Proc Natl Acad Sci US A. 2005 febrero 1; 102(5): 1737-1742.
Resumen
La cocaína, una droga de abuso, aumenta los niveles sinápticos de dopamina en el estriado al bloquear la recaptación de dopamina en los terminales de los axones. La cinasa dependiente de la ciclina 5 (Cdk5) y su activador p35, proteínas involucradas en la fosforilación de sustratos en las neuronas postmitóticas, se encuentran reguladas por incremento luego de la exposición crónica a la cocaína. Para examinar más a fondo los efectos de la inducción de Cdk5 y p35 en la señalización de dopamina del estriado, generamos dos líneas de ratones transgénicos independientes en las que Cdk5 o p35 se sobreexpresaron específicamente en las neuronas. Informamos aquí que el aumento de la actividad de Cdk5, como resultado de p35 pero no de la sobreexpresión de Cdk5, conduce a la atenuación de la señalización de dopamina mediada por cocaína. El aumento de la fosforilación mediada por Cdk5 de la dopamina y la fosfoproteína regulada por cAMP, la masa molecular 32 kDa (DARPP-32) en Thr-75, se acompañó de una disminución de la fosforilación de DARPP-32 en Thr-34. El aumento de la fosforilación mediada por Cdk5 de la quinasa quinasa 1 regulada por señales extracelulares en Thr-286 estuvo acompañado por una menor activación de la quinasa 1 / 2 regulada por señales extracelulares. Estos efectos contribuyeron a la atenuación de la fosforilación de la proteína de unión al elemento de respuesta al AMPc inducida por la cocaína, así como a una menor inducción de c-fos en el cuerpo estriado. Estos resultados apoyan la idea de que la actividad Cdk5 está involucrada en la expresión génica alterada después de la exposición crónica a la cocaína y, por lo tanto, afecta los cambios duraderos en la función neuronal subyacente a la adicción a la cocaína.
La cocaína aumenta los niveles de dopamina sináptica en el estriado y altera la expresión de los genes en las neuronas dopaminoceptivas al activar vías intracelulares que propagan la señal inicial del receptor D1 de dopamina al núcleo (1). La exposición crónica a la cocaína regula de manera positiva varios factores de transcripción, lo que da como resultado los cambios duraderos en la expresión génica que se cree que subyacen a las adaptaciones neuronales en la adicción a la cocaína (2). ΔFosB, identificado como tal factor de transcripción (3), se ha demostrado que mejora la capacidad de respuesta de los animales a la cocaína (4, 5). Por lo tanto, se espera que la identificación de los genes objetivo que están regulados por la inducción de ΔFosB contribuya a una mayor comprensión del mecanismo molecular subyacente a la adicción a la cocaína. Recientemente, se ha demostrado que el tratamiento crónico de animales con cocaína regula al alza la expresión de la quinasa 5 dependiente de ciclina (Cdk5) y su activador p35 en el estriado a través de la inducción de ΔFosB (6, 7).
Cdk5 es un miembro de la familia Cdk de serina / treonina quinasas. A diferencia de otros Cdks que son reguladores importantes de la progresión del ciclo celular, Cdk5 participa principalmente en la fosforilación de sustratos en neuronas postmitóticas (8). La especificidad neuronal de la actividad de Cdk5 se logra a través de la asociación con sus activadores, p35 o p39, que se expresan predominantemente en las neuronas postmitóticas (8). Además del papel esencial de Cdk5 en el desarrollo del cerebro (9, 10), yoTambién se ha implicado en la transmisión dopaminérgica en el cerebro postnatal (11, 12). La inhibición de la actividad de Cdk5 produce un aumento de la liberación de dopamina en el cuerpo estriado, lo que indica una función presináptica de Cdk5 como regulador negativo de la liberación de dopamina (11). Además, Cdk5 modula la eficacia de la señalización postsináptica de dopamina mediante la fosforilación de la fosfoproteína regulada por dopamina y AMPc, la masa molecular 32 kDa (DARPP-32) en Thr-75, que convierte a DARPP-32 en un inhibidor de cAMP-dependiente (12).
