Regulación de la estabilidad de DeltaFosB por fosforilación (2006)

J Neurosci. 2006 May 10;26(19):5131-42.

Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ.

Fuente

Departamento de Psiquiatría, Centro de Neurociencia Básica, Centro Médico de la Universidad de Texas Southwestern, Dallas, Texas 75390-9070, EE. UU.

Resumen

El factor de transcripción DeltaFosB (también conocido como FosB2 o FosB [forma corta]) es un mediador importante de la plasticidad a largo plazo inducida en el cerebro por exposición crónica a varios tipos de estímulos psicoactivos, incluidas drogas de abuso, estrés y convulsiones electroconvulsivas. . Una característica distintiva de DeltaFosB es que, una vez inducida, persiste en el cerebro durante períodos de tiempo relativamente largos en ausencia de estimulación adicional. Los mecanismos subyacentes a esta aparente estabilidad, sin embargo, han permanecido desconocidos. Aquí, demostramos que DeltaFosB es un factor de transcripción relativamente estable, con una vida media de aproximadamente 10 h en cultivo celular. Además, mostramos que DeltaFosB es una fosfoproteína en el cerebro y que la fosforilación de un residuo de serina altamente conservado (Ser27) en DeltaFosB lo protege de la degradación proteasomal. Ofrecemos varias líneas de evidencia que sugieren que esta fosforilación está mediada por la caseína quinasa 2. Estos hallazgos constituyen la primera evidencia de que DeltaFosB está fosforilado y demuestran que la fosforilación contribuye a su estabilidad, que es el núcleo de su capacidad para mediar adaptaciones duraderas en el cerebro.

Introducción

El factor de transcripción ΔFosB, también denominado FosB2 o FosB [forma corta], es una variante de empalme truncada en el extremo C del gen temprano inmediato Fosb (Dobrazanski y otros, 1991; Nakabeppu y Nathans, 1991; Yen et al., 1991). Al igual que FosB de longitud completa, ΔFosB tiene un dominio básico de unión a ADN y una cremallera de leucina a través de la cual dimeriza con las proteínas Jun para formar los complejos de factor de transcripción activador de la proteína 1 (AP-1), que regulan la expresión de muchos genes (Morgan y Curran, 1995; Rylski y Kaczmarek, 2004). A pesar de la falta de parte del dominio de transactivación encontrado en el extremo C de FosB, ΔFosB funciona como un potente activador y represor transcripcional en células cultivadas y en el cerebro (Dobrazanski y otros, 1991; Nakabeppu y Nathans, 1991; Chen et al., 1997; McClung y Nestler, 2003; Kumar et al., 2005).

ΔEl FosB se induce a niveles altos en una forma específica de la región en el cerebro después de la exposición crónica, pero no aguda, a una variedad de estímulos psicoactivos, incluido el estrés, ciertas lesiones, fármacos antipsicóticos y antidepresivos, fármacos contra el abuso y recompensas naturales (Hope et al., 1994b; Hiroi y Graybiel, 1996; Moratalla et al., 1996; Bing et al., 1997; Mandelzys et al., 1997; Kelz et al., 1999; Werme et al., 2002; Andersson y otros, 2003; Colby et al., 2003; Peakman et al., 2003; Perrotti et al., 2004; Zachariou et al., 2006). La inducción de ΔFosB se ha relacionado directamente con los efectos funcionales de varios de estos estímulos en el cerebro. La persistencia de ΔFosB incluso en ausencia de estimulación adicional lo distingue de todos los otros factores de transcripción de la familia Fos, que se inducen rápidamente en respuesta a estímulos agudos, regresan a los niveles basales en unas pocas horas y generalmente muestran desensibilización después de la estimulación crónica (Hope et al., 1992; Daunais et al., 1993; Persico et al., 1993; Hiroi y Graybiel, 1996; Perrotti et al., 2004). Esto hace que ΔFosB sea un candidato atractivo para mediar algunos de los cambios a largo plazo en la expresión génica que subyacen en las adaptaciones neuronales estables causadas por ciertos estímulos crónicos.

