La sobreexpresión de DeltaFosB en el núcleo accumbens imita el fenotipo de adicción protectora, pero no el fenotipo de depresión protectora del enriquecimiento ambiental (2014)

Frente Behav Neurosci. 2014; 8: 297.

Publicado en línea agosto 29, 2014. doi  10.3389 / fnbeh.2014.00297

PMCID: PMC4148937

Resumen

El enriquecimiento ambiental produce adicciones protectoras y fenotipos de depresión en ratas.. ΔFosB es un factor de transcripción que regula la recompensa en el cerebro y es inducido por el estrés psicológico y las drogas de abuso. Sin embargo, el papel desempeñado por ΔFosB en los fenotipos protectores del enriquecimiento ambiental no ha sido bien estudiado. Aquí, demostramos que ΔFosB está regulado de manera diferente en ratas criadas en una condición aislada (IC) en comparación con aquellas en una condición enriquecida (EC) en respuesta al estrés de restricción o la cocaína.

El estrés crónico o el tratamiento crónico con cocaína elevan los niveles de proteína ΔFosB en el núcleo accumbens (NAc) de ratas IC, pero no de las ratas EC debido a una acumulación basal ya elevada de ΔFosB vista en condiciones EC.

La sobreexpresión de ΔFosB mediada por virus en la cáscara NAc de ratas alojadas en parejas (es decir, independiente del enriquecimiento / aislamiento ambiental) aumenta la respuesta operante para la sacarosa cuando está motivada por el hambre, pero disminuye la respuesta en animales saciados. Además, la sobreexpresión de BFosB disminuye la autoadministración de cocaína, aumenta la extinción de la búsqueda de cocaína y disminuye el restablecimiento de la autoadministración intravenosa de cocaína inducida por cocaína; Todos los hallazgos de comportamiento consistentes con el fenotipo de enriquecimiento..

Sin embargo, en contraste, la sobreexpresión de BFosB no alteró las respuestas de ratas alojadas en parejas en varias pruebas de comportamiento relacionado con la ansiedad y la depresión.

Así, ΔFosB en el Imitadores de concha NAc el fenotipo de la adicción protectora, pero no el fenotipo de la depresión protectora del enriquecimiento ambiental.

Palabras clave: [incremento]FosB, enriquecimiento ambiental, depresión, autoadministración de cocaína, virus adenoasociados (AAV), sobreexpresión

Introducción

La experiencia de vida, especialmente en las primeras etapas de la vida, tiene un profundo impacto en el comportamiento de los animales durante toda la vida. El medio ambiente desempeña un papel esencial en la vulnerabilidad y la resistencia a los trastornos mentales en los seres humanos (Elisei et al., 2013; Akdeniz et al. 2014; Kato y Iwamoto, 2014; Van Winkel et al. 2014). En modelos de roedores, se informó que vivir en un ambiente enriquecido desde el destete hasta la edad adulta joven produce adictos protectores y fenotipos de depresión (Green et al., 2002, 2003, 2010; Laviola et al. 2008; Solinas et al. 2008, 2009; El Rawas et al., 2009; Thiel et al. 2009, 2010). En este paradigma, los animales se asignan a una condición enriquecida (EC) en la que los animales se alojan en grupos y tienen acceso diario a nuevos objetos, o una condición aislada (CI) en la que los animales se alojan solos sin novedad ni contacto social. Los animales criados en la condición enriquecida, que incluye el contacto social, el ejercicio y la novedad, exhiben menos refuerzos y buscan cocaína o anfetamina en el paradigma de autoadministración de drogas intravenosas (Green et al., 2002, 2010). Además del fenotipo de la adicción, dicha exposición al enriquecimiento produce un efecto antidepresivo en modelos animales de depresión. (Green et al., 2010; Jha et al. 2011). Específicamente, los animales enriquecidos exhiben un comportamiento anhedonia disminuido en la prueba de preferencia de sacarosa, menos retiro social en una prueba de interacción social y menos inmovilidad en la prueba de natación forzada (FST). A pesar de los efectos anti-adicción y antidepresivos del enriquecimiento, los mecanismos subyacentes a estos fenotipos protectores del enriquecimiento ambiental siguen sin entenderse completamente, aunque nuestra investigación previa ha implicado un papel para la disminución de la actividad del factor de transcripción, CREB, en el núcleo accumbens (NAc ) en la mediación de algunos de los efectos del enriquecimiento ambiental (Green et al., 2010; Larson et al. 2011). Por lo tanto, el objetivo de estos estudios de crianza diferencial es utilizar un enfoque de ciencia básica para identificar mecanismos moleculares de resiliencia que luego se pueden traducir a la clínica. Este enfoque es el equivalente ambiental a estrategias genéticas bien establecidas, como la reproducción selectiva (McBride et al., 2014).

Aquí nos centramos en otro factor de transcripción, el ΔFosB, que se induce de manera prominente en el NAc por ciertas formas de estrés o por prácticamente todas las drogas de abuso, incluidas la cocaína, la morfina, el alcohol, la nicotina y la anfetamina (Hope et al., 1992; Kelz y Nestler, 2000; Perrotti et al. 2004, 2008). Como factor de transcripción, ΔFosB dimeriza con las proteínas de la familia Jun, preferentemente JunD, para formar un complejo activo AP-1 que se une al elemento de respuesta AP-1 para mejorar o reprimir la transcripción de sus genes objetivo (Nestler, 2001), aunque una nueva investigación sugiere que ΔFosB también puede actuar como homodímero (Wang et al., 2012). La proteína ΔFosB es una varianza de empalme truncada de la FosB gen, que hace que la proteína ΔFosB carezca de dos dominios C-terminales degron, lo que evita que la proteína ΔFosB se degrade rápidamente con FosB y todas las demás proteínas de la familia Fos. Debido a que ΔFosB es extraordinariamente estable en la NAc, ΔFosB actúa de manera muy diferente en respuesta a estímulos agudos vs. crónicos en comparación con otras proteínas Fos. Con la exposición repetida a drogas de abuso o estrés, la proteína osFosB se acumula gradualmente y persiste durante días o semanas, mientras que las proteínas FosB y otras proteínas Fos se inducen solo por un corto tiempo (horas) y desarrollan una inducción atenuada en la exposición posterior (Nestler et al., 2001; Nestler 2008).

