Fuente
Centro Wagoner para el alcoholismo y Adicción Investigación, Instituto de Neurociencia, Universidad de Texas en Austin, Austin, TX, 78712, EE. UU. [email protected].
Resumen
ABSTRACTO:
FONDO:
La incapacidad de reducir o regular el consumo de alcohol es un síntoma distintivo de los trastornos por consumo de alcohol. La investigación sobre nuevos modelos genéticos y de comportamiento de los cambios en la bebida inducidos por la experiencia mejorará nuestro conocimiento sobre los trastornos relacionados con el consumo de alcohol. Se observaron comportamientos distintos de autoadministración del alcohol al comparar dos cepas híbridas de ratones F1: C57BL / 6J x NZB / B1NJ (BxN) Mostrar menor preferencia de alcohol después de la experiencia con altas concentraciones de alcohol y períodos de abstinencia. mientras que C57BL / 6J x FVB / NJ (BxF) muestran preferencia sostenida por el alcohol. Estos fenotipos son interesantes porque estos híbridos demuestran la ocurrencia de aditividad genética (BxN) y sobredominancia (BxF) en la ingesta de etanol de una manera dependiente de la experiencia.
Específicamente, BxF exhibe preferencia de alcohol sostenida y BxN exhibe preferencia de alcohol reducida después de la experiencia con altas concentraciones de etanol; sin embargo, la experiencia con bajas concentraciones de etanol produce una preferencia sostenida del alcohol para ambos híbridos.
En el presente estudio, probamos la hipótesis de que estos fenotipos están representados por la producción diferencial del factor de transcripción inducible, ΔFosB, en regiones cerebrales relacionadas con la recompensa, la aversión y el estrés.
RESULTADOS:
Los cambios en la plasticidad neuronal (según lo medido por los niveles de osFosB) dependieron de la experiencia, así como la región del cerebro y el genotipo específico, lo que apoya aún más que los circuitos neuronales subyacen a los aspectos motivacionales del consumo de etanol.
Los ratones BxN que mostraron una preferencia por el alcohol reducido tuvieron niveles más bajos de ΔFosB en el núcleo de Edinger-Westphal que los ratones que mostraron una preferencia sostenida por el alcohol, y un aumento en los niveles de ΔFosB en la amígdala medial central en comparación con los ratones control.
Los ratones BxN que muestran una preferencia sostenida por el alcohol exhibieron niveles más altos de ΔFosB en el área tegmental ventral, Núcleo de Edinger-Westphal, y amígdala (divisiones central y lateral).
Por otra parte, en Los ratones BxN levelsLos niveles de FosB en el núcleo de Edinger-Westphal y las regiones tegmentales ventrales se correlacionaron significativamente de manera positiva con la preferencia y la ingesta de etanol. Además, el análisis de agrupamiento jerárquico reveló que muchos ratones sin uso de etanol con bajos niveles de BFosB en general están en un agrupamiento, mientras que muchos ratones que muestran una preferencia sostenida por el alcohol con altos niveles de ΔFosB en general están agrupados.
CONCLUSIONES:
Al comparar y contrastar dos fenotipos de alcohol, este estudio demuestra que los circuitos relacionados con la recompensa y el estrés (que incluyen el núcleo de Edinger-Westphal, el área tegmental ventral, la amígdala) experimentan una plasticidad significativa que se manifiesta como una menor preferencia de alcohol.
Antecedentes
Existen factores de susceptibilidad conocidos, ambientales y genéticos, asociados con el abuso del alcohol y el alcoholismo. La capacidad de beber grandes cantidades de alcohol con poca consecuencia para el individuo es un síntoma de inicio primario en muchos alcohólicos, lo que indica que un bajo nivel de respuesta al alcohol es un factor de vulnerabilidad importante en el desarrollo del alcoholismo [1,2]. Definir los factores neurobiológicos que contribuyen a la moderación del alcohol nos ayudará a comprender el uso y abuso del alcohol, y es una estrategia eficaz para el desarrollo de tratamientos mejorados para personas diagnosticadas con trastornos por el consumo de alcohol. El uso de modelos de roedores para imitar enfermedades humanas ha sido una herramienta poderosa para avanzar en la comprensión de esta enfermedad y mejorar los tratamientos. Existen varios modelos de roedores para estudiar aspectos del abuso del alcohol y el alcoholismo, sin embargo, ninguno ejemplifica el alcoholismo por completo.. La medida en que un ratón administrará oralmente las soluciones de etanol en condiciones ambientales similares depende en gran medida de su fondo genético [3].
Recientemente, encontramos que los ratones híbridos F57 de C6BL / 57JxFVB / NJ (BxF) y FVB / NJxC6BL / 6J (FVBxB1) F20 se autoadministran niveles inusualmente altos de alcohol (las hembras consumen 35-XNUM G / G / GX / gc / gc / kg) y machos 7 – 25 g / kg / día, dependiendo de la concentración y el paradigma) [4]. Este nuevo modelo genético tiene una ventaja significativa en comparación con las cepas puras existentes, incluida la evidencia de un fenotipo sobredominante y el consumo de alcohol a niveles elevados de alcohol en la sangre [4]. Además, el alto consumo de etanol exhibido por los ratones BxF se observa en dos paradigmas adicionales de consumo de etanol (beber en la oscuridad y la aceptación del etanol durante el acceso programado a los fluidos) [4]. Luego, observamos distintos comportamientos de autoadministración de alcohol cuando comparamos dos cepas híbridas de ratones F1: C57BL / 6J x NZB / B1NJ (BxN) muestran una preferencia de alcohol reducida después de la experiencia con altas concentraciones de alcohol y los períodos de abstinencia y BxF muestran una preferencia de alcohol sostenida [5]. Usando una batería de pruebas de comportamiento, hemos demostrado que BxN es más sensible que los ratones BxF a los efectos aversivos y sedantes, pero no gratificantes, del etanol. [6].