Estas observaciones sugieren que Cdk5 y p35 son reguladores descendentes de la activación prolongada de la señalización de dopamina después de la exposición crónica a la cocaína y por lo tanto en la adicción a la cocaína. Para abordar más a fondo el papel de Cdk5 en la señalización de dopamina estriatal, generamos dos líneas de ratones transgénicos en las cuales Cdk5 o p35 se sobreexpresaron específicamente en las neuronas bajo el control del promotor p35. Nuestros hallazgos indicaron que la actividad de Cdk5 estaba regulada al alza con niveles aumentados de proteína p35 pero no de proteína Cdk5, lo que sugiere que el nivel de proteína p35 es limitante de la velocidad para la actividad de Cdk5. Proveemos aquí in vivo la evidencia de que el aumento de la actividad de Cdk5, como resultado de la sobreexpresión de p35, conduce a la atenuación de la dopamina mediada por cocaína hacia el núcleo a través de una inhibición de la PKA y las cascadas de quinasas reguladas por señales extracelulares (ERK).
Materiales y Métodos
Anticuerpos Los anticuerpos policlonales contra Cdk5 (C-8) y p35 (C-19) se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology. Los anticuerpos dependientes de la fosforilación e independientes de la quinasa ERK (MEK) 1 / 2, ERK1 / 2 y la proteína de unión al elemento de respuesta a cAMP (CREB) se obtuvieron de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Los anticuerpos contra el fosfo-Thr-34 DARPP 32 (13), phospho-Thr-75 DARPP-32 (12), total DARPP-32 (12), y c-fos (14) se utilizaron como se describe. Se adquirió un anticuerpo para actina de Sigma.
Animales experimentales. Anteriormente clonamos el gen p35 del ratón. Cdk5r1, que codifica la proteína p35, y caracteriza su estructura genómica (15). Para generar el ratón transgénico con sobreexpresión neuronal de p35 (Tgp35), el 6-kb EcoRHODE ISLAND-EcoEl fragmento RI que contiene la región del promotor 1.2-kb se subclonó en un plásmido pGEM9Z (-), y se insertó una etiqueta 45-bp derivada de SV40 en el KpnMe ubico aguas abajo de la poli (A+) señal ( A). La etiqueta contenía un SpeSitio para el genotipado de los animales. El fragmento 6-kb se escindió del plásmido y se purificó, seguido de una inyección pronuclear del transgén para generar los ratones transgénicos. Para examinar el perfil de expresión del transgén bajo el control regulador del promotor p1.2 de 35-kb in vivo, se generó además un ratón transgénico doble (Tgp35; p35 - / -) mediante el uso de una estrategia de reproducción de dos pasos mediante la cual el ratón Tgp35 se regeneró en un fondo nulo p35 endógeno. Los otros modelos de ratón utilizados en este estudio incluyeron p35 +/–, p35 - / -, Cdk5 +/– y un ratón transgénico con sobreexpresión neuronal de Cdk5 (TgCdk5) (9, 16, 17). Los genotipos de estos ratones se determinaron mediante el análisis de transferencia Southern o la PCR en ADN genómico aislado de las biopsias de la cola. Los ratones se alojaron en un ciclo de luz 12-h light / 12-h. Todos los cuidados se prestaron de conformidad con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud sobre el cuidado y el uso de animales de laboratorio y experimentales.
Análisis de transferencia de Southern. El ADN genómico extraído de las biopsias de la cola se digirió con EcoRI y SpeYo, sometido a electroforesis en un gel de agarosa 0.9% y transferido a una membrana de nailon. La membrana se hibridó con un cebado aleatorio. 32Sonda marcada con P a 42 ° C durante la noche. La sonda 485-bp para el genotipado de ratones knockout p35 (p35 - / -) y Tgp35 se generó mediante PCR utilizando los siguientes cebadores: 5′-ACATCCTGCTGCCACGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG La membrana hibridada se lavó dos veces en 3 x SSC / 5% SDS a 3 ° C durante 2 min, y dos veces en 0.1 x SSC / 42% SDS a 10 ° C durante 0.1 min y se expuso a película de rayos X.
