DeltaFosB regula indirectamente la actividad del promotor Cck (2010)

Brain Res. 2010 mayo 6; 1329: 10 – 20.

Publicado en línea 2010 marzo 11. doi  10.1016 / j.brainres.2010.02.081

PMCID: PMC2876727

John F. Enwright, III,1 Megan Wald,1 Madison Paddock,1 Elizabeth hoffman,1 Rachel arey,2 Scott Edwards,2 Sade spencer,2 Eric J. Nestler,3 y Colleen A. McClung2, *

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Resumen

Algunos de los cambios bioquímicos, estructurales y de comportamiento importantes inducidos por la exposición crónica a drogas de abuso parecen estar mediados por el factor de transcripción altamente estable ΔFosB. Trabajos anteriores han demostrado que la sobreexpresión de ΔFosB en ratones durante semanas 2 conduce a un aumento en la expresión de numerosos genes en el cuerpo estriado, la mayoría de los cuales se regulan posteriormente luego de 8 semanas de expresión de ΔFosB. Curiosamente, un gran número de estos genes también se regularizaron en ratones que sobreexpresan el factor de transcripción CREB. No estaba claro a partir de este estudio, sin embargo, si a corto plazo ΔFosB regula estos genes a través de CREB. Aquí encontramos que las semanas 2 de sobreexpresión de ΔFosB aumentan la expresión de CREB en el cuerpo estriado, un efecto que se disipa en las semanas 8. La inducción temprana se asocia con un aumento de la unión de CREB a ciertos promotores de genes diana en esta región del cerebro. Sorprendentemente, un gen que era un objetivo sospechoso de CREB basado en informes anteriores, colecistoquinina (Cck), no fue controlado por CREB en el cuerpo estriado. Para seguir investigando la regulación de Cck Después de la sobreexpresión de ΔFosB, confirmamos que la sobreexpresión de ΔFosB a corto plazo aumenta tanto Cck Actividad promotora y expresión génica. También aumenta la actividad de enlace en un sitio de enlace putativo CREB (CRE) en el Cck promotor. Sin embargo, mientras que el sitio CRE es necesario para la expresión basal normal de Cck, no es requerido para la inducción de indFosB de Cck. En conjunto, estos resultados sugieren que si bien la inducción de ΔFosB a corto plazo aumenta la expresión y la actividad de CREB en ciertos promotores de genes, este no es el único mecanismo por el cual los genes se regulan positivamente en estas condiciones.

Palabras clave: núcleo accumbens, transcripción, adicción.

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INTRODUCCIÓN

La exposición crónica a drogas de abuso causa cambios bioquímicos y estructurales en varias regiones del cerebro. Se cree que estos cambios implican alteraciones en los perfiles de expresión génica en el sistema mesolímbico. Este sistema está compuesto por neuronas dopaminérgicas que se proyectan desde el área tegmental ventral (VTA) en el cerebro medio hasta las neuronas espinosas medias en el núcleo accumbens (NAc) (estriado ventral), así como en varias otras regiones cerebrales. Se han propuesto alteraciones en la actividad de dos factores de transcripción, proteína de unión al elemento de respuesta AMPc (CREB) y ΔFosB (una proteína de la familia Fos) para mediar en muchos de los cambios bioquímicos, estructurales y de comportamiento observados con la exposición crónica a drogas de abuso ( revisado por Nestler, 2005).

CREB es un factor de transcripción expresado de manera ubicua que es un miembro de la familia CREB / ATF. Los homodímeros CREB se unen a las variaciones de una secuencia CRE (consenso: TGACGTCA) que se encuentra en los promotores de muchos genes. La fosforilación de CREB (predominantemente en la serina 133, aunque se han identificado otros sitios) puede ser estimulada por varias cascadas de señalización, incluidas las que están más abajo de los receptores de dopamina (Cole et al., 1995). Tras la fosforilación en la serina 133, CREB recluta la proteína de unión a CREB (CBP) del coactivador o proteínas relacionadas que conducen a una mayor expresión de genes (revisado por Johannessen et al., 2004). La exposición crónica a drogas de abuso de opiáceos o psicoestimulantes induce aumentos transitorios en la actividad CREB en el núcleo accumbens (Barrot et al., 2002; Shaw-Lutchman et al., 2002, 2003), una adaptación pensada para disminuir las propiedades gratificantes de estas drogas y contribuir al estado emocional negativo de la abstinencia de drogas (Nestler, 2005).

LSe cree que las adaptaciones duraderas de Onger a las drogas de abuso están mediadas en parte por ΔFosB, una variante de empalme altamente estable de FosB (Nestler et al., 1999; McClung et al., 2004; Nestler, 2008). Los miembros de la familia Fos dimerizan con los miembros de la familia Jun para formar un complejo de proteína activadora 1 (AP-1). Los complejos de transcripción AP-1 se unen a las variaciones del elemento de respuesta AP-1 (consenso: TGACTCA) para regular la transcripción (revisado por Chinenov y Kerppola, 2001). Si bien la exposición aguda a drogas de abuso conduce a la inducción de corta duración (hrs) de los miembros de la familia Fos (así como a una mayor actividad de CREB), la exposición repetida a los medicamentos conduce a la acumulación de ΔFosB altamente estable (Hope et al., 1994; Perrotti et al., 2008), cuya expresión persiste durante semanas.

Los ratones bi-transgénicos que sobreexpresan de forma ΔFosB o CREB en el cuerpo estriado adulto muestran muchos de los fenotipos bioquímicos y de comportamiento observados en animales expuestos repetidamente a psicoestimulantes u otras drogas de abuso. UNAEl análisis de los cambios en la expresión génica en estos animales transgénicos identificó numerosos genes regulados al alza por la sobreexpresión de ΔFosB a corto plazo (semanas 2), cambios asociados con una disminución concomitante en la recompensa del fármaco. Los cambios en la expresión génica y la respuesta conductual con ΔFosB a corto plazo fueron notablemente similares a los observados en animales que expresan en exceso CREB para 2 o 8 semanas (McClung y Nestler, 2003). En sorprendente contraste, la sobreexpresión a largo plazo (8 semanas) de ΔFosB redujo la expresión de muchos de estos mismos genes y condujo a un aumento en la recompensa del fármaco (Kelz et al., 1999; McClung y Nestler, 2003).

Un gen identificado en estos estudios es colecistoquinina (Cck), un neuropéptido producido en varias regiones del cerebro, incluido el estriado (Hokfelt et al., 1980). CCK puede modular la transmisión dopaminérgica (Vaccarino, 1992), está involucrado en la recompensa y el refuerzo de drogas (Josselyn et al., 1996; Josselyn et al., 1997; Hamilton, et al., 2000; Beinfeld et al., 2002; Rotzinger y otros, 2002), y es inducida en el cuerpo estriado por la cocaína crónica (Ding y Mocchetti, 1992). Adicionalmente el Cck Se ha demostrado que el promotor responde a los complejos tanto CREB como AP-1 (Haun y Dixon, 1990; Deavall, et al., 2000; Hansen, 2001). Dado que muchos de los genes (incluyendo Cck) que mostraron un aumento en la expresión después de que tanto CREB como la expresión de BFosB a corto plazo eran conocidos o se sospechaban genes diana de CREB (McClung y Nestler, 2003), queríamos determinar si la expresión a corto plazo de ΔFosB conduce a la regulación de estos genes (con un enfoque en Cck) a través de la regulación de CREB o a través de mecanismos más complejos de regulación de genes.

