Inducción de DeltaFosB en subtipos de neuronas espinosas del medio estriado en respuesta a estímulos farmacológicos, emocionales y optogenéticos crónicos (2013)

J Neurosci. 2013 Nov 20; 33 (47):18381-95. doi: 10.1523/JNEUROSCI.1875-13.2013.

Lobo MK, Zaman s, Damez-Werno DM, Koo JW, Bagot RC, Dinieri ja, Nugent A, Finkel e, Chaudhury D, Chandra R, Riberio e, Rabkin j, Mouzon E, Cachope R, Alegría JF, Han MH, Dietz DM, Auto DW, Hurd YL, Vialou V, Nestler EJ.

Fuente

Departamento de Anatomía y Neurobiología, Facultad de Medicina de la Universidad de Maryland, Baltimore, Maryland 21201, Departamento de Neurociencia de Fishberg y Instituto Friedman Brain, Escuela de Medicina Icahn en Mount Sinai, Nueva York, Nueva York 10029, Departamentos de Psiquiatría y de Farmacología y Sistemas Terapéutica, Icahn School of Medicine en Mount Sinai, Nueva York, Nueva York 10029, Departamento de Psiquiatría, Universidad de Texas Southwestern Medical Center, Dallas, Texas 75390, Departamento de Farmacología y Toxicología y el Instituto de Investigación sobre Adicciones, Universidad Estatal de Nueva York en Buffalo, Nueva York, 14214 de Nueva York, y el Instituto Nacional de Salud y Medicina Médica, U952, Centro Nacional de Investigación Científica, Unidad Mixta de Investigación 7224, UPMC, París, 75005, Francia.

Resumen

El factor de transcripción, ΔFosB, se induce de forma robusta y persistente en el cuerpo estriado por varios estímulos crónicos, como drogas de abuso, antipsicóticos, recompensas naturales y estrés. Sin embargo, muy pocos estudios han examinado el grado de inducción de BFosB en los dos subtipos de neurona espinosa del medio estriado (MSN). Hacemos uso de ratones transgénicos BAC informadores fluorescentes para evaluar la inducción de ΔFosB en el receptor de dopamina 1 (D1) enriquecido y el receptor de dopamina 2 (D2) MSN enriquecido en el estriado ventral, núcleo accumbens (NAc), cáscara y núcleo, y en el estriado dorsal ) después de la exposición crónica a varias drogas de abuso, incluyendo cocaína, etanol, Δ (9) -tetrahidrocannabinol y opiáceos; el fármaco antipsicótico, haloperidol; enriquecimiento juvenil; el consumo de sacarosa; restricción calórica; el antidepresivo inhibidor de la recaptación de serotonina, fluoxetina; y el estrés de la derrota social. Nuestros hallazgos demuestran que la exposición crónica a muchos estímulos induce ΔFosB en un patrón selectivo de subtipo MSN en las tres regiones del estriado. Para explorar la inducción mediada por el circuito de strFosB en el cuerpo estriado, utilizamos optogenética para mejorar la actividad en las regiones del cerebro límbico que envían entradas sinápticas a NAc; estas regiones incluyen el área tegmental ventral y varias regiones aferentes glutamatérgicas: corteza prefrontal medial, amígdala e hipocampo ventral. Estas condiciones optogenéticas conducen a patrones muy distintos de inducción de ΔFosB en los subtipos de MSN en el núcleo y la carcasa de NAc. En conjunto, estos hallazgos establecen patrones selectivos de la inducción de ΔFosB en los subtipos de MSN del estriado en respuesta a estímulos crónicos y proporcionan una nueva visión de los mecanismos a nivel de circuito de la inducción de ΔFosB en el estriado.

Introducción

Los estímulos crónicos, incluidas las drogas de abuso, los antipsicóticos, el estrés y las recompensas naturales, causan la acumulación estable de ΔFosB, un producto truncado de FosB gen, en el cuerpo estriado (por ejemplo, Hope et al., 1994; Hiroi y Graybiel, 1996; Hiroi et al., 1997; Moratalla et al., 1996; Perrotti et al., 2004, 2008; Muller y Unterwald, 2005; McDaid et al., 2006; Teegarden y Bale, 2007; Wallace et al., 2008; Solinas et al., 2009; Vialou et al., 2010, 2011; Kaplan et al., 2011). Esta acumulación conduce a la regulación bidireccional de muchos genes por ΔFosB en esta región del cerebro (McClung y Nestler, 2003; Renthal et al., 2008, 2009; Vialou et al., 2010; Robison y Nestler, 2011). El cuerpo estriado está compuesto principalmente (∼95%) de neuronas espinosas del medio de proyección GABAergic (MSN), que se segregan en dos subtipos según el enriquecimiento de muchos genes, incluido el receptor de dopamina 1 (D1) o el receptor de dopamina 2 (D2) (Gerfen, 1992; Graybiel, 2000; Lobo et al., 2006; Heiman et al., 2008) y por sus salidas diferenciales a distintas estructuras subcorticales (Albin et al., 1989; Gerfen, 1992; Kalivas et al., 1993; Graybiel, 2000; Nicola, 2007; Smith et al., 2013). Recientemente, ha habido una gran cantidad de informes que demuestran distintos roles moleculares y funcionales de estos subtipos de MSN en el estriado ventral (núcleo accumbens [NAc]) y el estriado dorsal (dStr) en la mediación de conductas motivacionales y motrices (Lobo y Nestler, 2011; Gittis y Kreitzer, 2012).

Estudios previos han demostrado que el ΔFosB se induce principalmente en D1-MSN por tratamiento crónico con cocaína o rueda crónica, una forma de recompensa natural (Moratalla et al., 1996; Werme et al., 2002; Lee et al., 2006), mientras que el estrés por restricción crónica induce ΔFosB en ambos subtipos de MSN (Perrotti et al., 2004). Además, la evidencia convincente de las líneas transgénicas específicas del tipo celular o la transferencia génica mediada por el virus demuestra que la inducción de ΔFosB en D1-MSN aumenta la plasticidad conductual y estructural de la cocaína, las respuestas conductuales a la morfina, el funcionamiento de la rueda, la recompensa de los alimentos y la resistencia a la derrota social crónica estrés, mientras que la inducción de ΔFosB en D2-MSN regula negativamente las respuestas de comportamiento al funcionamiento de la rueda (Kelz et al., 1999; Werme et al., 2002; Colby et al., 2003; Olausson et al., 2006; Zachariou et al., 2006; Vialou et al., 2010; Grueter et al., 2013; Robison et al., 2013).

Dado el papel crucial de forFosB en la regulación de estos estímulos motivacionales crónicos, con distintos efectos en D1-MSN frente a D2-MSN, realizamos aquí un estudio exhaustivo sobre los patrones de inducción de ΔFosB en subtipos de MSN mediante varios estímulos crónicos, incluida la exposición crónica a medicamentos. de abuso, tratamiento crónico con un fármaco antipsicótico, exposición crónica a estímulos ambientales y apetitivos alterados, estrés por derrota social crónica y tratamiento crónico con un antidepresivo. Para entender los mecanismos del circuito que controlan la inducción de ΔFosB en el cuerpo estriado por varias regiones cerebrales aferentes aferentes, utilizamos tecnologías optogenéticas para activar repetidamente los cuerpos celulares en los subtipos dopaminérgicos o glutamatérgicos del cerebro y examinamos la inducción de ΔFosB resultante en los subtipos de MSN. Nuestros resultados proporcionan información novedosa sobre la inducción de ΔFosB en D1-MSN y D2-MSN estriatales por estímulos crónicos y, por primera vez, demuestran la inducción mediada por circuito de ΔFosB en el estriado y dentro de los subtipos selectivos de MSN.

Materiales y Métodos

Los animales

D1-GFP or D2-GFP ratones hemicigotos (Gong et al., 2003) en un fondo C57BL / 6 se mantuvieron en un ciclo de oscuridad ligera 12 h con ad libitum comida y agua. Todos los estudios se realizaron de acuerdo con las pautas establecidas por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales de la Escuela de Medicina de la Universidad de Maryland y la Escuela de Medicina Icahn en Mount Sinai. Ratones machos (edad 8 semanas) se utilizaron para todos los experimentos. Todos los ratones se perfundieron y los cerebros se recolectaron durante la tarde del ciclo de luz. Hemizigoto D1-GFP y D2-GFP Se ha demostrado que los ratones en un fondo C57BL / 6 o FVB / N son equivalentes a los ratones de tipo salvaje con respecto al comportamiento, la fisiología de D1-MSN y D2-MSN y el desarrollo de los MSN (Lobo et al., 2006; Chan et al., 2012; Nelson et al., 2012). Además, los patrones generales de la inducción de ΔFosB observados en este estudio son comparables a los observados en animales de tipo salvaje con herramientas no selectivas de tipo celular (por ejemplo, Perrotti et al., 2004, 2008).

