliĝon de CPARs en sinapsojn de la kerno de la akcizaĵoj.

figuro 3  

Sukero ingesta kaŭzas aliĝon de Ca2 + -permeblaj AMPA-riceviloj.

Sukero-ingeso induktas GluA1-kontrabandadon

CPARoj estas AMPA-riceviloj, kiuj malhavas de la GluA2 AMPA-ricevilo-subunuoj. Tiel, synaptic-aliĝo de CPAR-oj plej ofte implikas sinaptikan agadon depende de aktiveco de la subunuo GluA1 (He et al., 2009; Isaac et al., 2007; Liu kaj Zukin, 2007; Plant et al., 2006). Por konfirmi aliĝon de synaptic CPAR post trejnado kun sukerozo, ni esploris ĉu ingesta sukrozo pliigis sinaptan esprimon de GluA1. Ratoj ricevis aliron al sukrozo kiel priskribite supre dum 7 sinsekvaj tagoj. En tagoj 1, 3, 5, kaj 7, ni izolis la tutan ĉelon, sinaptosomon kaj postsinaptan densecon (PSD) frakciojn el tri cerbaj regionoj: akcentaj kernoj (kerno), akcipa ŝelo (ŝelo) kaj somatosensoria kortekso (kortekso). Ni analizis la tutan ĉelon kaj PSD-frakciojn per Western blot por esprimo de GluA1 kaj GluA2.

Ni trovis neniujn ŝanĝojn en GluA1 aŭ GluA2 en la ĉelaj frakcioj de akutaj lysatoj en la testaj tagoj ekzamenitaj, sugestante ke ripetita konsumo de sukerozo ne reguligas la totalajn nivelojn de ĉi tiuj proteinoj (Ciferoj 4A – C). Tamen, en la kutimaj PSD-frakcioj, GluA1 pliiĝis signife en tago 7 en la kerno sed ne en la ŝelo dum GluA2 ne ŝanĝis signife en ambaŭ frakcio (Ciferoj 4D-4F kaj datumoj ne montritaj). Ni observis neniun signifan kreskon de GluA1 en la akci-kernaj PSD-frakcioj en la antaŭaj provaj tagoj (Ciferoj 4D – F) kaj GluA1 aŭ GluA2 ne ŝanĝis la PSD-kortekajn frakciojn en iu ajn el la testaj tagoj (datumoj ne montritaj). Pliigita GluA1, precipe rilata al GluA2, en akcizaj kernaj PSD-oj post ripetita sukerkena ingestaĵo kongruas kun la pliigita rektigo observita en akcentaj neŭronoj, kiel priskribite pli supre.

figuro 4  

Postsinaptika denseco GluA1, sed ne GluA2, estas pliigita en la kerno de la nukleo accumbens post sukeroza ingestaĵo.

Aktive-dependa GluA1-kontrabandado estis montrita kontribui sinaptikan plastikecon en vitro kaj ankaŭ en vivo (Lu kaj Roche, 2011). Rapida, multpaŝa me mechanismanismo por GluA1-kontrabandado estis montrita en vitro (Serulle et al., 2007; Sun et al., 2008; Sun et al., 2005). Ĝis nun, tamen, la kontribuo de ĉi tiu multpaŝa mekanismo al sinaptika amasiĝo de GluA1 en vivo ne estis provita. Por determini, ĉu trejnado kun sukrozo induktas GluA1 akre per la multetaĝa mekanismo, ni lokalizis GluA1 ĉe nukleaj akcentoj sinapsoj de sukeroza kaj akvo-trejnitaj bestoj per kvanta elektronika mikroskopo. La kerna histo de Accumbens estis rikoltita en la sepa tago de sukrosa trejnado de testaj grupoj de 3-ratoj. Ĉi tiuj estis ratoj, kiuj: 1) konsumis akvon dum 7-tagoj (Akvo), 2) konsumis sukerozon dum 7-tagoj (Sukrozo), kaj 3) konsumis sukerozon dum 6-tagoj kaj akvon en la tago 7 (Sukrozo / Akvo). Ratoj estis oferitaj sur la 7th tago, 5 minutoj post konsumo de sukerozo aŭ akvo. Tiel, komparo de du el la testgrupoj, Sukroza / Akva kaj Sukrosa bestoj, unu al la alia kaj al Akvaj bestoj malkaŝis la tempodaŭron de postsinaptaj ŝanĝoj induktitaj de sukeroza konsumado en sukerozaj ratoj. Ni mezuris postmembran imunogoldon (PEG) - markitan GluA1 en 5 malsamajn postsinaptajn kupeojn: dendritika spina citosolulo (intraspino), ekstrasinaptan plasmembranon (membrano), PSD, proksime al PSD, kaj sinaptan fendon, kun la finaj tri kupeoj kunigitaj kiel 'PSD. '(Fig. 5A). Forigi eksperimentojn de fiasko, elektronaj mikrografaj testaj identecoj de estis trioblaj.

figuro 5  

Elektronika mikroskopio rivelas indukton de mult-paŝa GluA1-trafiko per sukeroza ingestaĵo.

Ambaŭ Sukrozo kaj Sukrozo / Akvaj bestoj elmontris signife levitan GrasA1 intraspinan rilate al Akvaj bestoj (Fig. 5B kaj 5C). Ĉi tio sugestas, ke kronika sukerozo pliigas intraĉelan amason da GPAA1-enhavantaj AMPA-receptorojn najbarajn al sinaptaj retejoj, riceviloj, kiuj povas esti facile haveblaj por sinaptika trafiko, kaj, grave, ke ĉi tiu intracelula naĝejo povas persisti dum 24-horoj post la fina konsumo de sukerozo . Ni tiam esploris la signifan demandon pri ĉu akra sukroza stimulo povas indukti rapidan GluA1-kontrabandadon. Ni observis, ke ekstrasinaptaj plasmaj membranoj GluA1 estis signife pliigitaj ĉe sukrozaj bestoj kompare al bestoj sukeroza / akva kaj akva (Figuroj 5B kaj 5D). Ĉi tiu konstato indikas, ke natura, orosensa rekompenco donita de ununura sakarosa stimulo povas rapide (<5 min) sed paseme (kaduka tempo <24 h) levi la ekstrasinaptan loĝantaron de riceviloj AMPA enhavantaj GluA1, kreante labilan naĝejon, el kiu la riceviloj povas trafiki al la sinapso.