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RESULTADOS

OverLa sobreexpresión de FosB aumenta de forma transitoria los niveles de CREB

Utilizamos la transferencia Western para investigar si la sobreexpresión de ΔFosB aumenta los niveles de proteína CREB en el cuerpo estriado de los ratones. Para este estudio, utilizamos ratones bi-transgénicos (línea 11A) que tienen un transgén NSE-tTA y un transgén TetOp-ΔFosB. En ausencia de doxiciclina, estos ratones muestran un aumento robusto en la expresión de ΔFosB en las neuronas positivas a la dinorfina en el estriado (Kelz et al., 1999). Este método de sobreexpresión de ΔFosB ha sido ampliamente documentado y permite la sobreexpresión específica de la región, que es paralela a la inducción de ΔFosB observada en animales expuestos a cocaína crónica (Hope et al., 1994; Kelz et al., 1999). Encontramos que en ratones 11A que expresaban en exceso ΔFosB, los niveles de proteína CREB aumentaban significativamente al alza después de las semanas de expresión de 2 y estos niveles volvían a la línea de base después de las semanas de expresión de 8 (Figura 1A, n = 8). Para determinar si los cambios en los niveles de CREB con la sobreexpresión de ΔFosB a corto plazo podrían replicarse en otro sistema, sobreexpresamos transitoriamente ΔFosB en células PC12 y descubrimos que los niveles de CREB aumentaron significativamente (p <0.05) en comparación con los controles (Figura 1B, n = 4). Estos resultados demuestran que la expresión de ΔFosB a corto plazo aumenta los niveles de proteína CREB.

Figura 1 y XNUMX

Figura 1 y XNUMX

Los niveles de CREB aumentan con la sobreexpresión de ΔFosB. Análisis de transferencia Western de lisados ​​de (A) Striata de ratón de ratones 11A sin dox para 2 o 8 semanas o (B) Células PC12 que sobreexpresan ΔFosB. Datos en A se muestran como cambio porcentual en dox dox comparado ...

Tanto ΔFosB como CREB se unen a promotores de genes diana específicos en el estriado después de la sobreexpresión de ΔFosB a corto plazo

Utilizamos ensayos de inmunodeficiencia de cromatina (ChIP, por sus siglas en inglés) de tejido estriatal para determinar si la unión de bindingFosB o CREB se produjo en ciertos promotores del gen diana y si esta unión se incrementó luego de una sobreexpresión de ΔFosB a corto plazo. Analizamos el enlace en el BDNF y Cck promotores, ya que ambos genes están altamente regulados al alza después de la sobreexpresión de FosB a corto plazo, la sobreexpresión de CREB o el tratamiento crónico de cocaína (McClung y Nestler, 2003). También analizamos la unión al CDK5 promotor, ya que es un objetivo directo conocido de ΔFosB (Chen et al., 2000; Bibb et al., 2001; Kumar et al., 2005). Finalmente, medimos la unión en la prodinorfina promotor, ya que estudios anteriores han encontrado que puede estar vinculado tanto por ΔFosB como por CREB en diferentes condiciones (Andersson y otros, 2001; Zachariou et al., 2006).

El análisis de ChIP se realizó en striata de ratones 11A que expresaban en exceso ΔFosB durante semanas 2 utilizando anticuerpos que reconocen CREB o ΔFosB. En condiciones normales, encontramos que ΔFosB se une a la CDK5 y prodinorfina promotores, mientras que no hay un enlace detectable en el BDNF or Cck promotoresTabla 1). Además, la sobreexpresión de ΔFosB aumentó la unión de ΔFosB en la CDK5 promotor, pero no en el prodinorfina promotor. A continuación, medimos la unión de CREB en estos promotores y encontramos que CREB se une a la CDK5, BDNF y prodinorfina promotores, pero no a la Cck promotor, en el cuerpo estriado normal, y que la sobreexpresión de ΔFosB durante semanas 2 aumenta la unión de CREB en el BDNF y prodinorfina promotores, pero no los CDK5 promotor. En conjunto, estos resultados muestran que FosB y CREB pueden unirse a ciertos promotores de genes, como prodinorfina y CDK5Sin embargo, la unión de CREB es específica de otros promotores tales como BDNF. Además, la sobreexpresión de ΔFosB conduce a aumentos en la unión de ΔFosB en ciertos promotores, como se esperaría, pero también a la unión de CREB a promotores específicos, consistente con la inducción de CREB mediada por osFosB observada en este momento.

Tabla 1

Tabla 1

Unión de proteínas reguladoras putativas a varios promotores en ratones que sobreexpresan ΔFosB durante dos semanas.

Trabajos anteriores han demostrado que los cambios en la expresión génica inducidos por la sobreexpresión de ΔFosB a largo plazo están asociados con modificaciones de la cromatina, en particular, la acetilación de la histona H3, en promotores de genes específicos (Kumar et al., 2005). Para determinar si esto podría explicar los cambios en la expresión génica en la sobreexpresión de ΔFosB a corto plazo, medimos la unión de la histona H3 acetilada (una modificación de histona asociada con cromatina transcripcionalmente activa), o una histona metilada H3 (Lys9, una modificación de histona asociada con transcripción) cromatina inactiva). Encontramos que la sobreexpresión de ΔFosB durante semanas 2 no produjo cambios en la unión de H3 acetilado en ninguno de los promotores de genes estudiados (Tabla 1). Encontramos una disminución significativa en la unión de la histona metilada H3 en el prodinorfina promotor, pero no vinculante en el Cck promotor y ningún cambio en la unión en el CDK5 y BDNF promotores, lo que sugiere que este no es un mecanismo general por el cual ΔFosB, a corto plazo, regula la expresión génica. Nos sorprendió e interesó el hecho de que no encontramos diferencias en nuestros ensayos de ChIP que podrían explicar el aumento en Cck La expresión de ARNm en los ratones 11A después de 2 semanas de expresión de ΔFosB y decidió investigar más este mecanismo.

Aumentos de FOSB a corto plazo Cck expresión en múltiples sistemas

La caracterización de microarrays de ratones 11A bi-transgénicos que sobreexpresan ΔFosB en el estriado encontró que Cck los niveles de expresión aumentan después de 2 semanas de sobreexpresión y luego disminuyen gradualmente con períodos más largos de expresión de ΔFosB (Figura 2A, n = 3). Validamos este efecto para Cck utilizando PCR en tiempo real en un grupo separado de animales en las semanas 2 y 8 y encontró que los resultados en los dos puntos de tiempo son similares al análisis de microarrays (datos no mostrados).

Figura 2 y XNUMX

Figura 2 y XNUMX

Sobreexpresión a corto plazo de increasesFosB aumenta Cck la expresion genica. (A) Cck Expresión de ARNm en el cuerpo estriado después de la sobreexpresión de BFosB en ratones 11A durante las semanas 1, 2, 4 o 8. El análisis de micromatrices se realizó en muestras estriadas y Cck ...

Para investigar más a fondo la capacidad de ΔFosB para regular Cck expresión, utilizamos células PC12 transfectadas transitoriamente con un CckPlásmido indicador de la luciferasa y un plásmido de expresión ΔFosB o una cantidad igual de pCDNA. Los dos días (n = 5-9) y tres (n = 11-13) de la sobreexpresión de ΔFosB dieron como resultado un aumento significativo en Cck-expresión de la luciferasa. Además, tres días de sobreexpresión de ΔFosB dieron como resultado significativamente más CckInducción de la luciferasa en comparación con dos días de sobreexpresión (Figura 2B). La sobreexpresión de ΔFosB no indujo la expresión de una construcción de luciferasa sin promotor (datos no mostrados). Bajo ninguna condición de tratamiento hubo una reducción en CckActividad de la luciferasa aparente. Estos resultados muestran que la expresión de ΔFosB a corto plazo aumenta la actividad de la Cck promotor, y deja sin respuesta el mecanismo por el cual la sobreexpresión de ΔFosB a largo plazo suprime Cck expresión.