Tratamiento de la cocaína.

D1-GFP (n = 4 por tratamiento) y D2-GFP (n = 4 por tratamiento) los ratones recibieron 7 inyecciones diarias intraperitoneales de cocaína (20 mg / kg) o 0.9% de solución salina en la jaula de la casa. Para las inyecciones de 1 o 3 d cocaína (20 mg / kg), los ratones recibieron 6 o 4 d de 0.9% de inyecciones salinas seguidas de 1 o 3 d de inyecciones de cocaína, respectivamente. Todos los ratones se perfundieron 24 h después de la última inyección. Esta dosis de cocaína fue seleccionada en base a estudios previos (por ejemplo, Maze et al., 2010).

Tratamiento con haloperidol.

D1-GFP (n = 3 o 4 por tratamiento) y D2-GFP (n = 4 por tratamiento) los ratones recibieron haloperidol (2 mg / kg) en el agua de bebida, pH 6.0 (Narayan et al., 2007), o agua potable regular, pH 6.0, para 3 semanas (21 d). Los ratones se perfundieron en el día 22.

Tratamiento con morfina.

D2-GFP ratonesn = 4 o 5 por tratamiento) se anestesiaron brevemente con isoflurano y recibieron implantes subcutáneos de morfina (25 mg) o pastillas simuladas el día 1 y el día 3 como se describió anteriormente (Mazei-Robison et al., 2011). Los ratones se perfundieron en el día 5.

Tratamiento con etanol.

D2-GFP ratonesn = 4 o 5 por tratamiento) se expusieron a 10% etanol (EtOH), una dosis que se ha demostrado que C57BL / 6 bebe (Yoneyama et al., 2008). Los ratones recibieron una prueba de elección de dos frascos para 10% EtOH (frasco A) y agua (frasco B), mientras que D2-GFP los controles recibieron agua en ambas botellas (botella A y B) para 10 d. Todos los ratones que recibieron botellas de EtOH mostraron una preferencia por EtOH, según lo calculado por (100 x botella A volumen / [botella A volumen + botella B volumen]). Los ratones que recibieron el 10% de botella de EtOH consumieron significativamente más EtOH en comparación con el agua, mientras que los ratones que recibieron agua en ambas botellas no mostraron diferencias en el consumo de líquidos. En la tarde del día 10, a todos los ratones se les dio agua potable normal y se perfundieron el día 11.

Tratamiento con Δ (9) -tetrahidrocannabinol (Δ (9) -THC).

D2-GFP (n = 3 por tratamiento) los ratones recibieron inyecciones intraperitoneales de Δ (9) -THC (10 mg / kg) o vehículo (0.9% de solución salina con 0.3% de Tween) dos veces al día para 7 d (Perrotti et al., 2008). Los ratones se perfundieron 24 h después de la última inyección.

Autoadministración de la cocaína.

D2-GFP ratonesn = 4 o 5 por tratamiento) fueron entrenados inicialmente para presionar con palanca para 20 mg de pellets de sacarosa en una proporción fija. El programa de refuerzo de 1 (FR1) hasta que se alcanzó un criterio de adquisición de 30 pellets de sacarosa consumidos durante 3.Larson et al., 2010). Los ratones que aprendieron a presionar con palanca se implantaron quirúrgicamente con un catéter yugular intravenoso para permitir la posterior administración intravenosa de cocaína. Una semana después de la cirugía, los ratones fueron introducidos en el paradigma de autoadministración durante las sesiones diarias de 2 h en un programa de refuerzo FR1. El equipo de autoadministración (Med Associates) se programó de tal manera que una respuesta en la palanca activa dio lugar a la entrega (sobre 2.5 s) de cocaína (0.5 mg / kg / infusión por presión de la palanca correcta), mientras que una respuesta en la palanca inactiva No tuvo ninguna consecuencia programada. Ratones autoadministrados de cocaína en un programa FR1 en sesiones diarias de 2 h, 5 d por semana, durante las semanas 3. D2-GFP Los ratones que recibieron 0.9% de inyecciones de solución salina durante el período de tiempo equivalente se utilizaron como controles. Los ratones se perfundieron 24 h después de la última administración de cocaína o solución salina.

La autoadministración de heroína.

Antes de la autoadministración de heroína, D2-GFP ratonesn = 4 por tratamiento) fueron entrenados para la prensa de palanca para pellets de chocolate (BioServ, Dustless Precision Pellets) en siete sesiones diarias de 1 h. Los ratones que aprendieron a presionar con palanca se implantaron quirúrgicamente con un catéter yugular intravenoso para permitir la posterior administración intravenosa de heroína. Una semana después de la cirugía, los ratones fueron introducidos en el paradigma de autoadministración durante las sesiones diarias de 3 h en un programa de refuerzo FR1 de acuerdo con los procedimientos estándar (Navarro et al., 2001). El equipo de autoadministración (Med Associates) se programó de tal manera que una respuesta en la palanca activa resultó en el suministro (en 5 s) de heroína (30 μg / kg / inyección; Programa de Suministro de Medicamentos NIDA), mientras que una respuesta en el inactivo La palanca no tuvo consecuencia programada. Los animales tuvieron acceso al procedimiento autoadministrado de heroína para 14 d. D2-GFP Los ratones que recibieron 0.9% de inyecciones de solución salina durante el período de tiempo equivalente se utilizaron como controles. Los ratones se perfundieron 24 h después de la última administración de heroína o solución salina.

Enriquecimiento ambiental juvenil.

D2-GFP (n = 4 por grupo) los ratones se destetaron en un ambiente enriquecido o en condiciones normales de alojamiento en el día postnatal 21 (P21) usando un paradigma adaptado de ratas (Green et al., 2010). El ambiente enriquecido consistía en una jaula de hámster más grande con ropa de cama de enriquecimiento de o-cob (ropa de cama de Andersons Laboratory) llena de dispositivos de enriquecimiento que incluían túneles de ratón, domo y ruedas, bolas de arrastre, chozas (Bio Serv) y otros juguetes. Los ratones permanecieron en las condiciones de alojamiento durante semanas 4 hasta P50 y luego se perfundieron.

Tratamiento de sacarosa.

D2-GFP ratonesn = 4 o 5 por tratamiento) se les realizó una prueba de elección de dos frascos para 10% de sacarosa similar a un estudio previo (Wallace et al., 2008). Los ratones recibieron 10% de sacarosa (botella A) y agua (botella B), mientras que D2-GFP Los controles recibieron agua en ambas botellas para 10 d. Todos los ratones que recibieron botellas de sacarosa mostraron una preferencia por la sacarosa calculada por (100 × botella A volumen / botella A volumen + botella B volumen). Los ratones que recibieron la botella de sacarosa 10% consumieron significativamente más sacarosa en comparación con el agua, mientras que los ratones que recibieron agua en ambas botellas no mostraron diferencias en el consumo de líquidos. En la tarde del día 10, a todos los ratones se les dio agua potable normal y se perfundieron el día 11.

Restricción calórica.

D2-GFP ratonesn = 4 por genotipo) pasó por un protocolo de restricción de calorías, en el que recibieron 60% de ad libitum calorías diariasVialou et al., 2011) para 10 d. D2-GFP Los ratones de control recibieron acceso completo al perro. En la tarde del día 10, todos los ratones recibieron acceso total al alimento y se perfundieron el día 11.

El estrés de la derrota social.

D2-GFP ratonesn = 4 o 5 por grupo) se sometieron a 10 d de estrés por derrota social como se describió anteriormente (Berton et al., 2006; Krishnan y otros, 2007). Los ratones se expusieron a reproductores agresivos retirados de CD1 para 5 min en una jaula de hámster grande. Los ratones se alojaron para 24 h en la misma jaula en el otro lado de un divisor perforado para mantener el contacto sensorial. Al día siguiente, los ratones fueron expuestos a un nuevo ratón CD1 en las mismas condiciones y alojamiento. Esto se repitió para 10 d con un nuevo CD1 cada día. Los ratones de control se alojaron en condiciones similares sin estrés de derrota. Los ratones fueron probados para la interacción social en el día 11. Los ratones se probaron primero para el tiempo dedicado a interactuar con una cámara nueva en un cuadro de campo abierto sin otro ratón presente (sin objetivo) y luego se probaron para determinar el tiempo dedicado a interactuar con un nuevo ratón CD1 (objetivo) que estaba contenido detrás de la cámara (Berton et al., 2006; Krishnan y otros, 2007). Los ratones fueron segregados en grupos susceptibles o resistentes basados ​​en parámetros descritos previamente (Krishnan y otros, 2007). Esto incluyó el tiempo total pasado con el nuevo ratón y la relación de interacción: (tiempo gastado con el objetivo / tiempo pasado sin el objetivo) × 100. Se ha demostrado que esta medida identifica de manera confiable los grupos susceptibles y resistentes y está altamente correlacionada con otras diferencias de comportamiento (Krishnan y otros, 2007). Todos los ratones se perfundieron 24 h después de la prueba de interacción social (48 h después del último episodio de derrota social).