La importancia de ΔFosB no solo es que está altamente inducida por drogas de abuso y estrés, sino que también se ha demostrado que la manipulación de ΔFosB en el cerebro afecta el comportamiento de los animales. La inducción selectiva de ΔFosB en las neuronas espinosas medianas de dinorfina en ratones adultos aumenta la sensibilidad locomotora en respuesta a la cocaína aguda y repetida, así como las respuestas gratificantes a la cocaína en el paradigma de preferencia de lugar condicionado y el refuerzo en el paradigma de autoadministración (Kelz et al., 1999; Kelz y Nestler, 2000; Colby et al. 2003).

Aunque la adicción protectora y los fenotipos de depresión se han descrito en detalle para ratas enriquecidas con el medio ambiente, un posible papel para ΔFosB en la mediación de estos fenotipos protectores no se ha evaluado completamente. Estudios previos de enriquecimiento ambiental demostraron que, en comparación con el entorno estándar (EE), un entorno enriquecido aumenta los niveles basales de ΔFosB en neuronas espinosas del medio D1 y D2 de las regiones estriatales en ratones (Solinas et al., 2009; Lobo et al. 2013). Además, las ratas Wistar enriquecidas mostraron células ΔFosB positivas elevadas en las células NAc y prefrontal en comparación con las ratas SE, lo que sugiere un posible papel de ΔFosB en el fenotipo de adicción protectora a la nicotina (Venebra-Muñoz y otros, 2014). Además, la sobreexpresión de ΔFosB en todo el estriado de los ratones aumenta la marcha diaria de la rueda, lo que puede ser análogo al aumento de la actividad de las ratas en un entorno enriquecido (Werme et al., 2002).

En el estudio actual, planteamos la hipótesis de que: (1) el enriquecimiento ambiental aumentaría la acumulación de niveles basales de ΔFosB en la NAc; y (2) esta acumulación de ΔFosB contribuiría a los efectos protectores del enriquecimiento ambiental.

Materiales y métodos

Animales

Para el enriquecimiento ambiental, se asignaron aleatoriamente ratas Sprague-Dawley macho (Harlan, Houston, TX, EE. UU.) A alojamientos de EC o IC desde el día postnatal 21 hasta el día 51. Las ratas EC se alojaron en grupo (20 por jaula) en una jaula de metal grande (70 × 70 × 70 cm) con varios objetos de plástico duro (juguetes para niños, recipientes de plástico, tubos de PVC, etc.). Estos objetos fueron reemplazados por nuevos objetos y se reorganizaron en una configuración novedosa diaria. Las ratas IC se alojaron individualmente en jaulas de policarbonato estándar. Las ratas permanecieron en estas condiciones a lo largo de los experimentos y todas las pruebas de comportamiento y pruebas bioquímicas comenzaron después de los días de edad de 51 (es decir, al menos 30 días de enriquecimiento / aislamiento). Para la sobreexpresión de ΔFosB, se obtuvieron ratas Sprague-Dawley macho (Harlan, Houston, TX, EE. UU.) En el tamaño 225 – 250 g y se alojaron en parejas en jaulas de policarbonato estándar antes de ser inyectadas estereotácticamente con un vector viral asociado al virus la sobreexpresión de ΔFosB con proteína fluorescente verde (GFP) o solo GFP como control (ver más abajo). El chow de ratas estándar y el agua estaban disponibles para todas las ratas, excepto durante las pruebas de comportamiento y la regulación de los alimentos. Todas las ratas se mantuvieron en un ambiente controlado (temperatura, 2 ° C, humedad relativa, 22% y 50 h ciclo luz / oscuridad, luces en 12 h) en una colonia aprobada por la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio (AAALAC) . Todos los experimentos se ajustaron a la Guía de NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio y al Comité institucional de cuidado y uso de animales de la Rama médica de la Universidad de Texas.

El enriquecimiento ambiental es una manipulación compuesta que consiste en novedad, contacto social y ejercicio. La vivienda para parejas proporciona contacto social y, por lo tanto, representa una EC (consulte la Guía NIH). Por lo tanto, el grupo de control apropiado para una condición con novedad, contacto social y ejercicio sería un grupo sin novedad, contacto social o ejercicio, la condición de IC. Las ratas IC muestran menos signos de estrés crónico que las ratas EC. Específicamente, las ratas EC tienen adrenales agrandadas (Mlynarik et al., 2004), respuestas CORT embotadas (Stairs et al., 2011), atenuación de la inducción génica temprana inmediata (Zhang et al., manuscrito en preparación) y acumulación de osFosB (Solinas et al., 2009; Lobo et al. 2013), todos los signos de estrés crónico (Crofton et al., en revisión).

Estrés psicológico

Las ratas enriquecidas y aisladas se colocaron en sujetadores de roedores de plástico blando desechables (DecapiCone®, Braintree Scientific Inc., MA, EE. UU.) Durante 60 min para los días de 1 (agudo) o 9 (repetidos). Para las pruebas de ARNm de exposición corta, se decapitaron 30 min de ratas 5 (ratas 30 por grupo) después del comienzo del último período de estrés de restricción, se extrajeron los cerebros de ratas y se diseccionó la NAc para el análisis de ARNm. Para inmunohistoquímica, las ratas 12 se perfundieron con solución salina y 4% paraformaldehído, se extrajeron los cerebros, se fijaron posteriormente en 4% paraformaldehído y se almacenaron en 20% glicerol en 1xPBS a 4 ° C. Los cerebros de rata se cortaron a 40 μm con un microtomo de congelación. Los cerebros se recogieron 24 h después del estrés final para permitir que la proteína FosB de longitud completa se degradara (Perrotti et al., 2008).

Autoadministración intravenosa de cocaína con enriquecimiento ambiental.

Implantación de catéter intravenoso.

Las ratas se anestesiaron con ketamina (100 mg / kg IP) y xilazina (10 mg / kg IP) y se insertó un catéter Silastic y se aseguró en la vena yugular, saliendo de la piel en la espalda del animal. Cada día, los catéteres se infundieron con 0.1 ml de una solución salina estéril que contenía heparina (30.0 U / ml), penicilina G potásica (250,000 U / ml) y estreptoquinasa (8000 IU / ml) para prevenir la infección y mantener la permeabilidad del catéter durante toda la duración. de experimentos.

Autoadministración de cocaína con enriquecimiento ambiental.

