Circuito cortical prefrontal para los comportamientos relacionados con la depresión y la ansiedad mediados por colecistoquinina: función de ΔFosB (2014)

J Neurosci. 2014 Mar 12; 34 (11): 3878 – 3887.
doi 10.1523 / JNEUROSCI.1787-13.2014

PMCID: PMC3951691

Vicent vialou,^1,^6,^7,⁸ Rosemary C. Bagot,¹ Michael E. Cahill,¹ Deveroux Ferguson,¹ Alfred J. Robison,² David m. Dietz,³ Barbara Fallon,² Michelle Mazei-Robison,² Stacy m. Ku,¹ Eileen Harrigan,¹ Catherine A. Winstanley,⁴ Tej Joshi,¹ Jian feng,¹ Olivier Berton,⁵ y Eric J. Nestler¹

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Resumen

La disminución de la actividad neuronal del córtex prefrontal medial (mPFC) se asocia con conductas de depresión y ansiedad inducidas por la derrota social en ratones. Sin embargo, los mecanismos moleculares que subyacen a la disminución de la actividad de mPFC y su papel prodepresante siguen siendo desconocidos. Aquí mostramos que la inducción del factor de transcripción ΔFosB en mPFC, específicamente en el área prelímbica (PrL), media la susceptibilidad al estrés. La inducción de BFosB en PrL se produjo de forma selectiva en ratones susceptibles después de estrés por derrota social crónica y sobreexpresión de ΔFosB en esta región, pero no en el área infralímbica (IL) cercana, mayor susceptibilidad al estrés. ΔFosB produjo estos efectos en parte a través de la inducción del receptor de colecistoquinina (CCK) -B: el bloqueo de CCKB en mPFC induce un fenotipo resistente, mientras que la administración de CCK en mPFC imita los efectos ansiogénicos y depresivos del estrés social. Anteriormente, encontramos que la estimulación optogenética de las neuronas mPFC en ratones susceptibles revierte varias anomalías de comportamiento observadas después del estrés crónico de derrota social. Por lo tanto, la hipótesis de que la estimulación optogenética de las proyecciones corticales rescataría los efectos patológicos de CCK en mPFC. Después de la infusión de CCK en mPFC, estimulamos de forma optogenética proyecciones de mPFC a la amígdala basolateral o núcleo accumbens, dos estructuras subcorticales involucradas en la regulación del estado de ánimo. La estimulación de las proyecciones de corticoamígala bloqueó el efecto ansiogénico de CCK, aunque no se observó ningún efecto sobre otros síntomas de derrota social. A la inversa, la estimulación de las proyecciones de corticoacumbenos revirtió la evitación social inducida por CCK y los déficits de preferencia de sacarosa, pero no los efectos de tipo ansiogénico. En conjunto, estos resultados indican que las deficiencias de comportamiento inducidas por el estrés social están mediadas en parte por adaptaciones moleculares en mPFC que involucran a ΔFosB y CCK a través de proyecciones corticales a objetivos subcorticales distintoss.

Palabras clave: accumbens, amígdala, ansiedad, CCK, depresión, mPFC

Introducción

Varias regiones del cerebro límbicas anatómica y funcionalmente interconectadas, incluida la corteza prefrontal medial (mPFC), el hipocampo, la amígdala y el núcleo accumbens (NAc), están implicadas en la mediación de síntomas clave de depresión y ansiedad (Bremner, 1999; Drevets, 2001; Keedwell et al., 2005; Mayberg et al., 2005; Bremner, 2006, 2007; Krishnan y Nestler, 2008; Feder et al., 2009). Por ejemplo, la ausencia de retroalimentación cortical a la amígdala se correlaciona con emociones disfóricas y vuelve a niveles normales después de un tratamiento exitoso. Los efectos antidepresivos de la estimulación cerebral profunda de la corteza cingulada subgenual, un área de mPFC, están asociados con la restauración de la actividad cerebral tanto cortical como subcortical a niveles normales (Mayberg et al., 2005; Nahas et al., 2010). De manera similar, la estimulación cerebral profunda de NAc es antidepresiva y ansiolítica y se correlaciona con un metabolismo alterado en NAc, amígdala y mPFC (Schlaepfer et al., 2008; Bewernick et al., 2010; Grubert et al., 2011). Estos datos apoyan una hipótesis de la red neural de trastornos del estado de ánimo en los que los tratamientos con antidepresivos, independientemente de los mecanismos, normalizan la actividad en los circuitos subcorticales corticales y hiperactivos poco activos (Kennedy et al., 2001; Mayberg et al., 2005; Kennedy y Giacobbe, 2007; Fales et al., 2008; Fales et al., 2009; Leistedt y Linkowski, 2013).

Los modelos animales que involucran exposición crónica al estrés físico o psicológico afectan la estructura y función de las neuronas en mPFC (Radley et al., 2006), amígdalaAkirav y Maroun, 2007), hipocampoSurget et al., 2011), y NAc (Vialou et al., 2010; Christoffel et al., 2011). Estrés social crónico por estrés, un modelo de depresión etológicamente válido (Berton et al., 2006), disminuye la actividad neuronal de mPFC como se infiere a partir de la expresión reducida de Zif268 y c-Fos (Covington et al., 2005; Covington et al., 2010). Además, la estimulación optogenética de mPFC revierte estos déficits y ejerce efectos similares a los antidepresivos (Covington et al., 2010), confirmando la importancia de mPFC en fenómenos relacionados con el estado de ánimo. TEl roedor mPFC, como en primates, controla el comportamiento emocional en parte a través de proyecciones a la amígdala basolateral (BLA) y NAc (Vogt et al., 1992; Barbas y Blatt, 1995; Heidbreder y Groenewegen, 2003). Sin embargo, los mecanismos moleculares que median este papel de mPFC siguen siendo desconocidos.

El presente estudio se centró inicialmente en ΔFosB, un factor de transcripción estable que se induce en NAc por el estrés crónico de la derrota social donde se opone a la susceptibilidad al estrés. (Vialou et al., 2010). Realizamos un mapeo a nivel cerebral de la inducción de ΔFosB después del estrés por derrota y encontramos, similar a estudios anteriores (Perrotti et al., 2004; Nikulina et al., 2008; Lehmann y Herkenham, 2011), inducción robusta en mPFC. Sorprendentemente, encontramos que tal inducción de ΔFosB en mPFC promueve la susceptibilidad al estrés. Identificamos el receptor de colecistoquinina (CCK) -B como un objetivo molecular de ΔFosB en mPFC, donde la neurotransmisión CCKergic se ha implicado tanto en efectos ansiogénicos como depresogénicos del estrés social (Becker et al., 2001, 2008). Encontramos que la actividad de CCK en mPFC es necesaria y suficiente para los efectos de ansiedad y depresión del estrés social. Además, mediante el uso de enfoques optogenéticos, demostramos acciones específicas de CCK en subcircuitos de mPFC: CCK en proyecciones de mPFC-BLA media los síntomas de ansiedad, mientras que CCK en proyecciones de mPFC-NAc media los síntomas de depresión.