Tratamiento con fluoxetina.

D2-GFP ratonesn = 3 o 4 por grupo) recibieron 14 inyecciones diarias intraperitoneales de fluoxetina (20 mg / kg) o vehículo (0.9% solución salina con 10% ciclodextrina) (Berton et al., 2006). Los ratones se perfundieron 24 h después de la última inyección.

Cirugía estereotáxica.

D2-GFP los ratones se anestesiaron con ketamina (100 mg / kg) / xilazina (10 mg / kg), se colocaron en un instrumento estereotáxico de animales pequeños y se expuso la superficie de su cráneo. Se utilizaron treinta y tres agujas de jeringa de calibre para inyectar unilateralmente 0.5 – 1 μl, a una tasa de 0.1 μl por minuto, de virus de manera bilateral en el área ventral tegmental (VTA), corteza prefrontal medial (mPFC), amígdala o hipercampo ventral ( vHippo). AAV [virus adenoasociado] -hSyn-ChR2 [channelrhodopsin 2] -EYFP o AAV-hSyn-EYFP se infundió en el VTA de D2-GFP ratonesn = 5 por grupo) en coordenadas estereotáxicas (anterior-posterior, −3.3 mm; lateral-medial, 0.5 mm; dorsal-ventral, −4.4 mm, ángulo de 0 °). Esto fue seguido por una cánula bilateral (calibre 26), con una longitud de 3.9 mm, implantación sobre el VTA (anterior-posterior, −3.3 mm; lateral-medial, 0.5 mm; dorsal-ventral, −3.7 mm)Koo et al., 2012; Chaudhury et al., 2013). AAV-CaMKII-ChR2-mCherry o AAV-CaMKII-mCherry se inyectaron en el mPFC (n = 4 o 5 por grupo), amígdala (n = 3 o 4 por grupo), o vHippo (n = 3 o 4 por grupo) de D2-GFP ratones seguidos de la implantación de fibras ópticas implantables crónicas 105 μm (Sparta et al., 2011). Las coordenadas fueron las siguientes: mPFC (se enfocó la infralímbica, pero observamos la propagación del virus a las regiones prelímbicas: anterior-posterior, 1.7 mm; lateral-medial, 0.75 mm; dorsal-ventral, −2.5 mm, 15 ° ángulo) y fibra óptica (dorsal-ventral, −2.1 mm); amígdala (se apuntó a la amígdala basolateral, pero observamos la propagación del virus en el núcleo central de la amígdala; anterior-posterior, −1.6 mm; lateral-medial, 3.1 mm; dorsal-ventral, −4.9 mm, 0 ° ángulo) y óptica fibra (dorsal-ventral, −4.9 mm); vHippo (se enfocó el subículo ventral, pero observamos la propagación del virus en otras regiones del hipocampo ventral; anterior-posterior, −3.9 mm; lateral-medial, 3.0 mm; dorsal-ventral, −5.0 mm, 0 ° ángulo) y fibra óptica (dorsal-ventral, −4.6 mm).

Condiciones optogenéticas.

Para in vivo En el control óptico de la activación neuronal de VTA, se modificó un cordón de parche de fibra óptica 200 μm para su acoplamiento a la cánula. Cuando la fibra se aseguró a la cánula, la punta de la fibra se extendió ∼0.5 mm más allá de la cánula (Lobo et al., 2010; Chaudhury et al., 2013). por in vivo control óptico de mPFC, amígdala y vHippo neuronal, se conectó un cordón de parche de fibra dividida 62.5 μm a las fibras de montaje de cabeza implantable (Sparta et al., 2011). Las fibras ópticas se conectaron a través de un adaptador FC / PC a un diodo láser azul 473 nm (Crystal Lasers, BCL-473-050-M), y se generaron pulsos de luz a través de un estimulador (Agilent, 33220A). Para VTA, pulsos fásicos de luz azul (473 nm), 20 Hz para 40 ms (Chaudhury et al., 2013), se entregaron para 10 min al día sobre 5 d. Para mPFC, amígdala y vHippo, se enviaron pulsos de luz azul (473 nm), 20 Hz para 30 s, para 10 min al día para 5 d. El suministro de luz ocurrió en la jaula de la casa, y todos los ratones se perfundieron 24 h después de la última estimulación con luz.

Electrofisiología in vitro de pinzamientos.

Se obtuvieron grabaciones de células completas de neuronas de dopamina VTA o neuronas glutamatérgicas mPFC en cortes cerebrales agudos de ratones inyectados con los virus mencionados anteriormente. Se realizaron grabaciones de rebanadas en ratones sin in vivo estimulación, pero con 1 d de estimulación de corte (1 d) o 4 d de in vivo Estimulación y 1 d de la estimulación de corte (5 d). Para minimizar el estrés y obtener cortes saludables, los ratones se anestesiaron inmediatamente después de llevarlos al área de electrofisiología y se perfundieron para 40-60 s con aCSF helado, que contenía 128 mm NaCl, 3 mm KCl, 1.25 mm NaH2PO4, 10 mm d-glucosa, 24 mm NaHCO3, 2 mm CaCl2, y 2 mm MgCl2 (oxigenada con 95% O2 y 5% CO2, pH 7.4, 295 – 305 mOsm). Se cortaron cortes cerebrales agudos que contenían mPFC o VTA utilizando una microclicadora (Ted Pella) en sacarosa fría aCSF, que se derivó reemplazando por completo NaCl con 254 mm sacarosa y se saturaron con 95% O2 y 5% CO2. Las rebanadas se mantuvieron en una cámara de retención con aCSF para 1 h a 37 ° C. Las pipetas de parche (3 – 5 MΩ), para la corriente de células completas, se llenaron con una solución interna que contenía lo siguiente: 115 mm gluconato de potasio, 20 mm KCl, 1.5 mm MgCl2, 10 mm fosfocreatina, 10 mm HEPES, 2 mm magnesio ATP y 0.5 mm GTP (pH 7.2, 285 mOsm). Los registros de células completas se realizaron utilizando aCSF a 34 ° C (caudal = 2.5 ml / min). Se generaron trenes de luz azul (20 Hz para mPFC o 20 Hz fásico, 40 ms para VTA) mediante un estimulador conectado a través de un adaptador FC / PC a un diodo láser azul (OEM) de 473 nm y se entregaron a cortes de mPFC y VTA a través de un 200. Fibra óptica μm. Los experimentos de pinza de corriente se realizaron con el amplificador Multiclamp 700B, y la adquisición de datos se realizó en pClamp 10 (Molecular Devices). La resistencia en serie se monitorizó durante los experimentos, y las corrientes y voltajes de membrana se filtraron a 3 kHz (filtro Bessel).

Inmunohistoquímica.

Los ratones se anestesiaron con hidrato de cloral y se perfundieron con 0.1 m PBS seguido de 4% de paraformaldehído en PBS. Los cerebros se fijaron posteriormente en 4% paraformaldehído durante la noche y luego se conservaron en 30% sacarosa. Los cerebros se seccionaron en un criostato (Leica) a 35 μm en PBS con 0.1% de azida sódica. Para la inmunohistoquímica, las secciones se bloquearon en 3% de suero de asno normal con 0.01% Triton-X en PBS para 1 h en el agitador a temperatura ambiente. Las secciones se incubaron luego en anticuerpos primarios en bloque durante la noche en el agitador a temperatura ambiente. Los anticuerpos utilizados fueron los siguientes: conejo anti-FosB (1: 2000, catálogo # sc-48, Santa Cruz Biotechnology), ratón anti-NeuN (1: 1000, catálogo #MAB377, Millipore), pollo anti-GFP (1: 5000: 10 , catálogo # 20-1, Aves), y anti-CREB de conejo (proteína de unión al elemento de respuesta cAMP; 1000: 06, catálogo # 863-1, Millipore). Al día siguiente, las secciones se enjuagaron en PBS seguido de una incubación con 3 h en anticuerpos secundarios: CykeyNUMX anti-conejo de burro, Cy5 anti-mouse de burro, y anti-pollo DyLight-488 de burro o Alexa-488 (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Para la inmunohistoquímica de mCherry y tirosina hidroxilasa, los experimentos se realizaron como se describió anteriormente (Lobo et al., 2010; Mazei-Robison et al., 2011). Las secciones se enjuagaron en PBS, se montaron en portaobjetos y se cubrieron con un portaobjetos.

Imágenes y conteo celular.