Debido a que la presencia prolongada de ΔFosB se produce en ausencia de una mayor inducción de su ARNm (Chen et al., 1995), especulamos que, a diferencia de FosB de longitud completa y todas las demás proteínas de la familia Fos, que son intrínsecamente inestables, ΔFosB puede ser un factor de transcripción inusualmente estable (Hope et al., 1994b; Chen et al., 1997; Nestler et al., 2001; McClung et al., 2004). Además, el análisis de inmunotransferencia del tejido cerebral estimulado agudo versus crónico sugirió que thatFosB cambia en aparente Mr (masa molecular) desde ∼33 kDa en estado agudo hasta ∼35 – 37 kDa durante el tratamiento crónico (Hope et al., 1994a; Chen et al., 1995). Debido a que no hay evidencia de la existencia de ARNm adicionales que puedan codificar para estas diversas isoformas, especulamos además que ΔFosB se modifica después de la traducción y que quizás esto contribuya a su inusual estabilidad. Hasta la fecha, sin embargo, no se han reportado análisis bioquímicos del volumen de negocios o modificaciones postraduccionales de ΔFosB. El objetivo del presente estudio fue determinar si ΔFosB es una fosfoproteína y si la fosforilación desempeña un papel en su estabilidad.

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Materiales y Métodos

Líneas celulares de mamíferos y construcciones de ADN.

Las células PC12 (Clontech, Mountainview, CA) se cultivaron en DMEM con alto contenido de glucosa que contenía l-glutamina (L-Gln) y se suplementaron con 5% de suero fetal bovino (FBS), 10% de suero de caballo (ambos de Invitrogen, Carlsbad, CA) , 100 U / ml de penicilina y 100 μg / ml de estreptomicina (ambas de Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Se cultivaron células HeLa (American Type Culture Collection, Manassas, VA) en DMEM con alto contenido de glucosa que contenía L-Gln y se suplementaron con 10% FBS, penicilina y estreptomicina. Ambas líneas celulares se mantuvieron a 37 ° C en un 5% CO húmedo2 atmósfera.

Para las transfecciones transitorias con ADN, las células PC12 o HeLa se sembraron en placas de seis pocillos (recubiertas con colágeno I para células PC12) para alcanzar la confluencia de 90-100 al día siguiente y luego se transfectaron usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). En algunos experimentos (ver Figs. 17), ΔFosB se expresó de forma transitoria en células PC12 a través de la infección con el virus del herpes simple recombinante (VHS).

Los cDNA de ΔFosB y FosB se obtuvieron de nuestras propias construcciones pTetop (Chen et al., 1997), y subclonado en un vector pcDNA3.1 (Invitrogen). Estas construcciones pcDNA3.1-ΔFosB / FosB se usaron para la expresión en células de mamíferos y como plantilla para la mutagénesis dirigida al sitio. El HSV-ΔFosB recombinante se preparó como se describió anteriormente (Neve et al., 1997), y la preparación tenía un título de ∼1 × 108 pfu / ml.

Experimentos de persecución por pulsos.

Aproximadamente 24 h después de la infección / transfección, las células (PC12 o HeLa) en placas de seis pocillos se lavaron dos a tres veces con 2 ml de PBS y se incubaron a 37 ° C durante ∼1 h en 2 ml de Cys / Met-DMEM (Invitrogen) suplementado con 5% de FBS dializado (Hyclone, Logan, UT) para agotar los grupos intracelulares de Met y Cys. Al final de este período de “inanición”, se agregaron medicamentos (si las células se iban a tratar) y las células se marcaron (pulso) con 12-25 μCi de 35Mezcla De Etiquetado De Proteína S (PerkinElmer, Wellesley, MA) para ∼1 h en 37 ° C para etiquetar todas las proteínas recién sintetizadas. Luego se retiró el radiomarcado lavando las células dos a tres veces con 2 ml de PBS, y 35Las proteínas marcadas con S fueron seguidas (persecución) reemplazando el medio con medio "frío" (no radioactivo) suplementado con 5% FBS y recogiendo las células en varios puntos de tiempo. Los tratamientos celulares se mantuvieron durante toda la persecución. Todas las figuras de estos experimentos muestran cantidades iniciales similares de las diversas proteínas para optimizar las comparaciones de sus tasas de rotación.

Animales y tratamiento convulsivo electroconvulsivo crónico.

Ratas macho Sprague Dawley adultas (200 – 300 g; Charles River Laboratories, Kingston, RI) se trataron una vez al día con convulsiones electroconvulsivas (ECS) para 7 – 9 d. ECS se realizó como se describió anteriormente (Hope et al., 1994a) usando un Ugo Basile (Comerio VA, Italia) Unidad ECS con las siguientes configuraciones: frecuencia, pulsos 100 / s; pulso con, 0.5 ms; duración del choque, 1.0 s; y actual, 75 mA. Los animales de control de simulación se trataron en paralelo aplicando los electrodos de clip de oreja sin ninguna corriente eléctrica.