Materiales y Métodos

Experimento 1: mapeo a nivel cerebral de la inducción de ΔFosB por estrés crónico de derrota social.

Ratones machos C57BL / 6J de ocho semanas de edad fueron sometidos a estrés por derrota social crónica durante 10 días consecutivos como se describió anteriormente (Berton et al., 2006; Krishnan y otros, 2007; Vialou et al., 2010) (ver Tabla 1; A). Brevemente, cada ratón se expuso a un ratón reproductor CD1 retirado, agresivo y desconocido para 5 min por día. Después de la interacción directa con el agresor CD1 (5 min), los animales se colocaron en un compartimento adyacente de la misma jaula para la siguiente 24 h con contacto sensorial, pero no físico. Los animales de control se alojaron en jaulas equivalentes pero con miembros de la misma cepa. Las pruebas de interacción social se realizaron 24 h después del último día de la derrota. La evitación social a un ratón macho CD1 desconocido se evaluó de acuerdo con los protocolos publicados. Se midió el tiempo transcurrido en la "zona de interacción" (un corredor de 8-cm de ancho que rodea la jaula). La segregación de ratones derrotados en subpoblaciones susceptibles y resilientes se realizó como se describió anteriormente (Krishnan y otros, 2007; Vialou et al., 2010). Debido a que la mayoría de los ratones de control pasan más tiempo interactuando con un objetivo social que con un recinto de objetivo vacío, se usa una relación de interacción de 100 (el mismo tiempo pasado en la zona de interacción en presencia o ausencia de un objetivo social) como límite: los ratones con puntuaciones <100 se etiquetan como "susceptibles" y aquellos con puntuaciones ≥100 como "resistentes". Amplios análisis de comportamiento, bioquímicos y electrofisiológicos respaldan la validez de estas distintas subpoblaciones susceptibles y resistentes (Krishnan y otros, 2007; Wilkinson y otros, 2009; Vialou et al., 2010).

Número medio (± SEM) de núcleos inmunorreactivos para FosB por mm² en las áreas del cerebro de los ratones control, susceptibles y resistentes 24 h después del estrés crónico (10 d) social

Figura 1.

La inducción de BFosB en mPFC promueve la susceptibilidad al estrés. AFotomicrografías representativas de la inmunohistoquímica ΔFosB en mPFC 24 h después del último episodio de derrota social 10. B, La inducción de ΔFosB no ocurre en GABAergic ...

Justo después de la prueba de interacción social, los ratones se anestesiaron y se perfundieron intracardialmente con 4% paraformaldehído / PBS. Recuentos de células para ΔFosB⁺ Las neuronas en NAc se realizaron como se describió anteriormente (Vialou et al., 2010). Los cerebros se crioprotegieron con 30% de sacarosa y las secciones coronales (30 μm) se cortaron en un microtomo de congelación y se procesaron para inmunohistoquímica. Las secciones de flotación libre se preincubaron en un tampón de bloqueo que contiene 0.3% Triton y 3% normal de cabra. ΔFosB se detectó usando anticuerpos policlonales de conejo generados contra la porción N-terminal de la proteína (1 / 1000 Santa Cruz Biotechnology, catálogo # sc-48) en el mismo tampón, luego se procesó con anticuerpos IgG de cabra biotinilados y avidina-biotina Método del complejo de peroxidasa con DAB como sustrato (Vector Laboratories). Los tiempos de incubación de diaminobenzidina se mantuvieron constantes para todas las condiciones (100 s). Las rebanadas se montaron, deshidrataron y cubrieron. Las células inmunopositivas FosB mostraron una tinción marrón específica en el núcleo y se cuantificaron mediante un observador ciego a las condiciones de tratamiento utilizando un microscopio (aumento de 20 ×). Se seleccionaron tres secciones de cerebro seleccionadas que abarcan cada área del cerebro por ratón para la cuantificación. La segregación anatómica de cada región del cerebro se realizó comparando la sección con el atlas de cerebro de ratón Paxinos. Las condiciones para la inmunohistoquímica se optimizaron para reducir los niveles de fondo al mínimo, permitiendo la correcta identificación de las células positivas para ΔFosB. Los valores medios se calcularon para cada animal y se consideraron como una observación individual para el análisis estadístico. Aunque el anticuerpo utilizado reconoce tanto el ΔFosB como el FosB de longitud completa, sabemos por transferencia de Western que solo el ΔFosB es detectable en las condiciones estudiadas (Perrotti et al., 2004; Vialou et al., 2010).

Experimento 2: identificación del fenotipo neuronal ΔFosB inducido por estrés social en mPFC.

Para examinar la expresión de ΔFosB en las neuronas GABAérgicas corticales, utilizamos tejidos de ratones GAD2-tdTomato expuestos a estrés por derrota social crónica y teñimos para ΔFosB como se describe anteriormente (ver B). Los ratones se generaron criando ratones knockin GAD2-Cre (Gad2tm2 (cre) Zjh / J; número de stock JAX 010802) (Taniguchi et al., 2011) con (B6.Cg-Gt (ROSA) 26Sortm9 (CAG-tdTomato) Hze / J; número de inventario de JAX 007908) que llevan el tdTomato controlado por parada floxed (variante RFP).

Experimento 3: efectos sobre el comportamiento de la sobreexpresión de ΔFosB en la corteza prelímbica (PrL) e infralímbica (IL).

La cirugía estereotáxica se realizó en ratones machos adultos (8 semanas) para inyectar HSV-ΔFosB-GFP o HSV-GFP en las regiones PrL o IL de mPFC. Brevemente, los ratones se anestesiaron utilizando una mezcla de ketamina (10 mg / kg) y xilazina (1 mg / kg), y se utilizaron las siguientes coordenadas estereotáxicas para el suministro viral para PrL: 1.8 mm (anterior / posterior), 0.65 mm (lateral) ), −2.2 mm (dorsal / ventral); y para IL: 1.9 mm (anterior / posterior), 0.75 mm (lateral), −2.8 mm (dorsal / ventral) en un ángulo de 10 ° desde la línea media (con respecto a bregma). Se administró un total de 0.5 μl de virus purificado bilateralmente durante un período de 5 min (0.1 μl / min) seguido de 5 min de descanso. Los sitios de inyección viral se confirmaron utilizando métodos histológicos estándar (ver C). Aunque no es posible apuntar selectivamente PrL versus IL en ratones con perfecta precisión, los datos en Figura 1 y XNUMXC ilustran que es muy factible apuntar predominantemente a una región u otra. De hecho, los distintos efectos de comportamiento obtenidos de las dos regiones (ver Resultados) confirman este enfoque. El primer lote de ratones se utilizó exclusivamente en un experimento de derrota social submáxima (ver D). Tres días después de la cirugía, los ratones se sometieron a dos derrotas consecutivas en el mismo día y luego se probaron para la interacción social 24 h más tarde. Este procedimiento de derrota submáxima ha sido validado previamente para revelar fenotipos de prosusceptibilidad después de manipulaciones genéticas (Krishnan y otros, 2007; Vialou et al., 2010).