La imagen de inmunofluorescencia se realizó en un microscopio confocal Zeiss Axioscope o Olympus Bx61. El conteo de células se realizó con el software ImageJ. Las imágenes que tomaron muestras del bregma 1.42 – 1.1 de NAc (núcleo y concha) y del cuerpo estriado dorsal se tomaron de cortes de cerebro / animal de 2 o 3 (ver A). Se contaron un total de células 400-500 por región del cerebro por ratón utilizando imágenes 250 μm × 250 μm. Las células se contaron utilizando el software ImageJ similar a un estudio anterior (Lobo et al., 2010). Aproximadamente 400-500 células NeuN totales se contaron por región cerebral por ratón, y luego el número de GFP+GFP+: ΔFosB+GFP-, y GFP-: ΔFosB+ Se contaron las células en cada región. Los datos se cuantificaron de la siguiente manera: (GFP+: ΔFosB+ neuronas × 100%) / (GFP total+ neuronas) y (GFP-: ΔFosB+ neuronas × 100%) / (GFP total- neuronas). Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software GraphPad Prism. Se utilizaron ANOVA de dos vías seguidas de las pruebas de Bonferroni posteriores para todos los análisis de recuento de células.

Figura 1.  

La cocaína crónica induce selectivamente ΔFosB en D1-MSN en regiones del estriado. ALas secciones de estriado de bregma + 1.42 a + 1.10 se utilizaron para el conteo de células. Imagen de un D2-GFP sección estriatal muestra las tres regiones estriatales estudiadas: núcleo NAc, ...

Resultados

ΔFosB se induce diferencialmente en D1-MSN y D2-MSN después de la exposición repetida a la cocaína frente al haloperidol

Primero examinamos la inducción de ΔFosB en los subtipos de MSN en D1-GFP y D2-GFP ratones que usan condiciones crónicas de cocaína que previamente demostraron inducir preferentemente la proteína ΔFosB en D1-MSNs (Moratalla et al., 1996). D1-GFP y D2-GFP Ratones transgénicos BAC, que expresan una proteína fluorescente verde aumentada bajo el gen del receptor D1 o D2 ( A), recibieron inyecciones intraperitoneales de cocaína (20 mg / kg) o solución salina para 7 d, y los cerebros se recogieron 24 h después de la inyección final ( B). Luego realizamos la inmunohistoquímica en secciones del cerebro utilizando anticuerpos contra NeuN, GFP o FosB y formamos imágenes y contamos las células en el núcleo de NAc, la cubierta de NAc y dStr ( A,C). Mientras que el anticuerpo anti-FosB reconoce FosB de longitud completa y ΔFosB, numerosos estudios que utilizan transferencia de Western o inmunohistoquímica han confirmado que ΔFosB es la única especie detectable presente en el punto de tiempo de retiro de 24 h (por ejemplo, Perrotti et al., 2008). Por lo tanto, utilizamos 24 h o un punto de tiempo más largo para recopilar cerebros después de todas las condiciones en este estudio para asegurarnos de que solo detectamos ΔFosB. Debido a que los MSN estriatales comprenden el ∼95% de todas las neuronas en el estriado, utilizamos el inmunomarcado NeuN para identificar el GFP- neuronas, que están enriquecidas en el subtipo de MSN opuesto (es decir, D2-MSN en el D1-GFP ratones y D1-MSNs en el D2-GFP ratones). Encontramos eso D1-GFP Los ratones tratados con cocaína muestran una inducción significativa de ΔFosB en GFP+/ NeuN+ neuronas (D1-MSN) en el núcleo de NAc, shell de NAc y dStr, mientras que GFP-/ NeuN+ Las células (D2-MSN) no mostraron una inducción significativa de ΔFosB en todas las regiones del estriado ( D): ANOVA bidireccional, núcleo NAc: tipo de fármaco × célula F(1,12) = 16.41, p <0.05, prueba posterior de Bonferroni: p <0.01; Capa de NAc: fármaco × tipo de célula F(1,12) = 12.41, p <0.05, prueba posterior de Bonferroni: p <0.001; dStr: fármaco × tipo de célula F(1,12) = 12.07, p <0.05, prueba posterior de Bonferroni: p <0.01. De acuerdo con estos hallazgos, observamos en D2-GFP Los ratones no tienen inducción significativa de ΔFosB en GFP+/ NeuN+ neuronas (D2-MSN) pero una inducción significativa de ΔFosB en GFP-/ NeuN+ (D1-MSNs) en todas las regiones estriatales después del tratamiento con cocaína ( D): ANOVA bidireccional, núcleo NAc: tipo de fármaco × célula F(1,12) = 15.76, p <0.01, prueba posterior de Bonferroni: p <0.0001; Concha NAc: fármaco × tipo de célula: F(1,12) = 20.33, p <0.05, prueba posterior de Bonferroni: p <0.01; dStr: fármaco × tipo de célula: F(1,12) = 35.96, p <0.01, prueba posterior de Bonferroni: p <0.001. Examinamos la cinética de la inducción de ΔFosB en MSN después de 1, 3 o 7 días de inyecciones de cocaína (20 mg / kg, ip). Observamos una inducción significativa de ΔFosB en D1-MSN con 3 o 7 días de tratamiento con cocaína en comparación con el tratamiento con solución salina en todas las regiones estriatales ( F): gráfica representativa de dStr; ANOVA bidireccional, tipo de celda × día F(2,13) = 17.87, p <0.01, prueba posterior de Bonferroni: p <0.01, p <0.001. Esto es consistente con el curso temporal de la acumulación de ΔFosB en el cuerpo estriado visto anteriormente por Western blot (Hope et al., 1994) y confirma la inducción selectiva de ΔFosB únicamente en D1-MSN a lo largo de un ciclo de exposición a la cocaína.

A continuación, examinamos la inducción de BFosB por inmunohistoquímica en subtipos de MSN después de la exposición crónica al haloperidol ( ). Trabajos previos sugirieron indirectamente que el haloperidol crónico podría inducir osFosB preferentemente en D2-MSNs (Hiroi y Graybiel, 1996; Atkins et al., 1999), aunque esto no ha sido examinado directamente hasta ahora. D1-GFP y D2-GFP los ratones recibieron haloperidol (2 mg / kg) en el agua potable, pH 6.0, mientras que D1-GFP y D2-GFP los ratones de control recibieron agua potable regular, pH 6.0, para 21 d (3 semanas) y los cerebros se recogieron el día 22 ( A). Al igual que con la cocaína, sabemos que toda la inmunorreactividad de tipo FosB en el estriado en este momento representa FosB, no FosB de longitud completa (Atkins et al., 1999). Encontramos eso D1-GFP los ratones que recibieron haloperidol no mostraron una inducción significativa de ΔFosB en GFP+/ NeuN+ neuronas (D1-MSN) en núcleo NAc, shell NAc o dStr; sin embargo, se observó un aumento significativo en ΔFosB en GFP-/ NeuN+ neuronas (D2-MSN) en todas las regiones estriatales ( B,C): ANOVA bidireccional, núcleo NAc: droga × tipo de célula: F(1,10) = 23.29, p <0.05, prueba posterior de Bonferroni: p <0.01; Capa de NAc: fármaco: fármaco × tipo de célula: F(1,10) = 30.14, p <0.05, prueba posterior de Bonferroni: p <0.01; dStr: fármaco × tipo de célula: F(1,10) = 37.63, p <0.001, prueba posterior de Bonferroni: p <0.0001. Esto fue confirmado por el examen de D2-GFP ratones: observamos una inducción significativa de ΔFosB en GFP+/ NeuN+ neuronas (D2-MSN) en las tres regiones del estriado, pero no hay cambios significativos en ΔFosB en GFP-/ NeuN+ (D1-MSNs) después del tratamiento con haloperidol ( B,C): ANOVA bidireccional, núcleo NAc: droga × tipo de célula: F(1,12) = 24.30, p <0.05, prueba posterior de Bonferroni: p <0.05; Concha NAc: fármaco × tipo de célula: F(1,12) = 26.07, p <0.01, prueba posterior de Bonferroni: p <0.001; dStr: fármaco × tipo de célula: F(1,12) = 21.36, p <0.01, prueba posterior de Bonferroni: p <0.01. Dado que observamos un patrón similar de inducción de ΔFosB en D1-MSN por exposición repetida a cocaína en ambos D1-GFP (GFP+/ NeuN+) y D2-GFP (GFP-/ NeuN+) ratones, y por haloperidol repetido en D2-MSN en D1-GFP (GFP-/ NeuN+) y D2-GFP (GFP+/ NeuN+) ratones, el resto de nuestros experimentos utilizados. D2-GFP ratones para examinar la inducción de ΔFosB en D1-MSN (GFP-/ NeuN+) y D2-MSNs (GFP+/ NeuN+) después de otros estímulos crónicos.

Figura 2.  