Signife, en vitro studoj sugestis, ke sinapsa aliĝo de AMPA-riceviloj okazas laŭ 2-paŝoj. En la unua, glutamato- aŭ dopamina-dependa Ser 845-fosforiligo levas la nivelojn de riceviloj ĉe ekstrasinaptaj lokoj en la plasmembrano (Esteban et al., 2003; Serulle et al., 2007; Sun et al., 2008; Sun et al., 2005), dum en la dua, fosforilación Ser 818 antaŭenigas sinaptikan aliĝon (Boehm et al., 2006). Nia elektronika mikroskopa komparo de sukero-bestoj kun sukero / akvo kaj akvo-bestoj pruvas, ke la unua paŝo de la trafiko de GluA1 observis en vitro (Makino kaj Malinow, 2009), ankaŭ rapida trafiko al la ekstrasinaptika membrano en vivo post provizo de orosensoria rekompenco.

Konforme al elektrofisiologio kaj biokemiaj rezultoj priskribitaj supre, PEG EM pruvis, ke la konsumado de sukerozo ankaŭ induktis la duan paŝon en la eniro de riceviloj GluA1 de GluA1 al la sinapso ĉar la nivelo de imunoreaktiveco GluA1 ĉe la PSD estis signife pli granda por sukero kompare al ratoj de Akvo, kaj estis tendenco al pliigita GluA1 en Sukrozo / Akvo kompare al Akvaj ratoj (Figuroj 5B kaj 5E). La kresko de Sukrozo / Akvaj bestoj estas konsekvenca de aŭ rapida aliĝo de GluA1, kiu malkreskas kun sinaptika duonvivo de ~ 24 hr, aŭ rapida aliĝo de GluA1 kaj anstataŭigo per sinapsa GluA1 / 2 dum simila tempoperiodo. La procento de sinapsoj esprimantaj GluA1 en la PSD ankaŭ estis signife pli granda en sukero-ratoj kompare kun Akvaj ratoj (Figuro 5F), sugestante ke GluA1 trafikis al sinapsoj al kiuj antaŭe mankis GluA1. Ĉi tio ankaŭ sugestas, ke la kresko de mEPSC-amplekso observita ĉe sakarozaj ratoj rezultas de kresko de sinapta GluA1, kaj ke la kresko de mEPSC-ofteco povas rezulti el rekrutado de GluA1 al antaŭe silentaj akumbensaj sinapsoj, kvankam potencigo de glutamata liberigo ne povas esti malakceptita. Ni ankaŭ mezuris la nombron de sinapsoj en ĉiu el la tri testgrupoj por determini ĉu ingesta sakarozo induktis sinaptogenezon; ne estis diferencoj inter la tri testgrupoj (datumoj ne montritaj). Ni konkludas, ke ripetita sakarosa ingestaĵo levas stabilan (> 24 horojn) intraspinan akvon de GluA1, kaj ununura sakarosa stimulo al sakarozo trejnita (6 tagoj) rato sufiĉas por rapide (5 min) levi GluA1 en la ekstrasinapta plasmomembrano, eble tirante ricevilojn el la intraspina naĝejo. Ni sugestas, ke parto de ĉi tiuj ekstrasinaptaj riceviloj estas stabila enmetita en la PSD, kondukante al la observita rektiga indekso kaj PSD-GluA1-ŝanĝoj, antaŭ ol la ekstrasinapta naĝejo revenas al baza linio je 24 h post stimulo. Ĉi tiuj rezultoj malkaŝas, ke natura rekompenco povas akre estigi rapidan GluA1-trafikon ĉe trejnita besto.

CPAR-agado estas bezonata por levita lokomocio post sukeroza ingestaĵo

Mezaj spinecaj neŭronoj ricevas kaj dopaminergajn kaj glutamatergajn enigaĵojnCalabresi, et al., 1992). Por taksi la implikiĝon de glutamata signalado en la levita spontanea lokomocio, kiun ni observis post la sukroza ingestaĵo en sukerozajn ratojn, ni enplantis kanulojn en la kernon de aknomoj de ratoj, kaj trejnis bestojn en lokomotoraj mezuraj ĉambroj kiel priskribite supre. En la tago 8 de sukeroza trejnado, ni microinjektis Naspm en la kernon antaŭ enloĝigo en la lokomotora testoĉambro. La injekto malpliigis la totalan distancon veturitan de la sukosaj bestoj kaj forigis la diferencon inter sukero kaj akvaj bestoj viditaj tuj post forigo de boteloj (Figuro 6A). Por kontroli, ke streĉo kaŭzita de pritraktado de la bestoj ne influis la respondon al sukeroza, ni injektis salon en la kernon en la sekva tago (tago 9 de sukeroza trejnado); denove signifa hiperaktiveco estis observita ĉe la Sukosaj bestoj tuj post forigo de boteloj (Figuro 6B). Ĉi tio pruvas, ke Naspm specife malhelpis altan lokomotivon de induktita sukrozo. La injekto de la NMDAR-antagonisto, APV, en la kernon en la sekvaj tagoj ankaŭ forigis la diferencon inter sukero kaj Akvaj bestoj (Figuro 6C), pruvante, ke NMDARoj ankaŭ estas bezonataj por altiĝo de spontana lokomocio post sukeroza ingestaĵo. Por determini ĉu kondiĉita respondo al la prova ĉambro ludis rolon en indukta hiperaktiveco, bestoj estis metitaj en la ĉambron por 35-min sen botelo-enkonduko; ne diferencoj en distanco veturita estis inter sukero kaj Akvaj bestoj (Figuro 6D). Naspm kaj APV ne influis konsumon de sukerozo (Figuro 6E), pruvante, ke kernaj CPARoj kaj NMDARoj ne bezonas por vigla konsumado de sukerozo. Bestoj, en kiuj kanulinoj ne estis metitaj en la kernon de akciuloj (2 el 15-bestoj), kiel taksita post-ofero (Figuro 6F), ne estis inkluditaj en la studo. Konklude, ĉi tiuj datumoj kune pruvas, ke konsumado de sukerozo de trejnita sukrozo induktas sinaptan trafikon de GluA1 en 5-minutoj, kaj ke blokado de signalaj mekanismoj, kiuj kontrolas ĉi tiun trafikon, malhelpas levi spontanean lokomotivan agadon post sukerozo.