La investigación básica sobre nuevos modelos genéticos y de comportamiento del alto consumo de alcohol y los cambios en la bebida inducidos por la experiencia mejorará nuestro conocimiento sobre el abuso del alcohol y el alcoholismo. El fenotipo de preferencia de alcohol reducido es interesante porque los ratones BxN inicialmente muestran una alta preferencia por las soluciones de etanol. Aunque el aspecto motivacional de reducir la ingesta de alcohol después de la experiencia con altas concentraciones de etanol y abstinencia es desconocido, los ratones BxN podrían compararse con los bebedores moderados de alcohol, ya que aún consumen soluciones de etanol pero a un nivel reducido, probablemente debido a una experiencia aversiva.
El modelo de preferencia de alcohol sostenido también es interesante, ya que los ratones BxF consumen de manera estable niveles extremadamente altos de etanol, independientemente de la experiencia previa. La preferencia de alcohol sostenida y reducida puede estar relacionada con un efecto de privación de alcohol, un fenómeno donde los animales exhiben un consumo de alcohol significativamente mayor después de un período de abstinencia forzada.e [7]. El efecto de la privación de alcohol es un fenómeno útil para estudiar el aumento del comportamiento de consumo de alcohol. Aunque el programa experimental conocido para inducir el efecto de privación de alcohol es bastante diferente del programa utilizado aquí, comparar la preferencia sostenida y reducida de alcohol con un efecto de privación de alcohol relaciona los diferentes fenotipos de comportamiento discutidos aquí con un fenómeno importante en modelos de roedores en la investigación del alcohol. La reducción de la preferencia de alcohol sería lo opuesto a un efecto de privación de alcohol y la preferencia sostenida de alcohol podría describirse como la ausencia de un efecto de privación de alcohol. El uso de diversos modelos genéticos de animales, como BxF y BxN, contribuye en gran medida al avance del campo, ya que se cree que los trastornos por el uso del alcohol surgen de interacciones complejas entre la genética y el medio ambiente. La identificación de la expresión génica temprana inmediata diferencial para estos híbridos ofrece información sobre los circuitos cerebrales importantes para las propiedades gratificantes y aversivas del etanol.
El etanol y otros neurocircuitos comprometidos con fármacos se han estudiado en modelos específicos de roedores utilizando marcadores moleculares de plasticidad y / o actividad neuronal [8–15]. El etanol autoadministrado y administrado por un experimentador no da como resultado mapas metabólicos cerebrales equivalentes, lo que sugiere que los circuitos específicos subyacen a los efectos de refuerzo del etanol [8,9].
Un componente clave, aún por explorar extensamente en la investigación del alcohol, es el examen de los comportamientos de preferencia de alcohol sostenidos y reducidos y la identificación de los circuitos neuronales involucrados durante estos comportamientos. El objetivo de este experimento fue identificar las regiones del cerebro comprometidas por una preferencia sostenida y reducida de alcohol. Debido a que se ha demostrado que la administración crónica de alcohol (junto con otras drogas de abuso) causa diferencias regionales cerebrales en los niveles de BFosB, probamos la hipótesis de que estos fenotipos de comportamiento están representados por la producción diferencial del factor de transcripción inducible, ΔFosB, en las regiones del cerebro conocidas por Involucrarse en la recompensa, la aversión y el estrés. [10].
Los estímulos crónicos que causan diferencias regionales en los niveles de BFosB incluyen drogas de abuso (alcohol, cocaína, anfetamina, nicotina, morfina y antipsicóticos), estrés crónico (estrés de restricción, choque de pies impredecible, convulsiones electroconvulsivas) y funcionamiento compulsivo de la rueda [11]. Como mediador potencial de las adaptaciones a largo plazo en el cerebro, la identificación de la variante dominante de FosB (FosB o ΔFosB) en respuesta al tratamiento crónico con etanol es una distinción importante.
Hay varios estudios que midieron FosB y ΔFosB después de estímulos crónicos para los cuales no se ha verificado que isFosB fue la isoforma dominante (como las que se describen a continuación). Sin embargo, existe una fuerte evidencia de que ΔFosB, no FosB, es la isoforma dominante después de los estímulos crónicos [10–12]. Un estudio realizado por Ryabinin y Wang (1998) encontró que en los ratones con bajo contenido de alcohol que preferían DBA / 2J, cuatro días de inyecciones repetidas de etanol dieron como resultado aumentos robustos en la expresión de FosB en las siguientes regiones del cerebro: núcleo amígdaloide cortical anterior, ventrale septum lateral, amígdala central , amígdala lateral, hipotálamo lateral, núcleo accumbens shell, núcleo del lecho de la estría terminal y núcleo paraventricular del tálamo [13]. Sus resultados identifican un neurocircuito sensible al etanol. La expresión de FosB también se ha medido en el ratón C57BL / 6J con alto contenido de alcohol durante la adquisición y el mantenimiento de la autoadministración de etanol en condiciones de acceso limitado. No hubo cambios en los niveles de FosB durante la adquisición de la autoadministración [14]. Sin embargo, después de dos semanas de autoadministración de etanol de acceso limitado, los niveles de FosB aumentaron en el núcleo medial central de la amígdala y el núcleo de Edinger-Westphal [15]. En general, los informes identifican nuevas regiones dedicadas a la autoadministración de etanol, así como implican un papel para la vía mesocorticolímbica y la amígdala extendida [16]. Sin embargo, es importante tener en cuenta que los cambios en los niveles de BFosB dependen de la vía de administración de etanol, la dosis y el tiempo de exposición a un tratamiento o cronograma [13–15].
