Fuente
El Instituto Nathan Kline, Orangeburg, Nueva York, 10962, EE. UU. [email protected]
Resumen
Los niños y adolescentes están cada vez más expuestos a psicoestimulantes, ya sea de forma ilícita o para el tratamiento de afecciones neuropsiquiátricas comunes, como el trastorno por déficit de atención con y sin hiperactividad. A pesar del uso generalizado de estimulantes psicomotores en grupos de edad más jóvenes, se sabe poco sobre las respuestas neuroadaptativas moleculares crónicas a estos agentes en el cerebro inmaduro. Aquí demostramos que, tras la administración crónica de los psicoestimulantes. cocaína y anfetamina, el factor de transcripción DeltaFosB Está regulado por incremento en el núcleo accumbens. periadolescente ratones pero no en post-destete o adulto ratones. Inducción de DeltaFosB También ocurre exclusivamente en el caudado putamen de periadolescente ratones después de anfetamina administración. Estos resultados demuestran la singular plasticidad en el cerebro adolescente de una molécula crítica que regula la acción psicoestimulante y sugieren que estos cambios neuroadaptativos pueden estar involucrados en la mediación de mejorado Tendencias adictivas en el adolescente en relación con el adulto.
Introducción
Los psicoestimulantes se utilizan en el tratamiento de trastornos infantiles comunes, como el trastorno por déficit de atención con hiperactividad. Además, el abuso de estimulantes, incluidas la anfetamina y la cocaína, es común entre los adolescentes, una edad en la que hay evidencia de un aumento de las tendencias adictivas en relación con los adultos (Estroff et al., 1989; Myers y Anderson, 1991). A pesar de los datos que indican efectos de comportamiento regulados en el desarrollo, se sabe poco sobre las respuestas neuroadaptativas moleculares en el cerebro inmaduro que ocurren durante el tiempo de administración de estos agentes. La cocaína y la anfetamina pueden provocar cambios de comportamiento de larga duración, parcialmente a través de la estimulación de la dopamina D1receptores y aumentos en los niveles de factores de transcripción, incluyendo ΔFosB, en el cuerpo estriado dorsal (es decir, el putamen caudado) y el cuerpo estriado ventral (es decir, el núcleo accumbens) (Chen et al., 1997). El aumento en los niveles de ΔFosB, tal vez a través de la estabilización de los productos proteínicos, se mantiene durante varias semanas después de la exposición crónica a la cocaína o la anfetamina y está regulado, al menos en parte, por la vía de transducción de la señal de dopamina (Chen et al., 1997; Nestler et al., 2001).
El sistema dopaminérgico central de los animales jóvenes está muy en movimiento como resultado de los niveles cambiantes de moléculas críticas durante el desarrollo normal, incluida la dopamina D1receptor DARPP-32 (dopamina y cAMP regulada por fosfoproteína; Mr de 32 kDa) y cAMP (Ehrlich et al., 1990;Teicher et al., 1993; Perrone-Capano et al., 1996; Tarazi et al., 1999;Andersen, 2002). La exposición durante este período a los psicoestimulantes, que mejoran la neurotransmisión dopaminérgica, puede por lo tanto dar lugar a respuestas moleculares cuantitativamente y / o cualitativamente diferentes, incluidas las alteraciones en la expresión de ΔFosB. Para probar la hipótesis de que hay respuestas neuroadaptativas dependientes de la edad durante la exposición crónica a los psicoestimulantes, se analizaron tres grupos de ratones en experimentos en serie: adultos (60 d old al inicio de las inyecciones), periadolescentes (33 d old al inicio de las inyecciones), y post-destete (24 d old al inicio de la inyección). Esta es la primera comparación directa de las respuestas neuroadaptativas moleculares a la exposición psicoestimulante crónica en estos tres grupos de edad. Encontramos que, después de paradigmas de tratamiento idénticos, los ratones periadolescentes muestran una mayor regulación positiva de ΔFosB en respuesta tanto a la cocaína como a la anfetamina.