figuro 6  

Alta spontanea lokomocio post ingesta sukerozo postulas CPARojn kaj NMDARojn.

Du vojoj por sukroza signalado eble estos antaŭviditaj. Unu, strikte kemosenzoria aŭ orosensoria vojo, estas komencita per sukeroza ligado al la dolĉa gusto-ricevilo, kiu respondas al la heteromera komplekso de proteinaj G-proteinoj, T1R2 / T2R3 (Kitagawa et al., 2001; Max kaj aliaj, 2001; Nelson et al., 2001; Sainz et al., 2001). Nutraj riĉaĵoj en kalorioj ankaŭ povas reguligi cerban funkcion per metabolaj vojoj sendepende de gusto, kvankam la mekanismoj ne bone komprenas (de Araujo et al., 2008). Por distingi inter ĉi tiuj du alternativoj por la vojo de GluA1-trafiko induktita de sukerozo, ni ripetis la trejnan protokolon kun tri grupoj de ratoj (4-ratoj / grupo), kiuj ricevis aliron dum 5-minutoj al boteloj enhavantaj akvon, 25% sukerozan solvon. , aŭ 3% sakarino (Dolĉa kaj Malalta). La boteloj estis forigitaj kaj la ratoj restis 15-minutojn pli longe en la trejnada kaĝo. Trejnado ripetiĝis dum 7-tagoj. La volumoj de likvaĵo konsumitaj de la testaj grupoj de sukerozo kaj sakarino ne multe diferencis unu de la alia kaj ambaŭ estis pli grandaj ol konsumo de la akva grupo, konforme al rekompenco de ambaŭ dolĉaj substancoj (Figuro 7A). En la 7th-tago de trinkado, tuj post la forigo de boteloj, ratoj estis oferitaj, la akcela kerna histo estis rikoltita kaj amasiĝis por ĉiu prova grupo, la PSD-frakcio izolita kaj la niveloj de GluA1 provitaj de Western blot (Figuro 7B). Kiel antaŭe, bestoj konsumantaj sukerozon montris altan GluA1 en la PSD-frakcio rilate al la akvogrupo (Figuro 7C). Signife, GluA1 ankaŭ estis levita en la PSD-frakcio de bestoj, kiuj konsumis sakarinon. Ekzistis neniu signifa diferenco en la niveloj de GluA1 en la tutaj ĉelaj frakcioj de akvokombaj kernoj de akvo, sukerozo kaj sakarinoj, sugestante ke la pliiĝo de GluA1 estis specifa al la sinaptika frakcio (Figuro 7D). Ĉar sakarino stimulas la saman heteromerian proteinon G kunplektitan gustan receptoron kompleksan kiel sukerozo (Masuda et al., 2012; Nelson et al., 2001), sed mankas kaloria valoro, ni konkludas, ke stimulado de la dolĉa gusto-receptoro sufiĉas por komenci signaladon, kiu altigas nivelojn de GluA1 ĉe kernaj sinapsoj de kerno.

figuro 7  

Sakarina Trejnado Indikas Pliigon de Sinaptika GluA1 Simila al Sukrosa Trejnado.

diskuto

Ni montris, ke orosensoria rekompenco, ripeta sukeroza konsumado, povas akre indukti GluA1 sinaptan aliĝon per multpaŝa traktado-mekanismo antaŭe priskribita en vitro. Ripeta konsumado de sukerozo dum 6-7-tagoj potencigitaj akcentaj kernaj sinapsoj elektrofisiologie per la enmeto de CPARoj. Ĉi tiu efiko estis akompanata de amasiĝo de GluA1 sed ne de GluA2 en la PSD de la kerno, kaj estis regiona kaj laŭtempa specifa, ĉar neniuj ŝanĝoj estis observitaj antaŭ trejnado de la tago 7 en la kerno, kaj neniu ŝanĝo estis observita en la akciaj ŝeloj aŭ en somerisensoria kortekso. Elektronika mikroskopa analizo malkaŝis, ke ripetita sukera ingeso altigis relative stabilan (t1 / 2 > 24 horoj) loĝantaro de enspinaj GluA1-enhavantaj riceviloj. Sakarozo ankaŭ rapide (5 min) kaj nedaŭre (t1 / 2 <24 horoj) altaj niveloj de GluA1-enhavantaj riceviloj ĉe ekstrasinaptaj lokoj en sakaroz-trejnitaj bestoj, pliigante la loĝantaron de AMPARoj kapablaj disvastigi flanke en la sinapson. Sinapta GluA1, kaj kiel reprezentita de la frakcio PSD kaj kiel detektita de PEG-EM, estis signife pliigita en Sakarozo kompare kun Akvaj bestoj. De ĉi tiuj rezultoj ni proponas, ke la du-ŝtupa mekanismo de ekstrasinapta eksocitozo sekvita de sinapta trafiko por AMPAR-sinapta enmeto antaŭe priskribita en vitro (Boehm et al., 2006; Makino kaj Malinow, 2009; Ho et al., 2006; Serulle et al., 2007; Sun et al., 2005) povas esti iniciatita rapide en vivo per natura, orosensoria rekompenco.

