Numerosos estudios con el marcador de actividad neural Fos indican que la cocaína activa solo una pequeña proporción de neuronas estriatales escasamente distribuidas. Hasta ahora, los métodos eficientes no estaban disponibles para evaluar las neuroadaptaciones inducidas específicamente dentro de estas neuronas activadas. Utilizamos la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) para purificar las neuronas del estriado activadas durante la locomoción inducida por la cocaína en personas inocentes y sensibilizadas con la cocaína. cfos-lacZ ratas transgénicas. Las neuronas activadas se marcaron con un anticuerpo contra la β-galactosidasa, el producto proteico del gen lacZ. doocaine indujo un perfil de expresión génica único selectivamente en la pequeña proporción de neuronas activadas que no se observó en la mayoría de las neuronas no activadas. Estos genes incluían niveles alterados de los genes tempranos inmediatos arco, fosBy nr4a3, así como los genes implicados en la señalización p38 MAPK y la especificidad de tipo celular. Proponemos que este método de FACS se puede usar para estudiar neuroadaptaciones moleculares en neuronas específicas que codifican los efectos de comportamiento de los medicamentos de abuso y otras conductas aprendidas.

Animales

Mujer cfos-lacZ ratas transgénicas (Kasof et al., 1995; Koya et al., 2009) y ratas Sprague-Dawley hembra (Charles River, Raleigh, NC, EUA) fueron alojadas individualmente en jaulas de plástico estándar en una habitación con temperatura y humedad controladas. Se mantuvieron en un 12: 12 h luz inversa: ciclo oscuro (las luces están encendidas en 20.00 h), y permitieron el acceso libre a alimentos y agua. Se aclimataron a estas condiciones de vivienda durante un mínimo de 7 días antes de los tratamientos con medicamentos. Los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de NIDA.

Tratamientos farmacológicos

Para los experimentos agudos de cocaína, a las ratas se les inyectó cocaína (30 mg / kg, ip; n = 8) o solución salina (1 ml / kg; n = 6) y se colocaron en una cámara redonda de Plexiglass (diámetro 38 cm). Las ratas se sacrificaron 90 minutos después de las inyecciones para obtener tejido cerebral. Este tratamiento se repitió tres veces en días separados para obtener tres réplicas biológicas para el análisis de micromatrices. Además, tres réplicas biológicas independientes se produjeron de manera similar para la PCR cuantitativa (qPCR). Para análisis de qPCR de arc, pdyn, adora2a, solo se utilizaron estas tres réplicas biológicas independientes. Para análisis de qPCR de fosB, nr4a3, kcnc1 y map2k6También utilizamos el ARN restante de cada una de las muestras de micromatrices.

Para los experimentos repetidos de cocaína, las ratas hembra se sensibilizaron con cuatro inyecciones de cocaína (15 mg / kg ip) administradas una vez cada dos días. En los días de inyección, cada rata se colocó en una cámara de actividad locomotora de plexiglás 43 x 43 cm cuadrada (Med Associates, St Albans, VT, EE. UU.) Para habituar durante 30 minutos. A las ratas se les inyectó cocaína y la actividad locomotora se registró como la distancia recorrida durante 60 minutos. Luego de la cuarta inyección repetida de cocaína, las ratas permanecieron en la jaula de su hogar durante los días 7 – 8. El día de la prueba, las ratas se habituaron a 30 min en las cámaras de actividad locomotora y luego se les inyectó cocaína (30 mg / kg ip) o vehículo salino. Las ratas se decapitaron y los cerebros se extrajeron noventa minutos después de las inyecciones. El tratamiento de sensibilización completo se repitió tres veces en semanas separadas para obtener tres réplicas biológicas de cada grupo para el análisis de qPCR.

Disociación celular

El tejido estriado se disoció para obtener una suspensión unicelular. Las ratas se decapitaron y su striata se extrajo en dos minutos. Cada estriado se picó con cuchillas de afeitar en una placa de vidrio helada y se colocó en 1 ml de Hibernate A (Cat # HALF; Brain Bits, Springfield, IL). Las estrías se digirieron enzimáticamente en 1 ml de Accutase per striatum (Cat # SCR005; Chemicon, Billerica, MA) con mezcla de extremo a extremo para 30 min a 4 ° C. El tejido se centrifugó durante dos minutos a 425 × g y se resuspendió en 300 μl de Hibernate A helado. Todas las etapas de centrifugación subsiguientes se realizaron a 4 ° C.