Las cepas de ratón utilizadas en este estudio proporcionan modelos interesantes para la comparación de la preferencia sostenida y reducida del alcohol y los mecanismos subyacentes responsables de estas distintas respuestas al alcohol. Este estudio demuestra que los ratones que exhiben una preferencia reducida por el alcohol también muestran una plasticidad significativa en los circuitos relacionados con la recompensa y el estrés (incluidos el núcleo de Edinger-Westphal, el área tegmental ventral, la amígdala, el núcleo accumbens y la corteza cingulada).
Resultados
El efecto de las concentraciones de alcohol y los períodos de abstinencia en la autoadministración en ratones BxF y BxN
Para demostrar que las concentraciones variables de etanol y / o los períodos de abstinencia cambiaron el consumo posterior de etanol, diseñamos cuatro programas (grupos) para medir el consumo de etanol (Figura (Figura 1a, b).1a, b). Hubo cuatro grupos experimentales para cada híbrido: altas concentraciones, altas concentraciones con periodos de abstinencia, bajas concentraciones y bajas concentraciones con periodos de abstinencia. Datos completos de preferencia de etanol (Figura (Figura 2)2) y el consumo (figura (Figura 3)3) los datos (para todos los grupos y ambos genotipos) se presentan para referencia. Para establecer e ilustrar los fenotipos de comportamiento de la preferencia de alcohol sostenida y reducida, los datos de consumo y preferencia de 9% etanol se presentan en las Figuras Figuras44 y y5.5. Estos fenotipos de comportamiento se basan en la comparación de 9% etanol preferencia y consumo de la primera, segunda, tercera y cuarta presentación en los grupos de Alta Concentración y días experimentales correspondientes para los grupos de Baja Concentración. Se realizó un ANOVA de dos vías (genotipo x tiempo) de 9% etanol de preferencia y consumo. Para el grupo de altas concentraciones, preferencia de etanol (Figura (Figura 4a)4a) y consumo (figura (Figura 5a)5a) fueron mayores para BxF que para BxN, y BxF exhibió preferencia y consumo sostenido de alcohol mientras que BxN exhibió preferencia y consumo reducidos de alcohol (PREFERENCIA DE ETANOL - interacción F (3,54) = 4.83, P <0, genotipo F (01, 1,54) = 24.10, P <0.001, tiempo F (3,54) = 9.92, P <0.0001; CONSUMO DE ETANOL - interacción N / S, genotipo F (1,54) = 50.73, P <0.0001, tiempo F (3,54, 11.68) = 0.0001, P <XNUMX). Para el grupo de Altas Concentraciones con abstinencia, preferencia de etanol (Figura (Figura 4b)4b) y consumo (figura (Figura 5b)5b) fueron mayores para BxF que para BxN, y BxF mostró preferencia y consumo sostenido de alcohol mientras que BxN mostró preferencia y consumo de alcohol reducidos (PREFERENCIA DE ETANOL - interacción F (3,132) = 15.89, P <0.0001, genotipo F (1,132) = 250.43, P <0.0001, tiempo F (3,132) = 27.48, P <0.0001; CONSUMO DE ETANOL - interacción F (3,132) = 11.35, P <0.0001, genotipo F (1,132) = 510.88, P <0.0001, tiempo F (3,132) = 22.42, P <0.0001). Para el grupo de Concentraciones bajas, preferencia de etanol (Figura (Figura 4c)4c) y consumo (figura (Figura 5c)5c) fueron mayores para BxF que para BxN, y ambos híbridos exhibieron preferencia y consumo sostenido de alcohol (PREFERENCIA DE ETANOL - interacción N / S, genotipo F (1,54) = 12.2, P <0.01, tiempo N / S; CONSUMO DE ETANOL - interacción N / S, genotipo F (1,54) = 74.83, P <0.0001, tiempo N / S). Para el grupo de Concentraciones bajas con abstinencia, preferencia de etanol (Figura (Figura 4d)4d) y consumo (figura (Figura 5d)5d) fueron mayores para BxF que para BxN, y ambos híbridos exhibieron reducciones moderadas en la preferencia y consumo de alcohol (PREFERENCIA DE ETANOL - interacción N / S, genotipo F (1,132) = 166.58, P <0.0001, tiempo N / S; CONSUMO DE ETANOL - interacción F (3,132) = 3.61, P <0.05, genotipo F (1,132) = 480.64, P <0.0001, tiempo F (3,132) = 7.87, P <0.0001). En resumen, en los grupos de altas concentraciones (sin abstinencia), BxF mostró una preferencia alcohólica sostenida mientras que BxN mostró una preferencia alcohólica reducida y en los grupos de concentraciones bajas (sin abstinencia), tanto BxF como B6xN mostraron una preferencia alcohólica sostenida. Dado que los fenotipos de interés se capturan mejor en grupos sin abstinencia, son el foco del resto del estudio.