MATERIALES Y MÉTODOS
Administración de animales y fármacos. Ratones machos CD-1 (Charles River Laboratories, Kingston, NY) se alojaron en un ciclo de luz / oscuridad de 12 hr (6: 00 AM a 6: 00 PM) con ad libitumAcceso a comida y agua. Se permitió que los animales se acomodaran en la habitación de los animales durante un mínimo de 10 d antes del inicio de las inyecciones. Los animales fueron manejados por dos investigadores que realizaron todas las inyecciones en la misma habitación en la que se alojaron los animales. Todos los animales fueron destetados a la edad de 21. Las inyecciones comenzaron en 24 (post-destete), 33 (periadolescente) o 60 (adulto) d de edad. Los animales recibieron 20 mg / kg de cocaína (Sigma, St. Louis, MO), 5 mg / kg de anfetamina (Sigma), o un volumen igual de solución salina por vía intraperitoneal entre 4: 00 y 5: 00 PM diariamente para 7 d. Los animales fueron sacrificados por decapitación después de una breve exposición a CO2 en 10: 00 AM el día después de la inyección final. Los cerebros se extrajeron inmediatamente del cráneo y el putamen caudado y el núcleo accumbens se diseccionaron rápidamente en hielo. Todas las disecciones se realizaron a partir de cortes cerebrales coronales por un solo investigador, y los extractos de proteínas se prepararon a partir de tejido fresco sin congelar. Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales y se ajustaron a los Institutos Nacionales de Salud. Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio.
Análisis de Western Blot. Para los análisis de transferencia Western, se cargaron cantidades iguales de proteína (40 μg para el putamen de caudato y 20 μg para el núcleo accumbens) de cada muestra en cada línea de un gel de 10% SDS-poliacrilamida después de medir las concentraciones de proteína con el ensayo BCA (Pierce Rockford, IL). La carga de proteína igual también se verificó mediante la visualización de la proteína total por Ponceau Red después de la transferencia a nitrocelulosa y / o la transferencia con anticuerpo anti-actina (1: 500; Sigma). El antisuero relacionado con Fos (FRA), que reconoce las isoformas de ΔFosB, fue proporcionado generosamente por el Dr. M. Iadarola (Institutos Nacionales de la Salud, Bethesda, MD) y se utilizó a una concentración de 1: 4000. Estudios previos (Chen et al., 1997; Hiroi et al., 1997), incluida la preadsorción del antisuero FRA con el inmunógeno péptido M, demostró la especificidad de este antisuero. El anticuerpo monoclonal DARPP-32 5a, utilizado en 1: 10,000, fue proporcionado generosamente por los Dres. Hugh Hemmings y Paul Greengard (The Rockefeller University, Nueva York, NY). El anticuerpo transportador de dopamina (DAT) era de Chemicon (Temecula, CA). Las transferencias se hicieron reaccionar con el sistema de quimioluminiscencia NEN-DuPont (Boston, MA) y se expusieron a una película. Los valores densitométricos para la inmunorreactividad de ΔFosB se obtuvieron utilizando ScanAnalysis para Apple (Biosoft, Ferguson, MO). La significación estadística se determinó utilizando un ANOVA de una vía, seguido de post hoc Prueba de comparación múltiple de Tukey o una prueba de Student de dos colas no emparejada t Prueba como se indica en las leyendas de las figuras. Para los experimentos de tratamiento farmacológico, el análisis de cada grupo de edad se realizó en una transferencia separada y, por lo tanto, a cada grupo de solución salina se le asignó arbitrariamente un valor de 100% para la comparación entre grupos de edad. Para los estudios de ontogenia, las muestras de todos los grupos de edad se analizaron juntas en una sola transferencia.