OverLa sobreexpresión de FosB aumenta el enlace en un sitio de enlace putativo de CREB en el Cck promotor

Nuestros análisis encontraron que Cck la expresión se incrementa después de la expresión de ΔFosB a corto plazo, sin embargo, nuestros ensayos de ChIP encontraron que ni CREB ni ΔFosB se unen a Cck promotor. Para determinar si hay cambios en la unión de proteínas en el Cck promotor después de la sobreexpresión de ΔFosB, utilizamos ensayos de cambio de movilidad electroforética (EMSA) con una sonda que contiene el supuesto sitio similar a CRE presente dentro del Cck promotor. Usando extractos nucleares de estrías de ratones 11A que sobreexpresan ΔFosB durante semanas 2, encontramos un aumento en la unión al sitio CRE potencial en el Cck promotorFigura 3 A, C, n = 4). Curiosamente, los ratones 11A sobreexpresan ΔFosB durante las semanas 8, que muestran una disminución en Cck expresión, también mostró un aumento de la unión en este sitio (Figura 3B, C, n = 4). Como comparación, examinamos la unión a un sitio CRE de consenso en ratones que sobreexpresan ΔFosB durante 2 semanas y encontramos una fuerte unión a CRE en extractos del cuerpo estriado, pero no hay aumento en la unión después de la inducción de ΔFosB (Figura 3F, n = 4). Por lo tanto, a pesar de un aumento en los niveles de CREB total inducido por CREFosB visto en este momento, estos resultados están en línea con nuestros ensayos de ChIP que encuentran que el aumento de la unión de CREB en los promotores después de la sobreexpresión de ΔFosB es específico de solo ciertos genes y no es un fenómeno global . Para determinar si CREB está vinculado a la Cck promotor en nuestro análisis EMSA, realizamos ensayos de supershift con un anticuerpo específico para CREB. De acuerdo con nuestros ensayos ChIP, no encontramos ninguna vinculación de CREB a un Cck la sonda que contiene el sitio CRE putativo en los ensayos EMSA, mientras que CREB se unió y superpuso significativamente un sitio CRE de consenso (Figura 3D, E, n = 4). La actividad de unión al ADN en el Cck el promotor tampoco se vio afectado por un anticuerpo contra ΔFosB (datos no mostrados), en las condiciones mostradas en varios estudios anteriores para bloquear la unión de ΔFosB a sitios AP-1 bona fide (Hope et al., 1994a, 1994b; Chen et al., 1995, Hiroi et al., 1998). También realizamos ensayos de ChIP en striata de animales 11A después de 8 semanas de expresión de ΔFosB y aún no encontramos unión de CREB o ΔFosB en el Cck promotor (datos no mostrados). Por lo tanto, la expresión de ΔFosB conduce a un aumento en la unión de proteínas en el Cck promotor después de las dos semanas de expresión de 2 y 8; Sin embargo, la identidad de estos factores sigue siendo desconocida.

Figura 3 y XNUMX

Figura 3 y XNUMX

La unión de proteínas en el Cck promotor. (A, B) Ensayo de cambio de movilidad electroforética utilizando el Cck Sitio similar a CRE con tejido estriado de animales que sobreexpresan ΔFosB durante 2 semanas (A) o 8 semanas (B). En (A), competencia con exceso de competidor sin etiqueta. ...

El supuesto sitio CRE en el Cck El promotor no es responsable de una mayor actividad del promotor.

Desde que encontramos un aumento en la unión de proteínas usando un fragmento de la Cck promotor, que contiene el sitio CRE putativo, después de la sobreexpresión de BFosB, queríamos determinar si este sitio es necesario para aumentar Cck Expresión después de la sobreexpresión de ΔFosB. Para probar esta posibilidad, transfectamos células PC12 con un Cck- Plásmido de la luciferasa que contiene su sitio intacto de tipo CRE o uno que contiene una mutación en el sitio que anularía cualquier interacción con CREB. Curiosamente, la mutación del sitio similar a CRE disminuyó basal Cck actividad promotora por 32% (Figura 4A, n = 9), pero no afectó a la Cck inducción del promotor por sobreexpresión de ΔFosB (Figura 4B, n = 11-13). Esto sugiere que, aunque el Cck el promotor requiere un sitio similar a CRE intacto para la actividad basal completa, la actividad incrementada del promotor inducida por la sobreexpresión de ΔFosB no requiere la secuencia similar a CRE.

Figura 4 y XNUMX

Figura 4 y XNUMX

La Cck-al igual que el sitio CRE no es necesario para Cck Inducción por ΔFosB. (A) CckLa actividad de la luciferasa se midió 2 días después de la transfección con cualquiera de los valores normales. Cck-luciferasa o una en la que se mutó el sitio de tipo CRE. * p <0.05 (B) Cck-luciferasa ...

cFos se une a la Cck promotor

Estudios previos han encontrado que cFos El ARNm aumenta con la expresión de ΔFosB a corto plazo, sin embargo, después de la expresión prolongada de ΔFosB, la capacidad del tratamiento con cocaína para inducir cFos en el estriado se reduce (McClung y Nestler, 2003; Renthal et al., 2008). Por lo tanto, podría ser posible que cFos contribuya al aumento de Cck Expresión después de la expresión de ΔFosB a corto plazo. Realizamos ensayos de ChIP con un anticuerpo específico para cFos y medimos la unión de cFos en el Cck Promotor con y sin expresión de termFosB a corto plazo. Mientras que encontramos que cFos se une a la Cck promotor, esta unión no aumentó significativamente después de la sobreexpresión de ΔFosB (Figura 5 y XNUMX, n = 5). Esto sugiere que ya que cFos une al Cck promotor, puede contribuir a la regulación general de Cck expresión, pero es probable que no esté involucrado en la regulación de la Cck Promotor por ΔFosB.

Figura 5 y XNUMX

Figura 5 y XNUMX

cFos se une a la Cck promotor. Los ensayos de inmunoprecipitación de cromatina se realizaron con un anticuerpo específico para cFos utilizando tejido del cuerpo estriado de ratones con sobreexpresión de BFosB en dox, o después de 2 semanas de eliminación de dox. El análisis de PCR en tiempo real fue ...

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DISCUSIÓN

Este estudio confirma y amplía los hallazgos previos que muestran que ΔFosB regula la expresión génica en el cuerpo estriado y encontramos que lo hace a través de múltiples mecanismos después de la expresión a corto plazo. Mostramos que, después de 2 semanas de sobreexpresión, ΔFosB se une directamente a los promotores en ciertos genes que conducen a cambios en la expresión (es decir, CDK5). Además, aumenta los niveles de proteína CREB, un efecto observado en las células cultivadas, así como en el cuerpo estriado, lo que lleva a un aumento de la unión de CREB en otros promotores de genes (es decir, dinorfina y BDNF). En un estudio anterior, encontramos que la sobreexpresión a corto plazo de ΔFosB en el cuerpo estriado conduce a muchos de los mismos cambios en la expresión de los genes que se encuentran cuando se sobreexpresa CREB, y conduce a respuestas de comportamiento similares en las medidas de preferencia de la cocaína (McClung y Nestler, 2003). Por lo tanto, el presente descubrimiento de que ΔFosB conduce a una inducción de CREB, así como a la unión de CREB a ciertos promotores de genes, ayuda a explicar por qué estos dos factores de transcripción comparten muchos de los cambios en la expresión de genes.

La inducción de CREB por ΔFosB es interesante, ya que se ha demostrado que las drogas de abuso inducen cambios en los niveles de CREB fosforilados en serina 133 (Mattson et al., 2005) y aumentar la transcripción mediada por CRE (Barrot et al., 2002; Shaw-Lutchman et al., 2002, 2003), sin alterar los niveles generales de CREB. Es posible que los cambios en los niveles de CREB puedan ser transitorios, y, por lo tanto, se pierdan fácilmente en otros estudios. En nuestras manos, hemos visto aumentos inducidos por la cocaína en el ARNm de CREB en experimentos particulares, sin embargo, este efecto es muy variable (observación no publicada). Dado que tanto los ratones transgénicos 11A como las células PC-12 muestran inducción de CREB luego de la sobreexpresión de ΔFosB a corto plazo, esto sugiere que CREB es inducido por ΔFosB (o un objetivo de ΔFosB), lo que proporciona otro mecanismo para explicar los cambios inducidos por el fármaco en el gen expresión.