Ŝanĝoj en sinaptikaj GluA1-niveloj nur estis observitaj post 7-trejnaj kunsidoj, sugestante ke pluraj tagaj procezoj necesas por potenco. En biokemiaj eksperimentoj en vivo, ni ne observis gravajn pliigojn en la akcentaj niveloj de PSD GluA1 en tagoj 1, 3, kaj 5 de sukrosa trejnado; nur post 7 tagoj da sukrosa trejnado estis GluA1 en la PSD signife levita. En eksperimentoj pri elektronika mikroskopio, ni observis, ke bestoj kun sukrozo / akvo, kiuj estis trejnitaj sukrozo dum 6-tagoj sed ne ricevis sukroran stimulon en 24-horoj, elmontris tendencon al pliigita PSD GluA1. Ĉi tiuj bestoj ankaŭ elmontris altan intraspinan GluA1 kompare al Akvaj bestoj, sed neniu ŝanĝo en ekstrasinaptika membrano GluA1 estis observita. El ĉi tiuj rezultoj ni eltiras tri konkludojn. Unue, AMPA-riceviloj enhavantaj GluA1 akumuliĝas intraspinamente kun pluaj sukuraj stimuloj. Konsiderante, ke antaŭaj studoj pruvis, ke ingesta sukerozo induktas liberigon de dopamino en la akcizaĵoj (Cacciapaglia et al., 2012; McCutcheon et al., 2012; Rada et al., 2005), kaj ke D1Rs povas funkciigi lokan GluA1-tradukadon en dendritojn (Smith et al., 2005), liberigo de dopamino post ingesta sukerozo povas deĉenigi lokan GluA1-sintezon, kiu kondukas al intraspina GluA1-amasiĝo. Alternative la neintensiga kresko eble reflektas trafikon de GluA1 de distalaj lokoj. Estas verŝajne, ke ekzokotika trafiko de ĉi tiu levita neintensia naĝejo kontribuas al la ekstrasinaptika naĝejo en la plasmembrano. Due, la observado de pliigo de ekstrasinaptaj membranoj GluA1 en Sukrozo, sed ne en sukeroza akvo- aŭ akvaj bestoj sugestas, ke la ekstrasinaptaj riceviloj aŭ moviĝas tra dua paŝo en la sinapson aŭ estas endokititaj en la 24 hr post sukeroza konsumo, farante la ekstrasinaptika naĝejo transitiva. Trie, la alto de sukeruja besto PSD GluA1 kompare kun Akvaj bestoj, sed ne Sukroza / Akvaj bestoj ankaŭ sugestas, ke post ĉiu sukrosa stimulo, riceviloj moviĝas laterale en la sinapson de la naĝejo de riceviloj trafitaj rapide al la ekstrasinaptaj plasmembranoj. Ni ne povas forĵeti, ke GluA1 trafikas rekte de la neintensa naĝejo al sinapso. Tia vojo tamen ŝajnas malverŝajne donita la studojn, kiuj montras GluA1 estas enmetita ekstreme sinaptike (Boehm et al., 2006; Makino kaj Malinow, 2009; Ho et al., 2006; Serulle et al., 2007; Sun et al., 2005). Ĉi tiuj trovoj reprezentas la unuan pruvon, kiun observis la tempa kurso por GluA1-trafiko (<5 min) kaj vojo en vitro estas ankaŭ observataj en vivo. Krome, niaj rezultoj sugestas, ke ripetaj rekompencaj stimuloj modifas la kapablon por potencigo de sinapso altigante la naĝejon de intraspinaj riceviloj kapablaj esti trafitaj.

Ĉar sakarino induktis GluA1-komercon simile al sukerozo, la kaloria enhavo de sukerozo ne bezonas. Sukarino stimulas la saman dolĉan gustan receptoron, T1R2 / T2R3, kiel sukerozo (Masuda et al., 2012; Nelson et al., 2001), sUggesting-aktivigo de ĉi tiu ricevilo probable kreas la aliĝon de GluA1 al MSN-sinapsoj. Sukero altigas dopaminan liberigon en la akcizoj de VTA-neŭronoj (Cacciapaglia et al., 2012; McCutcheon et al., 2012; Rada et al., 2005) ltranssendante al GluA1 surfac-kontrabandadon. Tiel la vojo, kiu ligas la dolĉan gustan receptoron al la VTA, verŝajne estas centra en la plastikeco studita ĉi tie.