El tejido estriado digerido se disoció mecánicamente mediante trituración. Cuatro striata se combinaron en un tubo Eppendorf y se trituraron diez veces con una pipeta Pasteur de gran diámetro (~ 1.3mm). Los tubos se colocaron brevemente en hielo para que los trozos grandes de tejido se asentaran; Se transfirieron 600 μl de suspensión turbia que contenía células disociadas a un tubo Falcon de 15 ml en hielo. Se agregaron 600μL de Hibernate A fresco al tubo Eppendorf original y luego se repitieron los pasos de trituración como anteriormente con pipetas de diámetro medio y pequeño (~ 0.8mm y ~ 0.4mm). Cada suspensión turbia que contenía células disociadas se agrupó con la suspensión anterior.

Los grupos de células restantes en la suspensión de células reunidas se eliminaron mediante filtración a través de filtros de células 100 μm y 40 μm prehumedecidos (marca Falcon, BD Biosciences, San Jose, CA). Los residuos celulares pequeños en la suspensión se redujeron al centrifugar el filtrado durante 3 min a 430 × g a través de un gradiente de densidad de Percoll de tres pasos (Nº de catálogo P1644; Sigma, St. Louis, MO). Se desechó la capa superior turbia (aproximadamente 2 ml) que contenía residuos. Las células en las capas restantes se resuspendieron en la solución de Percoll restante y se centrifugaron durante cinco minutos a 550xg. El sedimento se resuspendió en 1 ml de Hibernate A.

Inmunolibilización y FACS

Las células disociadas se fijaron y se permeabilizaron añadiendo un volumen igual de etanol para una concentración final de 50% de etanol y se mantuvieron en hielo durante 15 minutos con mezcla ocasional. Las células se centrifugaron durante dos minutos a 425xg y se resuspendieron en solución salina tamponada con fosfato libre de ARNasa (PBS). Las células se incubaron con un anticuerpo primario biotinilado contra NeuN (dilución 1: 1000, Cat # MAB377B, Chemicon) y un anticuerpo primario contra la β-galactosidasa ((β-gal; 1: dilución 10000, Cat # 4600-1409, Biogenesis, Poole , Reino Unido). Las células se rotaron de extremo a extremo en el anticuerpo primario durante 30 minutos a 4 ° C y se centrifugaron durante 3 minutos a 425xg. Las células se lavaron con 800 μl de PBS y se resuspendieron en 700 μl de PBS. Las células se incubaron con estreptavidina marcada con fluorescencia (estreptavidina-ficoeritrina, 1: dilución 1000, n. ° de gato SA1004-1, Invitrogen, Carlsbad, CA) y anticuerpo secundario (anti-cabra IgG etiquetada con Alexa Fluor 488, 1) 1000, Invitrogen) y extremo a extremo girado para 11055 min. Las células se lavaron con 15 μl de PBS, se centrifugaron durante tres minutos a 800 xg y se resuspendieron en 425 ml de PBS.

Las células inmunomarcadas se escanearon y clasificaron en el centro de citometría de flujo de Bayview Campus de Johns Hopkins. Se usó un Aria FACS (BD, Franklin Lakes, NJ) para la clasificación celular. Las muestras de control se analizaron primero para determinar los criterios óptimos para clasificar las muestras de prueba. Específicamente, se utilizaron células fijas sin tratamiento con anticuerpos para establecer la puerta de dispersión de la luz. Las células fijas tratadas con anticuerpo secundario fluorescente, pero sin anticuerpo primario, se usaron para establecer umbrales para la fluorescencia del tejido endógeno y la unión no específica por estreptavidina o anticuerpo secundario. A continuación, se utilizaron muestras de control marcadas individualmente con anticuerpo primario y secundario para cada proteína (NeuN o β-gal) para compensar la superposición de fluorescencia en los canales vecinos. Finalmente, se analizaron y clasificaron las muestras de prueba marcadas con ambos marcadores fluorescentes. Las células clasificadas se recolectaron en tubos de baja unión (Cat # 022431081, Eppendorf, Westbury, NY) con 100 μl de PBS en cada tubo.