Tratamiento farmacológico. La cocaína (Sigma) se disolvió en solución salina estéril. Los animales se inyectaron ip con cocaína (15 mg / kg) o un volumen igual de solución salina a la edad de 3 meses y se sacrificaron por decapitación en diferentes puntos de tiempo (15, 30, 60 y 120 min) después de la inyección. Los cerebros se retiraron rápidamente y se enfriaron en PBS enfriado con hielo. Las estrías se diseccionaron y se sometieron a un análisis de transferencia Northern u Western. Para el análisis inmunohistoquímico, se obtuvieron secciones del cuerpo estriado de ratones 2 h después de la inyección.
Análisis de transferencia Northern. El ARN total se extrajo del estriado con el reactivo TRIzol (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) y se sometió a un análisis de transferencia Northern como se describe (18). Para la detección del ARNm de c-fos, se usó un fragmento 189-bp del ADNc de c-fos de ratón como una sonda como se describe (19). Los niveles de ARNm de c-fos se cuantificaron midiendo la densidad óptica de la banda específica mediante el uso de un sistema de análisis de imágenes con el software de imágenes nih, versión 1.62.
Análisis de Western Blot. Los tejidos del cuerpo estriado se sonicaron en 1% SDS y se hervieron durante 10 min. La concentración de proteína en cada muestra se determinó mediante el ensayo de proteína BCA (Pierce). Se separaron cantidades iguales de proteínas mediante SDS / PAGE antes de transferirlas a una membrana de nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon en 1 × PBS que contenía 5% de leche desnatada y 0.05% Tween 20 y se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4 ° C. La incubación con IgG anti-ratón o conejo conjugado con peroxidasa (Sigma) se realizó a temperatura ambiente durante 60 min. Se detectó una señal por quimioluminiscencia mejorada (Pierce), y las densidades ópticas de las bandas se cuantificaron como se describió anteriormente.
Cdk5 Ensayo de quinasa. Los lisados estriatales se prepararon con un tampón de lisis que consiste en 50 mM Tris · HCl, pH 7.4 / 50 mM NaCl / 5 mM EDTA / 1% Triton X-100 / X / ex. ml de inhibidores de leupeptina / fosfatasa (inhibidores de la fosfatasa mezcla I y II, Sigma). Los lisados se inmunoprecipitaron con anticuerpos anti-Cdk1 (C-1) o anti-p1 (C-1). Los inmunoprecipitados de Cdk5 se prepararon mediante la incubación de 8 μl del lisado (correspondiente a 35 μg de proteína) con anticuerpo anti-Cdk19 (5 μg) durante la noche a 300 ° C, seguido de una posterior incubación con 300 μl de proteínas de la proteína A-agarosa (XUM). % de suspensión en el tampón de lisis; Biotecnología Santa Cruz) para 5 h a 3 ° C. Para la preparación de inmunoprecipitados de p4, se incubaron 25 μl del lisado (correspondiente a 50 mg de proteína) con anticuerpo anti-p3 (4 μg) como se describió anteriormente. Los inmunoprecipitados se lavaron dos veces con el tampón de lisis y dos veces con un tampón de quinasa que consiste en Tris · HCl 35 mM, pH 500 / MgCl mNUMX XMUM2/ 1 mM EDTA / 1 mM EGTA / 1 mM DTT, resuspendido en 60 μl del tampón de quinasa. La actividad de la quinasa se midió utilizando la histona H1 como sustrato (18).
Inmunohistoquímica. Los ratones se anestesiaron mediante inyecciones ip de avertin (250 mg / kg, Fluka) y se perfundieron transcardialmente con tampón de fosfato de sodio 0.1 M, pH 7.4, seguido de fijador de tejidos Streck (Streck Laboratories, La Vista, NE), un fijador que no se reticula. Los cerebros disecados se fijaron adicionalmente en el mismo fijador durante la noche a 37 ° C. Luego, los cerebros se incrustaron en parafina, se cortaron en secciones coronales de 5-μm de espesor y se sometieron a inmunohistoquímica utilizando la técnica del complejo avidina-biotina-peroxidasa (Vector Laboratories) con diaminobenzidina como sustrato. Las secciones se incubaron con un anticuerpo policlonal purificado por afinidad contra c-fos durante la noche a 4 ° C. La especificidad de la tinción se evaluó por omisión del anticuerpo primario.