32 Etiquetado metabólico p.

Para el etiquetado de cortes de cerebro, se decapitaron ratas, se diseccionaron rápidamente los cerebros y se prepararon cortes de cortical frontal 300 μm con un microlijador DSK (Ted Pella, Redding, CA). Las rodajas se incubaron dentro de tubos de plástico en 2 ml de CSF artificial deficiente en fosfato (ACSF) y se mantuvieron a 30 ° C bajo constante burbujeo suave con O2/CO2 mezclaHemmings et al., 1989). Las rodajas (dos rodajas por tubo) se marcaron con 1.3 mCi para 8-10 h en presencia o ausencia de ácido okadaico (100 ng / ml). Al final de esta incubación, las rodajas se enjuagaron al menos tres veces con ACSF frío y luego se homogeneizaron por sonicación en 250 μl de un tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación fría (RIPA) [PBS, pH 7.4, 150 mm NaCl, 1% (v / v) ) Igepal, 0.5% (p / v) desoxicolato de sodio, 0.1% (p / v) SDS, 1 mm EDTA] complementado antes de su uso con SDS hasta 0.6%, cóctel inhibidor de proteasa para células de mamíferos (utilizado a 5 μl / ml; Sigma-Aldrich), inhibidores de la fosfatasa cócteles I y II (utilizados en 1: 100; Sigma-Aldrich), 1 mm PMSF y 2% glicerol. Luego se homogeneizaron los homogeneizados durante 15 min y se aclararon por centrifugación a 15,000 × g para 15 min. La concentración de proteína en los sobrenadantes resultantes se evaluó utilizando el ensayo de proteína BCA (Pierce, Holmdel, NJ).

Para el 32Marcado P de células cultivadas, ∼24 h después de la infección / transfección, las células se lavaron de dos a tres veces con medio sin fosfato y se incubaron en este medio durante ∼1 h. Después de este período de inanición, 0.2 – 0.3 mCi de 32PH3PO4 (PerkinElmer) se agregaron a cada pozo, y las células se marcaron para 4 – 12 h dependiendo del tipo de experimento (ver Figs. 1 – 7 para especificaciones). Las células se lavaron tres veces con PBS y se lisaron en hielo durante 15 min con 50 μl de tampón RIPA suplementado. Los lisados ​​se recogieron mediante raspado y se pasaron 10 veces a través de una aguja 25 ga para cizallar el ADN, se hervieron durante 10 min y se centrifugaron a 15,000 rpm para 15 – 30 min a 4 ° C. Los lisados ​​eliminados (sobrenadantes) se transfirieron a un nuevo tubo y se realizó un ensayo de proteína BCA (Pierce). Todas las figuras de estos experimentos muestran cantidades similares de proteínas de tipo salvaje (WT) y S27A ΔFosB totales para optimizar las comparaciones de sus niveles de fosforilación relativa.

Tratamientos químicos y cultivos celulares.

El ácido okadaico (OA; Sigma-Aldrich) se disolvió en etanol y se utilizó a una concentración final de 100 ng / ml. 5,6-Dicloro-1-β-d-ribofuranosil-bencimidazol (DRB; Biomol, Plymouth Meeting, PA) se disolvió en dimetilsulfóxido (DMSO; Sigma-Aldrich) y se usó en un cultivo celular en una concentración final de 50 μm. La espermina (Sigma-Aldrich) se disolvió en agua y se utilizó a una concentración final de 200 μm. Calphostin-C (Biomol) se disolvió en DMSO y se usó a 0.2 μm, mientras que el forbol 12 myristate 13-acetate (PMA; Promega, Madison, WI) se disolvió en DMSO y se usó a 0.1 μm. El péptido inhibidor relacionado con 2 autistomosis miristoilado (m-AIP; Biomol) se disolvió en agua y se usó a una concentración final de 1 y 10 μm. Los inhibidores de la proteína quinasa de amplio espectro H-7 y H-8 (Biomol) se disolvieron en agua y se usaron a una concentración final de 150 y 200 μm, respectivamente. MG132 (Calbiochem, San Diego, CA) y epoxomicina (Peptides International, Louisville, KY) se disolvieron en DMSO y se utilizaron a una concentración final de 12.5 y 7.5 μm, respectivamente. En todos los experimentos, se agregó DMSO (vehículo) a las células según sea necesario para mantener una cantidad constante de DMSO en todos los tratamientos. por 32P experimentos de etiquetado, los medicamentos se agregaron inmediatamente antes de la etiqueta y se mantuvieron durante el resto del período de etiquetado. Para los experimentos de pulsos de persecución, se agregaron medicamentos en el momento de la “inanición” de Cys / Met, se mantuvieron durante el período de etiquetado y luego se agregaron nuevamente al medio de persecución. Los inhibidores del proteasoma se dispararon cada 3-4 h a lo largo de la persecución para compensar la rápida rotación de estos péptidos.