Veinte ratas enriquecidas y aisladas con 20 se colocaron en cámaras operantes 30 × 24 × 21 cm (Med-Associates, St. Albans, VT) y se les permitió presionar una palanca para infusiones de cocaína (0.5 mg / kg / infusión, suministro de medicamentos NIDA, Research Triangle Institute, NC, EE. UU.) O solución salina con un índice 1 (FR1) de proporción fija para 2 h por día durante un total de días 14. Para mantener una ingesta similar de cocaína entre los grupos EC e IC, hubo un máximo de infusiones de 30 por sesión. La capacidad de procesamiento del tejido se limitó a las muestras de 30, por lo que no se procesaron las ratas de respuesta más baja de cada grupo, lo que dejó Ns de 8 para la cocaína y 7 para los grupos salinos. Por lo tanto, no hubo diferencias de CE / IC en la ingesta total de cocaína o el curso de tiempo de las infusiones entre ratas CE e IC. Los cerebros de rata se extrajeron 3 h después del comienzo de la última sesión de autoadministración y la NAc se diseccionó para el análisis de ARNm y proteínas. Un lado de la NAc se usó para Western blot, el otro lado se usó para qPCR.

Administración no contingente de cocaína con enriquecimiento ambiental.

Para una comparación directa con la literatura publicada anteriormente (Hope et al., 1994; Chen et al. 1995), CE (N = 12) y ratas IC (N = 12) se inyectaron con solución salina o 20 mg / kg de cocaína por vía intraperitoneal (IP) para los días 1 (agudos) o 9 (repetidos). Una muestra de EC se perdió durante el procesamiento. El grupo agudo recibió inyecciones de solución salina durante los días 8 y una inyección de cocaína en el día 9, de modo que todas las ratas recibieron la misma cantidad de inyecciones. Los cerebros se extrajeron 30 min después de la última inyección y la NAc se diseccionó para el análisis de ARNm.

Cuantificación de ARNm utilizando qPCR

El ARN se extrajo mediante homogeneización en ARN STAT-60 (Teltest, Friendswood, TX), separando el ARN del ADN y la proteína utilizando cloroformo y precipitando el ARN total con isopropanol. El ADN contaminante se eliminó (TURBO DNA-Free, Life Technologies, CA, EE. UU.) Y 5 ug del ARN purificado se transcribió de forma inversa en cDNA (Síntesis de la primera hebra de SuperScript III: catálogo de Invitrogen # 18080051). ΔFosB ARNm se cuantificó utilizando cuantitativa en tiempo real PCR (SYBR Green: Applied Biosystems, Foster City, CA) en un termociclador rápido Applied Biosystems 7500 con cebadores diseñados para detectar sólo ΔFosB (adelante: AGGCAGAGCTGGAGTCGGAGAT; inversa: GCCGAGGACTTGAACTTCACTCG) y normalizado a cebadores diseñados para detectar GAPDH de rata (adelante: AACGACCCCTTCATTGAC; reverso: TCCACGACATACTCAGCAC). Todos los cebadores se validaron y analizaron para determinar su especificidad y linealidad antes de los experimentos (Alibhai et al., 2007).

Western blot

El lado derecho del NAc de ratas EC e IC autoadministradas con cocaína o solución salina se homogeneizó en un tampón que contiene sacarosa, tampón Hepes, fluoruro de sodio, SDS al 10, e inhibidores de la proteasa y la fosfatasa (Sigma-Aldrich: P-8340, P -2850, P-5726). La concentración de proteínas se evaluó utilizando el kit de ensayo de proteínas Pierce BCA (Thermo Scientific, IL, EE. UU.). Debido a que la proteína extraída de una rata no era suficiente para el análisis, las muestras de 2 del mismo grupo se agruparon, produciendo muestras de 4 para cada grupo. Las muestras de proteínas se desnaturalizaron a 95 ° durante 5 min y se procesaron en un gel de gradiente de poliacrilamida 10-20% (Criterion TGX, Bio-Rad Laboratories, CA, EE. UU.) Y luego se transfirieron a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) (Millipore, MA, EE. UU. ). La membrana se bloqueó con un bloqueador de grado de transferencia (leche en polvo sin grasa), se incubó con el anticuerpo primario primaryFosB (conejo, 1: 1000, #2251, Cell Signaling Technology, MA, EE. UU.) Y el anticuerpo primario β-actina (ratón, 1: 1000 , Cell Signaling Technology, MA, EE. UU.), Se lavó con TBST y luego se incubó con anticuerpos fluorescentes secundarios (anti-conejo burro (780 nm), anti-ratón burro (680 nm), 1: 15000, Li-Cor Biosciences, NE, ESTADOS UNIDOS). Luego se tomaron imágenes de las transferencias Western (Odyssey, Li-Cor Biosciences, NE, EE. UU.) Y se cuantificaron los niveles de proteína con el software Odyssey.

Inmunohistoquímica

Para la figura Figura11 (N = 3), las células que contenían ΔFosB se visualizaron y se contaron a través del marcado inmunohistoquímico de ΔFosB en rodajas NAc teñidas con DAB (kit de sustrato de peroxidasa DAB, Vector Laboratories, CA, EE. UU.). Los cerebros se extrajeron, se fijaron posteriormente, se crioprotegieron y se seccionaron en rebanadas de 40 μm que contenían el NAc en un microtomo deslizante de congelación (Leica Biosystems, IL, EE. UU.). Las rodajas permanecieron flotantes y se enjuagaron con 1xPBS antes de que se apagaran las peroxidasas endógenas, antes de bloquearlas con 3% de suero normal de cabra (Jackson ImmunoResearch, PA, EE. UU.) Con 0.3% de tritón y avidina D (Vector Laboratories, CA, EE. UU.). Las rodajas NAc se incubaron con anticuerpo primario FosB durante la noche (1: 1000, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EE. UU.) Con 3% de suero de cabra, 0.3% de tritón, 1xPBS y solución de biotina (Vector Laboratories, CA, EE. UU.). Aunque este anticuerpo reconoce tanto FosB como ΔFosB, estudios previos de Western blot mostraron que en 24 h después de la estimulación, la gran mayoría de la señal inmunohistoquímica está compuesta de ΔFosB porque FosB se degrada mucho antes de 24 h (Perrotti et al., 2008). Después del lavado, las rodajas se incubaron con un anticuerpo IgG anti-conejo secundario biotinilado (Vector Laboratories, CA, EE. UU.), Suero de cabra y 1xPBS. Luego, las rodajas se incubaron con una tinción con peroxidasa del complejo avidina-biotina (ABC) durante 15 min (Thermo Scientific, IL, EE. UU.). Finalmente, las rodajas se montaron, se deshidrataron con etanol y CitriSolv (Fischer Scientific, MA, EE. UU.) Y se cubrieron con DPX (Fisher Scientific). Para el recuento de células, se tomaron muestras de Bregma + 1.80 a + 1.44 de cada animal. El número total de células inmunopositivas ΔFosB se contó a partir de cuatro secciones NAc desde el núcleo y la cáscara de cada rata.