Extracción de ARN

Después de la clasificación, se centrifugaron las muestras que contenían células βgal-positivas o βgal-negativas de ratas inyectadas con cocaína o todas las células positivas a NeuN de ratas inyectadas con solución salina durante 8 min a 2650 × g a 18 ° C. Las células negativas para NeuN de ratas inyectadas con solución salina se centrifugaron durante 8 min a 6000 ×g a 18 ° C. Para los experimentos de micromatrices, el ARN se extrajo con reactivo Trizol (Cat # 15596-026, Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La calidad y la cantidad de ARN se evaluaron utilizando el Bioanalizador Picochip (Cat # 5067-1513, Agilent Technologies, Palo Alto, CA). Para los experimentos de qPCR, el ARN se extrajo con el kit RNEasy Micro (Cat # 74004; Qiagen, Valencia, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante con el tratamiento con DNasa. La cantidad y la pureza del ARN se evaluaron utilizando un espectrofotómetro Nanodrop (Thermo Scientific, Wilmington, DE).

Experimentos de microarrays

Se usaron microarrays para analizar el ARN de las células NeuN-positivas y NeuN-negativas de las ratas inyectadas con solución salina, y las neuronas βgal-positivas y βgal-negativas de las ratas inyectadas con cocaína. Como se describió anteriormente en la sección de tratamiento con medicamentos, los microarrays contenían tres réplicas biológicas para cada uno de los cuatro tipos de muestras. Cinco μl de ARN total de cada muestra se marcaron con el kit de amplificación de ARN Illumina TotalPrep (Cat # IL1791; Ambion, Austin, TX) en un proceso de dos pasos de síntesis de ADNc seguido de in vitro Transcripción de RNA con biotina-16-UTP. 0.75 μg de cRNA marcado con biotina se hibridó durante 16 horas a Illumina Sentrix Rata Ref12_v1 BeadChips (Cat # BD-27-303; Illumina, San Diego, CA). El ARNc biotinilado hibridado con el chip se detectó con estreptavidina marcada con Cy3 y se cuantificó utilizando el escáner BeadStation 500GX Genetic Analysis Systems de Illumina. Todo el etiquetado y el análisis se realizaron en el Centro de Genómica Familiar Lowe del Campus Médico de Bayview de Johns Hopkins.

PCR cuantitativa en tiempo real

Se utilizó la PCR cuantitativa en tiempo real para validar los resultados de FACS y microarrays. El ARN se transcribió de forma inversa en ADNc utilizando el kit RETROscript (Cat # AM1710, Ambion) con un cebador de oligo (dT). Cada reacción de PCR de 25 μl incluyó 12.5 μl de la mezcla maestra de expresión génica de Taqman (Cat #4369514; Applied Biosystems, Foster City, CA), 1.1 μl de 20 μM de los cebadores directos e inversos, 0.25 μl de 100 μM FAM con sonda XAMX µl de agua y 5 µl de 5 ng / µl de ADNc. Combinaciones de cebador y sonda [Tabla 1] se diseñaron utilizando el Centro de Diseño de Ensayos de la Biblioteca de Sonda Universal de Roche para que se extienda por intrones. Las reacciones de PCR se monitorizaron utilizando el Opticon Light Cycler (Biorad, Hercules, MD). El programa comenzó con lecturas de la placa 20 a 50 ° C para el fotodecoloro, seguido de 5 min a 95 ° C, y luego ciclos de 40 de 20 sec a 94 ° C, 1 min a 60 ° C y lectura de la placa.