RESULTADOS
La inducción de ΔFosB después de la cocaína y la anfetamina ocurre en el núcleo accumbens de ratones periadolescentes solamente
La expresión de ΔFosB se midió en el núcleo accumbens y el putamen caudado de ratones post-destete, periadolescentes y adultos después de 7 d de la administración de anfetamina o cocaína. El núcleo accumbens es la región del cerebro que se considera más crítica para mediar los efectos gratificantes de los psicoestimulantes. La inmunorreactividad de BFosB (35 kDa) se indujo selectivamente en el núcleo accumbens de animales periadolescentes después de la administración crónica de anfetamina (Fig. 1 A) o cocaína (fig. 1 B). En contraste, los niveles de ΔFosB (35 kDa) no se alteraron significativamente en el núcleo accumbens de animales post-destete o adultos (Fig.1 A,B). En el putamen caudado, los niveles de BFosB (35 kDa) también aumentaron significativamente después de la administración crónica de anfetamina solo en animales periadolescentes (Fig.2 A). Los tres grupos de edad mostraron aumentos significativos en la expresión de ΔFosB (35 kDa) en el putamen caudado después de la administración crónica de cocaína (Fig.2 B). La magnitud de la inducción, sin embargo, fue mayor en los animales periadolescentes, en particular en comparación con los post-destete (Fig. 2 B). Otras isoformas de FRA y Fos no se modificaron en todos los grupos de edad (datos no mostrados).
ImmunFluorreactividad de FosB en el núcleo accumbens después de la administración de un psicoestimulante crónico. Los ratones CD-1 se inyectaron una vez al día con solución salina, anfetamina o cocaína para 7 d a partir del día 24 (P24; post-destete), día 33 (P33; periadolescente), o día 60 (Adulto). Los niveles de inmunorreactividad a ΔFosB (35 kDa) en el núcleo accumbens se muestran después de la anfetamina crónica (A) o cocaína (B) administración. Inmunoblots representativos de la solución salina-S), anfetamina- (A), y la cocaína-C) inyectado después del destete (P24), periadolescente (P33), y ratones adultos se muestran en la paneles superiores. Paneles de fondo mostrar media ± SEM porcentaje de expresión basal de ΔFosB. n Los valores para cada grupo se muestran en el bares . Se encontraron aumentos significativos en ΔFosB en el núcleo accumbens de solo los ratones periadolescentes. *p <0.05; **p <0.01 (Student's t prueba; solución salina vs droga).
ImmunFosB inmunorreactividad en el putamen caudado después de la administración crónica de psicoestimulantes. Los ratones CD-1 se inyectaron una vez al día con solución salina, anfetamina o cocaína para 7 d a partir del día 24 (P24; post-destete), día 33 (P33; periadolescente), o día 60 (Adulto). Los niveles de inmunorreactividad a BFosB (35 kDa) en el putamen caudado se muestran después de la anfetamina crónica (A) o cocaína (B) administración. Inmunoblots representativos de la solución salina-S), anfetamina- (A), y la cocaína-C) ratones periadolescentes inyectados (P33) se muestran en elpaneles superiores. Paneles de fondo mostrar media ± SEM porcentaje de expresión basal de ΔFosB. n Los valores para cada grupo se muestran en el bares . Se encontraron aumentos significativos inducidos por la anfetamina en la inmunorreactividad de ΔFosB en el putamen caudado de ratones periadolescentes solamente (A). La administración crónica de cocaína produjo aumentos de ΔFosB en los tres grupos de edad (B). *p <0.05; **p <0.01 (Student's t prueba; solución salina vs droga).
Los niveles de DAT y DARPP-32 no se alteran después de la cocaína crónica o la anfetamina
Varias moléculas clave expresadas por neuronas dopaminérgicas y / o dopaminoceptivas, incluyendo DARPP-32, la D1 receptor de dopamina, y DAT, contribuyen a las respuestas agudas y crónicas a los psicoestimulantes (Moratalla et al., 1996; Fienberg et al., 1998; Sora et al., 1998; Gainetdinov et al., 2001). Datos de DARPP-32, D1 El receptor y los ratones DAT null y DAT knock-down indican una relación complicada entre sus niveles, la regulación de la actividad dopaminérgica y las respuestas a los psicoestimulantes. De hecho, la inducción de ΔFosB no se produce en ratones nulos DARPP-32 que reciben cocaína crónica (Fienberg et al., 1998). Sin embargo, en ratones adultos, la exposición a 7 d a 20 mg / kg de cocaína no altera los niveles totales de DARPP-32 (Fienberg et al., 1998). La regulación de la proteína DAT no se ha informado previamente en ratones expuestos crónicamente a psicoestimulantes, aunque se han notificado alteraciones en la unión de radioligando al transportador de dopamina después de la exposición a psicoestimulantes en algunas especies (Letchworth et al., 2001). Aquí medimos los niveles de DARPP-32 y la proteína DAT para determinar si la expresión de estas proteínas se altera después de la administración de un psicoestimulante crónico en cualquiera de las tres edades de los ratones. Nuestros hallazgos indican que no hubo cambios significativos en los niveles de DARPP-32 total o DAT en todo el putamen caudado o el núcleo accumbens después de la administración crónica de cocaína o anfetamina en ninguno de los tres grupos de edad (Tabla 1).