Figura 1 y XNUMX  

El estrés y la [incremento]FosB en ratas CE e IC. (ANUNCIO) Inmunohistoquímica representativa Tinción DAB de ΔFosB en NAc shell y núcleo de IC (A y B) y CE (C y D) ratas conB y D) y sin (A y C) estrés repetido (N = 3). (E) Cuantificación ...

Sobreexpresión de virus adenoasociados. [incremento]FosB

Un vector basado en AAV2 que expresa ΔFosB y renilla GFP humanizada (hrGFP; Winstanley et al., 2007, 2009a,b) o hrGFP control vector (N = 10 cada uno) se inyectó bilateralmente en la rata NAc. Debido a que no hay seres humanos con CI, se utilizaron ratas alojadas en parejas en lugar de ratas con CI para este estudio para aumentar la relevancia para la comunidad científica al demostrar los efectos de ΔFosB independientes del paradigma EC / IC. Se utilizó como control un AAV que expresaba hrGFP pero que no sobreexpresa ΔFosB. La expresión de ΔFosB in vivo se validó mediante tinción de inmunofluorescencia con anticuerpo primario de FosB (1: 200, Rabbit, Cell Signaling Technology, MA, EE. UU.). Los vectores de AAV se inyectaron en la envoltura NAc de forma bilateral (1 μl / lado sobre 10 min) utilizando coordenadas (AP = 1.7, L = 2.0, D = −6.5). Las pruebas de comportamiento comenzaron 3 semanas después de la cirugía estereotáxica. La colocación precisa se determinó inmunohistoquímicamente después de la conclusión de las pruebas de comportamiento.

Neofobia sacarosa

RatFosB que sobreexpresan ratas (N = 10) y ratas de control (N = 8) se manejaron durante la semana 1 antes del inicio de las pruebas de comportamiento. Para probar el comportamiento similar a la ansiedad, las ratas se evaluaron para detectar neofobia a un sabor novedoso (sacarosa). Las ratas se separaron en jaulas individuales y el agua se eliminó en 1600 h. Las botellas de agua de rata estándar se llenaron con una solución de sacarosa 1% p / v en el agua del "grifo" normal de las ratas y se pesaron antes de colocarlas en cada jaula en 1800 h. Después de 30 min, las botellas se retiraron y se volvieron a pesar, y se calculó la diferencia del peso de las botellas de sacarosa antes y después de la prueba. Luego, la sacarosa se reemplazó en las jaulas durante un período adicional de 2 para que las ratas se familiarizaran con el sabor de la sacarosa antes de la prueba de preferencia de sacarosa.

Elevado más laberinto

Otra prueba de comportamiento similar a la ansiedad, el laberinto más elevado (EPM), se probó 2 días después de la neofobia a la sacarosa. El EPM mide el comportamiento exploratorio modificado con vectores en un entorno novedoso y que produce ansiedad (Green et al., 2008). Dos brazos cerrados y dos brazos abiertos (Med Associates Inc., VT, EE. UU.) Que miden 12 x 50 cm fueron 75 cm por encima del piso y tenían fotobeames en la entrada de cada brazo. El tiempo invertido en los brazos abiertos se controló durante 5 min mediante roturas de fotobayo utilizando el software Med-PC.

Defecación inducida por estrés por frío

El día después de la EPM, se utilizó una tercera prueba de ansiedad: la defecación en respuesta a un ambiente ligeramente estresante (frío). Las jaulas de policarbonato para ratones (33 × 17 × 13 cm) se enfriaron previamente en hielo durante 10 min. Las ratas se colocaron en las jaulas en hielo durante 30 min y se registró el número de bolos fecales cada 5 min.

Contacto social

Al día siguiente, se midió el comportamiento depresivo mediante una prueba de interacción social. Las ratas se separaron para el 24 h antes de la prueba. El día de la prueba, las ratas se colocaron en un entorno nuevo (recipiente de plástico, 45 × 40 × 45 cm) con su compañero de jaula y se registró el comportamiento del video para 30 min. La cantidad de tiempo que un par de ratas pasó preparándose entre sí se midió por un investigador ciego a la condición de las ratas.

Preferencia de sacarosa

Después del contacto social, la prueba de preferencia de sacarosa se utilizó como modelo de anhedonia. Las ratas alojadas en pares se separaron en 1600 h con alimento pero no se permitió el acceso al agua para 2 h. En 1800 se colocaron dos botellas de agua pesadas previamente en cada jaula, una conteniendo agua y la otra una solución de sacarosa 1 en agua. Las botellas de agua se colocaron en la posición normal, mientras que la sacarosa se colocó a aproximadamente 10 cm de distancia. Las botellas se retiraron y se volvieron a pesar después de 15 min.

Actividad locomotora

Tres días después de la preferencia de sacarosa, la actividad locomotora se evaluó en condiciones de luz normales colocando a las ratas en cámaras de plexiglás transparentes (40 × 40 × 40 cm) con una capa delgada de lecho, rodeada por dos matrices de fotobusos 4 × 4, una 4 cm superior el suelo y un 16 cm sobre el suelo para registrar la ambulación horizontal y la actividad vertical (crianza). Las roturas de fotobeam se monitorearon para 2 h mediante un sistema de actividad de campo abierto modificado (San Diego Instruments, CA, EE. UU.).

Prueba de natación forzada

La última prueba de comportamiento espontáneo fue la FST, un modelo sensible a los antidepresivos. Las ratas se colocaron en un cilindro de plexiglás lleno con aproximadamente 14 L de agua a temperatura ambiente (24 ± 0.5 °) para 15 min en la sesión 1, y 5 min en la sesión 2 al día siguiente. Las ratas se secaron y se colocaron de nuevo en sus jaulas. La actividad de natación se grabó en video y la latencia del primer período de inmovilidad (1 s) y el tiempo total inmóvil se determinaron para la sesión 2 por un investigador ciego a las condiciones.