Se usó un segundo lote de ratones para evaluar los comportamientos depresivos y de ansiedad basales (ver E – J). Un día después de la cirugía, los ratones se habituaron con una solución de sacarosa 1% (w / v). Al día siguiente, los ratones podían elegir entre una botella de agua y una botella de solución de sacarosa 1%, cambiada diariamente. La ingesta de solución de sacarosa para 24 h se midió durante el cuarto y quinto día después de la cirugía y se expresó como un porcentaje de la cantidad total de líquido ingerido. Los ratones se analizaron en el campo abierto (día 3), elevado más laberinto (día 4), interacción social (día 5 por la mañana) y pruebas de natación forzada (día 5 por la tarde) según los protocolos publicados (Vialou et al., 2010). Hemos encontrado que, con este orden de prueba, los resultados de las pruebas posteriores no se ven afectados por las anteriores (Krishnan y otros, 2007). La actividad de los ratones en el campo abierto se registró para 5 min utilizando un sistema de seguimiento de video (Ethovision) en condiciones de luz roja. El laberinto elevado y elevado consistía en dos pistas de intersección rectas ubicadas a 60 cm por encima del piso y divididas en dos brazos abiertos y dos cerrados. Los ratones se colocaron individualmente en el centro del laberinto y se les permitió explorar libremente cada brazo durante un período de 5 min. En el campo abierto y las pruebas de laberinto más elevado, el tiempo pasado en el centro y los brazos abiertos, respectivamente, se usó como un índice inverso de respuestas relacionadas con la ansiedad. Se realizó una prueba de natación forzada de un día por un período de 5 min. El aumento del tiempo de inmovilidad durante la prueba de natación forzada se interpretó como un comportamiento similar al de la prodepresión. Esta prueba diurna 1 se ha utilizado ampliamente en ratones y se ha validado como una medida de validez predictiva, ya que los fármacos antidepresivos reducen los tiempos de inmovilidad.

Finalmente, a un grupo separado de ratones se les inyectó intra-mOFC con HSV-ΔFosB y se probó la interacción social después de una derrota submáxima (ver K).

Los vectores de HSV se obtuvieron de Rachael Neve (Instituto de Tecnología de Massachusetts). Los genes de interés (ΔFosB y GFP) están bajo un promotor de CMV. Estos vectores se han validado ampliamente en publicaciones anteriores (por ejemplo, Maze et al., 2010).

Experimento 4: efectos del estrés social crónico en los niveles de receptores CCKB en mPFC.

En 24 h después de la prueba de interacción social, los cerebros se extrajeron rápidamente y se cortaron en serie, y la mPFC se diseccionó rápidamente y se congeló en hielo seco (ver A,B). El aislamiento de ARN, la qPCR y el análisis de datos se realizaron como se describió anteriormente (Maze et al., 2010; Vialou et al., 2010). El ARN se aisló con reactivo de TriZol (Invitrogen) y se purificó adicionalmente con micro kits RNAeasy de QIAGEN. Se determinó que todas las muestras de ARN tenían valores 260 / 280 y 260 / 230 ≥1.8. La transcripción inversa se realizó utilizando iScript (Bio-Rad). qPCR utilizando SYBR Green (Quanta) se realizó con un sistema de PCR 7900HT RT de Applied Biosystems con los siguientes parámetros de ciclo: 2 min a 95 ° C; 40 ciclos de 95 ° C para 15 s, 59 ° C para 30 s, y 72 ° C para 33 s; y calentamiento gradual a 95 ° C para generar curvas de disociación para la confirmación de productos de PCR individuales. Los datos fueron analizados comparando C_t valores de la condición de tratamiento (ratones susceptibles o resistentes frente a controles, o HSV-ΔFosB frente a HSV-GFP) con el ΔΔC_t método (Tsankova et al., 2006). Los cebadores de qPCR son los siguientes: ΔFosB, adelante, AGGCAGAGCTGGAGTCGGAGAT y reverso, GCCGAGGACTTGAACTTCACTCG; CCKB, adelante, ACCCTTTATGCGGTGATCTTTC y reverso, ATGAGCACGTTTCCGCCAA; CCK, adelante, AGCGCGATACATCCAGCAG y reverso, ACGATGGGTATTCGTAGTCCTC; GAPDH, adelante, AGGTCGGTGTGAACGGATTTG y reverso, TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA.

Figura 2.

El bloqueo del receptor de CCKB tiene un efecto antidesresante, similar al de los antidepresivos. A, La derrota social disminuye los niveles de receptores CCKB en mPFC solo en ratones resistentes (n = 8 – 10). *p <0.05, en comparación con el control (ANOVA de una vía). **p <0.05 ...

Experimento 5: efectos de ΔFosB en los niveles de receptor CCKB y cFos.

Los ratones se inyectaron intra-PrL con HSV-ΔFosB. En 72 h después de la cirugía, en el pico de sobreexpresión viral, los sitios de inyección se diseccionaron bajo un microscopio fluorescente (ver C). El aislamiento de ARN, la qPCR y el análisis de datos se realizaron como se describió anteriormente. Los cebadores qPCR son los siguientes: c-fos, forward, AATCCGAAGGGAACGGAATAAGA y reversa, TGCAACGCAGACTTCTCATCT.

Experimento 6: efectos del bloqueo de ΔFosB en los niveles de receptores de CCKB inducidos por el estrés y la resiliencia.

Los ratones adultos fueron inyectados bilateralmente con HSV-GFP o HSV-ΔJunD en PrL (ver D – F). ΔJunD es un mutante truncado N-terminal de JunD que actúa como un antagonista negativo dominante de ΔFosB. Los ratones fueron sometidos a una derrota social dos veces al día por 5 d. Este protocolo acelerado de derrota social, acortado para coincidir con el período de máxima expresión del transgén del VHS, se ha utilizado anteriormente y se ha demostrado que induce niveles máximos de evitación social (Covington et al., 2011). A las 24 h del último episodio de estrés, los ratones fueron decapitados sin anestesia para evitar los efectos de los anestésicos en los niveles de proteínas neuronales. El tejido infectado se eliminó en inhibidores de proteasa (Roche) y fosfatasa (Sigma-Aldrich) que contenían PBS usando un punzón de calibre 15 y se congeló inmediatamente en hielo seco. Las muestras se homogeneizaron mediante sonicación ligera en tampón RIPA modificado: base Tris 10 mm, cloruro sódico 150 mm, EDTA 1 mm, SDS al 0.1%, Triton X-1 al 100%, desoxicolato sódico al 1%, pH 7.4 e inhibidores de proteasa y fosfatasa como encima. Después de la adición del tampón de Laemmli, las proteínas se separaron en geles de gradiente de poliacrilamida al 4–15% (Criterion System; Bio-Rad), y se realizó la transferencia Western utilizando el sistema Odyssey (Li-Cor) de acuerdo con los protocolos del fabricante. Las membranas se transfirieron con anticuerpo del receptor CCKB (1/1000, Acris, catálogo nº AP01421PU-N). A otro grupo de ratones se les inyectó AAV-ΔJunD o AAV-GFP en PrL y luego, 5 semanas después de la cirugía para permitir la máxima expresión transgénica, los ratones se sometieron al protocolo de derrota submáxima. Fueron probados para la interacción social 24 h después de la última derrota.