 

Tabla 1

Cebadores y sondas utilizados para qPCR

Primero se ejecutaron reacciones de curva estándar para cada gen para determinar la eficiencia de amplificación [Tabla 1]. Los niveles de expresión para cada gen amplificado se calcularon utilizando la eficiencia ^ C_q donde ΔC_q = C_q(gen experimental) - C_q(gen de referencia) para cada réplica biológica. Gorasp2 fue elegido como gen de referencia porque no se expresaba de manera diferente entre las neuronas y la glía en los análisis de micromatrices. Se validó aún más como un gen de referencia debido a una amplificación de qPCR igual en todas las muestras al cargar la misma cantidad de plantilla. Ensayo técnico triplicado C_q los valores se promediaron antes de calcular ΔC_q para cada gen en una muestra. Para cada mRNA medido en qPCR, los valores de expresión génica se promediaron a través de réplicas biológicas. Luego, para reflejar los valores de cambio en el plegado, dividimos este promedio por los valores promedio de expresión génica de células positivas para NeuN de ratas inyectadas con solución salina. Estos valores se indican como medias y errores estándar en los gráficos y tablas.

Inmunohistoquímica

El tejido cerebral se obtuvo de ratas Spraque-Dawley hembras de tipo salvaje después de los mismos tratamientos agudos y repetidos con cocaína descritos anteriormente para los experimentos de micromatrices y qPCR. Sin embargo, 90 minutos después de las inyecciones del día de prueba, las ratas se anestesiaron profundamente con isoflurano y se perfundieron con 100 ml de PBS seguido de 400 ml de 4% de paraformaldehído (PFA). Los cerebros se posfiguraron en PFA durante 2 horas y se transfirieron a 30% de solución de sacarosa a 4 ° C durante 2 – 3 días. Los cerebros se congelaron en hielo seco en polvo y se mantuvieron a -80 ° C hasta el corte. Las secciones coronales se cortaron 40 μm de espesor entre Bregma 2.5 y −0.5 (Paxinos y Watson, 1998).

Las secciones fueron inmunolacladas para Fos y Arc. En resumen, las secciones se lavaron tres veces en solución salina tamponada con Tris (TBS) y se permeabilizaron durante 30 min en TBS con 0.2% Triton X-100. Las secciones se lavaron de nuevo en TBS y se incubaron en anticuerpos primarios diluidos en PBS con 0.3% Triton X-100 durante 24 horas en un agitador a 4 ° C. Utilizamos un policlonal de conejo contra el anticuerpo c-Fos (dilución 1: 500, Cat # sc-52, Biotecnología Santa Cruz, Santa Cruz, CA) y un anticuerpo de arco monoclonal de ratón (1: dilución 100, Cat # sc-17839, Santa Biotecnología de la Cruz). Las secciones se lavaron tres veces en TBS y se incubaron en anticuerpos secundarios diluidos en PBS durante 1.5 horas en un agitador a temperatura ambiente. Utilizamos anticuerpos anti-conejo de burro marcados con Alexa Fluor 488 (Dilución 1: 200, N.º de cat. A21206, Invitrogen) y el anticuerpo anti-ratón de cabra marcado con Alexa Fluor 568 (Dilución 1: 200, Nº de cat. A11004, Invitrogen). Las secciones se lavaron en TBS, se montaron en portaobjetos recubiertos con cromo-alumbre y se cubrieron con medios de montaje rígidos VectaShield.

Las imágenes fluorescentes de la inmunorreactividad de Fos y Arc en el caudado-putamen y NAc (aproximadamente 2.0 mm anterior a Bregma) se capturaron usando una cámara CCD (Coolsnap Photometrics, Roper Scientific Inc., Trenton, NJ) conectada a un microscopio Zeiss Axioskop 2. Se tomaron imágenes para contar células marcadas con un aumento de 200x; Las imágenes para determinar la colocalización de Fos y Arc se tomaron con un aumento de 400x. Las células marcadas de cuatro hemisferios por rata se contaron automáticamente utilizando el software IPLab para Macintosh, versión 3.9.4 r5 (Scanalytics, Inc., Fairfax, VA). Los promedios de los cuatro hemisferios se promediaron para obtener un valor único para cada rata.