Immun Inmunoprecipitación con FosB, inmunotransferencia y autorradiografía.

Para las inmunoprecipitaciones, los lisados ​​se diluyeron 1: 5 con RIPA simple para reducir la concentración de SDS al 0.1% antes de proceder con la inmunoprecipitación (IP). Para limitar la unión no específica, los lisados ​​se eliminaron primero mediante inmunoprecipitación con IgG no inmunitaria y proteína G-Sefarosa (Sigma-Aldrich) durante al menos 4 h. ΔFosB se inmunoprecipitó a partir de los lisados ​​eliminados utilizando un anticuerpo policlonal de cabra que reconoce un epítope interno presente en FosB y ΔFosB (SC-48G; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) en 0.5 – 1 μg IgG por 10 μg de proteína de lis (50 – 300 μg de proteína total) en un volumen total de 0.5 ml. Las IP se mezclaron suavemente a 4 ° C en un rotor durante al menos 8 hy luego se agregaron 15 μl de proteína G-Sepharose y las IP se mezclaron durante al menos otra 4 h. Los IP se acumularon por centrifugación en 3000 × g para 3 – 5 min a 4 ° C, se lavó tres veces con 0.5 ml de RIPA liso frío y dos veces con PBS frío que contenía 0.1% Tween 20. Las IP se resuspendieron luego en 0.5 ml de PBS frío, se transfirieron, se sedimentaron en un nuevo tubo y las proteínas inmunoprecipitadas se eluyeron luego mediante la adición de 15-25 μl de 2 × reductor de la muestra de proteína Laemmli. Este protocolo IP dio como resultado la precipitación específica y efectiva de prácticamente todos los ΔFosB en el lisado. Las proteínas inmunoprecipitadas se sometieron a SDS-PAGE cargando toda la IP en un gel de criterio de 12.5% Tris-HCl (Bio-Rad, Hercules, CA) y luego se transfirieron a PVDF o nitrocelulosa. Después de la transferencia, la membrana se secó al aire y 32P- y 35Las bandas de proteínas radiomarcadas en S se observaron mediante autorradiografía utilizando la película autorradiográfica Kodak (Rochester, NY), así como mediante la fosforilación de imágenes utilizando un PhosphorImager Storm (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Se detectó osFosB total (no fosforilado y fosforilado) en lisados ​​celulares o en homogeneizados de cerebro mediante inmunotransferencia de cualquiera de las proteínas inmunoprecipitadas (usando la misma membrana utilizada para detectar el 32Proteína marcada con P), o de cantidades iguales de proteína lisada / homogeneizada sometida a SDS-PAGE y transferida a PVDF o nitrocelulosa. La membrana se bloqueó primero incubándola con 1% (w / v) de leche seca sin grasa (Bio-Rad) en PBS suplementado con 0.1% (v / v) Tween 20 (Sigma) durante 1 h a 25 ° C. Luego, la membrana se sometió a inmunotransferencia durante la noche a 4 ° C con nuestro propio anticuerpo policlonal anti-FosB de conejo generado contra los aminoácidos 1-16 de FosB / ΔFosB (usado en 1: 10,000). Después de la incubación primaria, las membranas se lavaron cuatro veces durante 5 min con tampón de bloqueo y luego se incubaron a 25 ° C durante ∼1 h con una IgG de cabra anti-conejo conjugada a peroxidasa de rábano picante (utilizada en 1: 5000 en un tampón de bloqueo, de Vector Laboratorios, Burlingame, CA). Las membranas se lavaron tres veces durante 10 min con tampón de bloqueo y una vez durante 5 min con PBS. Las bandas de proteína ΔFosB total se visualizaron en la película Kodak MR mediante quimioluminiscencia mejorada (Pierce) y / o detección de fluorescencia utilizando los reactivos ECL-Plus (Amersham Biosciences) y Storm PhosphorImager.