El haloperidol crónico induce selectivamente ΔFosB en D2-MSN en regiones del estriado. A, Plazo de 21 d tratamiento del haloperidol (2 mg / kg, en el agua potable) o agua. B, Inmunohistoquímica de la concha NAc de D1-GFP y D2-GFP ratones después de haloperidol ...

Como control, examinamos los niveles de expresión de CREB en las condiciones de cocaína y haloperidol para determinar si nuestros hallazgos podrían generalizarse a otros factores de transcripción ( ). No observamos diferencias significativas en la expresión de CREB entre el control y los ratones tratados con fármacos. Además, no observamos diferencias en los niveles de CREB entre D2-MSN y D1-MSN ( B,C).

Figura 3.  

La cocaína crónica o el haloperidol no inducen CREB en los subtipos de MSN. A, Inmunotinción para CREB y GFP en estriado de D2-GFP ratones después de la cocaína crónica o haloperidol crónico ( y Y22 Leyendas para tratamientos de drogas). Barra de escala, 50 μm. ...

Diferentes patrones de inducción de ΔFosB en subtipos de MSN por drogas de abuso

Debido a que estudios anteriores han demostrado que otras drogas de abuso pueden inducir potentemente ΔFosB en subregiones del estriado (Perrotti et al., 2008), examinamos ΔFosB en los subtipos de MSN después de la exposición crónica a opiáceos, EtOH o Δ (9) -THC. En primer lugar, examinamos si la exposición crónica a la morfina induce BFosB en subtipos específicos de MSN en las regiones estriatales. D2-GFP los ratones recibieron dos implantes subcutáneos de un sedimento simulado o de morfina (25 mg) los días 1 y 3, y los cerebros se recogieron el día 5 ( A) cuando inducedFosB, pero no FosB, es inducido (Zachariou et al., 2006). En sorprendente contraste con la cocaína, ambos subtipos de MSN mostraron un aumento significativo (y aproximadamente comparable) en ΔFosB en el núcleo de NAc, cáscara de NAc y dStr en el grupo de morfina en comparación con los controles falsos, sin inducción de subtipo celular diferencial de ΔFosB en todo el estriado regiones ( A): ANOVA bidireccional; Núcleo NAc: droga F(1,14) = 75.01, p <0.0001, prueba posterior de Bonferroni: p <0.01 (D2-MSN), p <0.001 (D1-MSN); Cáscara de NAc: droga F(1,14) = 62.87, p <0.0001, prueba posterior de Bonferroni: p <0.01 (D2-MSN), p <0.05 (D1-MSN); dStr: fármaco F(1,14) = 60.11, p <0.001, prueba posterior de Bonferroni: p <0.01 (D2-MSN), p <0.05 (D1-MSN).

Figura 4.  

Las drogas de abuso inducen ΔFosB en los subtipos de MSN en las regiones estriatales. A, Tratamiento de morfina crónica (25 mg gránulos en los días 1 y 3) en D2-GFP los ratones dan como resultado una inducción significativa de ΔFosB en ambos subtipos de MSN en el núcleo de NAc, la cubierta de NAc y dStr ...

A continuación, investigamos el patrón de inducción de ΔFosB en los subtipos de MSN después de la exposición crónica a EtOH. D2-GFP a los ratones se les realizó una prueba de elección de dos botellas para 10% de EtOH (botella A) y agua (botella B), mientras que D2-GFP los controles recibieron agua en ambas botellas (botellas A y B), para 10 d y los cerebros se recolectaron el día 11 ( B). Los ratones que recibieron el 10% de botella de EtOH consumieron significativamente más EtOH en comparación con el agua, mientras que los ratones que recibieron agua en ambas botellas no mostraron diferencias en el consumo de líquido ( B): preferencia por el grupo de agua de la botella A: 50.00 ± 4.551%, grupo EtOH: 84.44 ± 8.511%; Del estudiante t prueba p <0.05. La administración crónica de EtOH resultó en una inducción significativa de ΔFosB selectivamente en D1-MSN en NAc core, NAc shell y dStr, sin cambios en D2-MSNs ( B): ANOVA bidireccional, núcleo NAc: droga × tipo de célula: F(1,14) = 24.58, p <0.05, prueba posterior de Bonferroni: p <0.05; Concha NAc: fármaco × tipo de célula: F(1,14) = 36.51, p <0.01, prueba posterior de Bonferroni: p <0.01; dStr: fármaco × tipo de célula: F(1,14) = 29.03, p <0.01, prueba posterior de Bonferroni: p <0.01.

D2-GFP los ratones también se trataron con Δ (9) -THC (10 mg / kg, ip) dos veces al día para 7 d, y los cerebros se recogieron 24 h después de la última inyección. De manera similar a las condiciones de la cocaína y el EtOH, observamos un aumento significativo en ΔFosB selectivamente en D1-MSN en todas las regiones del estriado en ratones que recibieron Δ (9) -THC crónica ( E): ANOVA bidireccional, núcleo NAc: tipo de fármaco × célula F(1,8) = 26.37, p <0.01, prueba posterior de Bonferroni: p <0.01; Concha NAc: fármaco × tipo de célula: F(1,8) = 44.49, p <0.05, prueba posterior de Bonferroni: p <0.001; dStr: fármaco × tipo de célula F(1,8) = 29.30, p <0.05, prueba posterior de Bonferroni: p <0.01.

A continuación, examinamos si el patrón observado de la inducción de BFosB en los subtipos de MSN por la administración de cocaína u opiáceos por parte de un investigador ocurre en paradigmas contingentes en los que los ratones se autoadministran voluntariamente el fármaco. Primero, D2-GFP los ratones fueron entrenados para autoadministrarse cocaína (0.5 mg / kg / infusión) en un programa FR1 para 2 ha día durante 3 semanas y los cerebros se recolectaron 24 h después de la última infusión ( D), cuando se sabe que ΔFosB, pero no FosB, se induce (Larson et al., 2010). Los ratones pasaron mucho más tiempo presionando la palanca activa frente a inactiva ( D; Del estudiante t prueba p <0.01). La dosis diaria promedio de cocaína fue de 19.1 mg / kg por vía intravenosa ( D), similar a la dosis intraperitoneal de 20 mg / kg utilizada anteriormente ( ). Al igual que con la exposición no contingente a la cocaína ( ), encontramos que la autoadministración de cocaína causó una inducción significativa de ΔFosB solo en D1-MSN en todas las regiones del estriado en comparación con la exposición salina ( D): ANOVA bidireccional, núcleo NAc: tipo de fármaco × célula F(1,14) = 21.75, p <0.05, prueba posterior de Bonferroni: p <0.01; Concha NAc: fármaco × tipo de célula: F(1,14) = 26.52, p <0.01, prueba posterior de Bonferroni: p <0.01; dStr: fármaco × tipo de célula F(1,14) = 33.68, p <0.001, prueba posterior de Bonferroni: p <0.001. Asimismo, de manera similar a la exposición no contingente a opiáceos (morfina) ( A), Encontramos eso D2-GFP los ratones que se auto administraron heroína (30 μg / kg por infusión), en un programa de FR1 3 por día durante las semanas 2 examinaron 24 h después de la última exposición al fármaco, mostraron una inducción significativa de osFosB tanto en D2-MSNs como en D1-MSNs en todo el estriado regiones ( E): ANOVA bidireccional, núcleo NAc: fármaco F(1,12) = 68.88, p <0.001, prueba posterior de Bonferroni: p <0.01 (D2-MSN), p <0.05 (D1-MSN); Cáscara de NAc: droga F(1,12) = 80.08, p <0.0001, prueba posterior de Bonferroni: p <0.01 (D2-MSN), p <0.001 (D1-MSN); dStr: fármaco F(1,12) = 63.36, p <0.001, prueba posterior de Bonferroni: p < 0.05 (D2-MSN), p <0.05 (D1-MSN). La dosis diaria promedio de heroína fue de 0.459 mg / kg, y los ratones pasaron significativamente más tiempo presionando la palanca activa versus inactiva t prueba p <0.05) ( E).

El enriquecimiento ambiental y los estímulos apetitivos inducen ΔFosB tanto en D1-MSN como en D2-MSN.