Sucrosa operante respondiendo

Las ratas de control de AAV y las ratas que expresaban ΔFosB se regularon a 85% del peso de alimentación libre durante los días de 7. Todas las ratas fueron entrenadas para presionar en barra para pellets de sacarosa (Bio-Serv, NJ, EE. UU.) En un programa de refuerzo FR1 para sesiones mínimas de 15 en días consecutivos de 5. Las ratas se les dio acceso libre a los alimentos durante 3 días y nuevamente se les permitió presionar en barritas para obtener pellets de sacarosa en un programa FR1 para 15 min, esta vez con un peso de 100% de alimentación libre.

Autoadministración de cocaína.

Acquisition

Una semana después de la cirugía de catéter (como se describió anteriormente), todas las ratas (ratas de control 7 y ratas que sobreexpresan 10 ΔFosB, una rata de control se perdió de la cirugía de catéter) se colocaron en cámaras operantes 30 × 24 × 21 cm (Med-Associates, St. Albans, VT) y se permitió la autoadministración de 0.2 mg / kg / infusión de dosis unitaria de cocaína para 2 h por sesión durante los días 4; luego 0.5 mg / kg / infusión para los días 3 en un programa FR1. Cada infusión se administró por vía intravenosa en un volumen de 0.01 ml sobre 5.8 s. La infusión se señaló mediante la iluminación de dos luces indicadoras para 20 s, lo que señaló un período de tiempo de espera durante el cual no se pudieron obtener más infusiones.

Extinción

Debido a que la exposición crónica a la cocaína presumiblemente induciría la acumulación de ΔFosB en las ratas de control, lo que causaría que las ratas en ambas condiciones de vector tuvieran niveles altos de ΔFosB en el cerebro, las ratas se limitaron a sus jaulas de origen durante los días 4 sin que la autoadministración permitiera Los niveles de proteína proteinFosB disminuyen en ratas de vectores de control. Después de la abstinencia de 4 días, se colocaron ratas en la cámara operante y se les permitió autoadministrarse solución salina en lugar de cocaína bajo un programa FR1 para sesiones de 1 h durante días consecutivos de 3.

Proporción fija dosis respuesta

A cada rata (control y sobreexpresión de BFosB) se le permitió autoadministrarse 0.00325, 0.0075, 0.015, 0.03, 0.06, 0.125, 0.25, 0.5 mg / kg / infusión de cocaína en orden ascendente en un horario de FR1 cada día por 5 durante días consecutivos. Las ratas se autoadministraron cada dosis de cocaína para 30 min.

Reincorporación a la cocaína.

Las ratas se sometieron a un procedimiento de reincorporación dentro de la sesión. Las ratas recibieron 0.5 mg / kg / infusión en un programa FR1 para 60 min seguido de 3 h de extinción (con indicios de cocaína contingentes). Luego recibieron una inyección IP (Green et al., 2010) de cocaína de una de cinco dosis (0, 2.5, 5, 10 o 20 mg / kg) en un orden aleatorio para cada rata a través de las sesiones de restablecimiento de 5. La última fase 3 h de la sesión fue la respuesta de reincorporación, nuevamente con señales de cocaína pero aún sin infusiones de cocaína. Después de cada sesión de reincorporación inducida por la cocaína, las ratas recibieron 2 días intermedios de dosis altas (0.5 mg / kg / infusión) de cocaína en un programa FR1 para 2 h para mantener altas tasas de respuesta en todas las sesiones. Durante el proceso de autoadministración de cocaína, los catéteres de algunas ratas perdieron gradualmente la permeabilidad; por lo tanto, los datos de ratas de control 6 y ratas que sobreexpresan 7 ΔFosB se utilizaron en este análisis.

análisis estadístico

Se realizaron análisis de varianza de dos vías (ANOVA) y ANOVA de medidas repetidas de dos vías para comparar los cuatro grupos de tratamiento y se utilizaron comparaciones planificadas para comparar las diferencias entre las condiciones. La significación entre solo dos condiciones fue analizada usando un t-prueba. Todos t-los datos de prueba pasaron la prueba de normalidad de Shapiro-Wilk. Todos los datos se expresan como media ± SEM. La significación estadística se estableció en p <0.05. Todas las ratas enriquecidas para un solo experimento se alojaron en una jaula pero se trataron como sujetos separados, lo que proporciona implicaciones con respecto al tema de la posible pseudorreplicación.

Resultados

Las ratas EC muestran niveles basales más altos de [incremento]FosB en ratas NAc que IC

En comparación con las ratas IC, las ratas EC tienen un número significativamente mayor de células positivas a ΔFosB en ambos núcleos NAc (t(4) = −3.31, p <0.05) y concha (t(4) = −6.84, p <0.05) (Figuras 1A, C, E, F), sugiriendo que el tono basal de ΔFosB es mayor en ratas EC en comparación con ratas IC. Además, los resultados de Western blot mostraron una fuerte tendencia para las ratas con solución salina EC que tienen un nivel basal más alto de proteína osFosB en la NAc en comparación con las ratas con solución salina IC (t(6) = −2.03, p = 0.089; Figura Figura 2A) 2A) utilizando una prueba de dos colas. Sin embargo, dada la mayor expresión en las figuras. 1A – F y los aumentos observados en otros artículos (Solinas et al., 2009), confiamos en este efecto. Los resultados de la transferencia Western también verifican que prácticamente toda la inmunorreactividad de tipo FosB detectada por la inmunohistoquímica fue ΔFosB y no FosB, que no fue detectable en 24 h.

Figura 2 y XNUMX  

Cocaína y [incremento]FosB en ratas CE e IC. (A – B) Proteína proteinFosB media (A) y ARNm (B) nivel (± SEM) en NAc después de 14 días de autoadministración salina o de cocaína en ratas IC y EC (N = 7 – 8). Bandas rojas en Panel a denotar ...