Sobreexpresión y purificación de ΔFosB recombinante de células de insecto.

ΔFosB se sobreexpresó en células de insecto Sf9 como una proteína marcada con hexa-His del extremo N (N-His (6) ΔFosB) utilizando el sistema de expresión de baculovirus Bac-to-Bac (Invitrogen) y siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, el ADNc de ΔFosB (residuos 2-237) precedido por la etiqueta N-terminal de afinidad MGHHHHHHAG se subclonó en el vector pFASTBacTM1, que se usó para generar baculovirus recombinante. Se infectaron células Sf9 con virus recombinante y se purificó N-His (6) osFosB de lisados ​​celulares mediante varias etapas cromatográficas, incluida cromatografía de afinidad usando una columna de níquel (Qiagen, Valencia, CA), intercambio de aniones usando una columna mono-Q (Amersham Biosciences), y exclusión de tamaño utilizando una columna de filtración en gel (Amersham Biosciences).

In vitro Estudios de fosforilación.

In vitro Las reacciones de fosforilación para el curso del tiempo y el análisis de estequiometría se realizaron en un volumen de 30 μl que contiene 10 μm de sustrato (N-His (6) ΔFosB o un sustrato de control positivo), 250 μm ATP y 1 μCi / μl [γ-32P] ATP, el tampón suministrado por el fabricante de la quinasa, y una de las siguientes quinasas: CK2 (20 ng / μl; Upstate, Charlottesville, VA), CaMKII (10 ng / μl; Upstate), PKC (1.6 ng / μl; Calbiochem) o p70S6K (2.5 mU / μl; Upstate). Las reacciones en el tiempo se realizaron eliminando las alícuotas de 5 μl de la solución de reacción en los puntos de tiempo designados y agregando un volumen igual de 4 × reduciendo el tampón de muestra de la proteína Laemmli. Los parámetros cinéticos de Michaelis-Menten para la reacción CK2 se determinaron en condiciones de estado estacionario lineal definidas empíricamente. Estas reacciones se realizaron para 15 min en un volumen de 10 μl que contiene 2 ng / μl enzima, 250 μm ATP, 1 μCi / μl [γ-32P] ATP, y N-His (6) concentrationsFosB concentraciones que van desde 2.5 a 30 μm. Todas las reacciones se realizaron a 30 ° C en un baño de agua. Después de SDS-PAGE y la tinción del gel con Bio-Safe Coomassie (Bio-Rad), el gel se secó y 32La incorporación de P-fosfato se evaluó mediante un análisis de imágenes de fósforo (ver más adelante, Cuantificación de datos, cálculos y estadísticas).

Mapa de fosfopéptidos bidimensional y análisis de fosfoaminoácidos.

Ambos análisis se realizaron según lo descrito por Ploegh y Dunn (2000). Brevemente, fragmentos de gel secos que contienen 32ΔFosB etiquetado con P (ya sea de in vitro reacciones o de inmunoprecipitados de células marcadas metabólicamente), se extirparon, se rehidrataron, se lavaron y se sometieron a digestión tríptica. El sobrenadante que contenía los productos de la digestión tríptica se liofilizó y el liofilizado se lavó varias veces y se resuspendió en 10 μl de tampón de electroforesis, pH 1.9. La muestra (3 μl) se manchó en una placa de cromatografía de capa fina de celulosa (TLC) (Analtech, Newark, DE) y se separó en una dimensión por electroforesis y la otra dimensión por TLC ascendente. Los mapas de fosfopéptidos resultantes se visualizaron mediante autorradiografía y fosforimagen. Para el análisis de fosfoaminoácido, se escindieron 2 μl de las digestiones trípticas que se habían vuelto a suspender en el tampón de electroforesis mediante hidrólisis con HCl a 105 ° C durante 25 min en 3 m HCl bajo N2 atmósfera. La reacción se detuvo mediante una dilución de seis veces en agua y la mezcla se liofilizó. El liofilizado se resuspendió en 5 μl de tampón de electroforesis, pH 1.9, y se colocó en una placa de TLC de celulosa junto con los estándares de fosfo-Ser, -Thr y -Tyr. La electroforesis se realizó en la mitad de la longitud de la placa de TLC usando un tampón de electroforesis, pH 1.9, y luego la placa se transfirió al tampón de pH 3.5, y se realizó la electroforesis hasta su finalización. Los estándares de fosfoaminoácido se visualizaron rociando la placa de TLC con una solución de ninhidrina 1% (v / v) en acetona, y 32Las muestras de aminoácidos marcados con P se visualizaron mediante autorradiografía y imagen de fósforo.