Debido a que estudios anteriores demostraron que las recompensas naturales inducen ΔFosB en las regiones estriatales (Werme et al., 2002; Teegarden y Bale, 2007; Wallace et al., 2008; Solinas et al., 2009; Vialou et al., 2011), con inducción por rueda de marcha selectiva para D1-MSNs (Werme et al., 2002), examinamos si la inducción por otras recompensas naturales demostró especificidad celular. Primero usamos un paradigma de enriquecimiento juvenil en el cual D2-GFP los ratones se alojaron en un ambiente enriquecido desde el destete (semanas 3) durante un período de semana 4 ( A). Este enfoque se mostró anteriormente para inducir ΔFosB en ratones NAc y dStr (Solinas et al., 2009; Lehmann y Herkenham, 2011). Comparado con las condiciones normales de alojamiento, el ambiente enriquecido aumentó significativamente el ΔFosB en todas las regiones del estriado pero no lo hizo de una manera específica del tipo de célula, con una inducción comparable observada en D1-MSN y D2-MSN ( A): ANOVA bidireccional, núcleo NAc: medio ambiente F(1,12) = 89.13, p <0.0001, prueba posterior de Bonferroni: p <0.0001 (D2-MSN), p <0.0001 (D1-MSN); Shell NAc: medio ambiente F(1,12) = 80.50, p <0.0001, prueba posterior de Bonferroni: p <0.001 (D2-MSN), p <0.001 (D1-MSN); dStr: medio ambiente F(1,12) = 56.42, p <0.01, prueba posterior de Bonferroni: p <0.05 (D2-MSN), p <0.05 (D1-MSN).

Figura 5.  

El enriquecimiento ambiental y los estímulos apetitivos inducen ΔFosB en ambos subtipos de MSN. A, D2-GFP los ratones que se alojaron en un ambiente enriquecido a partir de P21 durante 4 semanas muestran la inducción de ΔFosB en ambos subtipos de MSN en todo el cuerpo estriado ...

A continuación, examinamos la expresión de ΔFosB en los subtipos de MSN después de los estímulos apetitivos crónicos. Primero probamos los efectos del consumo crónico de sacarosa, que se demostró previamente para inducir ΔFosB en ratas NAc (Wallace et al., 2008). D2-GFP a los ratones se les realizó una prueba de elección de dos botellas para 10% de sacarosa (botella A) y agua (botella B), mientras que D2-GFP los controles recibieron agua en ambas botellas (botella A y B) para 10 d y los cerebros se recolectaron el día 11 ( B). Los ratones que recibieron 10% de sacarosa consumieron significativamente más sacarosa, mientras que los ratones que recibieron agua en ambas botellas no mostraron diferencias en el consumo de líquidos ( B): preferencia por la botella A, agua: 50.00 ± 4.749%, sacarosa: 89.66 ± 4.473%; Del estudiante t prueba p <0.001. Encontramos que el consumo crónico de sacarosa inducía ΔFosB en el núcleo de NAc, la cáscara de NAc y el dStr y que esto ocurrió en ambos subtipos de MSN ( B): ANOVA bidireccional, núcleo NAc: tratamiento F(1,12) = 76.15 p <0.0001, prueba posterior de Bonferroni: p <0.01 (D2-MSN), p <0.01 (D1-MSN); Cáscara NAc: tratamiento F(1,12) = 63.35, p <0.001, prueba posterior de Bonferroni: p <0.05 (D2-MSN), p <0.01 (D1-MSN); dStr: tratamiento F(1,12) = 63.36, p <0.001, prueba posterior de Bonferroni: p <0.01 (D2-MSN), p <0.05 (D1-MSN).

Finalmente, examinamos la expresión de ΔFosB en los subtipos de MSN después de la restricción calórica porque esta condición, que aumenta la actividad locomotora y el estado motivacional, demostró previamente que aumenta los niveles de ΔFosB en ratones NAc (Vialou et al., 2011). D2-GFP Los ratones pasaron por un protocolo restringido en calorías, en el que recibieron 60% de ad libitum Las calorías diarias para 10 d y los cerebros se recolectaron el día 11 ( C). La restricción calórica aumentó los niveles de ΔFosB en el núcleo de NAc y en la concha de NAc como se demostró anteriormente (Vialou et al., 2011) y también aumentó los niveles de ΔFosB en dStr. Sin embargo, no observamos inducción diferencial en D1-MSN versus D2-MSNs ( C): ANOVA bidireccional, núcleo NAc: tratamiento F(1,12) = 67.94 p <0.0001, prueba posterior de Bonferroni: p <0.01 (D2-MSN), p <0.01 (D1-MSN); Cáscara NAc: tratamiento F(1,12) = 67.84, p <0.0001, prueba posterior de Bonferroni: p <0.001 (D2-MSN), p <0.01 (D1-MSN); dStr: tratamiento F(1,12) = 82.70, p <0.0001, prueba posterior de Bonferroni: p <0.001 (D2-MSN), p <0.001 (D1-MSN).

El estrés crónico por derrota social y el tratamiento con antidepresivos causan la inducción diferencial de ΔFosB en los subtipos de MSN

Anteriormente, demostramos que ΔFosB aumenta en NAc de ratones después de estrés por derrota social crónica (Vialou et al., 2010). Aunque esta inducción se observó tanto en ratones susceptibles (aquellos que muestran secuelas perjudiciales del estrés) como en ratones que son resistentes (aquellos que escapan a la mayoría de estos efectos perjudiciales), la inducción de ΔFosB fue mayor en el subgrupo resistente y se mostró directamente Para mediar en un estado de resiliencia. En el presente estudio, encontramos una sorprendente especificidad celular para la inducción de ΔFosB en estos dos grupos fenotípicos. D2-GFP los ratones fueron sometidos a 10 d de estrés por derrota social y se separaron en poblaciones susceptibles y resistentes en función de una medida de interacción social ( A), que se correlaciona altamente con otros síntomas de comportamiento (Krishnan y otros, 2007). Los ratones que desarrollaron conductas susceptibles después del estrés por derrota social mostraron una inducción significativa de ΔFosB en D2-MSN en NAc core, NAc shell y dStr en comparación con ratones de control y resistentes, sin inducción aparente en D1-MSNs. En sorprendente contraste, los ratones resistentes mostraron una inducción significativa de ΔFosB en D1-MSN en todas las regiones del estriado en comparación con los ratones susceptibles y de control, sin ninguna inducción aparente en D2-MSN ( A; ANOVA bidireccional, núcleo NAc: grupo × tipo de célula F(1,20) = 20.11, p <0.05, post-prueba de Bonferroni: D2-MSN / susceptible p <0.05, D1-MSN / resistente p <0.05; Shell NAc: grupo × tipo de celda F(1,20) = 27.79, p <0.01, post-prueba de Bonferroni: D2-MSN / susceptible p <0.001, D1-MSN / resistente p <0.01; dStr: grupo × tipo de celda F(1,20) = 19.76, p <0.01, post-prueba de Bonferroni: D2-MSN / susceptible p <0.05, D1-MSN / resistente p <0.01).

Figura 6.  

El estrés de la derrota social crónica y la fluoxetina crónica causan la inducción de BFosB en distintos subtipos de MSN en el cuerpo estriado. A, D2-GFP que son susceptibles a un curso 10 d de estrés por derrota social ΔFosB inducción en D2-MSN en todos los estriatales ...

El tratamiento crónico con el antidepresivo ISRS, la fluoxetina, revierte los comportamientos parecidos a la depresión que presentan los ratones susceptibles después del estrés crónico de derrota social (Berton et al., 2006). Además, dicho tratamiento induce ΔFosB en NAc de ratones susceptibles y de control, y hemos demostrado que dicha inducción es necesaria para los efectos conductuales beneficiosos de la fluoxetina (Vialou et al., 2010). Por lo tanto, examinamos la especificidad celular de la inducción de BFosB después de la administración crónica de fluoxetina. D2-GFP los ratones recibieron fluoxetina (20 mg / kg, ip) para 14 d, y los cerebros se recogieron el día 15 ( B). Observamos una inducción significativa de ΔFosB en D1-MSN, pero no en D2-MSN, en ratones tratados con fluoxetina en comparación con los controles de vehículo ( B; ANOVA bidireccional, núcleo NAc: medicamento × tipo de célula F(1,10) = 14.59, p <0.05, prueba posterior de Bonferroni: p <0.01; Concha NAc: fármaco × tipo de célula: F(1,10) = 26.14, p <0.05, prueba posterior de Bonferroni: p <0.01; dStr: fármaco × tipo de célula F(1,10) = 8.19, p <0.05, prueba posterior de Bonferroni: p <0.001).