El análisis de datos

Los datos de sensibilización locomotora se analizaron utilizando ANOVA de una vía con medidas repetidas para el efecto principal del tiempo durante 4 días de inyección. La significación estadística se estableció en p <0.05. Los datos de microarrays se analizaron utilizando DIANE 6.0, un programa de análisis de microarrays basado en hojas de cálculo basado en SAS JMP 7.0, como se describió anteriormente (Garg et al., 2009). Los datos de intensidad de fluorescencia de micromatrices se filtraron por detección p-valores y Z normalización. La calidad de la muestra se analizó mediante diagramas de dispersión, análisis de componentes principales y muestra de genes. Z- agrupamiento jerárquico basado en puntajes para excluir posibles valores atípicos. Luego, se utilizaron pruebas ANOVA para eliminar genes con variaciones más grandes dentro de cada grupo de comparación. Los genes se identificaron como expresados ​​diferencialmente si p <0.01, valor absoluto Z-relación ≥ 1.5 y relación de falsos descubrimientos (fdr) <0.07. Para los datos de qPCR, se utilizó ANOVA unidireccional para comparar los datos de cada gen. La significación estadística se estableció en p <0.05. Para la inmunohistoquímica de Fos y Arc, se utilizó una prueba t asumiendo una varianza desigual para calcular la significación estadística, establecida en p <0.05.

ratas transgénicas cfos-lacZ

El cfos-lacZ transgén en estas ratas está regulada por una c-fos Promotor similar al de los endógenos. c-fos gen y por lo tanto se activa de forma similar en las neuronas por altos niveles de entrada sináptica excitatoria (Shin et al., 1990; Labiner et al., 1993; Sgambato et al., 1997). El producto proteico de la cfos-lacZ transgén, β-galactosidasa (βgal), se coexpresa con c-Fos en neuronas fuertemente activadas (Koya et al., 2009) y se utiliza para etiquetar las neuronas estriatales activadas en el siguiente procedimiento de purificación FACS.

Purificación por FACS de las neuronas estriatales activadas después de inyecciones agudas de cocaína.

Se obtuvieron estrías enteras de cfos-lacZ ratas 90 minutos después de inyecciones agudas de 30 mg / kg de cocaína o solución salina fuera de su jaula. Las células del estriado disociadas de ratas tratadas de forma similar se agruparon antes de la purificación con FACS para cada una de las réplicas biológicas en los análisis subsiguientes de microarrays y PCR cuantitativa (qPCR). Las células del cuerpo estriado disociadas se analizaron inicialmente de acuerdo con sus características de dispersión de la luz delantera y lateral [Figura 1a]. La mayoría de las neuronas marcadas con NeuN se encontraron dentro de una tira de eventos a lo largo de la parte inferior de la trama. Por lo tanto, todos los análisis subsiguientes se remitieron para incluir solo los eventos encontrados dentro de esta tira.

 

Figura 1 y XNUMX

Clasificación de células activadas por fluorescencia de las neuronas marcadas con βgal de ratas tratadas con una sola inyección de cocaína

Las células dentro de esta puerta se separaron según su grado de inmunomarcaje con el marcador neuronal NeuN y el marcador de activación neural βgal. En el tejido obtenido de ratas inyectadas con cocaína, aproximadamente el 15% de las neuronas marcadas con NeuN tenían niveles altos de βgal [Figura 1b], que correspondió a aproximadamente 100,000 βgal-neuronas marcadas por rata. Todas las células marcadas con βgal coexpresaron NeuN, lo que indica que solo las neuronas expresaron βgal. En contraste, muy pocas neuronas marcadas con NeuN obtenidas de ratas inyectadas con solución salina expresaron los marcadores de activación βgal o Fos, que apoyan la inmunorreactividad de βgal y Fos como marcadores de activación neural en ratas inyectadas con cocaína. Los bajos números de neuronas que expresan βgal de ratas inyectadas con solución salina no proporcionaron suficientes células para los análisis moleculares posteriores. Por lo tanto, solo utilizamos el marcaje con NeuN para separar las células neuronales de las no neuronales en todos los experimentos posteriores con tejido estriado obtenido de ratas inyectadas con solución salina. En general, aproximadamente el 30% de todos los cuerpos celulares del cuerpo estriado fueron positivos para NeuN, que correspondieron a aproximadamente las neuronas del cuerpo estriado 600,000 por rata. Cuando las células purificadas con FACS se examinaron con microscopía de fluorescencia, todas las células eran redondas y carecían de procesos [Figura 2 y XNUMX]. La observación microscópica confirmó que las células clasificadas por FACS se marcaron apropiadamente para la inmunorreactividad de NeuN- y βgal. Se encontró que las muestras de células purificadas con FACS tenían una pureza> 90% cuando se evaluaron con una segunda ronda de citometría de flujo (datos no mostrados).