Estas verŝajne, ke rapida trafiko de GluA1 post ingesta sukerozo ludas rolon en reguligado de spontanea lokomotivo. Efektive, ĉe sukeroza-trejnitaj bestoj, inhibicio de CPAR-oj malebligis altigon de spontanea lokomotora agado tuj post sukeroza ingestaĵo. La tuta distanco veturita de ratoj post la sukeroza konsumo mezurita en sinsekvaj tagoj estis signife levita nur por la periodo 3 min tuj post sukeroza konsumo en la sepa tago de trejnado. Pliigita aktiveco tuj post sukrozo estis observita komencante de la tago 3 de trejnado, sed ne fariĝis signife malsama ĝis la tago 7. Ĉi-foja kurso de aktiveco korelacias kun la tempa kurso de amasiĝo de GluA1 en akcizaj kernaj dendritoj.. La pliigita lokomotivo estis funkcia sekvo de CPAR-trafiko al MSN-sinapsoj en la kerno de la akciuloj ĉar Naspm-injekto en la kernon malhelpis la pliiĝojn de aktiveco. Antaŭzorgo de levita lokomocio fare de NMDA-ricevilo-inhibilo montris, ke signalado de glutamato per NMDA-riceviloj same kiel CPARoj estis necesa por levi lokomotivan agadon. Sukero-ingestaĵo tamen ne estis tuŝita de blokado de glutamata signalado, konforme al antaŭaj studoj pruvantaj, ke la akcenta kerno okupiĝas pri la orkestrado de motorrespondoj rilataj al orosensoria rekompenco sed ne konsumado mem (Smith, 2004). Simila tempa kurso por disvolviĝo de hiperlokomotivo estis raportita pri disvolviĝo de kondiĉita hiperactiveco ĉe bestoj nutrantaj sian ĉiutagan manĝon en distinga medio (Matthews et al., 1996). Se la aktuala respondo estis hiperactiveco rezultita de parigado de kunteksto kaj sukerozo, tamen ĝi antaŭus liveradon de sukerozo, kio ne estis observita. Eblas, ke la subjektoj montras esploran ekscitiĝon. Pluaj eksperimentoj estus necesaj por distingi ĉu levita lokomocio post sukeroza ingestaĵo ekscitis esploradon kontraste al formo de motora sento aŭ alia konduto. Ĉiuokaze, la altigo de spontana lokomotivo postulis glutamatan signaladon, kaj rezultis, almenaŭ parte, de la aliĝo de CPAR-oj en la kerno de la akcizaĵoj.

La pliigita lokomotora agado post la sukroza ingestaĵo povas rezulti rekte de la observata potencigo de la akcentaj sinapsoj, ĉar pliigita elfluo de la rekta basa ganglio vojo antaŭenigas lokomotivon per malinhibicio de motora thalamo (Sesack and Grace, 2010). Tli potencigis sinapsojn plej verŝajne loĝas sur rekta vojo, kiu alkondukas kernajn neŭronojn, kiuj esprimas D1Rojn. Potencado de sinapsaj rektaj vojaj vojoj rezultus se D1R-aktiveco induktis trakti AMPARojn kun GluA1-sinapsoj en ĉi tiuj neŭronoj post fortika dopamina liberigo. La rezulta potencigo pliigus aktivecon en inhibiciaj projekcioj de rektaj vojaj neŭronoj al bazaj ganglioj elirantaj kernoj, tiel malinstigante motoran talamon kaj antaŭenigante aktivecon de motora kortekso (Gerfen kaj Surmeier, 2011; Kravitz et al., 2010; Sesack and Grace, 2010). La sinaptika potenco observita post ripetita sukerkena ingestaĵo probable okazas specife en rektaj vojaj neŭronoj ĉar dopamino aganta tra la D1-ricevilo povas indukti GluA1 S845-fosforiladon, kondukante al surfaco-trafiko.

Pluraj studoj ekzamenis la efikojn de ripeta stimulado kun kokaino sekvata de retiriĝo, kuracado, kiu praktikas profundajn efikojn pri rekompenca sistemo funkcianta kaj eventuale kondukas al sentaŭga kokaino, kiu estas karakterizita de levita motora respondo al kokaino, avido de drogoj kaj receso. (Kalivas et al., 1998). Ripeta IP-injekto kun kokaino dum 5-10-tagoj sekvitaj de retiriĝo rezultigis laŭgradan pliiĝon dum 14-tagoj en surfacaj AMPA-ricevantoj de GluA2. (Boudreau et al., 2007; Kourrich et al., 2007). Tamen, je 45 tagoj de retiriĝo post 10 d de memadministrado, granda kresko de rektiga indekso estis observita en rataj MSNoj. (McCutcheon et al., 2011b) indikante kreskon de CPARoj. Tiel, CPAR-komerco estis observita post ambaŭ sukeroza ingestaĵo, en la nuna laboro, kaj kokain-memadministrado, kvankam en tre malsamaj kuracaj kondiĉoj.. Ĉar la tujaj konsekvencoj de kokaina memadministrado aŭ injekto (ekz. Ĉe 5-minutoj post) ne estas konataj, kokaina agado ne povas esti komparebla rekte kun la aktuala sukerosa laboro. Tiel same, oni ne scias, ĉu CPARoj persistas en MSN-sinapsoj de sukroso-trejnitaj bestoj post ĉeso de sukrosa trejnado aŭ se tiaj bestoj montras sakrosan sentivigon post longa retiriĝo.

Kompreni kiel rekompencaj stimuloj reguligas akuzan plastikecon kaj konduton estas kritikaj por trakti toksomanion, hiperfagion, patologian vetludadon kaj aliajn kondutajn malordojn (Basar et al., 2010; Berridge, 2009; Luscher kaj Malenka, 2011). La konsumado de sukero kontribuas al la epidemio de obesidad (Hu kaj Malik, 2010), kaj kvankam eble simila al droguzado (Avena et al., 2008), ĝia mekanismo ne estis vaste esplorita. La aktualaj trovoj establas bazajn elementojn de rekompenca plastikeco, el kiuj estontaj studoj povas trakti reguladon de kompleksaj kondutoj, eble provizante novajn avenuojn por alfronti rekompencajn patologiojn.