Sorprendentemente, encontramos que ni CREB ni ΔFosB se unen a la Cck promotor aunque Cck La expresión está claramente regulada al alza después de la expresión de ΔFosB a corto plazo. Cck es un neuropéptido abundante expresado tanto en VTA como en NAc (Hokfelt et al., 1980) y es probable que esté involucrado en las respuestas de comportamiento a las drogas de abuso (Josselyn et al., 1996; Josselyn et al., 1997; Hamilton, et al., 2000; Beinfeld et al., 2002; Rotzinger y otros, 2002). En ensayos de cultivo celular, el Cck el promotor se ha caracterizado ampliamente y se ha demostrado que responde a los miembros de la familia CREB y AP-1 (revisado por Hansen, 2001). Haun y Dixon (1990) mostró que los complejos AP-1 pueden unirse a la Cck Sitio similar a CRE in vitro, y más tarde se demostró, utilizando células de neuroblastoma SK-N-MC, que la mutación del sitio similar a CRE redujo la capacidad de respuesta del promotor a cFos / cJun sobreexpresado (Rourke et al., 1999). De hecho, también encontramos aumento Cck actividad promotora (Figura 2 y XNUMX) y el enlace en o alrededor del elemento similar a CRE (Figura 3 y XNUMX) tras la sobreexpresión de ΔFosB, otro miembro de la familia AP-1, pero no encontramos una unión directa de ΔFosB a la Cck promotor in vivo or in vitro, incluso en su sobreexpresión.

Mucho trabajo ha demostrado un papel para CREB en la regulación de Cck Actividad promotora. los Cck El sitio similar a CRE se conserva en los vertebrados (Hansen, 2001) y, en algunos ensayos de cultivo celular, tanto los complejos CREB como AP-1 se unen a este sitio y son necesarios para Cck actividad promotora (Haun y Dixon, 1990; Deavall, et al., 2000; Hansen, 2001). Adicionalmente, varios activadores conocidos de Cck Se ha demostrado que la expresión (incluidos bFGF, PACAP, peptonas y despolarización) actúa a través de CREB (Hansen, et al., 1999; Deavall, et al, 2000; Bernard, et al., 2001; Gevrey, et al., 2002; Hansen, et al., 2004). Nuestro CckLos datos del gen reportero de la luciferasa apoyan un papel esencial para el sitio similar a CRE en la regulación de Cck Actividad promotora, ya que la mutación de este sitio reduce el basal. Cck actividad promotora y CckLa expresión de la luciferasa inducida por VP16-CREB, una forma constitutivamente activa de CREB, se pierde cuando este sitio está mutado (observación no publicada). Por lo tanto, nos sorprendió descubrir que CREB no parece vincularse a la Cck promotor en extractos estriados, ya sea en la línea de base o en la sobreexpresión de ΔFosB a corto plazo cuando se incrementan los niveles de CREB. Esto argumenta que los niveles de CREB per se no son el único factor para determinar la cantidad de enlace en este sitio, y esto está respaldado por el trabajo de otros (Cha-Molstad, et al., 2004). Dado que los promotores de otros genes diana CREB previamente identificados, como BDNF y prodinorfina, se unió a CREB, confiamos en nuestro descubrimiento de que CREB no está vinculado a la Cck Promotor en extractos nucleares estriatales. Además, la inducción de CckLa actividad de la luciferasa de ΔFosB no dependía del sitio intacto de CRE, lo que sugiere que ΔFosB no regula Cck expresión mediante la regulación de la unión directa de CREB a la Cck promotor.

Nuestra incapacidad para detectar CREB interactuando con el Cck el promotor es apoyado por Renthal et al. (2009), que usó un enfoque de chip ChIP para observar los cambios globales en CREB fosforilado (pCREB) y la unión de osFosB en el estriado después de la exposición crónica a la cocaína. En estos experimentos, los complejos de ADN-proteína se inmunoprecipitaron con anticuerpos ΔFosB o pCREB y el ADN precipitado, después del marcado, se hibridó con un microarray promotor. Si bien muchos genes objetivo CREB previamente caracterizados se identificaron con este enfoque (por ejemplo, BDNF, prodynorphin), Cck no fue identificado Además, se ha demostrado que la unión de CREB a un sitio CRE de consenso varía mucho entre líneas celulares cultivadas (Cha-Molstad, et al., 2004). Todos los estudios previos que encontraron interacciones de CREB con el Cck el promotor se llevó a cabo en un cultivo celular (no en el cerebro del que se derivaron nuestras muestras EMSA y ChIP) y se usaron ensayos de cambio de gel para investigar las interacciones proteína-ADN. Mientras que una EMSA puede evaluar el potencial de un factor para unirse a una secuencia de ADN, los ensayos de ChIP brindan una nueva mirada a estas interacciones in vivo. Además, gran parte de los datos que demuestran la inducción de Cck actividad promotora o enlace CREB a la Cck Se obtuvieron promotores a partir de células que habían sido estimuladas por factores como las peptonas (Bernard et al., 2001), despolarización (Hansen, et al., 2004), o una variedad de activadores de cascadas de señalización intracelular incluyendo cAMP y ERK (Hansen et al., 1999). En nuestros experimentos, el único "estímulo" utilizado fue la sobreexpresión de ΔFosB, que es suficiente para inducir Cck expresión. En conjunto, esto sugiere que la capacidad de CREB para vincularse (y potencialmente regular) a la Cck El promotor depende en gran medida del tipo de célula y la activación de vías de señalización particulares. Además, el Cck El elemento promotor similar a CRE (al menos en las células PC12 no inducidas y en el estriado del ratón) no es un objetivo directo de CREB o ΔFosB. Curiosamente, la regulación de FosB La expresión de CREB también es específica para el tipo de célula y el tipo de estimulación. Un estudio de Andersson. et al. encontraron que la inyección de oligonucleótidos antisentido CREB en el estriado del ratón inhibió parcialmente la inducción de FosB tras la administración de cocaína (Andersson y otros, 2001). Sin embargo, también encontraron que la capacidad de L-Dopa para inducir FosB La expresión en el cuerpo estriado lesionado por 6-OHDA no se vio influenciada por la presencia de oligonucleótidos antisentido CREB.

Dado que CREB y ΔFosB parecen regular indirectamente el Cck promotor, y los cambios en la estructura de la cromatina se han documentado en respuesta a una variedad de estímulos que inducen ΔFosB (Tsankova et al., 2004; Kumar et al., 2005; Renthal et al., 2008), razonamos que ΔFosB podría modular indirectamente la actividad del promotor al alterar la estructura de la cromatina. Sin embargo, en ratones que sobreexpresan ΔFosB durante 2 semanas, no hubo cambios en la acetilación de la histona H3 en el Cck promotorTabla 1). Esto es apoyado por los datos de chip de ChIP Renthal et al. (2009), que no informó ningún cambio en la unión de H3 acetilado en el Cck Promotor en ratones expuestos a cocaína crónica. Desde el Cck el promotor es activo en el cuerpo estriado, no se esperaba ni se observó unión a la histona metilada metilada H3. Curiosamente, tampoco vimos ningún cambio debido a la sobreexpresión de ΔFosB en el enlace de H3 acetilado en el BDNF promotor (que mostró un aumento de la unión CREB) o en el CDK5 y prodinorfina Promotores (que mostraron un aumento de la unión de ΔFosB). Dado que hay una gran cantidad de modificaciones de histonas asociadas con cambios en la actividad del promotor (revisado por Rando y Chang, 2009), es probable que haya otras modificaciones de la cromatina que se asocian con la inducción de estos genes. Cualquier modificación de la cromatina individual, aunque a menudo predice el nivel de actividad del promotor, no puede cambiar durante la activación de un gen en particular. En un trabajo futuro, sería interesante observar otros cambios potenciales en la estructura de la cromatina en torno al Cck promotor después de la sobreexpresión de ΔFosB. Curiosamente, la cocaína crónica (probable vía Se ha demostrado que la inducción de BFosB) induce la expresión de sirtuina 1 y 2, histonas desacetilasas de clase III que parecen alterar la fisiología neuronal, la señalización de ERK y las respuestas de comportamiento a la cocaína (Renthal et al., 2009). La inducción de una histona desacetilasa tendría la capacidad de regular simultáneamente la expresión de un gran número de genes vía Cambios globales en la estructura de la cromatina.