LevelFosB Levels
QuantLa cuantificación y el análisis de FosB se utilizaron para identificar los neurocircuitos activados crónicamente durante la preferencia sostenida y reducida de alcohol. Había tres grupos experimentales para cada híbrido: altas concentraciones, bajas concentraciones y agua (control). Los datos de ΔFosB se presentan como porcentaje de neuronas positivas a positiveFosB [(# de neuronas positivas a BFosB) / (# de neuronas positivas a ΔFosB + # de neuronas positivas a Nissl)] (Tabla (Table1).1). Trabajos previos han demostrado que la experiencia con etanol puede inducir la neurodegeneración [17]. Por lo tanto, investigamos los números neuronales en este estudio y no informamos diferencias significativas basadas en el genotipo o grupo de las regiones del cerebro cuantificadas en este estudio. Se realizaron los siguientes tres análisis de los datos de ΔFosB: 1) ANOVA de tres vías (genotipo x grupo x región del cerebro), 2) ANOVA de dos vías (región del cerebro x grupo) para cada genotipo y 3) se desarrollaron matrices para correlacionar la correlación redes
ANOVA de tres vías de medidas repetidas (genotipo x grupo x región cerebral) reveló una interacción genotipo x región cerebral [F (15,375) = 2.01, P <.05], una interacción grupo x región cerebral [F (15.375) = 1.99, P <0.01] y un efecto principal de la región del cerebro [F (15,375) = 43.36, P <000]. ANOVA bidireccional de medidas repetidas (región del cerebro x grupo) para cada genotipo mostró que había un efecto principal de grupo y región del cerebro tanto para BxF como para BxN [BxF - F (2,374) = 11.79, P <.0001, efecto principal de grupo; F (15,374) = 25.64, P <0001, efecto principal de la región del cerebro; BxN - F (2,360) = 43.38, P <0001, efecto principal del grupo; F (15,360) = 23.73, P <0001, efecto principal del genotipo]. El análisis post-hoc reveló seis diferencias de grupo significativas para BxN (Figura (Figura 6a-c).6C.A). Los niveles de ΔFosB en porcentaje fueron mayores en el grupo de bajas concentraciones que en el grupo de agua en La, CeC / CeL, EW y VTA. El porcentaje de ΔFosB fue mayor en el grupo de altas concentraciones que en el grupo de agua en CeMPV. El porcentaje de ΔFosB fue mayor en el grupo de bajas concentraciones que en el grupo de altas concentraciones en la SE. DataLos datos de FosB para todas las demás regiones del cerebro cuantificadas se presentan en la Tabla Table1.1. Se utilizó el análisis correlacional r de Pearson para determinar si el% de neuronas positivas a ΔFosB en una región cerebral determinada se correlacionaba con el consumo o preferencia de etanol. El consumo y la preferencia de etanol mostraron una correlación positiva significativa con el% ΔFosB en la EW y VTA de ratones BxN (CONSUMO DE ETANOL - EW r = 0.85; VTA r = 0.85; PREFERENCIA DE ETANOL - EW r = 0.83, VTA r = 0.88; p <0.05 para todos).
La compleja relación entre la expresión de ΔFosB, el genotipo, la región del cerebro y el consumo de etanol se exploró más a fondo utilizando el análisis de componentes principales y el agrupamiento jerárquico. El análisis de los componentes principales reveló que la mayoría de la variabilidad (~ 80%) en los datos estaba representada por los componentes 5. El agrupamiento jerárquico no supervisado (agrupado por individuos y regiones del cerebro) se realizó y ordenó utilizando el primer componente principal (Figura (Figura 7).7). La agrupación individual reveló patrones de agrupación fuertes, pero no perfectos, basados en el consumo de etanol, independientemente del genotipo. Muchos de los ratones no tratados con etanol se agruparon y mostraron menos ΔFosB en general que la media y muchos de los ratones que mostraron una preferencia sostenida por el alcohol se agruparon y mostraron más ΔFosB en general que la media. Estos dos grupos eran los más divergentes. Los tres grupos intermedios representaron una mezcla mayor que, menor que y media de los valores de ΔFosB y fenotipos de consumo de etanol.
Discusión
Se observaron distintos comportamientos de autoadministración de alcohol cuando se compararon dos cepas híbridas de ratones F1: BxN muestra una preferencia de alcohol reducida después de la experiencia con altas concentraciones de alcohol y períodos de abstinencia, mientras que BxF muestra una preferencia de alcohol sostenida. Modelos BxF estables, alto consumo (preferencia sostenida de alcohol) y modelos BxN moderados para beber (preferencia alcohólica reducida). La plasticidad neuronal (o actividad, medida por los niveles de FosB) fue diferente dependiendo de la experiencia con etanol, lo que respaldó aún más el papel subyacente de los circuitos neuronales específicos en la preferencia sostenida y reducida del alcohol.
Para la cepa que consume mucho alcohol, C57BL / 6, la preferencia y el consumo de etanol dependen en gran medida de la concentración inicial de etanol, la duración de la abstinencia y la sub-cepa (C57BL / 6Cr o C57BL / 6J) [7,18]. Encontramos que la preferencia y el consumo de etanol observados en los ratones BxF fueron consistentemente más altos (y más estables que en BxN) en los cuatro programas diferentes probados. La preferencia y el consumo de etanol moderadamente altos en BxN solo se mantuvieron con un programa de consumo crónico (bajas concentraciones sin abstinencia), mientras que se observaron reducciones en la preferencia y el consumo con todos los otros programas de consumo crónico probados. La preferencia de alcohol reducido de BxN ofrece un nuevo modelo animal en el que la experiencia (presentación repetida de etanol después de la experiencia con múltiples concentraciones altas de etanol y / o varios períodos cortos de abstinencia) reduce dramáticamente su respuesta a una concentración de etanol previamente muy preferida.