 

Figura 2 y XNUMX

Fotos de microscopio de células y escombros purificados por FACS

Determinamos la selectividad de nuestro procedimiento de purificación de FACS con micromatrices para analizar los patrones de expresión génica de las células purificadas con FACS. Comparamos la expresión génica en las neuronas βgal-positivas y βgal-negativas de ratas inyectadas con cocaína, así como las células NeuN-positivas y NeuN-negativas de las ratas inyectadas con solución salina. El componente principal y el análisis de grupo indicaron que el factor diferenciador primario era si las células eran neuronas o glía [Figura 3a]. El segundo factor de diferenciación fue la expresión de βgal utilizada para separar las neuronas activadas de las no activadas. Los genes se identificaron como expresados ​​diferencialmente si p <0.01, valor absoluto Z-relación ≥ 1.5 y relación de falsos descubrimientos (fdr) <0.07. Encontramos que 125 genes aumentaron y 467 genes disminuyeron en las neuronas βgal positivas en relación con las neuronas βgal negativas obtenidas del mismo tejido estriado de ratas inyectadas con cocaína [Figura 3b]. Cuando se compararon las mismas neuronas positivas para βgal de ratas inyectadas con cocaína con muestras de control de todas las neuronas marcadas con NeuN de ratas inyectadas con solución salina, se incrementaron 133 genes y disminuyeron 890 genes en las neuronas positivas para βgal. En particular, los dos grupos de control (neuronas βgal negativas de ratas inyectadas con cocaína y todas las neuronas marcadas con NeuN de ratas inyectadas con solución salina) produjeron patrones de expresión génica muy similares; la expresión génica no fue significativamente diferente entre estos grupos de control [Figura 3b].

 

Figura 3 y XNUMX

Análisis de microarrays de células clasificadas a partir de striata de rata después de una única inyección de cocaína o solución salina

Los genes específicos encontrados en los diferentes grupos de muestra confirmaron la separación de neuronas activadas de no activadas, así como neuronales de no neuronales utilizando FACS [Tabla 2]. Las neuronas βgal positivas de ratas inyectadas con cocaína expresaron niveles más altos de muchos genes marcadores de activación neural en relación con las neuronas βgal negativas de las mismas ratas inyectadas de cocaína o todas las neuronas marcadas con NeuN de ratas inyectadas con solución salina [Figura 3c]. Estos genes marcadores de actividad incluyen c-fos, junio, arco, EGR familia (1, 2, 4), y nr4a3 (Guzowski et al., 2005). Curiosamente, estas neuronas βgal positivas también expresaron niveles significativamente más altos del gen de la prodinorfina marcador específico del tipo de célula del receptor de dopamina D1 y niveles significativamente más bajos del gen del receptor de dopamina D2.

 

Tabla 2

Resumen de los datos de microarrays y qPCR del experimento de cocaína aguda.

Los datos de expresión génica de micromatrices se validaron utilizando qPCR. Los marcadores marcadores de actividad. FOC, arcoy nr4a3 se expresaron a niveles más altos en neuronas βgal positivas de ratas inyectadas con cocaína en relación con ambas neuronas βgal negativas de las mismas ratas inyectadas con cocaína y a todas las neuronas de ratas inyectadas con solución salina [Figura 4a; datos e información estadística en Tabla 2]. Las neuronas βgal positivas también expresaron niveles más altos del gen de la prodinorfina [Figura 4b]. Mientras que las neuronas βgal positivas tenían niveles de expresión aparentemente más bajos para varios genes, incluido el receptor de adenosina A2A, el canal de potasio Kv3.1 y map2k6 / MEKK6, solo los valores de Kv3.1 y map2X6 / MEKK6 eran de tipo exagerado, pero no estaban exagerados.Figura 4c]. En general, las alteraciones en la expresión génica evaluadas con qPCR fueron casi idénticas a las alteraciones en la expresión génica evaluadas por experimentos de micromatrices.