Valores de densitometría relativos para DARPP-32 y DAT en P24, P33 y ratones adultos tratados con anfetamina y cocaína en relación con el control, valores salinos, establecidos arbitrariamente en 100%
Los niveles de referencia de ΔFosB están regulados por el desarrollo
Examinamos la ontogenia de ΔFosB porque los ratones adultos con expresión aumentada modificada por ingeniería genética de ΔFosB en el cuerpo estriado tienen una mayor respuesta conductual a los psicoestimulantes (Kelz et al., 1999). Encontramos que los niveles de referencia de ΔFosB fueron significativamente más bajos en animales más jóvenes en comparación con adultos tanto en el putamen caudado como en el núcleo accumbens (Fig.3 A). Niveles de marcadores funcionales del sistema de dopamina, incluyendo DARPP-32 (Ehrlich et al., 1990), DAT (Perrone-Capano et al., 1996), y los receptores de dopamina (Teicher et al., 1993; Tarazi et al., 1999) también están regulados por el desarrollo. Los informes anteriores en ratones CD-1 indican un pico en DARPP-32 estriatal en el día postnatal 28 (P28) (Ehrlich et al., 1990). En ratas putamen putamen y núcleo accumbens, D1los niveles de receptores alcanzan desde P28 a P40 (Teicher et al., 1993; Tarazi et al., 1999), pero no se han realizado estudios similares en el ratón. En contraste, aquí encontramos que los niveles de proteína DAT en el putamen caudado y el núcleo accumbens se mantuvieron constantes entre el día postnatal 24 y la edad adulta (Fig. 3 B). Así, las relaciones relativas entre D1 Los receptores DAT, DARPP-32 y ΔFosB difieren entre los grupos de edad, lo que podría dar lugar a diferencias en D1 Actividad del receptor que podría influir en el grado de inducción de FosB.
Expresión de desarrollo de ΔFosB y DAT. A, Inmunorreactividad de BFosB (35 – 37 kDa) en el putamen caudado y el núcleo accumbens de ratones CD-1 sin tratamiento previo en función de la edad. Inmunoblots representativos se muestran en la paneles superiores.Paneles de fondo Mostrar medias ± SEM de tres ratones por grupo. *p <0.05, adulto frente a P24; #p <0.05, adulto versus P36 (prueba de comparación múltiple de Tukey después de ANOVA). BValores densitométricos de la inmunorreactividad DAT en el putamen caudado y el núcleo accumbens para ratones CD-1 sin tratamiento en función de la edad. Los niveles de DAT no difirieron entre los tres grupos de edad.
DISCUSIÓN
Los efectos del comportamiento de los estimulantes psicomotores dependen de la edad. Las tendencias adictivas son más altas en la adolescencia, cuando el uso de sustancias ilícitas aumenta (Estroff et al., 1989; Myers y Anderson, 1991). De hecho, los niños más pequeños con frecuencia se vuelven disfóricos cuando están expuestos a los psicoestimulantes, mientras que los adolescentes y adultos experimentan euforia (Rapoport et al., 1980). En modelos de roedores, algunos estudios sugieren que los animales periadolescentes tienen niveles de actividad de referencia más altos (Lanza y freno, 1983) y respuestas alteradas a los psicoestimulantes en relación con animales más jóvenes y más viejos. Por lo tanto, muestran menos estimulación locomotora y búsqueda de novedades en respuesta a la administración aguda de dosis bajas de psicoestimulantes en relación con animales de destete y adultos, pero un aumento de la hiperactividad después del tratamiento con dosis altas. Con la administración crónica, la sensibilización a la locomoción inducida por la cocaína es mayor en ratas periadolescentes en comparación con las adultas, mientras que la sensibilización a la estereotipia es menor. Además, los datos de microdiálisis han revelado diferencias entre ratas periadolescentes y adultas con respecto a la sensibilización a la liberación de dopamina inducida por anfetaminas (Laviola et al., 1995; Adriani et al., 1998; Adriani y Laviola, 2000;Laviola et al., 2001). Sin embargo, hay estudios contradictorios en cuanto a la reactividad a largo plazo a la cocaína después de la administración de metilfenidato en ratas adolescentes (Brandon y otros, 2001; Andersen et al., 2002). Estos dos últimos informes resaltan la dificultad de comparar estudios cuando se utilizan diferentes paradigmas experimentales. Los intentos de comparar los estudios de comportamiento en animales más jóvenes se confunden aún más por el uso de diferentes especies y cepas.