El etanol autoadministrado y administrado por experimentadores produce diferentes mapas metabólicos del cerebro, lo que sugiere que los circuitos específicos subyacen a los efectos de refuerzo del etanol [8,9]. Probamos la hipótesis de que los fenotipos conductuales de preferencia de alcohol sostenida y reducida están representados por la producción diferencial del factor de transcripción inducible, ΔFosB, en regiones del cerebro que se sabe están involucradas en la recompensa, la aversión y el estrés. ΔFosB es un factor de transcripción con una estabilidad única a largo plazo y no insensibiliza a los estímulos como lo hace c-Fos, sino que se acumula durante los tratamientos crónicos. Los aumentos en ΔFosB se deben a una mayor actividad neuronal y se cree que reflejan la plasticidad neuronal de larga duración. Encontramos que el porcentaje de neuronas positivas a ΔFosB en las regiones del cerebro depende del genotipo (BxF y BxN) y del grupo (control de agua, bajas concentraciones y altas concentraciones).
Fo BxN, el análisis post-hoc reveló que el consumo voluntario de etanol resultó en un aumento de ΔFosB en el núcleo EW, VTA y amígdala: lo que indica una mayor plasticidad neuronal en las regiones del cerebro que se sabe están involucradas en las respuestas de etanol, recompensa y estrés. Los ratones BxN en el grupo de altas concentraciones (menor preferencia por el alcohol) han reducido la plasticidad neuronal en la SE, lo que sugiere que estas neuronas responden a la ingesta de alcohol con una plasticidad dependiente de la experiencia. En el grupo de bajas concentraciones (exhibió una preferencia sostenida por el alcohol), la plasticidad neuronal en la SE es mayor que en los grupos de altas concentraciones y control de agua. Aunque se realizaron utilizando diferentes paradigmas de consumo de etanol y modelos genéticos de ratones, nuestros hallazgos en la SE de ratones BxN concuerdan con estudios de consumo de etanol anteriores14,15]. La EW no pregangliónica se ha caracterizado recientemente por contener neuronas que contienen urocortina perioculomotora (Ucn) [19]. Ucn1 es un péptido similar al factor de liberación de corticotropina (CRF) que se une a los receptores CRF1 y CRF2. Estudios previos que utilizan enfoques genéticos, farmacológicos y de lesiones han demostrado que Ucn1 participa en la regulación del consumo de alcohol [19–22]. TAquí hay una predisposición genética conocida para el alto consumo de alcohol en roedores que se correlaciona con niveles basales más altos de Ucn1 en SE y LSi [23]. Por lo tanto, la falta de significación post-hoc que observamos en la SE para los alcoholes BxF con un alto contenido de alcohol fue inesperada. Quizás esto se deba al porcentaje ligeramente elevado de ΔFosB en el grupo de agua BxF en comparación con el grupo de agua BxN. De hecho, el porcentaje de niveles de ΔFosB para todos los ratones que exhibieron una preferencia sostenida por el alcohol (grupo de altas concentraciones BxF, grupo de bajas concentraciones BxF y grupo de bajas concentraciones BxN) fue bastante similar.
Para BxN, el consumo de etanol en el grupo de bajas concentraciones incrementó la plasticidad neuronal en el VTA (mayor que en los grupos de control de altas concentraciones y agua). La preferencia y el consumo de etanol también fueron mayores para el grupo de bajas concentraciones.. La falta de importancia post-hoc que observamos en VTA para los ratones BxF con un alto contenido de alcohol fue inesperada y puede deberse a niveles basales ligeramente más altos de ΔFosB en el grupo de control de agua. Los porcentajes de ΔFosB estaban ligeramente elevados en el grupo de agua BxF en comparación con el grupo de agua BxN, mientras que los porcentajes de ΔFosB eran bastante similares para todos los ratones que exhibían una preferencia sostenida por el alcohol (grupo de altas concentraciones de BxF, grupo de bajas concentraciones de BxF y grupo de bajas concentraciones de BxN) . El sistema de dopamina VTA juega un papel importante en la mediación de los efectos de refuerzo del etanol y participa en muchas conexiones recíprocas importantes para el etanol y las conductas relacionadas con la recompensa [24–26]. Adicionalmente, el VTA proyecta a la amígdala y al núcleo EW. Se ha demostrado que las ratas se autoadministran etanol directamente en el VTA [27]. Además, la exposición al etanol aumenta la velocidad de activación de las neuronas dopaminérgicas en VTA [28,29]. El aumento de la velocidad de encendido podría estar vinculado a la inducción de BFosB en el VTA que observamos después de la administración crónica voluntaria de etanol en BxN.