Dankojn

Ni dankas membrojn de la Ziff-Laboratorio, pasintajn kaj nunajn, pro teknika helpo kaj helpemaj diskutoj, inkluzive de H. Girma, L. Lee kaj D-roj. B. Fernholz, B. Jordan, W. Lu, G. Rameau, S. Restituito & Y. Serulle. Ĉi tiu laboro estis subtenata de Nacia Mezlernejo de Mensa Sano Antaŭdoktoriĝa Kunularo F31MH76617-01 kaj NIH Training Grant 5T32DC000063 al la New York University Training Program in the Neurosciences (DST), R01NS061920 de la National Institute of Neurological Disorders and Stroke (EBZ), 1R21MH091445- 01 de la Nacia Mezlernejo de Mensa Sano kaj Oficejo de Esploro pri Virina Sano, Programo de Stipendioj pri Klarman-Familia Fondaĵo en Esplorado pri Manĝ-Malordoj, Fondaĵo de Esplorado-Defio de NYU kaj P30EY13079 (CA), Nacia Instituto pri Drogmanio DA003956 kaj Sendependa Enketisto (KDC), Nacia Instituto pri Surdeco kaj aliaj Komunikaj Malordoj donas DC009635 al RCF, kaj per semaj subvencioj en la Centro de Plejboneco pri Dependeco de la Medicina Centro Langone de Novjorko.

Piednotoj

Konflikto de intereso: La aŭtoroj deklaras neniujn konkurencajn financajn interesojn.