La manipulación optogenética in vivo de las regiones cerebrales aferentes de NAc causa distintos patrones de inducción de BFosB en regiones del estriado y subtipos de MSN

Dado que los aportes aferentes dopaminérgicos y glutamatérgicos a NAc pueden facilitar la búsqueda de recompensas y alterar conductas similares a la depresión (Tsai et al., 2009; Covington et al., 2010; Adamantidis et al., 2011; Witten et al., 2011; Britt et al., 2012; Lammel et al., 2012; Stuber et al., 2012; Chaudhury et al., 2013; Kumar et al., 2013; Tye et al., 2013), examinamos la inducción de BFosB en los subtipos estriados de MSN después de manipular la actividad de varias regiones cerebrales aferentes clave. Expresamos viralmente ChR2 en cada una de varias regiones y las activamos con luz azul (473 nm) como se describió anteriormente (Gradinaru et al., 2010; Yizhar et al., 2011). Debido a que un estudio reciente demostró que la estimulación fásica con luz azul, después de la expresión no selectiva de células de ChR2 en VTA, dio lugar al mismo fenotipo de comportamiento que la estimulación fásica selectiva de las neuronas de dopamina VTA por ChR2 (Chaudhury et al., 2013), expresamos ChR2 utilizando AAV-hsyn-ChR2-EYFP en VTA de D2-GFP ratones; Los ratones de control se inyectaron con AAV-hsyn-EYFP. Las secciones de VTA se coadministraron con tirosina hidroxilasa y GFP para visualizar la expresión de ChR2-EYFP ( C). D2-GFP los ratones que expresan ChR2-EFYP o EYFP solo en VTA recibieron 5 d de 10 min de estimulación fásica de luz azul del VTA como se describió anteriormente (Koo et al., 2012; Chaudhury et al., 2013) ( A), y se recolectaron los cerebros 24 h después de la última estimulación. No hubo desensibilización de la capacidad de ChR2 para activar las neuronas de dopamina VTA después de 5 d de estimulación ( B). Encontramos que la estimulación fásica repetida de las neuronas VTA que expresan ChR2-EYFP aumenta ΔFosB en ambos subtipos de MSN en el núcleo de NAc, pero solo en D1-MSN en la capa de NAc ( C; ANOVA bidireccional, núcleo NAc: estímulos optogenéticos F(1,16) = 51.97, p <0.0001, prueba posterior de Bonferroni: p <0.001; (ambos subtipos de MSN) NAc shell: estímulos optogenéticos × tipo de célula: F(1,16) = 13.82, p <0.05, prueba posterior de Bonferroni: p <0.01). No observamos inducción de ΔFosB en dStr después de la estimulación fásica con luz azul a ChR2-EYFP que expresa VTA en comparación con los controles EYFP. Estos resultados deben interpretarse con precaución, ya que no nos dirigimos selectivamente a las neuronas de dopamina VTA para la estimulación óptica, y estudios recientes han demostrado neuronas de proyección no dopaminérgicas en VTA, así como una heterogeneidad considerable de VTA, que puede conducir a respuestas conductuales divergentes dependiendo de la activación. parámetros y subpoblaciones de neuronas afectadas (Tsai et al., 2009; Lammel et al., 2011, 2012; Witten et al., 2011; Kim et al., 2012, 2013; Tan et al., 2012; van Zessen y otros, 2012; Stamatakis y Stuber, 2012; Chaudhury et al., 2013; Tye et al., 2013).

Figura 7.  

La activación optogenética de las regiones cerebrales que inervan la NAc causa distintos patrones de inducción de BFosB en los subtipos de MSN y en las regiones estriatales. A, Paradigma de estimulación optogenética para todas las condiciones. Los cerebros fueron cosechados 24 h después de 5 d de optogenetic ...

A continuación, usamos los vectores AAV-CaMKII-ChR2-mCherry y AAV-CaMKII-mCherry para expresar ChR2-mCherry, o mCherry solo como control, en mPFC, amígdala o vHippo de D2-GFP ratones D – F). Se ha demostrado previamente que ChR2 y la expresión mCherry mediada por el virus CaMKII-ChR2 colocalizan con la expresión CaMKII, que en su mayoría marca neuronas glutamatérgicas (Gradinaru et al., 2009; Warden et al., 2012). Activamos las células que expresan ChR2 en estas regiones con 20 Hz luz azul para 10 min al día para 5 d, y los cerebros se recolectaron 24 h después de la última estimulación ( A). Este patrón de estimulación provocó el disparo de ∼27 – 33 Hz, principalmente debido al aumento del doblete observado. No se produjo una desensibilización aparente de ChR2 con 5 d de estimulación; sin embargo, observamos un ligero aumento en la activación de 1 a 5 d (32 – 33 Hz) de la estimulación. Encontramos que la activación optogenética de las neuronas mPFC dio como resultado la inducción de ΔFosB en D1-MSN en el núcleo de NAc, mientras que la inducción de ΔFosB ocurrió en ambos subtipos de MSN en la cáscara de NAc ( D; ANOVA bidireccional, núcleo NAc: estímulos optogenéticos × tipo de célula F(1,14) = 10.31, p <0.05, prueba posterior de Bonferroni: p <0.01; Shell NAc: estímulos optogenéticos F(1,14) = 57.17, p <0.001, prueba posterior de Bonferroni: p <0.05 (D2-MSN), p <0.01 (D1-MSN)). No se observaron cambios en los niveles de ΔFosB en dStr después de la activación de mPFC. Por el contrario, la activación optogenética de las neuronas de la amígdala indujo ΔFosB en ambos subtipos de MSN en el núcleo de NAc, y selectivamente en D1-MSN en la capa de NAc, sin que se produjeran cambios en dStr ( E; ANOVA bidireccional, núcleo NAc: estímulos optogenéticos F(1,10) = 78.92, p <0.0001, prueba posterior de Bonferroni: p <0.001 (D2-MSN), p <0.0001 (D1-MSN); Cáscara NAc: estímulos optogenéticos × tipo de célula: F(1,10) = 30.31, p <0.0001, prueba posterior de Bonferroni: p <0.0001). Finalmente, la activación optogenética de las neuronas vHippo causó una inducción significativa de ΔFosB solo en D1-MSN tanto en el núcleo de NAc como en la capa de NAc, y nuevamente no se observaron cambios en dStr ( F; ANOVA bidireccional, núcleo NAc: estímulos optogenéticos × tipo de célula F(1,10) = 18.30, p <0.05, prueba posterior de Bonferroni: p <0.01; Cáscara NAc: estímulos optogenéticos × tipo de célula: F(1,10) = 22.69, p <0.05, prueba posterior de Bonferroni: p <0.01).

Discusión

El presente estudio examina la inducción de BFosB en D1-MSN y D2-MSN en regiones del estriado después de varios estímulos crónicos (Tabla 1). Primero establecemos la viabilidad de usar D1-GFP y D2-GFP líneas informativas para demostrar la inducción selectiva de BFosB en D1-MSN después de la cocaína crónica y en D2-MSN después del haloperidol crónico. Los hallazgos de la cocaína son consistentes con estudios previos (Moratalla et al., 1996; Lee et al., 2006) y el rol establecido para ΔFosB en D1-MSN en la promoción de la recompensa de cocaína (Kelz et al., 1999; Colby et al., 2003; Grueter et al., 2013). Anteriormente mostramos que la cocaína administrada por el investigador y autoadministrada induce ΔFosB en un grado equivalente en NAc (Winstanley et al., 2007; Perrotti et al., 2008), y lo que es más importante, mostramos aquí que ambos modos de consumo de cocaína inducen ΔFosB selectivamente en D1-MSN en las tres regiones del estriado. Nuestros hallazgos son consistentes con estudios previos que demuestran que la cocaína aguda induce otros genes tempranos inmediatos y la fosforilación de varias proteínas de señalización intracelular solo en D1-MSN (Bateup et al., 2008; Bertran-Gonzalez et al., 2008). Del mismo modo, el patrón opuesto de la inducción de BFosB después del haloperidol crónico es consistente con el bloqueo de esta inducción por los agonistas del receptor tipo D2 (Atkins et al., 1999), y con la inducción selectiva aguda de haloperidol de genes tempranos inmediatos y la fosforilación de varias proteínas de señalización en D2-MSN (Bateup et al., 2008; Bertran-Gonzalez et al., 2008).

Tabla 1.  

IndFosB inducción en subtipos de MSN estriatal después de estímulos farmacológicos, emocionales y optogenéticos crónicosa

Al igual que con la cocaína, encontramos que la exposición crónica a otras dos drogas de abuso, EtOH y Δ (9) -THC, induce ΔFosB selectivamente en D1-MSN en todas las regiones del estriado. Anteriormente, demostramos que EtOH induce ΔFosB en el núcleo NAc, NAc shell y dStr, pero que Δ (9) -THC regula de forma significativa ΔFosB en el núcleo NAc, con una tendencia observada en las otras regiones (Perrotti et al., 2008). De manera similar, observamos aquí la mayor inducción de Δ (9) -THC de ΔFosB en el núcleo de NAc en D1-MSN; Nuestra capacidad para demostrar la inducción en otras regiones del estriado probablemente se deba al análisis específico de la célula utilizado. Curiosamente, la autoadministración crónica de morfina y heroína, a diferencia de otras drogas de abuso, indujo ΔFosB en ambos subtipos de MSN en un grado comparable en todas las regiones estriatales. Un estudio reciente demostró que la morfina aguda induce c-Fos en D1-MSN, mientras que la abstinencia precipitada por naloxona después de la morfina crónica induce c-Fos en D2-MSN (Enoksson et al., 2012). Aunque no observamos signos de abstinencia de opiáceos en nuestro estudio, es posible que la abstinencia más sutil que se produce con la administración de morfina o heroína en el momento estudiado sea responsable de la inducción de osFosB en D2-MSN que se observa aquí. Mostramos anteriormente que ΔFosB en D1-MSN, pero no en D2-MSN, aumenta las respuestas gratificantes a la morfina (Zachariou et al., 2006). Ahora sería interesante probar la posibilidad de que la inducción de ΔFosB en D2-MSN contribuya a los efectos adversos de la abstinencia de opiáceos. Del mismo modo, se debe investigar la posible contribución de la abstinencia y el deseo de drogas a la inducción de BFosB observada con todos los medicamentos.