Un posible candidato involucrado en Cck La regulación después de la sobreexpresión de ΔFosB fue el miembro de la familia AP-1 cFos. La expresión de cFos está regulada por CREB (Sheng et al., 1990; Impey et al., 2004), y aumenta la sobreexpresión de cFos (concordante con la sobreexpresión de su socio vinculante cJun) Cck actividad promotora (Rourke et al., 1999). Por lo tanto, el aumento de los niveles de CREB debido a la sobreexpresión de ΔFosB a corto plazo podría aumentar los niveles de cFos y dar como resultado una mayor unión a la Cck CRE-como sitio. cfos Se induce ARNm en ratones después de dos semanas de sobreexpresión de ΔFosB (McClung y Nestler, 2003) y disminuyó en ratones expuestos a cocaína crónica o sobreexpresión de ΔFosB a largo plazo (Renthal et al., 2008). Aquí encontramos que cFos se une directamente a la Cck promotor en el tejido estriado, sin embargo, la sobreexpresión de FosB no aumenta significativamente la unión. Esto sugiere que si bien cFos podría estar involucrado en la regulación Cck expresión en general, un cambio en la unión de cFos por sí solo no es el mecanismo por el cual ΔFosB regula Cck expresión. Sin embargo, es posible que ΔFosB pueda inducir cambios postraduccionales en cFos (p. Ej., Alteración de la fosforilación) o inducir la expresión de un compañero de unión (como cJun) o proteína coactivadora. Sin embargo, dado que el sitio intacto de tipo CRE (que anteriormente se ha demostrado que es un sitio de enlace para los complejos AP-1, vea Haun y Dixon, 1990) no se requiere para el aumento Cck la actividad del promotor vista con la sobreexpresión de ΔFosB (según se evaluó en nuestros experimentos de genes informadores), es lógico que otros factores de acción trans también estén regulados por ΔFosB.

La Cck el fragmento promotor utilizado en nuestros experimentos con el gen indicador de luciferasa contiene un sitio de unión a Sp1 conservado y una caja E (revisada por Hansen, 2002). En particular, se ha demostrado que las secuencias de la caja E se unen a numerosos factores de transcripción (revisado por Forrest y McNamara, 2004). Usando células PC12, hemos visto que la mutación de la E-box disminuye Cck actividad del promotor, pero no altera la respuesta del promotor a ΔFosB (datos no mostrados). Curiosamente, un CckEl informador de la luciferasa que contiene mutaciones tanto en el sitio CRE como en la casilla E no tiene actividad basal detectable y no responde a la sobreexpresión de ΔFosB (observación no publicada). Otro mediador potencial de la acción de ΔFosB en el Cck Los promotores son ATF, y se sabe que ciertas formas son inducidas en el estriado por la exposición crónica a los psicoestimulantes (Green et al., 2008). Sin embargo, no hemos encontrado evidencia de la inducción de ΔFosB de estos ATF (datos no mostrados), y no se esperaría que los ATF se unan al sitio mutado similar a CRE en el Cck promotor.

Una advertencia de este estudio es que estamos usando un sistema bi-transgénico para sobreexpresar ΔFosB y, por lo tanto, uno debe ser conservador al establecer paralelismos entre este paradigma y la administración de cocaína crónica. Sin embargo, los ratones transgénicos 11A brindan la oportunidad única de observar los efectos específicos de ΔFosB en el cuerpo estriado, ya que la sobreexpresión se limita a esta región del cerebro (Chen et al., 1998), mientras que la administración de cocaína induce cambios en una amplia variedad de otras regiones cerebrales que pueden afectar indirectamente al cuerpo estriado. Además, varios estudios han documentado fenotipos moleculares y de comportamiento similares en los ratones 11A en comparación con animales no transgénicos tratados con cocaína crónica (Kelz et al., 1999; McClung y Nestler, 2003; Renthal et al., 2009). Adicionalmente, Bibb et al. (2001) informó niveles similares de estriado Cdk5 La inducción de ARNm y proteínas en esta misma cepa 11A en comparación con los compañeros de camada no transgénicos tratados con cocaína, así como los cambios similares en los objetivos CDK5, p35 y DARPP-32.

En conclusión, encontramos que la expresión de ΔFosB a corto plazo conduce a la inducción de genes en el estriado a través de múltiples mecanismos. Estos incluyen la unión directa al promotor, la inducción de la proteína CREB y la actividad, la modificación de la cromatina, además de las vías aún por determinar.

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PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES

Animales

En este estudio se utilizaron animales machos bi-transgénicos 11A (NSE-tTA x TetOP-ΔFosB) y se caracterizan en Kelz et al., 1999. Para sobreexpresar ΔFosB, los ratones se retiraron de la doxiciclina entre las semanas de edad 3 y 6, mientras que los ratones de control se mantuvieron en doxiciclina. Todos los ratones se alojaron en grupo y se mantuvieron en un ciclo de luz / oscuridad 12: 12, las luces se encendieron en 7 am y las luces se apagaron en 7 pm, con a voluntad Acceso a comida y agua. Todos los experimentos con ratones cumplieron con los protocolos aprobados por el comité de cuidado y uso de animales del Centro Médico Southwestern de la Universidad de Texas en Dallas.

Reportero y plásmidos de expresión.

El tipo salvaje (WT) Cck Se preparó el promotor luciferase reportero insertando un fragmento de PCR de aproximadamente 200 pb en el vector pGL3-luc (Promega). Este fragmento se obtuvo de ADN genómico de ratón (cebadores: 5 'TATCCTCATTCACTGGGACGC 3' en sentido ascendente, y 5 'TACCTTTGGATGGGGAAATCG 3' en sentido descendente) e inicialmente insertado en el vector pGEM-T Easy (Promega, #A1360). El fragmento promotor se clonó luego en los sitios de enzimas de restricción Kpn1 / Xho1 de pGL3-luc.

Para crear la mutación puntual CRE en el Cck promotor, un cebador mutagénico dirigido contra un sitio similar a CRE previamente informado (cebador de sentido: 5'CGTGTCCTGCTGGACTGAGCTCGCACTGGGTAAACA 3 ', cebador antisentido: 5'CTGTTTACCCAGTGCGCGCTGAGTCCAGCAGGACACG 3') se utilizó en combinación con el kit de fabricación de mutagénesis de Stratagene . Esto convierte el sitio similar a CRE informado (ACTGCGTCAGC) en ACTGAGCTCC. Todos los plásmidos informadores se confirmaron mediante secuenciación de ADN. El plásmido de expresión de ΔFosB contiene una secuencia de ΔFosB de longitud completa insertada en el sitio de clonación múltiple de pCDNA 3.1 y se ha descrito anteriormente (Ulery y Nestler, 2007).

Cultivo celular y transfecciones de ADN.

Las células de feocromocitoma de rata (PC12) se mantuvieron en medio F-12 de Eagle modificado por Dulbecco, suplementado con suero de caballo al 10%, suero bovino fetal al 5% y penicilina / estreptomicina al 1% a 37 ° C y 5% de CO2. Las células se transfectaron mediante electroporación usando un electroporador BTX 360 (350 V, 0 ohmios y 850 μF) en 800 μl de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco en cubetas con brecha de 4 mm con 10 μg del indicador y 5 μg de la construcción de expresión. Se utilizó un plásmido de vector vacío (pCDNA) para normalizar las cantidades totales de ADN. Después de la transfección, las células se cultivaron en placas recubiertas de colágeno de 35 mm durante los períodos de tiempo indicados.