Referencoj

  1. Avena NM, Rada P, Hoebel BG. Indikoj pri sukera toksomanio: kondutaj kaj neŭrokemiaj efikoj de intermita, troa sukero. Neŭroska Biobehav-Rev. 2008; 32: 20-39. [PMC libera artikolo] [PubMed]
  2. Basar K, Sesia T, Groenewegen H, Steinbusch HW, Visser-Vandewalle V, Temel Y. Nucleus acumbens and impulsivity. Prog Neurobiol. 2010; 92: 533 – 557. [PubMed]
  3. Berridge KC. "Ŝati" kaj "voli" manĝaĵojn: cerbaj substratoj kaj roloj en manĝaj malordoj. Fiziologio kaj konduto. 2009; 97: 537-550. [PMC libera artikolo] [PubMed]
  4. Boehm J, Kang MG, Johnson RC, Esteban J, Huganir RL, Malinow R. Sinaptika aliĝo de AMPA-riceviloj dum LTP estas kontrolita de fosforiliga loko de PKC sur GluR1. Neŭrono. 2006; 51: 213 – 225. [PubMed]
  5. Boudreau AC, Reimers JM, Milovanovic M, Wolf ME. Ĉelaj surfacaj AMPA-riceviloj en la rato-kerno akcensensas pliiĝante dum kokaina retiriĝo sed internaĵoj post kokaina defio en asocio kun ŝanĝita aktivigo de mitogen-aktivigitaj proteinoj kinases. J Neŭroscio. 2007; 27: 10621 – 10635. [PMC libera artikolo] [PubMed]
  6. Brebner K, Wong TP, Liu L, Liu Y, Campsall P, Griza S, Phelps L, Phillips AG, Wang YT. Kerno akuzas longperspektivan depresion kaj esprimon de kondutisma sentivigo. Scienco. 2005; 310: 1340 – 1343. [PubMed]
  7. Cacciapaglia F, Saddoris MP, Wightman RM, Carelli RM. Malsamaj dopamin-liberigaj dinamikoj en la kerno akcentas kernojn kaj ŝelojn spuras malsamajn aspektojn de cel-direktita konduto por sukerozo. Neŭarmasikologio 2012 [PMC libera artikolo] [PubMed]
  8. Calabresi P, Maj R, Pisani A, Mercuri NB, Bernardi G. Longtempa sinapsa depresio en la striatumo: fiziologia kaj farmakologia karakterizado. J Neŭroscio. 1992; 12: 4224 – 4233. [PubMed]
  9. Carr KD, Chau LS, Cabeza de Vaca S, Gustafson K, Stouffer M, Tukey DS, Restituito S, Ziff EB. AMPA-ricevilo subunuo GluR1 malsupren de D-1 dopamina ricevilo-stimulado en kerno accumbens-ŝelo mezumas pliigitan drogan rekompencon en manĝ-restriktitaj ratoj. Neŭroscienco. 2010; 165: 1074 – 1086. [PMC libera artikolo] [PubMed]
  10. Conrad KL, Tseng KY, Uejima JL, Reimers JM, Heng LJ, Shaham Y, Marinelli M, Lupo ME. Formado de akuŝuloj GluR2-mankantaj AMPA-receptoroj medias kovadon de koka-avido. Naturo. 2008: 454: 118-121. [PMC libera artikolo] [PubMed]
  11. Tago JJ, Carelli RM. La kerno acumbens kaj Pavlovian rekompencas lernadon. Nekrologo. 2007; 13: 148 – 159. [PMC libera artikolo] [PubMed]
  12. de Araujo IE, Oliveira-Maia AJ, Sotnikova TD, Gainetdinov RR, Caron MG, Nicolelis MA, Simon SA. Manĝaĵa rekompenco en manko de gustuma receptoro. Neŭrono. 2008; 57: 930 – 941. [PubMed]
  13. Ehlers MD, Heine M, Groc L, Lee MC, Choquet D. Disvastiga kaptado de AMPA-receptoroj de GluR1 per eniga specifa sinaptika agado. Neŭrono. 2007; 54: 447 – 460. [PMC libera artikolo] [PubMed]
  14. Esteban JA, Shi SH, Wilson C, Nuriya M, Huganir RL, Malinow R. PKA fosforiligo de AMPA-ricevilo-subunuoj kontrolas sinaptan trafikan subteran plastikecon. Nat Neurosci. 2003; 6: 136 – 143. [PubMed]
  15. Gerfen CR, Surmeier DJ. Modulado de striaj projekciaj sistemoj per dopamino. Ĉiujara revizio de neŭroscienco. 2011; 34: 441 – 466. [PMC libera artikolo] [PubMed]
  16. Grueter BA, Brasnjo G, Malenka RC. Postsynaptic TRPV1 ellasas ĉel-specan longperspektivan depresion en la kerno accumbens. Naturscienco pri naturo. 2010; 13: 1519 – 1525. [PMC libera artikolo] [PubMed]
  17. Li K, Kanto L, Cummings LW, Goldman J, Huganir RL, Lee HK. Stabiliĝo de Ca2 + -permeblaj AMPA-receptoroj ĉe perisinaptaj retejoj per GluR1-S845-fosforilado. Proc Natl Acad Sci Usono A. 2009; 106: 20033 – 20038. [PMC libera artikolo] [PubMed]
  18. Hu FB, Malik VS. Suker-dolĉigitaj trinkaĵoj kaj risko de obezeco kaj tipo 2-diabeto: epidemiologia evidenteco. Fiziologio kaj konduto. 2010; 100: 47-54. [PMC libera artikolo] [PubMed]
  19. Isaac JT, Ashby MC, McBain CJ. La rolo de la subgrupo GluR2 en AMPA-ricevilfunkcio kaj sinaptika plastikeco. Neŭrono. 2007; 54: 859 – 871. [PubMed]
  20. Jordanio BA, Fernholz BD, Boussac M, Xu C, Grigorean G, Ziff EB, Neubert TA. Identigo kaj kontrolo de novaj ronĝuloj postsinaptaj densecaj proteinoj. Mol Cell Proteomics. 2004; 3: 857 – 871. [PubMed]
  21. Kalivas PW, Pierce RC, Cornish J, Sorg BA. Rolo por sentivigo en avido kaj reaperado en kokaino. J Farmakolo. 1998; 12: 49 – 53. [PubMed]
  22. Kitagawa M, Kusakabe Y, Miura H, Ninomiya Y, Hino A. Molekula genetika identigo de geno de kandidata ricevilo por dolĉa gusto. Komunikadoj pri biokemia kaj biofizika esplorado. 2001; 283: 236 – 242. [PubMed]
  23. Kourrich S, Rothwell PE, Klug JR, Thomas MJ. Kokaino-sperto kontrolas dudirektan sinaptikan plasticecon en la kerno accumbens. J Neŭroscio. 2007; 27: 7921 – 7928. [PubMed]
  24. Kravitz AV, Freeze BS, Parker PR, Kay K, Thwin MT, Deisseroth K, Kreitzer AC. Reguligo de parkinsonianaj motoraj kondutoj per optogenetika kontrolo de bazaj ganglioj. Naturo. 2010; 466: 622 – 626. [PMC libera artikolo] [PubMed]
  25. LaPlant Q, Vialou V, Covington HE, 3rd, Dumitriu D, Feng J, Warren BL, Maze I, Dietz DM, Watts EL, Iniguez SD, et al. Dnmt3a reguligas emocian konduton kaj spinan plasticon en la kerno accumbens. Nat Neurosci. 2010; 13: 1137 – 1143. [PMC libera artikolo] [PubMed]
  26. Liu SJ, Zukin RS. Ca2 + -permeblaj AMPA-riceviloj en sinaptika plastikeco kaj neŭrona morto. Tendencoj en neŭrosciencoj. 2007; 30: 126 – 134. [PubMed]
  27. Lu W, Isozaki K, Roche KW, Nicoll RA. Sinaptika celado de AMPA-riceviloj estas reguligita de CaMKII-ejo en la unua intracelula buklo de GluA1. Proc Natl Acad Sci Usono A. 2010; 107: 22266 – 22271. [PMC libera artikolo] [PubMed]
  28. Lu W, Roche KW. Posttradukula regulado pri komercfunkciado kaj funkcio de receptoroj AMPA. Nuna opinio en neurobiologio 2011 [PMC libera artikolo] [PubMed]