Experimento 7: efectos de intra-mPFC CI-988, un antagonista de CCKB, en la evitación social inducida por el estrés social y la anhedonia.

Cánula bilateral (distancia de la cánula 1.0 mm a la cánula, 1.8 mm anterior, inyector -2.2 mm dorsal / ventral) dirigida a mPFC en ratones susceptibles (ver G,H). Una semana después de la cirugía, se inyectó 10 ng de CI-988 directamente en mPFC, apuntando principalmente a PrL. Los ratones fueron luego evaluados por su comportamiento de interacción social. La preferencia de sacarosa se midió para el 24 h restante. Se disolvió CI-988 (Tocris Bioscience) en solución salina, se dividió en alícuotas y se congeló. La dilución final se preparó el día del experimento. Se realizó un experimento adicional en ratones susceptibles con CI-988 administrado por vía intraperitoneal (2 mg / kg) 30 min antes de la prueba de interacción social.

Experimento 8: efectos del agonista de CCKB sobre la susceptibilidad al estrés social y la reversión mediante la estimulación optogenética de las proyecciones de mPFC a BLA o NAc.

Se inyectó AAV-CaMKII-ChR2-EYFP o AAV-CaMKII-EYFP en el mPFC derecho, apuntando de nuevo principalmente a PrL (ver A – G). Cinco semanas después, se implantaron fibras ópticas en NAc derecha (1.4 anterior / posterior, 2.6 lateral, −4.7 dorsal / ventral en un ángulo de 25 ° desde la línea media) o BLA (−1.6 anterior / posterior, 3.1 lateral, −4.7 dorsal / ventral sin ángulo desde la línea media). Durante el mismo procedimiento quirúrgico, se implantaron cánulas bilaterales en mPFC (ver arriba). Se aseguraron cánulas y fibras al cráneo con cemento dental. A los ratones se les permitió a 1 semana recuperarse antes del inicio de los experimentos de comportamiento. Los ratones se sometieron a una derrota submáxima, luego se probaron 24 h más tarde para la interacción social, seguidos directamente por laberinto más elevado y para la preferencia de sacarosa para el 24 h restante. En 30 min antes de la prueba de interacción social, la mitad de los ratones se infundieron con CCK-8 (10 ng) en mPFC mientras que la otra mitad recibió el vehículo (solución salina). Los ratones se analizaron en pares (un ratón tratado con un vehículo y un ratón tratado con CCK-8, con AAV-GFP o AAV-ChR2). CCK-8 (Sigma) se disolvió en solución salina, se dividió en alícuotas y se congeló. La dilución final se preparó el día del experimento.

Figura 3.

La susceptibilidad al estrés inducido por CCK-8 depende de proyecciones corticales específicas. A, En 24 h después de la derrota social submáxima y 30 min después de la infusión de CCK-8, las regiones de proyección de mPFC se estimularon con láser durante una prueba de interacción social. Infusión CCK-8 ...

Se realizaron estimulaciones ópticas según protocolos publicados (Covington et al., 2010). Las fibras ópticas (Thor Laboratories) se implantaron crónicamente y se conectaron a través de un adaptador FC / PC a un diodo láser azul 473 nm (Crystal Lasers, BCL-473 – 050-M). Se utilizó un estimulador (Agilent, #33220A) para generar pulsos de luz azul. Durante todas las estimulaciones, 40 ms ráfagas de 100 Hz (9.9 ms picos de ancho) impulsos de luz azul se entregaron cada 3 s a las regiones terminales en BLA o NAc durante la duración de la prueba de interacción social solamente, para imitar un patrón de cortical similar al estallido actividad. La intensidad de la luz de la fibra óptica se verificó antes de cada uso, utilizando un sensor de luz (Thor Laboratories, S130A), y la intensidad de la luz fue de ∼15 mW. Este protocolo de estimulación, que fue validado electrofisiológicamente anteriormente (Covington et al., 2010), no indujo convulsiones basadas en observaciones de comportamiento y la ausencia de expresión de c-Fos fuera de las regiones estimuladas optogenéticamente (Covington et al., 2010).

Experimento 9: efectos del agonista de CCKB sobre la actividad neuronal de mPFC medida por los niveles de ARNm de c-Fos.

Se implantaron cánulas bilaterales en ratones adultos dirigidos a la mPFC (ver H). Después de una semana de descanso, los ratones se sometieron a una derrota submáxima y se infundieron con CCK-8 24 h más tarde. Los punzones de mPFC se tomaron 30 min después de la infusión del fármaco y las muestras se prepararon para el análisis de ARNm como se describió anteriormente.

Alojamiento de animales.

Se utilizaron ratones machos C57BL / 6J de ocho semanas de edad (The Jackson Laboratory). Todos los ratones se habituaron a la instalación de animales durante al menos 1 semana antes de las manipulaciones experimentales y se mantuvieron a 23 ° C – 25 ° C en un ciclo de luz / oscuridad 12 h (las luces se encienden en 7: 00 AM) con ad libitum Acceso a comida y agua. Los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices de la Sociedad de Neurociencias y el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en la Escuela de Medicina Icahn en Mount Sinai.

Análisis estadístico.

Los datos mostrados se expresan como media ± SEM (representados como barras de error). Se usaron ANOVA de una vía para comparar medias entre ratones control, susceptibles y resistentes en análisis inmunohistoquímicos, bioquímicos y de comportamiento. Se utilizaron ANOVA de una vía para comparar las medias entre los controles de GFP y la sobreexpresión de ΔFosB en PrL o IL en las pruebas de campo abierto, de laberinto más elevado, de nado forzado y de preferencia de sacarosa. Se utilizaron ANOVA de dos vías para comparar las medias entre los controles de GFP, ΔFosB-PrL y ΔFosB-IL en la prueba de interacción social. Se utilizaron ANOVA de dos vías para comparar los efectos de CCK-8 con o sin estimulación optogenética en todos los experimentos conductuales, así como el efecto de la sobreexpresión de ΔFosB o la infusión de CI-988 en la evitación social. Cuando sea apropiado, post hoc Los análisis se realizaron con un Bonferroni. post hoc prueba. Del estudiante t Las pruebas se usaron para comparar las medias del efecto de la infusión de CI-988 en la preferencia de sacarosa y las pruebas de natación forzada, y de CCK-8 en c-Fos los niveles de mRNA. Las diferencias entre las condiciones experimentales se consideraron estadísticamente significativas cuando p ≤ 0.05.