Estudios previos demuestran que el enriquecimiento ambiental durante el desarrollo induce ΔFosB en NAc y dStr (Solinas et al., 2009; Lehmann y Herkenham, 2011). Nuestros datos demuestran que esta acumulación se produce igualmente en D1-MSN y D2-MSN en todas las regiones del estriado. Anteriormente, se demostró que el paradigma de enriquecimiento atenúa las respuestas gratificantes y locomotoras a la cocaína (Solinas et al., 2009); sin embargo, este fenotipo de comportamiento probablemente no sea una consecuencia de la acumulación de ΔFosB debido a que la inducción de ΔFosB en D1-MSN solo mejora las respuestas de comportamiento a la cocaína, mientras que dicha inducción en D2-MSN no tiene un efecto perceptible (Kelz et al., 1999; Colby et al., 2003; Grueter et al., 2013). Se demostró previamente que el consumo crónico de sacarosa aumenta ΔFosB en NAc, y la sobreexpresión de ΔFosB, ya sea en D1-MSN solo o en ambos subtipos, en NAc aumenta el consumo de sacarosa (Olausson et al., 2006; Wallace et al., 2008). Aquí, observamos una inducción de ΔFosB comparable en ambos subtipos de MSN en NAc y dStr después del consumo de sacarosa. Finalmente, demostramos anteriormente que la inducción de ΔFosB en NAc media ciertas respuestas adaptativas a la restricción de calorías a través de una mayor motivación para alimentos altos en grasa y un gasto energético reducido (Vialou et al., 2011). En general, estos resultados demuestran que la acumulación de ΔFosB en NAc y dStr se produce tanto en D1-MSN como en D2-MSN en respuesta a varias recompensas naturales. Este hallazgo es sorprendente dada la observación de que ΔFosB se acumula en D1-MSN solo después de otra recompensa natural, la rueda crónica en funcionamiento, y que la sobreexpresión de ΔFosB en D1-MSNs funciona con la rueda mientras que la sobreexpresión de osFosB en D2-MSNs disminuye la ruedaWerme et al., 2002). Sin embargo, la marcha de la rueda puede activar distintas rutas del motor, que son responsables de su patrón diferente de inducción de ΔFosB. En cualquier caso, los resultados con las otras recompensas naturales sugieren que controlan diferencialmente ΔFosB en el cuerpo estriado en comparación con las recompensas de drogas más potentes, como la cocaína, EtOH y Δ (9) -THC. IndLa inducción de FosB en ambos subtipos de MSN en estas condiciones naturales gratificantes es consistente con un estudio reciente que demuestra que el inicio de la acción para una recompensa de alimentos activa ambos subtipos de MSN (Cui et al., 2013).

El estrés crónico por derrota social induce a ΔFosB en cáscara de NAc de ratones susceptibles y resistentes, pero en el núcleo de NAc solo en ratones resistentes (Vialou et al., 2010). Además, la sobreexpresión de ΔFosB en D1-MSN promueve la resiliencia después del estrés crónico de la derrota social. El tratamiento crónico con fluoxetina también causa la acumulación de ΔFosB en NAc de ratones sin estrés y en ratones susceptibles después del estrés por derrota social crónica, y se demostró que la sobreexpresión de osFosB media las respuestas de comportamiento de tipo antidepresivo en estas últimas condiciones (Vialou et al., 2010). Finalmente, un estudio previo demostró la inducción de BFosB en ambos subtipos de MSN después del estrés crónico de restricción (Perrotti et al., 2004). Los resultados del presente estudio, donde mostramos la inducción de BFosB selectivamente en D1-MSN en ratones resistentes y tratados con fluoxetina, pero selectivamente en D2-MSN en ratones susceptibles, brindan información importante sobre estos hallazgos anteriores y apoyan la hipótesis de que FosB en D1- MSNs media la resistencia y la acción antidepresiva, mientras que ΔFosB en D2-MSNs puede mediar la susceptibilidad. Ahora se necesita más trabajo para probar esta hipótesis.

Trabajos recientes que utilizan optogenética demuestran el potente papel de los aferentes dopaminérgicos y glutamatérgicos a la NAc en la modulación de las respuestas de recompensa y estrés (ver Resultados). Hacemos uso de estas herramientas optogenéticas para examinar la inducción de BFosB en D1-MSN y D2-MSN después de la activación repetida de las regiones aferentes NAc. Encontramos que la estimulación fásica de las neuronas VTA, o la activación de neuronas principalmente glutamatérgicas en la amígdala, induce ΔFosB en D1-MSN en la cáscara de NAc y en ambos subtipos de MSN en el núcleo de NAc. En contraste, la activación de las neuronas mPFC resulta en el patrón opuesto de la inducción de FosB, con niveles aumentados en D1-MSN en el núcleo de NAc pero la inducción en ambos subtipos de MSN en la capa de NAc. Finalmente, la activación optogenética de las neuronas vHippo causa la acumulación de ΔFosB solo en D1-MSN en el núcleo y la carcasa de NAc. Los hallazgos de vHippo son consistentes con estudios recientes que demuestran que las entradas de hipocampo son mucho más débiles en D2-MSN en comparación con D1-MSN (MacAskill et al., 2012) y que estos insumos controlan la locomoción inducida por la cocaína (Britt et al., 2012). Además, nuestra demostración de la inducción de ΔFosB predominantemente en D1-MSN con todos los insumos es consistente con estudios previos que demuestran que ΔFosB en D1-MSN mejora las respuestas gratificantes a las drogas de abuso, así como los estudios que demuestran que la estimulación optogenética de las neuronas de dopamina VTA o mPFC, las terminales de amígdala o vHippo en NAc promueven la recompensa (Kelz et al., 1999; Zachariou et al., 2006; Tsai et al., 2009; Witten et al., 2011; Britt et al., 2012; Grueter et al., 2013).

Finalmente, es probable que haya grupos neuronales selectivos dentro de estos dos subtipos de MSN que se activan diferencialmente por estímulos positivos o negativos. Esto podría explicar nuestra observación de la inducción de ΔFosB en D2-MSN en ciertas condiciones gratificantes (opiáceos y recompensas naturales), así como las condiciones aversivas (derrota social). El estriado es muy heterogéneo más allá de los subtipos de MSN, incluidos los parches y los compartimentos de la matriz en el estriado dorsal y ventral (Gerfen, 1992; Watabe-Uchida et al., 2012). Además, estudios previos demuestran la activación de un porcentaje muy pequeño de conjuntos neuronales del estriado por psicoestimulantes, con una mayor inducción de la FosB gen en estas neuronas activadas (Guez-Barber et al., 2011; Liu et al., 2013), aunque se desconoce si estas neuronas activadas son D1-MSN o D2-MSN. La función de ΔFosB en core versus shell en la mediación de comportamientos gratificantes y aversivos es igualmente desconocida. OverLa sobreexpresión de FOSB en D1-MSN incrementó las sinapsis silenciosas tanto en el núcleo como en la shell, pero la expresión en D2-MSNs disminuyó las sinapsis silenciosas solo en la shell (Grueter et al., 2013). Además, es probable que la inducción de ΔFosB en el núcleo contra la cáscara esté mediada a través de diferentes mecanismos, ya que encontramos que la estabilización CaMKIIα mediada por la cocaína de ΔFosB en la cáscara, pero no el núcleo, conduce a una mayor acumulación de ΔFosB en la cáscaraRobison et al., 2013). Los estudios futuros que aborden selectivamente los subtipos de MSN en el núcleo frente a la cáscara, los conjuntos neuronales activados o los parches frente a los compartimentos de la matriz ayudarán a definir el papel del comportamiento de ΔFosB en estas regiones heterogéneas.

En general, estos patrones de inducción selectivos de tipo celular mediado por circuito de osFosB en NAc sugieren que los estímulos gratificantes y estresantes involucran diferencialmente distintos aferentes de NAc para codificar características específicas de estos estímulos. Nuestros resultados no solo brindan una visión completa de la inducción de ΔFosB en los subtipos de MSN estriatales por estímulos crónicos, sino que también ilustran la utilidad del uso de ΔFosB como marcador molecular para comprender los efectos duraderos de los circuitos neuronales específicos para influir en la función de NAc.

Notas a pie de página

Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

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