 

Figura 4 y XNUMX

La PCR cuantitativa demuestra un perfil de expresión génica diferente para las neuronas βgal positivas después de las inyecciones agudas de cocaína, en comparación con las neuronas βgal negativas de las mismas ratas, o con todas las neuronas de ratas inyectadas con solución salina

Para determinar si las alteraciones del ARNm en las neuronas activadas se reflejaron a nivel de proteína, se utilizó el análisis inmunohistoquímico de las secciones del cerebro coronal de ratas de tipo salvaje inyectadas con cocaína y solución salina [Figura 5 y XNUMX]. Estas secciones no se sometieron a disociación o FACS y, por lo tanto, el análisis inmunohistoquímico no se vio afectado por la disociación celular encontrada en el procedimiento de FACS. En el estriado ventral de ratas inyectadas con cocaína [Figura 5a], los marcadores de actividad neural Fos y Arc se expresaron conjuntamente en las mismas células: 85 ± 4% de todas las células Fos positivas fueron Arc-positivas, mientras que 82 ± 3% de todas las células Arc positivas fueron Fos-positivas. Las inyecciones de cocaína produjeron un aumento de 2.7 veces en las neuronas marcadas con Fos y un aumento de 2.7 veces en las neuronas marcadas con Arco. En el cuerpo estriado dorsal de ratas inyectadas con cocaína [Figura 5b], 80 ± 2% de todas las células positivas para Fos fueron Arc-positivas, mientras que 86 ± 3% de todas las células positivas para Arc fueron Fos-positivas. Las inyecciones de cocaína produjeron un aumento de 4.4 veces en las neuronas marcadas con Fos y un aumento de 3.8 veces en las neuronas marcadas con Arco.

 

Figura 5 y XNUMX

Fos y Arc se coexpresan en (a) cuerpo estriado ventral y (b) cuerpo estriado dorsal después de una sola inyección de cocaína

Purificación por FACS de neuronas del cuerpo estriado activadas de ratas sensibilizadas con cocaína

En el segundo experimento FACS, todas las ratas fueron sensibilizadas con inyecciones repetidas de cocaína. La administración repetida de cocaína en la caja locomotora incrementó la locomoción inducida por la cocaína: la locomoción en el día 7 fue 180 ± 18% del día de locomoción 1 (efecto principal del tiempo sobre las inyecciones repetidas de 4, F_{3, 363} = 24.9, p <0.001), lo que indica una sensibilización psicomotora significativa. Siete días después, el día de la prueba, se administró cocaína o solución salina a las ratas en la misma caja locomotora. Noventa minutos más tarde, se extrajo tejido estriado que incluía NAc y las células se purificaron con FACS usando el procedimiento descrito anteriormente.

Las células dentro de la misma franja de eventos dispersados ​​por la luz que en el experimento anterior se separaron según su grado de inmunomarcaje con el marcador neuronal NeuN y el marcador de activación neural βgal. En el tejido obtenido de ratas inyectadas con cocaína, aproximadamente el 10% de las neuronas marcadas con NeuN tenían niveles altos de βgal [Figura 6 y XNUMX], que correspondió a aproximadamente 60,000 βgal-neuronas marcadas por rata. Todas las células marcadas con βgal coexpresaron NeuN, lo que indica que solo las neuronas expresaron βgal. Nuevamente, el tejido obtenido de ratas inyectadas con solución salina el día de la prueba produjo muy pocas neuronas que expresan βgal o Fos, y por lo tanto no suficientes células para los análisis moleculares posteriores. Por lo tanto, utilizamos solo el marcaje con NeuN para separar las células neuronales de las no neuronales obtenidas de ratas inyectadas con solución salina. Aproximadamente el 30% de todos los cuerpos celulares en ratas inyectadas con solución salina fueron NeuN positivos, lo que en este experimento correspondió a aproximadamente 400,000 neuronas del estriado por rata.