Ensayos de luciferasa

Dos o tres días después de la transfección, las células se lavaron 3 veces en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco, se lisaron (usando glicilglicina 25 mM, MgSO 15 mM4, 4 mM EGTA, 1% Triton X-100, pH 7.8, 1 mM DTT), se recogieron y se aclararon mediante centrifugación. 30 μL de lisado se combinó con 140 μL de tampón de ensayo de luciferasa (25 mM glicilglicina, 15 mM MgSO)4, 4 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM ATP, 1 mM fosfato de potasio, 1 mM coenzima A, pH 7.8). La actividad de luminiscencia se midió utilizando un lector de fluorescencia de microplacas FLx-800 después de una inyección automática de 40 μL 1 mM luciferina por pocillo. La actividad de la luciferasa se normalizó al contenido total de proteínas según lo determinado por un ensayo de proteínas BioRad.

Ensayo de cambio de movilidad electroforética

Extractos nucleares de cortes bilaterales de estriado de ratones 11A bi-transgénicos (que se mantuvieron dentro o fuera de la doxiciclina durante las semanas 2 o 8) (McClung y Nestler, 2003) fueron preparados de acuerdo a Huang y Walters (1996). 32Las sondas de oligonucleótidos de doble cadena marcadas con P se prepararon usando el protocolo del sistema de ensayo de cambio de gel Promega (#E3300) y las sondas se purificaron usando columnas de giro rápido de Roche. Las secuencias de consenso de CRE y AP-1 fueron de Promega (#E328A y E320B, respectivamente) y Cck Las secuencias CRE fueron (sentido Cck-CRE: CTAGCGAGCTCTGGACTGCGTCAGCACTGGGTGCA; antisentido Cck-CRE: CCCAGTGCTGACGCAGTCCAGAGCTCGCTAGCTTT).

Las reacciones de unión y la electroforesis se realizaron utilizando modificaciones del procedimiento del sistema de ensayo de cambio de gel Promega (#E3300). 50,000 CPM de la sonda marcada se combinó con 10 μg de extracto nuclear del cuerpo estriado. Se agregaron ADN o anticuerpos competidores fríos antes de la introducción de las sondas radiomarcadas. Para los experimentos de supershift, se utilizaron 2 μg de anticuerpo CREB (Upstate Biotechnology # 06-083). Las reacciones se sometieron a electroforesis en geles de poliacrilamida 4%, se secaron y se expusieron a una película (usando pantallas de intensificación durante 1 hora a 2 días).

Inmunotransferencia

Para las células PC12, se lavaron placas de 35 mm de células transfectadas en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco enfriada con hielo y los lisados ​​se prepararon en tampón de lisis RIPA enfriado con hielo (Tris 50 mM pH 7.4, NaCl 5 mM, EDTA 5 mM, desoxicolato al 1%, 1 % Triton X-100, 0.1% de dodecilsulfato de sodio) que contiene inhibidores de proteasa. Después de la sonicación, el aclaramiento y el ensayo de proteínas de Bradford, los lisados ​​se desnaturalizaron por completo y se sometieron a electroforesis 50 µg de cada muestra en geles de poliacrilamida SDS al 10%. Las proteínas se transfirieron a la membrana de PVDF, se bloquearon durante 1 hora en leche en polvo desnatada al 3% en solución salina tamponada con Tris que contenía Tween-0.1 al 20% (leche TBS-T) y se sondaron durante la noche a 4 ° C con anticuerpos primarios (CREB- Upstate Biotechnology # 06-083, usado a 1: 1,000; GAPDH-Sigma # G8795, usado a 1: 80,000) diluido en leche TBS-T. Después de múltiples lavados en TBS-T, las transferencias se sondaron durante una hora a temperatura ambiente usando anticuerpos secundarios conjugados con fosfatasa alcalina (Sigma) diluidos 1: 5,000 en leche TBS-T. Después de múltiples lavados en solución salina tamponada con Tris, la reacción de color se realizó de acuerdo con las instrucciones de BioRad (nº 170-6432). Las membranas se secaron durante la noche, se escanearon en un escáner de superficie plana y se realizó una densitometría usando ImageJ (ver más abajo).

Para los extractos estriatales, los análisis de transferencia de Western se llevaron a cabo como se publicó anteriormente (Hope et al., 1994). Se extrajo el tejido de los ratones decapitados, se colocó en hielo y se seccionó en una matriz cerebral con un espesor de 1 mm. Luego se tomaron punzones de tejido y se congelaron a -80 ° C hasta su uso. El tejido se sonicó en hielo en un tampón a base de detergente modificado que contenía inhibidores de la fosfatasa y proteasa (Roche, Sigma). Después de la sonicación, las muestras se desnaturalizaron en agua hirviendo y se centrifugaron a 15,000xg durante 15 minutos; el sobrenadante fue posteriormente recogido y procesado; cantidades de concentración de proteína se cuantificaron usando un ensayo de Bradford (Bio-Rad). Las muestras se analizaron en un gel de acrilamida / bisacrilamida 10%, se transfirieron a una membrana de PVDF, se bloquearon en leche 5% y se incubaron con anticuerpos primarios (Anti-CREB, Upstate, Lake Placid, NY). Las transferencias se visualizaron posteriormente usando un sistema de quimioluminiscencia (Pierce). Todas las muestras se normalizaron a GAPDH (Fitzgerald, Concord, MA). Las curvas de calibración se llevaron a cabo para asegurar que estamos en el rango lineal del ensayo.

Analisis de densitometria

Para las inmunotransferencias de PC12, se realizó un análisis de densitometría utilizando ImageJ con calibración de barra de varilla. Se restó la señal de fondo promedio de cada medición y se calculó la relación de CREB a GAPDH para cada muestra. Para las inmunotransferencias estriatales y el análisis EMSA, se usó Scion Image 1.62c con la resta de fondo.

Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)

Los ensayos de ChIP se realizaron de acuerdo con los métodos de Tsankova et al. (2004) y Kumar et al. (2005). Brevemente, las muestras estriatales bilaterales de ratones 11A mantenidas con o sin doxiciclina se reticularon con formaldehído al 1% y la reticulación se inactivó con glicina (concentración final de 0.125 M). Estas muestras eran de cortes enteros de cerebro tomados al nivel del núcleo accumbens con la corteza extraída. La cromatina se cortó en fragmentos de aproximadamente 0.2 a 1 kb mediante sonicación, se aclaró con perlas de proteína G (Thermo Scientific nº 22852) y se congelaron las muestras de entrada a -80ºC. Se utilizaron entre 60 y 100 µg de cromatina para cada precipitación. Se usaron 5-10 μg de cada anticuerpo primario (CREB: Upstate Biotechnology # 06-863, ΔFosB: Santa Cruz Biotechnology # SC-48x, H3 acetilado: Upstate Biotechnology # 06-599, H3 metilado (LYS9): Cell Signaling Technology, cFos: Biotecnología de Santa Cruz # SC-7202x). Se inmunoprecipitaron complejos de anticuerpo-cromatina con proteína G más perlas de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Thermo Scientific nº 22852). Después de la reticulación inversa de las muestras de entrada y precipitadas, cada muestra se sometió a PCR cuantitativa (qPCR). El uso de todos estos anticuerpos para ChIP ha sido ampliamente validado (Tsankova et al., 2004; Kumar et al., 2005; Renthal et al., 2009).

Los niveles de unión a proteínas en cada gen promotor de interés se determinaron midiendo la cantidad de ADN asociado mediante qPCR (Applied Biosystems (ABI) Prism 7700, Foster City, CA). El ADN de entrada o total (no inmunoprecipitado) y el ADN inmunoprecipitado se amplificaron por triplicado en presencia de SYBR Green (Applied Biosystems, CA). Los valores Ct de cada muestra se obtuvieron usando el software Sequence Detector 1.1. La cuantificación relativa de la plantilla de ADN se realizó utilizando el método ΔΔCt (Tsankova et al., 2004). Cebadores utilizados: promotor BDNF 4: CTTCTGTGTGCGTGAATTTGCT; AGTCCACGAGAGGGCTCCA promotor de CDK5: GCTGAAGCTGTCAGGAGGTC; GTGCCCCGCTCTTGTTATTA Cck promotor: CTTGGGCTAGCCTCATTCACTG; TTAAATAGCTCCTCCCGGTTCG Promotor de Prodynorphin: GGCTTCCTTGTGCTTCAGAC; GCGCTGTTTGTCACTTTCAA.

análisis estadístico

Todos los datos se presentan como medias ± error estándar de la media. La diferencia estadística se determinó mediante la prueba t de dos colas de Student (p <0.05). Cuando se realizaron comparaciones múltiples, los valores de p se ajustaron mediante la corrección de Bonferroni.