[incremento]FosB es inducido diferencialmente en ratas EC e IC por estrés

Hubo un efecto principal significativo del estrés de restricción repetido en ambas conchas (F(1, 8) = 16.6, P <0.005) y núcleo (F(1, 8) = 7.9, P <0.05) del NAc y un efecto principal del enriquecimiento ambiental en la cáscara (F(1, 8) = 22.3, P <0.005; Cifras 1A – F). Más importante aún, la interacción entre el estrés y el enriquecimiento ambiental también fue significativa tanto en la capa (F(1, 8) = 25.6, P <0.01) y núcleo (F(1, 8) = 6.7, P <0.05). La interacción fue tal que, después de un estrés de restricción repetido, el número de células positivas para ΔFosB aumentó significativamente en ratas IC, mientras que este número no cambió en ratas EC después de un estrés repetido.

Para investigar más a fondo cómo el osFosB está regulado dinámicamente por estrés agudo vs. repetido y permitir la comparación con investigaciones anteriores (Alibhai et al., 2007), inducción de ΔFosB ARNm fue estudiado con estrés de restricción agudo y repetido (Figura (Figura 1G) .1G). Hubo un efecto principal importante del estrés (F(2, 24) = 31.9, P <0.001) y enriquecimiento ambiental (F(1, 24) = 5.1, P <0.05). En las ratas IC, el ARNm de ΔFosB fue fuertemente inducido después de un estrés de restricción agudo. Sin embargo, con estrés repetido, la inducción de ARNm de ΔFosB se atenuó significativamente en comparación con la inducción aguda. También hubo una interacción significativa (F(2, 24) = 4.6, P <0.05), lo que demuestra que la inducción aguda de ARNm de ΔFosB fue menor en ratas EC en comparación con ratas IC. Así, las ratas EC tienen niveles basales más altos de FosB proteína en la NAc, pero menos ΔFosB ARNm Inducción en respuesta a un estresor agudo.

[incremento]FosB es inducido diferencialmente por la cocaína en ratas NAc de EC e IC

Para determinar si las ratas EC e IC responden de manera diferente a la cocaína, estudiamos la regulación de la proteína ΔFosB y el mRNA en NAc de rata después de la autoadministración de cocaína (Figuras 2A, B respectivamente). Un Western blot reveló un importante efecto principal de la cocaína (F(1, 12) = 24.9, P <0.001) y una interacción significativa (F(1,12) = 5.5, P <0.05). La interacción fue tal que ΔFosB aumentó más en ratas IC que en ratas EC (Figura (Figura 2A) .2A). De hecho, después de la autoadministración de cocaína, los niveles de proteína osFosB se elevaron significativamente , solamente en ratas IC. Con respecto a los niveles de ARNm, los resultados de qPCR también revelaron un efecto principal importante de la cocaína (F(1, 26) = 47.1, P <0.001) y efecto principal del enriquecimiento ambiental (F(1, 26) = 13.8, P <0.005). Aunque los niveles generales fueron más bajos en las ratas EC, ambos grupos aumentaron el ARNm de ΔFosB (Figura (Figura 2B2B).

Aunque los datos de proteínas apoyaron la hipótesis original, se formuló la hipótesis de la Figura Figura1G1G que las ratas EC mostrarían menos ARNm inducción que las ratas aisladas en el experimento de cocaína anterior, que no sucedió, probablemente porque la Figura Figura1G1G utilizó un punto de tiempo mínimo de 30 y el experimento de la cocaína utilizó un punto de tiempo de 3. Para interrogar más a fondo la hipótesis del ARNm, se utilizó un punto de tiempo mínimo de 30 para explorar tanto el tratamiento agudo como el repetido de la cocaína como una mejor comparación con la Figura Figura1G.1G. Debido a que la autoadministración aguda de cocaína es problemática por naturaleza (es decir, aprendizaje de adquisición), las ratas EC e IC recibieron días agudos o 9 de inyecciones repetidas no contingentes de IP de cocaína (20 mg / kg). Según la hipótesis, hubo un importante efecto principal del enriquecimiento ambiental (F(1, 17) = 14.3, P <0.005), pero el efecto principal del tratamiento con cocaína (F(2, 17) = 3.4, P = 0.057) y la interacción (F(2, 17) = 3.4, P = 0.055) solo mostró tendencias fuertes con una prueba de dos colas. Sin embargo, dado que teníamos hipótesis direccionales de la figura Figura1G, 1G, estamos extremadamente cómodos en nuestra opinión de que las ratas EC muestran menos inducción que las ratas IC (Figura (Figura 2C2C).

Sobreexpresión de [incremento]FosB en NAc shell imita el fenotipo protector de adicción inducida por enriquecimiento

Para investigar el efecto de ΔFosB en el comportamiento de la rata independiente del enriquecimiento / aislamiento ambiental (es decir, para hacer que estos resultados sean más relevantes para los estudios sin EC / IC), se usó el virus adenoasociado (AAV) para sobreexpresar bF de FOSB bilateralmente en la NAc en Ratas alojadas en pares no enriquecidos. Según nuestros estudios anteriores, la cubierta NAc es más sensible al control relacionado con la depresión y al comportamiento de toma / búsqueda de drogas, por lo que los vectores de AAV se inyectaron en la cubierta NAc en este estudio (Green et al., 2006, 2008, 2010). Figuras 3A, B muestre la inmunohistofluorescencia representativa de ΔFosB con el vector de control (panel A; es decir, la expresión de ΔFosB endógena) y el vector de sobreexpresión de ΔFosB (panel B) en la cáscara de NAc.

Figura 3 y XNUMX  

Sobreexpresión de [incremento]FosB en NAc shell imita el fenotipo de adicción protectora del enriquecimiento ambiental. (A – B) Inmunohistoquímica representativa de ΔFosB para el control de hrGFP (A) y overFosB-sobreexpresión (B) Vectores de AAV. ...

Habiendo validado el título, in vivo expresión y colocación general del vector viral, primero estudiamos el efecto de la sobreexpresión de ΔFosB en modelos de ansiedad. La sobreexpresión de ΔFosB en la capa NAc no fue suficiente para reproducir el efecto ansiogénico del enriquecimiento ambiental en la neofobia de la sacarosa y los paradigmas de defecación inducidos por estrés por frío (datos no mostrados). Además, no hubo efecto en el EPM (datos no mostrados). Debido a que el enriquecimiento ambiental produce un efecto antidepresivo en ratas, a continuación realizamos pruebas relacionadas con la depresión en ratas que expresan en exceso osFosB. De manera similar a los modelos de ansiedad, los resultados mostraron que la sobreexpresión de ΔFosB en la concha NAc no fue suficiente para disminuir el comportamiento de depresión en la prueba de preferencia de sacarosa, la prueba de interacción social o la FST (datos no mostrados).