 

Figura 6 y XNUMX

Clasificación de células activadas por fluorescencia de neuronas marcadas con βgal de ratas sensibilizadas sometidas a la prueba con 7 de cocaína días después del tratamiento repetido con cocaína

Usamos qPCR para comparar la expresión génica en neuronas βgal positivas y βgal negativas de ratas inyectadas con cocaína, así como todas las neuronas NeuN positivas de ratas inyectadas con solución salina después de la sensibilización a la cocaína. Las neuronas βgal positivas de ratas inyectadas con cocaína expresaron niveles más altos de tres genes marcadores de actividad neural. FOC, arcoy nr4a3–Relativo a las neuronas βgal-negativas de las mismas ratas inyectadas con cocaína y a todas las neuronas de las ratas inyectadas con solución salina [Figura 7a; datos e información estadística en Tabla 3]. Las neuronas βgal positivas también expresaron un nivel más alto del gen de la prodinorfina similar al del experimento de inyección de cocaína individual [Figura 7b]. En contraste, las neuronas βgal positivas tenían niveles de expresión más bajos para varios genes [Figura 7c], incluyendo Drd2 codificando el receptor de dopamina D2, y Map2k6 codificando la quinasa que activa p38 MAPK, similar al experimento de inyección aguda de cocaína. Finalmente, las neuronas βgal positivas tuvieron una mayor expresión de dusp1, también conocido como mkp1 [Figura 7c], que codifica la fosfatasa que desactiva p38 MAPK (Sgambato et al., 1998).

 

Figura 7 y XNUMX

La PCR cuantitativa demuestra un perfil de expresión génica diferente en las neuronas βgal positivas de ratas sensibilizadas con cocaína, en comparación con las neuronas βgal negativas de las mismas ratas, o todas las neuronas de ratas desafiadas con solución salina

 

Tabla 3

Resumen de los datos de qPCR del experimento de cocaína repetido.

Para determinar si las alteraciones del ARNm en las neuronas activadas se reflejan al nivel de la proteína, se utilizó el análisis inmunohistoquímico de las secciones del cerebro coronal de ratas hembra sensibilizadas con cocaína de tipo salvaje después de las inyecciones de cocaína o solución salina en el día de la prueba. En el cuerpo estriado ventral de ratas inyectadas con cocaína, los marcadores de actividad neural Fos y Arc se expresaron conjuntamente en las mismas células: 90 ± 2% de todas las células positivas para Fos fueron Arc-positivas y 83 ± 2% de todas las Arc-positivas las células fueron positivas para Fos. Las inyecciones de prueba de cocaína produjeron un aumento de 2.3 veces en las neuronas marcadas con Fos y un aumento de 2.2 veces en las neuronas marcadas con Arco. En el cuerpo estriado dorsal de ratas inyectadas con cocaína, 93 ± 2% de todas las células Fos positivas fueron Arc-positivas, y 90 ± 3% de todas las células Arc positivas fueron Fos-positivas. Las inyecciones de prueba de cocaína produjeron un aumento de 4.4 veces en las neuronas marcadas con Fos y un aumento de 4.5 veces en las neuronas marcadas con Arco. Por lo tanto, muy pocas células no marcadas con Fos expresaron Arc y muy pocas células no marcadas con Arco expresaron Fos que apoya nuestros hallazgos de células clasificadas.

Esta investigación fue apoyada por el Programa de Investigación Intramural del Instituto Nacional sobre el Abuso de Drogas. D. Guez-Barber recibió el apoyo del NIH MSTP TG 5T32GM07205, número de premio F30DA024931 del Instituto Nacional de Abuso de Drogas y la Cátedra Charles BG Murphy en Psiquiatría de la Universidad de Yale. Agradecemos a Joe Chrest por su excelente asistencia técnica con FACS, ya Chris Cheadle, Tonya Watkins y Alan Berger por su trabajo en la micromatriz. Agradecemos a Yavin Shaham por sus útiles comentarios sobre el manuscrito.

No hay conflictos de interés para los autores de este manuscrito.

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