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Agradecimientos

Nos gustaría dar las gracias a Will Renthal y Arvind Kumar útil para los debates. También nos gustaría agradecer a NIDA por financiar estos experimentos.

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Notas a pie de página

Descargo de responsabilidad del editor: Este es un archivo PDF de un manuscrito sin editar que ha sido aceptado para publicación. Como servicio a nuestros clientes, proporcionamos esta primera versión del manuscrito. El manuscrito se someterá a revisión, composición y revisión de la prueba resultante antes de que se publique en su forma final. Tenga en cuenta que durante el proceso de producción se pueden descubrir errores que podrían afectar el contenido, y todas las exenciones de responsabilidad legales que se aplican a la revista pertenecen.

Términos de clasificación:

Sección: #1 Biología celular y molecular de los sistemas nerviosos.

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Referencias

  1. Andersson M, Konradi C, Cenci MA. La proteína de unión al elemento de respuesta a AMPc es necesaria para la expresión de genes dependientes de dopamina en el cuerpo estriado intacto pero no denervado por dopamina. J Neurosci. 2001; 21: 9930-43. ElPubMed]
  2. Barrot M, Olivier JD, Perrotti LI, DiLeone RJ, Berton O, Eisch AJ, Impey S, Storm DR, Neve RL, Yin JC, Zachariou V, Nestler EJ. La actividad CREB en el núcleo accumbens shell controla la activación de las respuestas de comportamiento a los estímulos emocionales. Proc Natl Acad Sci US A. 2002; 99: 11435 – 40. ElArtículo gratuito de PMC] [PubMed]
  3. Beinfeld MC, Connolly KJ, Pierce RC. El tratamiento con cocaína aumenta la colecistoquinina extracelular (CCK) en la cáscara del núcleo accumbens de ratas despiertas que se mueven libremente, un efecto que aumenta en ratas con sensibilidad conductual a la cocaína. J Neurochem. 2002; 81: 1021-7. ElPubMed]
  4. Bernard C, Sutter A, Vinson C, Ratineau C, Chayvialle J, Cordier-Bussat M. Las peptonas estimulan la transcripción del gen de la colecistoquinina intestinal mediante factores de unión al elemento de respuesta al monofosfato de adenosina cíclicos. Endocrinología. 2001; 142: 721-9. ElPubMed]
  5. Bibb JA, Chen J, Taylor JR, Svenningsson P, Nishi A, Snyder GL, Yan Z, Sagawa ZK, Ouimet CC, Nairn AC, Nestler EJ, Greengard P. Los efectos de la exposición crónica a la cocaína están regulados por la proteína neuronal Cdk5. Naturaleza. 2001; 410: 376-80. ElPubMed]
  6. Cha-Molstad H, Keller DM, Yochum GS, Impey S, Goodman RH. Unión específica del tipo de célula del factor de transcripción CREB al elemento de respuesta cAMP. Proc Natl Acad Sci US A. 2004; 101: 13572 – 7. ElArtículo gratuito de PMC] [PubMed]
  7. Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y, Hope BT, Nestler EJ. Regulación de proteínas delta FosB y similares a FosB mediante convulsiones electroconvulsivas y tratamientos con cocaína. Mol Pharmacol. 1995; 48: 880-9. ElPubMed]
  8. Chen J, Kelz MB, Zeng G, Sakai N, Steffen C, Shockett PE, Picciotto MR, Duman RS, Nestler EJ. Animales transgénicos con expresión génica dirigida e inducible en el cerebro. Mol Pharmacol. 1998; 54: 495 – 503. ElPubMed]
  9. Chen J, Zhang Y, Kelz MB, Steffen C, Ang ES, Zeng L, Nestler EJ. Inducción de la quinasa 5 dependiente de ciclina en el hipocampo por convulsiones crónicas electroconvulsivas: papel de ΔFosB. J Neurosci. 2000; 20: 8965-71. ElPubMed]
  10. Chinenov Y, Kerppola TK. Encuentros cercanos de muchos tipos: interacciones Fos-Jun que median la especificidad reguladora de la transcripción. Oncogenes 2001; 20: 2438-52. ElPubMed]
  11. Cole RL, Konradi C, Douglass J, Hyman SE. Adaptación neuronal a la anfetamina y la dopamina: mecanismos moleculares de la regulación del gen de la prodinorfina en el cuerpo estriado de la rata. Neurona. 1995; 14: 813-23. ElPubMed]
  12. Deavall DG, Raychowdhury R, ​​Dockray GJ, Dimaline R. Control de la transcripción del gen CCK por PACAP en células STC-1. Am J Physiol Gastrointest Hígado Physiol. 2000; 279: G605 – 12. ElPubMed]
  13. Ding XZ, Mocchetti I. Regulación dopaminérgica del contenido de ARNm de colecistoquinina en el estriado de rata. Brain Res Mol Brain Res. 1992; 12: 77-83. ElPubMed]
  14. Forrest S, McNamara C. Id familia de factores de transcripción y formación de lesiones vasculares. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2004; 24: 2014-20. ElPubMed]
  15. Gevrey JC, Cordier-Bussat M, Némoz-Gaillard E, Chayvialle JA, Abello J. Co-requerimiento de AMP cíclicas y proteína quinasas dependientes de calcio para la activación transcripcional del gen de la colecistoquinina por hidrolizados de proteínas. J Biol Chem. 2002; 277: 22407-13. ElPubMed]
  16. Green TA, Alibhai IN, Unterberg S, Neve RL, Ghose S, Tamminga CA, Nestler EJ. Inducción de los factores de transcripción activantes (ATF) ATF2, ATF3 y ATF4 en el núcleo accumbens y su regulación del comportamiento emocional. J Neurosci. 2008; 28: 2025-32. ElPubMed]
  17. Hamilton ME, Redondo JL, Freeman AS. Desbordamiento de dopamina y colecistoquinina en el núcleo de rata accumbens en respuesta a la administración aguda de fármacos. Sinapsis 2000; 38: 238-42. ElPubMed]
  18. Hansen TV, Rehfeld JF, Nielsen FC. Las vías de señalización de la proteína quinasa activada por mitógeno y la proteína quinasa A estimulan la transcripción de colecistoquinina mediante la activación de la proteína de unión al elemento de respuesta de 3 ', 5'-monofosfato cíclico de adenosina. Mol Endocrinol. 1999; 13: 466–75. [PubMed]
  19. Hansen TV, Nielsen FC. Regulación de la transcripción del gen de la colecistoquinina neuronal. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 2001; 234: 61-7. ElPubMed]
  20. Hansen TV. Transcripción del gen de la colecistoquinina: elementos promotores, factores de transcripción y vías de señalización. Péptidos 2001; 22: 1201-11. ElPubMed]
  21. Hansen TV, Rehfeld JF, Nielsen FC. El KCl y la forskolina regulan sinérgicamente la expresión del gen de la colecistoquinina a través de la activación coordinada de CREB y el coactivador CBP. J Neurochem. 2004; 89: 15-23. ElPubMed]
  22. Haun RS, Dixon JE. Un potenciador transcripcional esencial para la expresión del gen de la colecistoquinina de rata contiene una secuencia idéntica al elemento -296 del gen c-fos humano. J Biol Chem. 1990; 265: 15455-63. ElPubMed]
  23. Hiroi N, Marek GJ, Brown JR, Ye H, Saudou F, Vaidya VA, Duman RS, Greenberg ME, Nestler EJ. Papel esencial del gen fosB en las acciones moleculares, celulares y de comportamiento de las convulsiones crónicas electroconvulsivas. J Neurosci 1998. 1998; 18: 6952-62. ElPubMed]