  29. Luscher C, Malenka RC. Sinapsa plasticeco elvokita de drogoj en toksomanio: de molekulaj ŝanĝoj ĝis cirkla remodelado. Neŭrono. 2011; 69: 650 – 663. [PMC libera artikolo] [PubMed]
  30. Makino H, Malinow R. AMPA-ricevilo en sinapsoj dum LTP: la rolo de flanka movado kaj eksocitozo. Neŭrono. 2009; 64: 381 – 390. [PMC libera artikolo] [PubMed]
  31. Mameli M, Halbout B, Creton C, Engblom D, Parkitna JR, Spanagel R, Luscher C. Sinapsa plasticite elvokita kokaino: persistado en la VTA ellasas adaptojn en la NAc. Nat Neurosci. 2009; 12: 1036 – 1041. [PubMed]
  32. Masuda K, Koizumi A, Nakajima K, Tanaka T, Abe K, Misaka T, Ishiguro M. Karakterizado de la modoj de ligado inter homa dolĉa gusto-receptoro kaj dolĉaj molekulaj pezaj komponaĵoj. PloS unu. 2012; 7: e35380. [PMC libera artikolo] [PubMed]
  33. Matthews K, Wilkinson LS, Robbins TW. Ripeta patrina disiĝo de ratĉasaj ratoj mildigas kondutajn respondojn al primaraj kaj kondiĉigitaj instigoj en plenaĝeco. Physiol Behav. 1996; 59: 99 – 107. [PubMed]
  34. Max M, Shanker YG, Huang L, Rong M, Liu Z, Campagne F, Weinstein H, Damak S, Margolskee RF. Tas1r3, kodanta novan kandidatan gustan receptoron, estas alela al la dolĉa respondigebleco locus Sac. Natura genetiko. 2001; 28: 58 – 63. [PubMed]
  35. McCutcheon JE, Beeler JA, Roitman MF. Sukro-prognozaj indikoj elvokas pli grandan fazan dopamin-liberigon ol sakarina-antaŭdiraj kvereloj. Sinapso 2012; 66: 346 – 351. [PMC libera artikolo] [PubMed]
  36. McCutcheon JE, Wang X, Tseng KY, Wolf ME, Marinelli M. AMPA-riceviloj per kalcio-permeablaj prezencoj en kernoj akcentas sinapsojn post plilongigita retiriĝo de kokain-memadministrado sed ne koka-administrita de eksperimentanto. The Journal of neuroscience: la oficiala taglibro de la Socio por Neŭroscienco. 2011a; 31: 5737 – 5743. [PMC libera artikolo] [PubMed]
  37. McCutcheon JE, Loweth JA, Ford KA, Marinelli M, Wolf ME, Tseng KY. Grupa I mGluR-aktivigo renversas kokainan-induktitan akumuladon de AMPA-riceviloj de kalcio-permeablaj en kerno accumbenssinapses per proteina kinase C-dependa mekanismo. J Neŭroscio. 2011b; 31: 14536 – 14541. [PMC libera artikolo] [PubMed]
  38. Nedelescu H, Kelso CM, Lazaro-Munoz G, Purpura M, Cain CK, Ledoux JE, Aoki C. AMPA-enhavantaj AMPA-receptoroj kun GluR1 endogenaj translokiĝas al nesimetriaj sinapsoj en la laterala amigdala dum la frua fazo de formado de timo-memoro: elektronika mikroskopa imunokitokemio studi. The Journal of comparative neurology. 2010; 518: 4723 – 4739. [PMC libera artikolo] [PubMed]
  39. Nelson G, Hoon MA, Chandrashekar J, Zhang Y, Ryba NJ, Zuker CS. Mammalaj dolĉaj gustaj riceviloj. Ĉelo. 2001; 106: 381 – 390. [PubMed]
  40. Oh MC, Derkach VA, Guire ES, Soderling TR. Ekstrasinaptaj membranokomercado reguligita de GluR1 serine 845 fosforilaj primoj AMPA-riceviloj por longtempa potenco. J Biol Chem. 2006; 281: 752 – 758. [PubMed]
  41. Pascoli V, Turiault M, Luscher C. Reverto de sinapsa potencigo el kokaino ellasas reagadon de drogoj induktitaj de drogoj. Naturo. 2012; 481: 71 – 75. [PubMed]
  42. Planto K, Pelkey ​​KA, Bortolotto ZA, Morita D, Terashima A, McBain CJ, Collingridge GL, Isaac JT. Transira aliĝo de denaskaj GPAR2-mankhavaj AMPA-riceviloj dum hipokampa longperspektiva potenco. Nat Neurosci. 2006; 9: 602 – 604. [PubMed]
  43. Rada P, Avena NM, Hoebel BG. Ĉiutaga ekscito de sukero multfoje ellasas dopaminon en la akuŝilo. Neŭroscienco. 2005: 134: 737-744. [PubMed]
  44. Roche KW, O'Brien RJ, Mammen AL, Bernhardt J, Huganir RL. Karakterizado de multoblaj fosforilaj ejoj sur la subunuo GPAR1 de la ricevilo AMPA. Neŭrono. 1996; 16: 1179 – 1188. [PubMed]
  45. Rumpel S, LeDoux J, Zador A, Malinow R. Trafiksado de receptoroj postsinaptaj sub formo de asocia lernado. Scienco. 2005; 308: 83 – 88. [PubMed]
  46. Sainz E, Korley JN, Battey JF, Sullivan SL. Identigo de nova membro de la familio T1R de putaj gustaj riceviloj. Revuo pri neŭkemio. 2001; 77: 896 – 903. [PubMed]
  47. Serulle Y, Zhang S, Ninan I, Puzzo D, McCarthy M, Khatri L, Arancio O, Ziff EB. GluR1-cGKII-interagado reguligas komercadon de AMPA-riceviloj. Neŭrono. 2007; 56: 670 – 688. [PMC libera artikolo] [PubMed]
  48. Sesack SR, Grace AA. Cortico-Basal Ganglia-rekompenca reto: mikrocirkvito. Neuropsikofarmakologio: oficiala publikigo de la usona Altlernejo pri Neuropsikofarmakologio. 2010; 35: 27 – 47. [PMC libera artikolo] [PubMed]
  49. Smith GP. Accumbens dopamine mezuras la rekompencan efikon de orosensoria stimulado per sukerozo. Apetito. 2004; 43: 11 – 13. [PubMed]
  50. Smith WB, Starck SR, Roberts RW, Schuman EM. Dopaminergia stimulado de loka proteina sintezo plibonigas surfacan esprimon de GluR1 kaj sinaptan transdonon en hipokampajn neŭronojn. Neŭrono. 2005; 45: 765 – 779. [PubMed]
  51. Sun X, Milovanovic M, Zhao Y, Wolf ME. Akra kaj kronika stimulilo de la dopamina ricevilo modulas la kompanion de riceviloj de AMPA en la neŭronoj de la kerno akcentitaj neŭronoj kulturataj kun neŭronaj kortekso. The Journal of neuroscience: la oficiala taglibro de la Socio por Neŭroscienco. 2008; 28: 4216 – 4230. [PMC libera artikolo] [PubMed]
  52. Sun X, Zhao Y, Lupo ME. Dopula ricevilo stimulilo modulas AMPA-ricevilon sinaptan enmeton en prefrontalaj kortekaj neŭronoj. J Neŭroscio. 2005; 25: 7342 – 7351. [PubMed]
  53. Thomas MJ, Beurrier C, Bonci A, Malenka RC. Longtempa depresio en la kerno accumbens: neŭrala korelacio de kondutisma sentivigo al kokaino. Nat Neurosci. 2001; 4: 1217 – 1223. [PubMed]
  54. Malglata MA, Whistler JL, Malenka RC, Bonci A. Ununura eksponiĝo al kokaino in vivo induktas longtempan potencon en dopaminaj neŭronoj. Naturo. 2001; 411: 583 – 587. [PubMed]
  55. Whitlock JR, Heynen AJ, Shuler MG, Bear MF. Lernado induktas longtempan potencon en la hipokampo. Scienco. 2006; 313: 1093 – 1097. [PubMed]