Resultados

Mapeo cerebral de la inducción de ΔFosB por estrés crónico de derrota social

Primero investigamos la inducción de osFosB por inmunohistoquímica en ratones control, susceptibles y resistentes, después de un curso de estrés por derrota social crónico (10 d), con un enfoque en las regiones del cerebro anterior y del cerebro medio implicadas anteriormente en las respuestas al estrés. Los animales fueron analizados 24 h después del último episodio de derrota. El estrés social crónico induce ΔFosB en numerosas áreas del cerebro con patrones distintos observados entre ratones resistentes y susceptibles. Como se muestra en Tabla 1 y Figura 1 y XNUMXA, IL, BLA, giro dentado del hipocampo, cuerpo estriado dorsal y núcleo NAc mostraron activación preferencial en ratones resistentes; dichos resultados en NAc son consistentes con los hallazgos publicados (Vialou et al., 2010). En sorprendente contraste, los ratones susceptibles mostraron una mayor inducción en PrL, tabique lateral y núcleo de lecho de la estría terminal. Varias regiones del cerebro mostraron una inducción de ΔFosB comparable en ratones susceptibles y resistentes; estos incluían la corteza orbitofrontal (OFC, otra área de PFC), concha NAc, hueso dorsal y gris periacueducal (PAG).

Para identificar el subtipo neuronal que muestra la inducción de BFosB en las regiones corticales, los ratones GAD2-tdTomato se sometieron a estrés crónico de derrota social. La inmunorreactividad de BFosB en ratones susceptibles fue indetectable en neuronas GABAérgicas ( B), que confirma hallazgos anteriores de la inducción específica de ΔFosB en neuronas piramidales corticales después de otras formas de estrés crónico (Perrotti et al., 2004). En ratones de control no vencidos, Los niveles iniciales de ΔFosB en las regiones del cerebro fueron similares a los informados en estudios previos (Perrotti et al., 2004, 2008) con niveles basales mucho más altos en el estriado dorsal y NAc en comparación con cualquier otra región, con la única excepción del giro dentado, que mostró niveles comparables con los de las regiones estriatales (Tabla 1).

ΔFosB en mPFC promueve la susceptibilidad al estrés

Para hacer un seguimiento de estos hallazgos, nos centramos en PrL porque ya habíamos demostrado que la activación optogenética de esta región ejercía efectos antidepresivos en el paradigma de la derrota social (Covington et al., 2010). Para probar las consecuencias funcionales de la inducción de ΔFosB en esta región del cerebro, hemos sobreexpresado viralmente ΔFosB en PrL de ratones de control ( C) y los sometió a un curso submáximo de estrés por derrota social, que no induce a la evitación social en animales normales. Los ratones que sobreexpresan ΔFosB en PrL fueron más susceptibles a la derrota social que los ratones de control con inyección de GFP en que mostraron una conducta de evitación social después de la derrota social submáxima (Interacción, F_(2,38) = 2.847, p > 0.05, efecto principal del virus, F_(2,38) = 6.013, p <0.05; Prueba posterior de Bonferroni t = 2.447, p <0.05) ( D). Estos ratones también mostraron una mayor inmovilidad en una prueba de natación forzada durante el día 1 (F_(2,31) = 6.448, p <0.05; Prueba posterior de Bonferroni t = 3.518, p <0.05) ( E), un efecto opuesto al producido por los fármacos antidepresivos. En contraste, la sobreexpresión de ΔFosB en PrL no alteró varias medidas de línea de base del comportamiento similar a la ansiedad, la preferencia de sacarosa, la interacción social o la actividad locomotora ( F – J). Juntos, estos hallazgos apoyan la hipótesis de que la inducción selectiva de ΔFosB en PrL de ratones susceptibles contribuye a la vulnerabilidad al estrés y sus consecuencias perjudiciales. En contraste, la sobreexpresión de ΔFosB en otra región de mPFC, IL, no tuvo ningún efecto en las conductas emocionales de referencia ni en las respuestas al estrés por derrota social ( DJ), mientras que la sobreexpresión de BFosB en la OFC medial tendió a promover la resistencia a la derrota social crónica, aunque este efecto no alcanzó significación estadística (Interacción, F_(1,31) = 1.741, p > 0.05, efecto principal del tiempo de interacción, F_(1,31) = 14.170, p <0.05; Prueba posterior de Bonferroni t = 3.860, p <0.05 dentro del grupo GFP; t = 1.960, p <0.05 dentro del grupo ΔFosB; efecto del virus, t = 2.447, p <0.05) ( K).

ΔFosB promueve la inducción de CCKB en mPFC

Un gran cuerpo de evidencia apoya la idea de que CCK, un neuropéptido abundante en el cerebro, desempeña un papel esencial en los mecanismos neurobiológicos del estrés y la ansiedad. (Rotzinger y Vaccarino, 2003). En particular, la liberación de CCK en mPFC durante el estrés social en ratas se asocia con conductas relacionadas con la ansiedad (Becker et al., 2001). Aunque la participación de CCK en la depresión humana aún no está clara, la evidencia reciente apunta a su papel en el comportamiento de depresión inducida por la derrota social en ratas (Becker et al., 2008). Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que las alteraciones en los niveles de CCK o su receptor CCKB (también conocido como CCK2) en mPFC podrían contribuir a las diferencias entre ratones susceptibles y resistentes. En 48 h después del episodio final de la derrota, los niveles de ARNm de CCKB se redujeron solo en mPFC de ratones resistentes (F_(2,18) = 8.084, p <0.01; Post prueba de Bonferroni, t = 3.104, p <0.05 frente al control; t = 5.113, p <0.01 vs susceptible) ( A). No se observaron diferencias en los niveles de ARNm de CCK en ratones susceptibles o resistentes (datos no mostrados). Observamos un aumento en ΔFosB Los niveles de ARNm solo en ratones susceptibles son consistentes con los datos de proteínas reportados anteriormente (F_(2,18) = 5.246, p <0.01; Prueba posterior de Bonferroni t = 3.336, p <0.05 frente a susceptibles; t test t₍₁₂₎ = 2.138, p <0.05 vs control) ( B). Porque ΔFosB regula la transcripción de numerosos genes (McClung y Nestler, 2003; Winstanley et al., 2007), consideramos la posibilidad de que pueda regular la expresión del ARNm de CCKB. Para abordar esta pregunta, primero sobreexpresamos ΔFosB en PrL y encontramos que esta manipulación regula al alza los niveles de ARNm de CCKB en esta región (t₍₁₂₎ = 2.012, p <0.05 frente a GFP) ( C). Curiosamente, también encontramos una disminución en c-Fos los niveles de ARNm después de la sobreexpresión de ΔFosB (t₍₁₁₎ = 3.382, p <0.01) ( C). TEstos hallazgos sugieren además que la inducción de ΔFosB en PrL de ratones susceptibles es un mecanismo activo de susceptibilidad al prevenir la supresión de CCKB observada en ratones resilientes.