  24. Hokfelt T, Rehfeld JF, Skirboll L, Ivemark B, Goldstein M, Markey K. Evidencia de coexistencia de dopamina y CCK en neuronas meso-límbicas. Naturaleza. 1980; 285: 476-8. ElPubMed]
  25. Esperanza BT, Kelz MB, Duman RS, Nestler EJ. El tratamiento de convulsiones electroconvulsivas crónicas (ECS) da como resultado la expresión de un complejo AP-1 de larga duración en el cerebro con composición y características alteradas. J Neurosci. 1994; 14: 4318-28. ElPubMed]
  26. Hope BT, Nye HE, Kelz MB, Self DW, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, Duman RS, Nestler EJ. Inducción de un complejo AP-1 de larga duración compuesto de proteínas similares a Fos alteradas en el cerebro mediante cocaína crónica y otros tratamientos crónicos. Neurona. 1994; 13: 1235 – 44. ElPubMed]
  27. Huang KX, Walters JR. Regulación dopaminérgica de la actividad de unión al ADN del factor de transcripción AP-1 en el estriado de rata. Neurociencia 1996; 75: 757-75. ElPubMed]
  28. Impey S, McCorkle SR, Cha-Molstad H, Dwyer JM, Yochum GS, Jefe JM, McWeeney S, Dunn JJ, Mandel G, Goodman RH. Definición del regulón CREB: un análisis genómico de las regiones reguladoras del factor de transcripción. Célula. 2004; 119: 1041-54. ElPubMed]
  29. Johannessen M, Delghandi MP, Moens U. ¿Qué enciende a CREB? Señal Celular. 2004; 16: 1211-27. ElPubMed]
  30. Josselyn SA, Vaccarino FJ. Efectos opuestos de los antagonistas de CCK (A) y CCK (B) sobre el desarrollo de la actividad condicionada en ratas. Behav Pharmacol. 1996; 7: 505-512. ElPubMed]
  31. Josselyn SA, De Cristofaro A, Vaccarino FJ. Evidencia de la participación del receptor CCK (A) en la adquisición de actividad condicionada producida por la cocaína en ratas. Brain Res. 1997; 763: 93-102. ElPubMed]
  32. Kelz MB, Chen J, Carlezon WA, Jr., Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR , Nestler EJ. La expresión del factor de transcripción deltaFosB en el cerebro controla la sensibilidad a la cocaína. Naturaleza. 1999; 401: 272 – 6. ElPubMed]
  33. Kumar A, Choi KH, Renthal W, Tsankova NM, Theobald DE, Truong HT, Russo SJ, Laplant Q, Sasaki TS, Whistler KN, Neve RL, Self DW, Nestler EJ. La remodelación de la cromatina es un mecanismo clave que subyace en la plasticidad inducida por la cocaína en el cuerpo estriado. Neurona. 2005; 48: 303-14. ElPubMed]
  34. Mattson BJ, Bossert JM, Simmons DE, Nozaki N, Nagarkar D, Kreuter JD, Hope BT. La fosforilación de CREB inducida por cocaína en el núcleo accumbens de ratas sensibilizadas con cocaína se habilita mediante la activación mejorada de la quinasa relacionada con la señal extracelular, pero no la proteína quinasa A. J Neurochem. 2005; 95: 1481-94. ElPubMed]
  35. McClung CA, Nestler EJ. Regulación de la expresión génica y recompensa de cocaína por CREB y DeltaFosB. Nat Neurosci. 2003; 6: 1208 – 15. ElPubMed]
  36. McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ. DeltaFosB: un interruptor molecular para la adaptación a largo plazo en el cerebro. Brain Res Mol Brain Res. 2004; 132: 146 – 54. ElPubMed]
  37. Nestler EJ, Kelz MB, Chen JS. ΔFosB: un mediador molecular de la plasticidad neural y conductual a largo plazo. Brain Res. 1999; 835: 10-17. ElPubMed]
  38. Nestler EJ. ¿Hay una vía molecular común para la adicción? Nat Neurosci. 2005; 8: 1445 – 9. ElPubMed]
  39. Nestler EJ. Mecanismos transcripcionales de la adicción: papel de DeltaFosB. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2008; 363: 3245-55. ElArtículo gratuito de PMC] [PubMed]
  40. Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S, Elmore RG, Knapp DJ, Selley DE, Martin BR, Sim-Selley L, Bachtell RK, Self DW, Nestler EJ. Diferentes patrones de inducción de DeltaFosB en el cerebro por drogas de abuso. Sinapsis 2008; 62: 358 – 69. ElArtículo gratuito de PMC] [PubMed]
  41. Rando OJ, Chang HY. Vistas genómicas de la estructura de la cromatina. Annu Rev Biochem. 2009; 78: 245-71. ElArtículo gratuito de PMC] [PubMed]
  42. Renthal W, Carle TL, Maze I, Covington HE, 3rd., Truong HT, Alibhai I, Kumar A, Montgomery RL, Olson EN, Nestler EJ. Delta FosB media la desensibilización epigenética del gen c-fos después de la exposición crónica a la anfetamina. J Neurosci. 2008; 28: 7344-9. ElArtículo gratuito de PMC] [PubMed]
  43. Renthal W, Kumar A, Xiao G, Wilkinson M, Covington HE, 3rd, Maze I, Sikder D, Robison AJ, LaPlant Q, Dietz DM, Russo SJ, Vialou V, Chakravarty S, Kodadek TJ, Stack A, Kabbaj M, Nestler EJ. El análisis del genoma de la regulación de la cromatina por la cocaína revela un papel para las sirtuinas. Neurona. 2009; 62: 335-48. ElArtículo gratuito de PMC] [PubMed]
  44. Rotzinger S, Bush DE, Vaccarino FJ. Modulación de la colecistoquinina de la función de la dopamina mesolímbica: regulación del comportamiento motivado. Pharmacol Toxicol. 2002; 91: 404 – 13. ElPubMed]
  45. Rourke IJ, Hansen TV, Nerlov C, Rehfeld JF, Nielsen FC. Cooperatividad negativa entre los elementos que responden a la E-box y cAMP / TPA yuxtapuestos en el promotor del gen de la colecistoquinina. FEBS Lett. 1999; 448: 15 – 8. ElPubMed]
  46. Shaw-Lutchman TZ, Barrot M, Wallace T, Gilden L, Zachariou V, Impey S, Duman RS, Storm D, Nestler EJ. Mapeo regional y celular de la transcripción mediada por CRE durante la extracción de morfina precipitada con naltrexona. J Neurosci. 2002; 22: 3663 – 3672. ElPubMed]
  47. Shaw-Lutchman TZ, Impey S, Storm D, Nestler EJ. Regulación de la transcripción mediada por CRE en cerebro de ratón por anfetamina. Sinapsis 2003; 48: 10 – 7. ElPubMed]
  48. Sheng M, McFadden G, Greenberg ME. La despolarización de la membrana y el calcio inducen la transcripción de c-fos a través de la fosforilación del factor de transcripción CREB. Neurona. 1990; 4: 571 – 82. ElPubMed]
  49. Tsankova NM, Kumar A, Nestler EJ. Modificaciones de histonas en las regiones promotoras de genes en el hipocampo de rata después de convulsiones electroconvulsivas agudas y crónicas. J Neurosci. 2004; 24: 5603 – 10. ElPubMed]
  50. Ulery PG, Nestler EJ. Regulación de la actividad transcripcional de DeltaFosB por fosforilación de Ser27. Eur J Neurosci. 2007; 25: 224 – 30. ElPubMed]
  51. Vaccarino FJ. Nucleus accumbens interacciones dopamina-CCK en la recompensa psicoestimulante y conductas relacionadas. Neurosci Biobehav Rev. 1992; 18: 207 – 14. ElPubMed]
  52. Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchmann T, Berton O, Sim-Selley LJ, DiLeone RJ, Kumar A, Nestler EJ. ΔFosB: un papel esencial para ΔFosB en el núcleo accumbens en la acción de la morfina. Neurosci de la naturaleza. 2006; 9: 205 – 11. ElPubMed]