La dependencia del alcohol induce neuroadaptaciones a largo plazo, lo que resulta en estados emocionales negativos; Un mecanismo importante en el refuerzo negativo es la señalización del factor liberador de corticotropina (CRF) dentro de la amígdala. [30]. Las manipulaciones farmacológicas de las neuronas en la CeA se han dirigido a los receptores de GABA, CRF, opioides, serotonina, dinorfina y norepinefrina [25,31–34]. solLos antagonistas de ABA, así como los antagonistas de CRF, disminuyen el consumo de etanol [32,33,35]. Las lesiones del CeA disminuyen el acceso continuo al consumo voluntario de etanol. [36]. Nuestros hallazgos apoyan aún más el papel de CeA en la regulación del comportamiento del consumo de alcohol. Las neuronas GABAérgicas en la amígdala central forman una población heterogénea cuyas conexiones parecen estar relacionadas con su contenido de péptidos. Estas neuronas GABAérgicas integran la actividad de salida del CeA. Según lo revisado en [Wee y Koob (2010]), sTodos los estudios han identificado un papel para los receptores de opioides dinorfina y kappa en el mantenimiento y la escalada de la ingesta de etanol.e [37]. Más recientemente, Walker et al han demostrado que el antagonista del receptor κ-opioide, nor-binaltorphimine, dentro de la amígdala extendida reduce selectivamente la autoadministración de etanol en animales dependientes [38]. La señalización del receptor opioide kappa sigue siendo un interés clave de la investigación en la intersección del estrés, la recompensa y la aversión. También se ha demostrado que la autoadministración de etanol inducida por estrés está mediada por la señalización del receptor opioide kappa [39]. El CeA central puede subdividirse en laterocapsular (CeL / CeC) y ventral posterior medial. Las neuronas GABAérgicas del CeL / CeC reciben inervaciones dopaminérgicas del VTA; como se señaló anteriormente, estas neuronas se activan después de la administración aguda de etanol y muestran un aumento de los ratones osFosB que muestran una preferencia sostenida por el alcohol. También, vea Mc [Novia (2002]) para una excelente revisión sobre CeA y los efectos del alcohol [40]. En nuestro estudio, los ratones BxN con preferencia sostenida de alcohol (grupo de bajas concentraciones) mostraron una mayor plasticidad neuronal en los ratones CeC / CeL y La y BxN con una preferencia reducida de alcohol (grupo de altas concentraciones) exhiben una mayor plasticidad neuronal en el CeMPV. Estos resultados sugieren que la experiencia específica con etanol involucra plasticidad en neuronas GABAérgicas en la amígdala. Con estos datos, junto con los cambios correspondientes en la plasticidad neuronal en VTA y EW, proponemos que este circuito experimente una plasticidad significativa en condiciones de preferencia de alcohol sostenida.
Investigaciones anteriores han demostrado que los ratones C57BL / 6J pueden alcanzar niveles altos de alcohol en la sangre al beber con dos botellas, sin embargo, estos niveles de alcohol en la sangre no se mantienen y, a menudo, el consumo no cumple con los criterios de motivación farmacológica establecidos por Dole y Gentry (1984) [41,42]. Los ratones BxN que exhiben una preferencia de alcohol reducida consumen menos de lo que se esperaría de un ratón C57BL / 6J típico [1]. Por lo tanto, aunque no tomamos muestras de alcohol en sangre, no es probable que los ratones BxN que muestran una preferencia reducida por el alcohol logren niveles de alcohol en sangre farmacológicamente relevantes sostenidos, lo que sugiere que las concentraciones altas de alcohol en sangre no son necesarias para inducir la plasticidad en estas regiones del cerebro. Es importante tener en cuenta que también existe un efecto altamente significativo del grupo en BxF, aunque los resultados post hoc (corregidos para comparaciones múltiples) para las regiones cerebrales BxF no indicaron cambios significativos en el porcentaje de neuronas positivas a FosB para cualquier región después del consumo crónico de etanol Con estos diferentes horarios.
Para visualizar relaciones potenciales entre variables se realizó la agrupación jerárquica. El mapa de calor del análisis resultante muestra una tendencia general entre los niveles de FosB y el consumo de etanol independientemente del genotipo. Los niveles más altos de ΔFosB se asociaron con un consumo elevado y los niveles más bajos de ΔFosB se asociaron con los animales de control; sin embargo, la fuerza de la relación no fue suficiente para predecir con precisión los fenotipos de consumo basados únicamente en los niveles de BFosB.
Conclusiones
Se observaron distintos comportamientos de autoadministración del alcohol con dos cepas híbridas de ratones F1: BxN muestra una preferencia reducida por el alcohol después de la experiencia con altas concentraciones de alcohol, mientras que BxF muestra una preferencia sostenida por el alcohol. Los modelos BxF son estables, de alto consumo (preferencia de alcohol sostenida) y los modelos BxN beben moderadamente (preferencia de alcohol reducida). Los cambios en la plasticidad neuronal (según lo medido por los niveles de osFosB) dependieron de la experiencia, así como la región cerebral y el genotipo, definiendo aún más los circuitos neuronales que subyacen a los aspectos motivacionales del consumo de etanol. Estos resultados muestran que el cambio de una línea parental en ratones híbridos produce cambios en los patrones de consumo de alcohol y cambios marcados en los patrones de expresión de ΔFosB, lo que sugiere que distintas redes cerebrales están involucradas en estos diferentes ratones híbridos.
Métodos
Ética
Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de la Salud. El protocolo fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Texas en Austin (AUP 2010 – 00028). Toda la cirugía se realizó bajo anestesia con pentobarbital sódico y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento.
Animales
Los estudios se realizaron utilizando ratones híbridos hembras F1 derivados de ratones C57BL / 6J y FVB / NJ o NZB / B1NJ (BxF F1 y BxN F1, cepa materna x cepa paterna). Los criadores de C57BL / 6J, FVB / NJ y NZB / B1NJ se compraron en el Laboratorio Jackson (Bar Harbor, ME) y se aparearon en las semanas 7-8. Los descendientes se destetaron en grupos isosexuales de cada uno de los genotipos (BxF F1, BxN F1). Probamos solo ratones hembra para facilitar la comparación con los datos recopilados previamente [1,5,6]. Los ratones se alojaron en jaulas estándar con comida y agua. ad libitum. La sala de colonias y la sala de pruebas estaban en un ciclo de luz 12 h: 12 h (las luces se encienden en 07: 00).