Resultados
Generación de ratones transgénicos con sobreexpresión neuronal de p35. El transgén utilizado para lograr una mayor expresión neuronal de p35 comprendía el fragmento 6-kb del gen p35 de ratón clonado que contiene el promotor 1.2-kb y la secuencia de codificación completa de p35 ( A). Los genotipos de los ratones se determinaron mediante análisis de transferencia Southern utilizando una sonda que fue diseñada para distinguir los ratones p35 - / - y Tgp35 de ratones de tipo salvaje ( A y B). Para examinar la expresión transgénica bajo el control del promotor p1.2 de 35-kb, generamos ratones transgénicos dobles (Tgp35; p35 - / -) en los que la expresión de p35 se dirigía solo desde el transgén. La expresión p35 en ratones Tgp35; p35 - / - se observó solo en el cerebro ( C), donde el patrón de expresión espacial fue similar al de los ratones de tipo salvaje ( D). Se ha demostrado que la falta de p35 produce una estructura de capas anormales en la corteza cerebral y el hipocampo de los ratones (10). Sin embargo, los ratones Tgp35; p35 - / - mostraron un completo rescate del fenotipo p35 - / - cerebro ( E). Estos datos indicaron que el promotor p1.2 de 35-kb controlaba la expresión del transgén con un perfil de expresión similar al de p35 del gen p35 endógeno.
El nivel de proteína p35 es un límite de velocidad para la regulación ascendente de la actividad Cdk5. Examinamos los efectos de la dosificación génica de los genes que codifican p35 y Cdk5 en la expresión de proteínas en extractos estriatales de p35 - / -, p35 +/–, de tipo salvaje, Tgp35, Cdk5 +/–, y TgCdkXNXX ratones a la edad de XUM. Los niveles de proteína p5 y Cdk3 se correlacionaron bien con las dosis del gen, respectivamente ( A y B). Los ratones Tgp35 mostraron un aumento de ≈1.6 veces en el nivel de proteína p35 en comparación con los ratones de tipo salvaje, mientras que los niveles de proteína Cdk5 no se vieron afectados por los diferentes niveles de proteína p35. Los ratones TgCdk5 mostraron un aumento de ≈1.9 veces en el nivel de proteína Cdk5 en comparación con los ratones de tipo salvaje, mientras que los niveles de proteína p35 no se vieron afectados por los diferentes niveles de proteína Cdk5. Para examinar los efectos de diferentes cantidades de la proteína p35 sobre la actividad de Cdk5, se inmunoprecipitó Cdk5 de extractos de estriado con anticuerpo anti-Cdk5 y se midió la actividad de la quinasa. Del mismo modo, para examinar los efectos de diferentes cantidades de proteína Cdk5 sobre la actividad de la quinasa, se inmunoprecipitó p35 a partir de extractos de estriado con anticuerpo anti-p35, y se midió la actividad de la quinasa. La actividad de Cdk5 se correlacionó bien con el nivel de proteína p35 pero no con el nivel de proteína Cdk5 ( C y D). Estos resultados indican que la cantidad de proteína p35 es un factor limitante de la velocidad para la actividad Cdk5. Por lo tanto, utilizamos ratones Tgp35 para investigar los efectos del aumento de la actividad de Cdk5 en la señalización de la dopamina del estriado.