Para fortalecer aún más estas observaciones, sobreexpresamos ΔJunD, un socio de unión de ΔFosB que carece de su dominio de transactivación y por lo tanto actúa como un antagonista negativo dominante, y determinamos su efecto en la expresión de CCKB inducida por el estrés. Confirmamos que el estrés crónico por derrota social incrementó los niveles de proteína CCKB en PrL de ratones susceptibles (t test t₍₁₂₎ = 2.289, p <0.05 vs control) ( D,E). Además, dicha inducción fue completamente bloqueada por la sobreexpresión de ΔJunD en esta región (F_(2,20) = 6.306, p <0.01, prueba posterior de Bonferroni t = 3.615_, p <0.01) ( D,E), apoyando la hipótesis de que ΔFosB media la expresión de CCKB inducida por el estrés. Además, el bloqueo de la actividad de ΔFosB en PrL, a través de la expresión ΔJunD local, también promovió la capacidad de recuperación para vencer el estrés (t test t₍₁₆₎ = 2.114, p = 0.05 vs control) ( F). El mecanismo subyacente a la regulación a la baja de CCKB en ratones elásticos aún no se ha dilucidado.

El papel de CCKB en la resiliencia y la susceptibilidad al estrés

Para probar directamente el papel de la regulación de CCKB en PrL en la mediación de la susceptibilidad frente a la resiliencia, infundimos el antagonista selectivo del receptor CCKB CI-988 (10 ng) directamente en esta región del cerebro de ratones susceptibles. CI-988 antagoniza eficazmente los receptores CCKB in vivo porque exhibe afinidad nanomolar y alta selectividad para el subtipo de receptor CCKB (Noble et al., 1999). El bloqueo de la actividad de CCKB incrementó fuertemente la interacción social ( G) (Interacción, F_(1,20) = 7.795, p <0.05; droga F_(1,20) = 5.38, p <0.05, prueba posterior de Bonferroni t = 3.615_, p <0.01). La infusión de CI-988 también revirtió el déficit en la preferencia de sacarosa observado en ratones susceptibles (t₍₈₎ = 2.681, p <0.05) ( H). Ambos resultados de comportamiento indican que el bloqueo de la acción de CCK en PrL ejerce potentes efectos similares a los antidepresivos. Curiosamente, cuando se administró por vía intraperitoneal, CI-988 fue ineficaz para revertir la evitación social (datos no mostrados).

Para probar lo contrario, esa activación de CCKB en PrL podría mediar la evitación social y la disminución de la preferencia de sacarosa inducida por el estrés crónico de la derrota social, se examinó el efecto de la infusión local de CCK-8 (10 ng), la forma predominante de CCK en el cerebro. , sobre conductas relacionadas con la depresión y la ansiedad. La dosis del fármaco se eligió en función de los resultados anteriores en la literatura (De Witte et al., 1987; Rotzinger y Vaccarino, 2003; Zanoveli et al., 2004). Los ratones fueron expuestos a estrés por derrota social submáxima 24 h antes de las pruebas de comportamiento ( A). CCK-8, infundido 30 min antes de la prueba, fue suficiente para inducir evitación social en la prueba de interacción social, así como una disminución en el tiempo pasado en los brazos abiertos en el laberinto más elevado (SI: BLA, interacción, F_(1,22) = 0.79, p > 0.05; efecto principal de la droga, F_(1,22) = 11.75, p <0.05; Prueba posterior de Bonferroni t = 2.957_, p <0.05; NAc: interacción, F_(1,26) = 6.688, p <0.05, prueba posterior de Bonferroni t = 2.816_, p <0.05; EPM: BLA, interacción, F_(1,22) = 8.0, p <0.01; Prueba posterior de Bonferroni t = 2.509_, p <0.05 efecto del fármaco; t = 2.528, p <0.05 efecto de virus; NAc, t test t₍₁₇₎ = 1.961; p <0.05 efecto del fármaco dentro del grupo eYFP) ( SER, izquierda). No se observaron diferencias en la preferencia de sacarosa ( F,G, izquierda). Finalmente, la infusión de CCK-8 no tuvo ningún efecto sobre el comportamiento (interacción social y elevación más laberinto) de ratones no vencidos no expuestos en estos ensayos (datos no mostrados). TEstos resultados demuestran que el aumento mediado por osFosB en la actividad de CCKB en PrL de ratones susceptibles, en comparación con ratones resilientes, contribuye a algunos de los déficits de comportamiento inducidos por el estrés exhibidos por estos animales.

Bloqueo de la susceptibilidad al estrés inducida por CCK por activación de proyecciones corticales a BLA versus NAc

La disminución de la actividad neural de mPFC se correlaciona con comportamientos similares a la depresión en ratones, con la estimulación optogenética de las neuronas mPFC de ratones susceptibles que producen efectos similares a los de los antidepresivos (Covington et al., 2010). Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que la CCK podría actuar en PrL al inhibir la actividad neuronal y, por lo tanto, causar un comportamiento similar a la depresión. De acuerdo con esta hipótesis, observamos una disminución en c-Fos Los niveles de ARNm en PrL en respuesta a la infusión de CCK en esta región del cerebro (t₍₁₃₎ = 2.235, p <0.05) ( H).

Luego planteamos la hipótesis de que la estimulación optogenética de mPFC ejerce sus acciones antidepresivas al oponerse a los efectos de CCK en la actividad neuronal. Al probar esta hipótesis, investigamos las estructuras subcorticales que median los efectos ansiogénicos y prodepresivos de CCK. Las neuronas piramidales de la mPFC se proyectan en gran medida en el NAc y el BLA, dos estructuras límbicas implicadas en las respuestas de comportamiento al estrés. Se ha demostrado que la actividad alterada de ambas regiones del cerebro desempeña un papel esencial en la expresión de conductas similares a la ansiedad y la depresión (Vialou et al., 2010; Tye et al., 2011). Por lo tanto, probamos si la estimulación de proyecciones glutamatérgicas de PrL a NAc o a BLA se opondría a los efectos nocivos de la microinfusión de CCK en PrL ( A). Inyectamos AAV-CaMKII-ChR2-EYFP, o AAV-CaMKII-EYFP como control, en PrL. Se sabe que el promotor CaMKII dirige la expresión viral a las neuronas piramidales glutamatérgicas en las regiones corticales. Luego permitimos suficiente tiempo (6 semanas) para que los transgenes se transportaran a los terminales nerviosos de estas neuronas piramidales en NAc y BLA ( I). Los ratones recibieron derrota social submáxima; Después de 24 h, infundimos CCK-8 en PrL y, después de eso, se midió la interacción social durante la estimulación optogenética de los terminales glutamatérgicos en NAc o BLA. Inmediatamente después de la prueba de interacción social, se evaluaron los ratones en el laberinto elevado para evaluar el comportamiento relacionado con la ansiedad y luego para determinar la preferencia de sacarosa para evaluar la anhedonia.