Prueba de preferencia de etanol de dos botellas a elección
El método de elección de dos frascos se usó para determinar los patrones voluntarios de autoadministración de etanol en ratones hembra BxF y BxN [1,6]. Los ratones hembras híbridos F1 (edad 63 días) se alojaron individualmente en jaulas estándar mientras se habituaban durante una semana en botellas con tubos de sipper que contenían agua antes de la introducción de una solución de etanol. Después de la habituación, los ratones tuvieron acceso a dos botellas idénticas: una que contenía agua y la otra que contenía una solución de etanol. Las posiciones de los tubos se cambiaron diariamente para controlar las preferencias de posición. Para tener en cuenta los posibles derrames y la evaporación, el peso promedio agotado de los tubos en jaulas de control sin ratones se restó de los valores de consumo individuales cada día. Los ratones se pesaron cada 4 días a lo largo del experimento. Todo el consumo de líquidos se midió diariamente a lo largo del experimento. La cantidad de etanol consumido y la preferencia de etanol se calcularon para cada ratón, y estos valores se promediaron para cada concentración de etanol. El efecto de las concentraciones de alcohol y los períodos de abstinencia en la autoadministración en ratones BxF y BxN se demostró mediante la designación de un grupo experimental con acceso a altas concentraciones (aumento del acceso a soluciones de etanol 3-35, seguido de ciclos repetidos de 3, 9, 18, y 27% de etanol, que finaliza con una presentación final de 9% de etanol) y otro grupo con bajas concentraciones (acceso escalonado a 3-9% de etanol, mientras que el resto del experimento se realizó con acceso a 9% de etanol). Cada uno de estos grupos tenía un subgrupo que experimentó o no tres períodos de abstinencia de una semana. Los ratones de control experimentaron condiciones similares al mismo tiempo que los ratones experimentales, pero solo se les ofreció una botella de agua.
En total, hubo cinco grupos para cada híbrido: agua (n = 14-16), altas concentraciones (n = 10), altas concentraciones con períodos de abstinencia (n = 20), bajas concentraciones (n = 10) y bajas concentraciones con períodos de abstinencia (n = 20). Consulte la figura Figure11 Para los horarios detallados del grupo de elección de dos botellas.
ImmFosB Inmunohistoquímica y cuantificación.
Se midió la inmunohistoquímica de ΔFosB (IHC) en 16 regiones del cerebro de ratones que experimentaron 72 días de acceso continuo a agua (Control) o agua y alcohol [Concentraciones altas y concentraciones bajas]. El efecto de las altas concentraciones sobre la preferencia y el consumo de etanol fue mucho mayor que el efecto de la abstinencia; por lo tanto, los grupos que experimentaron períodos de abstinencia no se incluyeron en las mediciones de ΔFosB IHC. Además, el experimento se llevó a cabo más allá de la primera aparición de preferencia de alcohol sostenida o reducida para mostrar que los fenotipos de comportamiento son estables con ciclos repetidos de cambios en la concentración de etanol para examinar los efectos del consumo crónico de etanol. De cuatro a ocho horas después de eliminar el alcohol en el día 73 del experimento, los ratones se anestesiaron profundamente (175 mg / kg de pentobarbital sódico) y se perfundieron intracardialmente con 20 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) 0.01 M, seguido de 100 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) al 4%. paraformaldehído en PBS. Se extrajeron los cerebros, se fijaron posteriormente en paraformaldehído al 4% a 4 ° C, se embebieron en agarosa al 3%, se seccionaron (50 um, coronal) en un vibratomo, se colocaron en crioprotector (sacarosa al 30%, etilenglicol al 30% y polivinilo al 0.1%). pirrolidona en PBS) durante la noche a 4 ° C y se almacena a -20 ° C hasta que se procesa para IHC. Las secciones descongeladas se lavaron con PBS, se trataron con H0.3O2 al 2% y se incubaron durante una hora en suero de cabra normal al 3% para minimizar el etiquetado no específico. A continuación, las secciones de tejido se incubaron durante la noche a 4 ° C en suero de cabra normal al 3% y anti-FosB (SC-48, dilución 1: 5000, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Las secciones se lavaron, se incubaron en Ig anti-conejo de cabra biotinilada (dilución 1: 200, Vector Laboratories, Burlingame, CA) durante una hora, se lavaron e incubaron en complejo avidina-biotina (dilución 1: 200, kit Elite-Vector Laboratories) . La actividad de peroxidasa se visualizó por reacción con diaminobencidina al 0.05% (que contenía 0.015% de H2O2). Las secciones de tejido se tiñeron de Nissl (utilizando azul de metileno / azul II). Las diapositivas fueron codificadas para conteo a ciegas. Las neuronas ΔFosB-IR se contabilizaron con un aumento de 50X (aceite) utilizando el método del fraccionador óptico y el software informático StereoInvestigator. Información del parámetro de muestreo: el marco de conteo (50um x 50um x 10um) fue el mismo para todas las regiones cuantificadas; sin embargo, el tamaño de la cuadrícula se determinó para cada región del cerebro para garantizar que los recuentos celulares bilaterales totales fueran iguales a 100-300 para lograr un coeficiente de variación menor que 0.1. Los datos se calcularon como porcentaje de los núcleos positivos de BFosB (número de núcleos positivos de ΔFosB / número de neuronas) para cada región.