La fosforilación de DARPP-32 inducida por la cocaína en Thr-34 se atenúa en ratones Tgp35. La función de DARPP-32 depende de su estado de fosforilación en múltiples sitios (20). PKA fosforila DARPP-32 en Thr-34, mientras que Cdk5 fosforila DARPP-32 en Thr-75. Por lo tanto, examinamos el estado de fosforilación de DARPP-32 en extractos de estriado de ratones de tipo salvaje y Tgp35. El nivel de fosfo-Thr-75 DARPP-32 fue mayor en ratones Tgp35 ( A; 1.6 ± 0.2-veces por encima del valor de los ratones de tipo salvaje). A continuación, evaluamos los efectos del aumento de la actividad de Cdk5 en la señalización de la dopamina del estriado. Examinamos la activación de PKA inducida por cocaína en ratones Tgp35 mediante el análisis del estado de fosforilación de DARPP-32 en Thr-34. El nivel de phospho-Thr-34 DARPP-32 aumentó en ratones de tipo salvaje 15 min después de la inyección de cocaína ( B; 1.8 ± 0.2-veces por encima del nivel basal). Sin embargo, el efecto de la cocaína en la fosforilación de Thr-34 de DARPP-32 se atenuó en ratones Tgp35 (1.2 ± 0.3-veces por encima del nivel basal). Estos resultados indicaron que un aumento de la actividad de Cdk5 atenuó la activación de PKA inducida por la cocaína, probablemente a través de la fosforilación de DARPP-32 en Thr-75 (6, 12). También es posible que un aumento en la actividad presináptica Cdk5 provoque una disminución en la liberación de dopamina, y que esto contribuya al efecto reducido de la cocaína. En particular, una sola inyección de cocaína no afectó los niveles de proteína p35 y Cdk5, así como la actividad de la quinasa ( C y D). Esto contrasta con un estudio anterior en el que se ha demostrado que la exposición crónica a la cocaína regula al alza la expresión de p35 y Cdk5 (6).
La regulación ascendente de la actividad Cdk5 atenúa la activación de ERK1 / 2 inducida por la cocaína. La evidencia reciente indica que la activación del receptor de dopamina en el cuerpo estriado también activa otras cascadas de señalización, incluida la vía ERK (21, 22), que tiene un papel importante en la respuesta de comportamiento a la cocaína (23). Por lo tanto, examinamos si la actividad de Cdk5 podría afectar la activación inducida por la cocaína de la vía ERK. La activación de la vía ERK se observó después de la inyección de cocaína en extractos del estriado de ratones de tipo salvaje, como se evidencia por el aumento de la fosforilación de MEK1 / 2 en Ser-217 y Ser-221 (1.5 ± 0.2-veces por encima del nivel basal) y de ERK1 / 2 en Thr-202 y Tyr-204 (fosforilación de ERK2: 1.5 ± 0.2 veces por encima del nivel basal) ( A y B). Sin embargo, la activación inducida por la cocaína de MEK1 / 2 (1.2 ± 0.2-fold por encima del nivel basal) y de ERK1 / 2 (fosforilación de ERK2: 1.2 ± 0.2-fold por encima del nivel basal) se atenuó en los ratones Tgp35 ( A y B). Además, los niveles basales de fosfo-ERK1 / 2 fueron más bajos en los ratones Tgp35 (0.8 ± 0.2 veces por debajo del valor de los ratones de tipo salvaje), mientras que esta tendencia no fue estadísticamente significativa. Este último resultado podría atribuirse a la fosforilación dependiente de Cdk5 de MEK1 en Thr-286, dando como resultado una disminución de la actividad catalítica (24). Para evaluar esta posibilidad, examinamos el estado de fosforilación de MEK1 en Thr-286 y encontramos que niveles más altos de fosfo-Thr-286 MEK1 estaban presentes en extractos estriatales de ratones Tgp35 ( C; 1.3 ± 0.1-veces por encima del valor de los ratones de tipo salvaje). Además, el estado de fosforilación de MEK1 en Thr-286 no se alteró con una sola inyección de cocaína, lo que concuerda con el hallazgo de que la actividad de Cdk5 no se vio afectada por el tratamiento ( D).