El ratón se está convirtiendo en un modelo animal cada vez más importante en el estudio del uso y abuso de los psicoestimulantes, y este es el primer análisis sistemático de las respuestas neuroadaptativas moleculares en tres diferentes edades de desarrollo en ratones o en cualquier otra especie. Estudios previos de los cuales derivamos nuestros paradigmas de tratamiento han demostrado un aumento de ΔFosB en el estriado dorsal y ventral aislado de ratas adultas de tipo salvaje después de la administración crónica de cocaína y anfetamina (Hope et al., 1994; Nye et al., 1995; Turgeon et al., 1997) pero solo en el estriado dorsal y ventral combinado o en el estriado dorsal aislado de ratones adultos de tipo salvaje después de la cocaína crónica (Fienberg et al., 1998; Zachariou et al., 2001).
Ahora demostramos una diferencia espacial y cuantitativa en ΔFosB inducida por psicoestimulantes en ratones post-destete, periadolescentes y adultos. La observación de una mayor respuesta en los animales periadolescentes en comparación con los adultos y post-destete se ve reforzada por el hecho de que la respuesta es similar en los ratones tratados con cocaína y anfetamina. Los psicoestimulantes de la cocaína y la anfetamina aumentan la dopamina sináptica, así como la serotonina y la norepinefrina, pero por diferentes mecanismos. La cocaína se une a los transportadores de plasmalemas para la dopamina, la serotonina y la norepinefrina e inhibe su recaptación en los terminales presinápticos. En contraste, la anfetamina promueve la liberación de estos transmisores. La inducción selectiva de ΔFosB en el núcleo accumbens de solo el grupo de edad periadolescente después de 7 d de la administración de estimulantes y la inducción relativamente mayor de ΔFosB en el putamen caudado puede ser una representación neurobiológica o la causa del aumento previamente observado para abusar de los psicoestimulantes en este grupo de edad (Estroff et al., 1989; Myers y Anderson, 1991) y otros cambios a largo plazo en la expresión génica, que difieren entre los grupos de edad (Andersen et al., 2002). Además, estas diferencias pueden ser reguladas intrínsecamente por alteraciones del desarrollo en los niveles de moléculas clave, incluido el propio ΔFosB. Las posibles implicaciones de las diferencias en los niveles de referencia de ΔFosB entre los grupos de edad son análogas a las propuestas con respecto a las diferencias entre las cepas de rata (Haile et al., 2001). De hecho, anticipamos que se encontrarán diferencias de tensión similares entre los ratones consanguíneos. También es posible que ratones de diferentes edades muestren diferentes adaptaciones moleculares en áreas del cerebro que no sean el núcleo accumbens. Análisis adicionales que utilizan ratones periadolescentes con alteraciones genéticamente modificadas en los niveles de moléculas clave y observaciones de comportamiento concurrentes probarán estas hipótesis.
Notas a pie de página
- Recibido Abril 8, 2002.
- Revisión recibida Agosto 6, 2002.
- Aceptados Agosto 8, 2002.
Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de la Salud / Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y la Beca NS41871 (MEE y EMU) y el Instituto Nacional sobre el Abuso de Drogas P30-DA13429 (EMU).
La correspondencia debe dirigirse a la Dra. Michelle E. Ehrlich, Universidad Thomas Jefferson, Curtis 310, 1025 Walnut Street, Filadelfia, PA 19107. Email: [email protected].
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