El anticuerpo FosB utilizado en este estudio (SC-48, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) se generó contra una región interna de FosB y reconoce tanto FosB como FosB. Aunque este anticuerpo reconoce tanto FosB como ΔFosB, las neuronas inmunopositivas cuantificadas en este estudio se denominarán neuronas positivas a BFosB ya que se ha demostrado que las drogas de abuso, incluido el alcohol, inducen específicamente ΔFosB, no FosB, en las neuronas. Perrotti et al. (2008]) midió la inducción de ΔFosB (en respuesta a la administración crónica de drogas de abuso, incluido el alcohol) usando dos anticuerpos: uno que reconoce FosB y ΔFosB (SC-48) y uno selectivo para ΔFosB (no disponible comercialmente) y encontró que para todos los medicamentos estudiado, la inmunorreactividad observada usando el anticuerpo FosB (SC-48) se debe a ΔFosB, ya que no detectaron ninguna neurona inmunorreactiva utilizando un anticuerpo selectivo para FosB de longitud completa [10]. Además, se sabe que el ΔFosB se induce de una manera específica de la región del cerebro y del tipo de célula, por varios tratamientos crónicos y excelentes revisiones sobre este tema están disponibles [11,43,44].
Abreviaturas y localizaciones de estructuras neuroanatómicas.
Il - corteza infralímbica (+1.70 mm); Cg1 - corteza cingulada 1 (+1.1 mm); Cg2 - corteza cingulada 1 (+1.10 mm); Núcleo NAcc - núcleo del núcleo accumbens (+1.10 mm); Capa de NAcc - caparazón del núcleo accumbens (+1.10 mm); LSi - tabique lateral intermedio (+1.10 mm); La - amígdala lateral (−1.22 mm); Bla - amígdala basolateral (-1.22 mm); CeC / CeL: amígdala capsular central y lateral central (−1.22 mm); CeMPV: porción posterioventral medial del núcleo central de la amígdala (-1.22 mm); PAG - gris periaquaductal (−3.64 mm); EW: núcleo de Edinger-Westphal (−3.64 mm); VTA - área tegmental ventral (−3.64 mm); DR - rafe dorsal (-4.60 mm); PBN - núcleo parabraquial (−5.2 mm); NTS: núcleo del tracto solitario (−6.96 mm). El cerebro del ratón en coordenadas estereotáxicas[45] se utilizó para hacer coincidir subjetivamente una a tres secciones para la cuantificación de cada región del cerebro.
Procedimientos estadisticos
Los datos se informan como la media ± SEM, excepto que se indique lo contrario. Los datos fueron distribuidos normalmente. Las estadísticas se realizaron utilizando Statistica versión 6 (StatSoft, Tulsa, OK, EE. UU.) Y GraphPad Prism versión 4.00 (GraphPad Software, San Diego, CA, EE. UU.). Se realizaron medidas repetidas de ANOVA de dos vías para el consumo de etanol y datos de preferencia para evaluar las diferencias entre los grupos. Se llevaron a cabo ANOVA de dos y tres vías para los datos de ΔFosB para evaluar las interacciones y los efectos principales para el grupo (altas concentraciones, bajas concentraciones y agua), región del cerebro y genotipo. La corrección de Bonferroni para comparaciones múltiples y el post-hoc de Bonferroni se llevaron a cabo cuando fue apropiado. Específicamente, planteamos la hipótesis de que los circuitos de estrés y recompensa habrían aumentado el FosB en ratones que mostraban una menor preferencia por el alcohol. Para cada cruce híbrido, la r de Pearson se usó para identificar la presencia de correlaciones significativas entre los niveles de ΔFosB y la preferencia y el consumo de etanol en ratones experimentados con etanol.
La agrupación jerárquica se llevó a cabo para visualizar cómo los datos varían y evaluar cómo se agrupan los datos. Los valores medianos imputados reemplazaron el porcentaje faltante de ΔFosB datos, que no excedieron 15% de datos. Aunque existe un grado mayor de incertidumbre que si los valores imputados se hubieran observado, el análisis de agrupamiento jerárquico requiere una membresía completa o una eliminación completa para las comparaciones de casos concretos. El agrupamiento jerárquico se realizó mediante el método de Ward y los agrupamientos resultantes se ordenaron según el primer componente principal de un análisis de componente principal (JMP®, versión 8, SAS Institute Inc., Cary, NC). Para los grupos con experiencia en agua y etanol, los datos de ΔFosB para cada región del cerebro se transformaron en puntaje zy se llevaron a cabo análisis de componentes principales para determinar el número de grupos. Luego, los datos se agruparon por regiones cerebrales e individuos utilizando un análisis de agrupamiento jerárquico supervisado.
Contribuciones de los autores
ARO, YAB, RAH, TAJ contribuyeron al diseño del estudio. ARO adquirió los datos. ARO, IP, RDM analizaron los datos. ARO, RDM, IP, TAJ, YAB y RAH participaron en la redacción y revisión del manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.
Agradecimientos
Nos gustaría agradecer a los Dres. Jody Mayfield y Colleen McClung para discusiones útiles y Marni Martínez, Jennifer Stokes, Michelle Foshat, José Cienfuegos, Jamie Seymour y Darshan Pandya para asistencia técnica. Esta investigación fue apoyada por la Iniciativa de Neurociencia Integrativa sobre el Alcoholismo Consorcio Grant AA13520, y el Instituto Nacional sobre Abuso de Alcohol y Becas de Alcoholismo AA06399-S y AA16424.
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