La propagación de la señalización de la dopamina al núcleo se ve atenuada por el aumento de la actividad de Cdk5. La activación inducida por cocaína de múltiples cascadas de señalización que involucran PKA y ERK conduce a la activación subsiguiente del factor de transcripción CREB en el núcleo a través de su fosforilación en Ser-133 (22, 25). Para investigar si los efectos inhibitorios mediados por Cdk5 en las cascadas de activación de PKA y ERK pueden converger en la fosforilación de CREB en el núcleo, examinamos el estado de fosforilación de CREB en Ser-133 en extractos estriatales de ratones de tipo natural y Tgp35. El nivel basal de fosfo-CREB fue menor en los ratones Tgp35 (0.7 ± 0.1-veces del valor de los ratones de tipo salvaje) ( ). En respuesta a la inyección de cocaína, el nivel de fosfo-CREB aumentó en el cuerpo estriado de los ratones de tipo salvaje (1.5 ± 0.1 veces más que el nivel basal), pero esta respuesta a la cocaína se atenuó en ratones Tgp35 (1.2 ± 0.1 doblar por encima del nivel basal) ( ).
La fosforilación de CREB en Ser-133 aumenta su actividad transcripcional a través de un elemento de respuesta cAMP en la región promotora de ciertos genes, incluido el gen c-fos (26). Por lo tanto, examinamos la inducción de c-fos en el estriado de ratones de tipo salvaje y Tgp35 después de la inyección de cocaína. En ratones de tipo salvaje, el nivel de ARNm de c-fos aumentó a un valor máximo (1.8 ± 0.2-veces más que el nivel basal) 30 min después de la inyección de cocaína, y posteriormente regresó al nivel basal por 120 min después de la inyección ( A y B). Sin embargo, los niveles de ARNm de c-fos fueron ≈30% más bajos en ratones Tgp35 que en ratones de tipo salvaje hasta 30 min después de la inyección ( A y B). La menor inducción de c-fos en ratones Tgp35 fue corroborada por la inmunohistoquímica ( C–F). La administración de cocaína incrementó la inmunorreactividad de c-fos, fuertemente en las partes dorsomedial-dorsocentral del estriado y débilmente en las partes laterales, tanto en ratones de tipo salvaje como en ratones Tgp35. Sin embargo, el aumento en el número de células inmunopositivas para c-fos inducido por la cocaína se atenuó notablemente en el cuerpo estriado de ratones Tgp35 ( G). En conjunto, estos resultados indicaron que la inhibición mediada por la cocaína de la señalización de dopamina estriatal al núcleo se inhibió en ratones Tgp35, un resultado probable del aumento de la actividad de Cdk5.
Discusión
Cdk5 y su activador p35 han sido identificados como genes diana que están regulados por la exposición crónica a la cocaína. (6). Presentamos aquí evidencia de que el aumento de la actividad de Cdk5, como resultado de la regulación por aumento de p35 en lugar de la regulación por aumento de Cdk5, conduce a la atenuación de la señalización de dopamina mediada por cocaína en las neuronas del estriado. Para examinar las consecuencias de la expresión regulada al alza de Cdk5 o p35 en la señalización de dopamina del estriado, se analizaron dos líneas de ratones transgénicos, ratones TgCdk5 y Tgp35. Encontramos que la actividad de Cdk5 estaba regulada al alza en proporción a un nivel elevado de proteína p35, pero no se vio afectada por un nivel mayor de proteína Cdk5. Nuestro informe anterior también ha demostrado que la actividad de Cdk5 en el cerebro de ratón TgCdk5 fue menor que en el cerebro de ratón de tipo salvaje cuando la actividad se midió utilizando inmunoprecipitados de Cdk5 (17), sugiriendo que la sobreexpresión de Cdk5 da como resultado un aumento del nivel de Cdk5 monomérico si el nivel de p35 no aumenta. Estos resultados indicaron que el nivel de proteína p35 es un factor limitante de la velocidad para la actividad de Cdk5.