En el paradigma de enriquecimiento ambiental, las ratas EC exhiben una actividad locomotora basal más baja que las ratas IC (Bowling et al., 1993; Bolos y bardo, 1994; Smith et al. 1997; Green et al. 2003, 2010). Para investigar el efecto de la sobreexpresión de ΔFosB en la cáscara de NAc, se probó la actividad locomotora espontánea para 120 mín. Usando una prueba de dos colas, los resultados revelaron que la sobreexpresión de ΔFosB en la cáscara de NAc produjo una fuerte tendencia a la disminución de la actividad locomotora basal en ratas (Figura (Figura 3C; 3C; t(16) = 1.84, p = 0.084). A pesar de no ser bastante estadísticamente significativo con una prueba de dos colas, estos datos aún son interesantes, ya que se ajustan a nuestra hipótesis direccional explícita basada en Green et al. (2010), que es consistente con el efecto del enriquecimiento ambiental.

IEn contraste con los modelos de depresión y ansiedad, la sobreexpresión de ΔFosB en NAc shell fue capaz de producir un fenotipo similar a EC en múltiples paradigmas de adicción / refuerzo. yoEn la prueba de autoadministración de la pastilla de sacarosa, hubo una interacción significativa entre la sobreexpresión de BFosB y la motivación del hambre de las ratas (F(1, 16) = 7.4, P <0.01). Las ratas que sobreexpresan ΔFosB en el caparazón de NAc tardaron significativamente más, pellets de sacarosa en condiciones motivadas por el hambre (es decir, con 85% de peso corporal libre), pero menos pellets en condiciones de baja motivación (es decir,% de peso libre de 100; Figura Figura 3D), 3D), que imita perfectamente el fenotipo EC (Green et al., 2010).

En el paradigma de enriquecimiento ambiental, las ratas de la CE mostraron una reducción en el comportamiento de búsqueda de cocaína en la extinción y el reintegro inducido por la cocaína (Green et al., 2010). Por lo tanto, el comportamiento de consumo y búsqueda de cocaína se midió en ratas que expresaban FosB utilizando el paradigma de autoadministración de cocaína por vía intravenosa. Como modelo de deseo, el paradigma de la extinción de la cocaína reveló que la sobreexpresión de FosB en la capa de NAc disminuyó el comportamiento de búsqueda de drogas.rF(1, 15) = 6.7, P <0.05; Figura Figura3E) .3E). También hubo un efecto principal significativo de la sesión (F(2, 30) = 74.0, P <0.001). Para el mantenimiento que respondía con un programa FR1, hubo un efecto principal significativo de la dosis (F(7, 105) = 222.6, P <0.001) y una interacción significativa (F(7, 105) = 2.3, P <0.05) en la ingesta acumulada de cocaína. La naturaleza de la interacción fue tal que las diferencias fueron evidentes solo con dosis más altas de cocaína (Figura (Figura 3F) .3F). Finalmente, en el restablecimiento inducido por la cocaína hubo un efecto principal importante de la dosis (F(4, 44) = 15.5, P <0.001) y una tendencia para un efecto principal de la sobreexpresión de ΔFosB usando una prueba de dos colas (F(1, 11) = 4.1, P = 0.067). Sin embargo, dada la hipótesis direccional de Green et al. (2010) y los resultados estadísticamente significativos y consistentes en las figuras 3D, E, F, es probable que ΔFosB disminuya el restablecimiento (Figura (Figura 3G) .3G). La respuesta a la dosis de 10 mg / kg fue significativamente menor para las ratas que expresaban ΔFosB. Los resultados en conjunto indican que la sobreexpresión de ΔFosB en la cáscara NAc de rata disminuye el comportamiento de consumo y búsqueda de cocaína, lo que es consistente con los efectos de comportamiento del enriquecimiento ambiental.

Discusión

La vulnerabilidad de los individuos a la adicción y la depresión se ve fuertemente afectada por factores ambientales. El enriquecimiento ambiental es un paradigma que manipula el entorno de vida de los animales, produciendo efectos protectores contra muchas condiciones psiquiátricas. ΔFosB desempeña un papel clave en la regulación de la función de recompensa en múltiples regiones del cerebro, incluidas la NAc y el cuerpo estriado dorsal (Koob et al., 1998; Sabio, 1998; Wallace et al. 2008; Grueter et al. 2013; Lanzadores et al., 2013). En este proyecto, estudiamos la regulación dinámica de ΔFosB por estrés de restricción y cocaína en ratas enriquecidas y aisladas. Los principales hallazgos de este proyecto son:

(1) las ratas EC tienen niveles elevados de ΔFosB en el NAc al inicio del estudio en comparación con las ratas IC;

(2) solo las ratas IC acumulan proteína ΔFosB adicional con estrés repetido;

(3) las ratas EC muestran una inducción atenuada del ARNm de ΔFosB después del estrés o la cocaína; y

(4) la sobreexpresión de ΔFosB en la NAc de ratas alojadas en pares imita el fenotipo de adicción protectora, pero no el fenotipo de depresión protectora.

Se podría esperar de la literatura publicada, que muestra que los ratones transgénicos que sobreexpresan ΔFosB muestran una mayor sensibilidad a la recompensa de la cocaína y la autoadministración a dosis bajas de medicamentos (Kelz et al. 1999; Colby et al. 2003; Vialou et al. 2010; Robison et al. 2013), que las ratas que sobreexpresan ΔFosB en el experimento actual mostrarían una mayor propensión a la autoadministración y búsqueda de cocaína. ISin embargo, en los experimentos actuales, la sobreexpresión de ΔFosB en la capa de NAc redujo la ingesta de cocaína y buscó cocaína durante la extinción y el restablecimiento, lo que indica una reducción de la motivación para la cocaína. La discrepancia podría deberse al hecho de que los ratones transgénicos expresaron ΔFosB a lo largo de todo el estriado, pero solo en células de dinorfina + (Colby et al., 2003). En el experimento actual, ΔFosB se sobreexpresó a través de un vector AAV que infecta las neuronas dinorfina + y encefalina +. En segundo lugar, el estudio actual se centró en la concha NAc en lugar de toda la región estriatal.