La estimulación optogenética de las proyecciones glutamatérgicas de PrL a NAc revirtió por completo la evitación social inducida por la CCK-8 intra-PrL (interacción, F_(1,26) = 6.688, p <0.05, sin efecto de fármaco en el grupo ChR2) ( C). En contraste, dicha estimulación de PrL a NAc no tuvo ningún efecto en el comportamiento similar a la ansiedad medido en el laberinto más elevado ( E); sin embargo, tal estimulación incrementó la preferencia de sacarosa en comparación con los ratones no estimulados (interacción, F_(1,20) = 5.77, p <0.05; Prueba posterior de Bonferroni t = 2.998_, p <0.05 efecto de estimulación en animales tratados con CCK-8) ( G).

Se observó un patrón de comportamiento muy diferente con la estimulación optogenética de proyecciones glutamatérgicas de PrL a BLA. Dicha estimulación no impidió la evitación social inducida por la infusión CCK-8 intraprol PrL (interacción, F_(1,22) = 0.79, p > 0.05; efecto principal de la droga, F_(1,22) = 11.75, p <0.05; ningún efecto en el grupo estimulado, t test t₍₁₂₎ = 2.054, p <0.05) ( B). Sin embargo, la estimulación de los aferentes de BLA ejerció un efecto de tipo ansiolítico como lo indica el aumento del tiempo empleado en los brazos abiertos del laberinto más elevado (interacción, F_(1,22) = 8.0, p <0.01; Prueba posterior de Bonferroni t = 2.528, p <0.05 efecto del virus en los grupos tratados con CCK-8) ( D). La estimulación de las proyecciones glutamatérgicas a BLA no tuvo un efecto significativo en la preferencia de sacarosa (interacción, F_(1,22) = 2.08, p > 0.05) ( F).

Discusión

Los resultados del presente estudio proporcionan evidencia de adaptaciones moleculares que ocurren en PrL que subyacen a la susceptibilidad al estrés social. Mostramos la inducción de ΔFosB en esta subregión mPFC después del estrés por derrota social crónica, donde la sobreexpresión de BFosB promueve la susceptibilidad al estrés. Identificamos el receptor CCKB como un gen objetivo regulado por ΔFosB en PrL, aparentemente induciendo la proteína CCKB en ratones susceptibles y evitando la regulación a la baja de la expresión de CCKB que se produce selectivamente en ratones resistentes. También demostramos que la infusión de un agonista de CCK en PrL promueve anormalidades de comportamiento similares a la depresión y la ansiedad en respuesta al estrés social, mientras que el bloqueo de la actividad del receptor CCKB en esta región de ratones susceptibles bloquea estos efectos. A continuación, utilizamos herramientas optogenéticas para identificar los microcircuitos involucrados en las acciones de CCK en PrL similares a proanxiety versus prodepression. Aunque las proyecciones glutamatérgicas cortico-NAc median en los déficits de recompensa evidenciados por la evitación social y la reducción de la preferencia de sacarosa, este microcircuito no influye en los efectos ansiogénicos de CCK infundidos en PrL. Por el contrario, las proyecciones corticales a BLA median la manifestación de conductas relacionadas con la ansiedad, pero no tienen efecto en la evitación social inducida por el estrés social o en los déficits de preferencia de sacarosa. Juntos, estos datos muestran que las alteraciones en la función de PrL después del estrés social crónico provocan numerosos déficits de comportamiento a través de proyecciones subcorticales específicas.

ΔFosB: mapeo de una red de estrés límbico y rol en mPFC

ImmLa inmunohistoquímica FosB identifica las neuronas afectadas por el estrés crónico con resolución de una sola célula y se ha utilizado para mapear los circuitos neuronales regulados por el estrés (Perrotti et al., 2004; Nikulina et al., 2008; Lehmann y Herkenham, 2011). Utilizamos esta metodología para mostrar que el estrés crónico de la derrota social induce a ΔFosB en varias áreas del cerebro con distintos patrones entre grupos resistentes y susceptibles, con algunas regiones que muestran la inducción solo en ratones resistentes, otras solo en ratones susceptibles y otras en ambas condiciones (Tabla 1). Trabajos previos demostraron que la inducción de BFosB en NAc o PAG ventral promueve la resistencia al estrés crónico y contribuye a las respuestas antidepresivas (Berton et al., 2007; Vialou et al., 2010).

Inducción de ΔFosB en PrL de ratones susceptibles, junto con hallazgos previos de que la estimulación optogenética de esta región ejerce efectos antidepresivos (Covington et al., 2010), nos incitó a estudiar la influencia de ΔFosB en esta región cortical. Al contrario de los hallazgos en NAc y PAG ventral, encontramos que ΔFosB en PrL promueve la susceptibilidad al estrés crónico de la derrota social y produce un efecto similar al de la prospección en la prueba de natación forzada, sin afectar el comportamiento similar a la ansiedad o la preferencia de sacarosa. A diferencia de PrL, no encontramos ningún efecto de la sobreexpresión de ΔFosB en la IL cercana. Un estudio reciente encontró niveles elevados de ΔFosB en IL en ratones resistentes e implicó a esta subregión en la resistencia al estrés social (Lehmann y Herkenham, 2011). Por lo tanto, se necesitan más estudios para abordar roles diferenciales para estas dos subregiones mPFC, que han demostrado producir efectos opuestos en otros dominios de comportamiento (Sierra-Mercado et al., 2011; Burgos-Robles et al., 2013; Richard y Berridge, 2013). Anteriormente informamos que los humanos deprimidos muestran niveles más bajos de ΔFosB en NAc examinado postmortem (Vialou et al., 2010), wSe han mostrado niveles más altos de ΔFosB en PFC dorsolateral (área de Brodmann 46) de humanos deprimidos (Teyssier et al., 2011). Otras regiones corticales no fueron examinadas en el último estudio. En cualquier caso, estos hallazgos juntos apoyan anomalías específicas de la región en la expresión de FosB en la depresión humana, donde el factor de transcripción ejerce efectos muy diferentes sobre la vulnerabilidad al estrés. Sería interesante en estudios futuros examinar la influencia de ΔFosB en muchas otras regiones del cerebro donde se induce (Tabla 1) sobre las respuestas al estrés.