Los ratones Tgp35 mostraron una inducción menor tanto de la fosforilación de CREB como de c-fos en el cuerpo estriado después de la inyección aguda de cocaína, lo que sugiere que la respuesta del cuerpo estriado a la cocaína fue inhibida por el aumento de la actividad Cdk5. La atenuación de la señalización de dopamina mediada por cocaína en ratones Tgp35 probablemente se logró a través de la inhibición mediada por Cdk5 de múltiples cascadas de señalización que involucran DARPP-32, PKA y ERK. La administración de cocaína aumentó la fosforilación de PKA de DARPP-32 en Thr-34 en ratones de tipo salvaje, mientras que esta respuesta se atenuó en ratones Tgp35. Se ha demostrado que la fosforilación de PKA de DARPP-32 en Thr-34 inhibe la actividad de la proteína fosfatasa 1 (PP1), la enzima responsable de la desfosforilación de Ser-133 de CREB (27). Por lo tanto, la actividad de PP1 no se antagonizaría a través de la ruta DARPP-32 / PP1 en ratones Tgp35.
La activación inducida por cocaína de ERK1 / 2 también se atenuó en ratones Tgp35. Hay varios mecanismos distintos por los cuales Cdk5 podría inhibir la activación de ERK1 / 2 inducida por la cocaína. Primero, la fosforilación de DARPP-5 en Thr-32 dependiente de Cdk75 podría inhibir la PKA, lo que lleva a una inhibición posterior de cualquier activación MEK1 / 2 mediada por PKA que se requiere para la activación de ERK1 / 2. Un estudio reciente también ha encontrado que la fosforilación de DARPP-32 en Thr-34 es necesaria para la activación mediada por cocaína de ERK1 / 2 por vías múltiples que involucran la regulación indirecta de la activación de MEK, así como la regulación de fosfatasa enriquecida en estriado, una tirosina Fosfatasa que actúa directamente sobre ERK1 / 2 (28). El descubrimiento de que la fosforilación de MEK1 / 2 en Ser-217 y Ser-221 fue abolida en ratones Tgp35 fue sugerido por el descubrimiento de esta posibilidad. Otra vía probable es a través de la fosforilación dependiente de Cdk5 de MEK1 en Thr-286, lo que resultaría en una disminución de su actividad catalítica y conduciría a la inhibición de la actividad de ERK1 / 2 (24).
Se ha demostrado que la inhibición de la actividad de Cdk5 en el cuerpo estriado potencia los efectos del comportamiento del tratamiento crónico de cocaína en animales (6). Consistente con la hipótesis de que la regulación al alza de la actividad Cdk5 puede contribuir a la adaptación neuronal para contrarrestar los efectos de la administración repetida de cocaína (6), encontramos que la fosforilación mediada por Cdk5 de DARPP-32 y MEK1 contribuyó a la atenuación de la activación de ERK1 / 2 inducida por la cocaína, lo que resultó en una menor inducción de la fosforilación de CREB y c-fos en el estriado. Nuestros hallazgos respaldan la idea de que el aumento de la actividad de Cdk5, como resultado de la regulación positiva de p35, puede alterar la expresión génica en el estriado después de la exposición crónica a la cocaína. Esto puede ocurrir a través de cambios en las actividades de los factores de transcripción como CREB y c-fos. Por lo tanto, el activador de Cdk5 p35, en virtud de sus efectos limitadores de velocidad en la actividad de Cdk5, puede contribuir a cambios duraderos en la función neuronal subyacente a la adicción a la cocaína..
AGRADECIMIENTOS
Agradecemos a los Dres. Mary Jo Danton, Philip Grant y Sashi Kesavapany por la lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de la Salud Grant Z01DE00664-05 (para ABK), el Servicio de Salud Pública de los EE. UU. DA10044, y subvenciones de la Fundación Simons, la Fundación Peter J. Sharp y la Fundación Picower (para PG).
Notas
Abreviaturas: Cdk5, quinasa dependiente de ciclina 5; ERK, quinasa regulada por señal extracelular; DARPP-32, dopamina y fosfoproteína regulada por AMPc, masa molecular 32 kDa; PKA, quinasa dependiente de AMPc; MEK, quinasa ERK; CREB, proteína de unión al elemento de respuesta AMPc.
Referencias
;