Además del fenotipo de adicción, el enriquecimiento ambiental produce perfiles antidepresivos y ansiogénicos en ratas (Green et al., 2010; Vialou et al. 2010). En el estudio actual, la sobreexpresión de ΔFosB en la NAc no produjo efectos en ninguna de las tres pruebas de depresión o tres pruebas de ansiedad. Si bien hay muchos factores posibles que pueden contribuir a que ΔFosB imite la adicción al enriquecimiento, pero no el fenotipo de la depresión, es posible que la concha NAc sea más dominante para el comportamiento relacionado con la adicción, mientras que el comportamiento relacionado con la depresión puede estar mediado de manera más sólida por otras regiones. Los resultados actuales están en desacuerdo con los estudios en ratones donde la sobreexpresión de ΔFosB en la NAc (donde no se puede distinguir de manera confiable shell contra núcleo) produjo efectos similares a los antidepresivos robustos en varios ensayos de comportamiento (Vialou et al., 2010). Una posible razón es que puede ser más fácil ver el efecto de ΔFosB en los modelos de comportamiento de estrés severo como el estrés de la derrota social. El estudio de sobreexpresión actual investigó el comportamiento depresivo en ausencia de un factor estresante grave.

Consistentemente a lo largo de este estudio, los niveles basales elevados de ΔFosB (por ejemplo, de enriquecimiento, estrés repetido o cocaína) se correlacionaron con una inducción posterior más débil de ΔFosB. Esto puede representar un efecto techo, sin que sea posible una inducción adicional sobre los niveles basales elevados de la proteína. También es posible que los niveles acumulados de ΔFosB puedan retroalimentarse para inhibir la inducción adicional del ARNm de ΔFosB después del estrés o la cocaína como un circuito de retroalimentación negativa. Por ejemplo, ELas ratas C tenían niveles altos de ΔFosB y mostraron una inducción atenuada de ΔFosB después del estrés o la cocaína. Esto subraya la correlación negativa entre los niveles de proteína ΔFosB y su inducción de ARNm. La retroalimentación negativa de ΔFosB acumulado también explica la inducción atenuada de ΔFosB con estrés repetido en ratas IC.

Para ser claros, no hacemos ninguna afirmación de que el paradigma de enriquecimiento ambiental tenga una relevancia de traslación directa, ya que hay muy pocos niños criados en una verdadera privación (debe observarse que la privación socioeconómica no equivale a la privación ambiental). La utilidad de este paradigma es que es una manipulación no genética no quirúrgica, no farmacológica, que produce fenotipos de comportamiento protectores para la adicción y la depresión que pueden explotarse en un entorno controlado por laboratorio como una herramienta científica básica para identificar mecanismos moleculares Resiliencia subyacente a las condiciones psiquiátricas. Investigaciones anteriores han descrito en detalle los fenotipos de comportamiento (Bowling et al., 1993; Bolos y bardo, 1994; Bardo et al. 1995; Green et al. 2002, 2003; El Rawas et al., 2009) y estudios más recientes (Solinas et al., 2009; Green et al. 2010; Lobo et al. 2013), junto con el estudio actual, brindan pistas sobre los mecanismos transcripcionales que subyacen a estos fenotipos de comportamiento. Los genes / proteínas diana transcripcionales corriente abajo que producen los fenotipos protectores se están investigando actualmente (Fan et al., 2013a,b; Lichti et al. 2014).

Nuestra conceptualización del enriquecimiento ambiental es que el enriquecimiento es un continuo con aislamiento en el extremo inferior y enriquecimiento completo en el extremo superior. "El "enriquecimiento total" en este caso se define como un entorno en el que los sujetos están expuestos a la novedad, al contacto social no amenazante con personas específicas, y se les permite espacio y objetos para hacer ejercicio. TEstos tres factores representan la condición compuesta de "enriquecimiento" porque son gratificantes y liberan dopamina en el NAc, y como tal, activan un circuito neurobiológico común (Louilot et al., 1986; Calcagnetti y Schechter, 1992; Crowder y Hutto, 1992; Rebec et al. 1997; Bevins et al. 2002). En esta conceptualización, el aislamiento se considera el grupo de control porque representa la ausencia de la manipulación (es decir, enriquecimiento; Crofton et al., En revisión). Sin embargo, otras conceptualizaciones son posibles. En una conceptualización alternativa, el continuo es el mismo, pero el grupo de aislamiento es el grupo experimental y el grupo enriquecido es el control. yoEn este modelo, privando a los sujetos de enriquecimiento normal. is La manipulación real. IEn este caso, en lugar de decir que el enriquecimiento es protector, uno diría que el aislamiento confiere susceptibilidad. Todavía una tercera conceptualización postula que no hay continuidad y que el enriquecimiento y el aislamiento son dos manipulaciones fundamentalmente diferentes. En esta vista, el enriquecimiento y el aislamiento se deben separar y ambos deben compararse con un control alojado en pares. La falta de un consenso universal en cuanto a la naturaleza del enriquecimiento representa una limitación del paradigma, pero proporciona orientación para estudios futuros. En cualquier caso, los resultados de estos experimentos son firmes, independientemente de la interpretación posterior.

El entorno y las experiencias de vida tienen una gran influencia en el desarrollo y la expresión de muchas afecciones psiquiátricas. La comprensión del mecanismo de la adicción protectora y los fenotipos de depresión del enriquecimiento ambiental aborda una cuestión fundamental en la investigación de los trastornos mentales, a saber, la contribución ambiental a la susceptibilidad o la resistencia a las condiciones psiquiátricas. Este estudio subraya la importancia de ΔFosB en la regulación de las conductas relacionadas con la adicción. En estudios futuros, la acción de ΔFosB y sus efectos inhibidores y de activación en genes específicos específicos deben explorarse más a fondo dentro del modelo de enriquecimiento ambiental.

Financiamiento y divulgación

Yafang Zhang, ninguno; Elizabeth J. Crofton, ninguno; Dingge Li, ninguno; Mary Kay Lobo, ninguna; Fan de Xiuzhen, ninguno; Eric J. Nestler, R37DA007359; Thomas A. Green, DA029091.

Declaracion de conflicto de interes

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pudiera interpretarse como un posible conflicto de intereses.

AGRADECIMIENTOS

Estos experimentos fueron financiados por una subvención del Instituto Nacional sobre el Abuso de Drogas, DA029091 y R37DA007359. Cocaína proporcionada por el Instituto Nacional sobre el Abuso de Drogas.

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