Un mecanismo por el cual la inducción de ΔFosB en PrL podría contribuir a un comportamiento similar a la depresión es mediante la supresión de la actividad de PrL. Se ha demostrado que osFosB suprime las respuestas de glutamato de AMPA, y c-Fos expresión, en las neuronas espinosas medianas NAc (Renthal et al., 2008; Vialou et al., 2010; Grueter et al., 2013). Asimismo, encontramos una disminución en c-Fos expresión después de la sobreexpresión de ΔFosB en PrL. Por lo tanto, la inducción de ΔFosB en PrL podría ser responsable de la reducción de la actividad neuronal observada en esta región después del estrés crónico de la derrota social. Se esperaría que tal disminución del tono de PrL sobre sus objetivos subcorticales, como BLA y NAc, aumentaría la expresión del miedo y la incapacidad de extinguir las respuestas emocionales al estrés (Fales et al., 2008, 2009). Además, las lesiones mPFC inducen respuestas de estrés sensibilizadas y déficits en la extinción del miedo (Holson, 1986; Silva et al., 1986; Diorio et al., 1993; Milad y Quirk, 2002), lo que sugiere que el deterioro inducido por el estrés de mPFC, mediado en parte a través de la inducción de BFosB, podría contribuir a la depresión y otros trastornos relacionados con el estrés (Choi et al., 2012).

Papel de CCK en la vulnerabilidad al estrés

Proporcionamos evidencia de que el receptor CCKB es un objetivo de ΔFosB, de modo que la inducción de ΔFosB en PrL de ratones susceptibles es solo un mecanismo a través del cual ΔFosB ejerce sus efectos similares a los de la prodepresión en esta región. Aunque las acciones específicas de CCK en los circuitos mPFC no están claras, en roedores CCK se localiza dentro de las interneuronas GABAérgicas (Somogyi et al., 1984). Se cree que suprime la actividad de las neuronas piramidales corticales al mejorar la liberación local de GABA y actuar directamente sobre los receptores CCKB expresados por las neuronas piramidales (Yaksh et al., 1987; Benoliel et al., 1992; Pérez de la Mora y otros, 1993; Gallopin et al., 2006). Por lo tanto, la neurotransmisión CCKergic podría contribuir a la actividad reducida de PrL mencionada anteriormente.

CCK es un agente ansiogénico, con administración sistémica de agonistas de CCKB que inducen ataques de pánico en voluntarios sanos. Los pacientes predispuestos a ataques de pánico se hipersensibilizan después de la exposición a CCK (de montigny, xnumx; Bradwejn et al., 1991). Varios estudios han confirmado los efectos ansiogénicos de CCK en roedores (Rotzinger y Vaccarino, 2003). La liberación de CCK en mPFC durante el estrés de derrota en ratas se asocia con conductas relacionadas con la ansiedad (Becker et al., 2001); Las subregiones de PrL e IL no se diferenciaron en este estudio. Más recientemente, el bloqueo sistémico y crónico de CCKB con CI-988 ejerció efectos antidepresivos similares en ratas (Becker et al., 2008). CI-988 tiempo de inmovilidad normalizado en la prueba de natación forzada. También evitó la hiperactividad del eje hipotalámico-hipofisario-suprarrenal, redujo el volumen del hipocampo y la proliferación celular, y redujo la preferencia de sacarosa normalmente provocada por la derrota social. Aquí, confirmamos estos resultados mostrando un efecto antidepresivo de CI-988 infundido en PrL de ratones susceptibles, aunque una sola inyección sistémica no imitó este efecto.

Además de las acciones agudas de CCK en PrL, identificamos niveles reducidos de ARNm de CCKB en ratones resistentes, lo que podría ser una adaptación molecular subyacente a la resistencia. De hecho, las alteraciones en el tono CCKergic, específicamente los niveles de CCKB, constituyen un mecanismo importante para la expresión de la ansiedad. Los ratones transgénicos que sobreexpresan CCKB en el cerebro anterior muestran una mayor ansiedad y respuestas de miedo (Chen et al., 2006). Nuestro hallazgo de niveles alterados de CCKB entre ratones resistentes y susceptibles podría contribuir a las diferencias fenotípicas en la ansiedad y el comportamiento depresivo. Aquí, demostramos la PrL como un sustrato anatómico crítico para los efectos ansiogénicos y prodepresores de CCK en el contexto de estrés social. Sin embargo, varias otras regiones del cerebro están involucradas en las acciones conductuales de CCK, incluidas BLA, hipocampo, NAc y PAG (De Witte et al., 1987; Belcheva et al., 1994; Nobles y Roques, 1999; Zanoveli et al., 2004; Rezayat et al., 2005). Además, encontramos un aumento en los niveles de proteína CCKB, pero no en los niveles de ARNm, en mPFC de animales susceptibles. Estos hallazgos subrayan que, aunque los niveles de ARNm a menudo se correlacionan con los niveles de proteínas, este no es necesariamente el caso (Gygi et al., 1999).

Nuestros experimentos optogenéticos demuestran que el aumento de la actividad de las proyecciones glutamatérgicas de PrL a NAc o a BLA antagoniza los efectos de CCK en PrL. Se necesitan más estudios para establecer que este efecto de la estimulación optogenética esté mediado por las mismas neuronas PrL que están controladas por CCK. Curiosamente, nuestros datos revelan roles distintos de estos dos microcircuitos en la mediación de diferentes dominios de anomalías de comportamiento. La proyección cortico-NAc controla anhedonia y recompensa; el hecho de que regule la evitación social confirma que este síntoma es más un reflejo de la disminución de la motivación y la recompensa por el comportamiento social y no de una mayor ansiedad social. Esta conclusión es consistente con la incapacidad de las benzodiacepinas para corregir esta anomalía (Berton et al., 2006), y con la reciente demostración de que la estimulación por mPFC de NAc aumenta la recompensa y la motivación por las drogas de abuso (Britt et al., 2012). En contraste, la proyección cortico-BLA controla los síntomas relacionados con la ansiedad, lo que concuerda con una extensa literatura sobre roedores y humanos (ver arriba).

En conclusión, los resultados del presente estudio identifican un patrón de regiones del cerebro límbico implicadas en animales susceptibles y resistentes, y demuestran alteraciones en la PrL que promueven la susceptibilidad. Estas alteraciones implican la inducción de ΔFosB y su inducción del receptor CCKB. En contraste, el bloqueo de las acciones de CCK en PrL promueve los efectos antidepresivos y ansiolíticos. También establecemos los objetivos subcorticales de estas neuronas piramidales corticales que median estas acciones, con un circuito de cortico-NAc esencial para las conductas relacionadas con la depresión, y un circuito de cortico-BLA esencial para las conductas relacionadas con la ansiedad. Mientras que los estudios clínicos de antagonistas de CCKB en pacientes deprimidos en los 1990 no arrojaron resultados prometedores, los hallazgos actuales sugieren el valor de revisar el potencial terapéutico de tales agentes en subconjuntos de pacientes expuestos a altos niveles de estrés.

Notas a pie de página

Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud Mental (EJN) y la Fundación de Investigación del Cerebro y el Comportamiento Alianza Nacional para la Investigación sobre la Esquizofrenia y la Depresión.

Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

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