SiRNA inducido por CK2α caída.

Utilizamos un método de interferencia de ARN para reducir selectivamente los niveles de CK2 (Di Maira et al., 2005). Las células PC12 se sembraron en placas de seis pocillos recubiertas con colágeno I para alcanzar una confluencia del N70-80% al día siguiente, cuando se transfectaron transitoriamente con 20 nm (concentración final) de siRNA no dirigido o siRNA dirigido hacia el mRNA del catalizador Subunidad α de Rata CK2, usando 5 μl del agente de transfección SilentFectin (Bio-Rad) y siguiendo las instrucciones del fabricante. Aproximadamente 24 h más tarde, las células se transfectaron transitoriamente con el plásmido ΔFosB, como se ha indicado anteriormente. Aproximadamente 24 h más tarde (∼48 h después de la transfección de ARNip), las células se sometieron a 32Marcaje metabólico de P o análisis de seguimiento de pulso como se describe anteriormente. Se utilizaron los siguientes cuatro siRNAs de CK2α con resultados similares: 5′P-UCAAUCAU Como control negativo, utilizamos Silenciador control negativo #3 siRNA de Ambion (Austin, TX). La extensión de la eliminación de CK2 se controló mediante inmunotransferencia utilizando un anticuerpo policlonal anti-CK2 (número de catálogo 06-873 de Upstate) durante la noche a una dilución 1: 1000. La β-tubulina se utilizó como control de carga y se detectó con un anticuerpo monoclonal (número de catálogo 05-661 de Upstate) durante la noche a una dilución de 1: 20,000.

Mutagénesis dirigida al sitio.

La mutación de Ser27 a Ala o a Asp se realizó con un kit de mutagénesis dirigida al sitio de cambio rápido (Stratagene, La Jolla, CA) y siguiendo las instrucciones del fabricante. Para introducir las mutaciones Ser27 en la proteína osFosB de ratón, se utilizaron los siguientes cebadores de mutagénesis. Ser27 a Ala: (cebador inverso) 5′GCCGAAGGAGTCCACCGAAGCCAGGTACTGAGACTCGGCGGAGGG3 ′. Ser27 a Asp (cebador directo) 5′CCCTCCGCCGAGTCTCAGTACCTGGATTCGGTGGACTCCTTCGGC3 ′. Las bases mutadas están en negrita, y el codón Ser27 está en cursiva.

Bioinformática.

Se realizaron búsquedas en los sitios de fosforilación potencial y en las cinasas para osFosB mediante el envío de la secuencia de la proteína del ratón a bases de datos especializadas que incluyen ProSite (http://www.expasy.org/prosite/), PredictProtein (Rost et al., 2004), y NetPhosK (Blom et al., 2004).

Cuantificación de datos, cálculos y estadísticas.

La cantidad de proteína presente en el PVDF o la membrana de nitrocelulosa se cuantificó utilizando un Storm PhosphorImager y el software ImageQuant que lo acompaña (Amersham Biosciences / Molecular Dynamics). En los estudios de cultivo celular y de fosforilación de cortes de cerebro, los valores obtenidos para la 32Las proteínas marcadas con P se dividieron luego por los valores obtenidos para ΔFosB total y se expresaron como una proporción. En el in vitro estudios de fosforilación, la cantidad de 32El ΔFosB marcado con P por mol de ΔFosB (estequiometría) se calculó como se describió anteriormente (Sahin et al., 2004). Todas las mediciones se tomaron dentro del rango de linealidad del instrumento utilizado. Los parámetros cinéticos se calcularon utilizando el modelo de Michaelis-Menten, mediante el cual V = VMax[S] / ([S]+KM) y VMax = k2[ETotal]. La vida media (t1/2) de ΔFosB y FosB se estimaron a partir de los gráficos de pulsos (utilizando la regresión no lineal que mejor se ajustó a los puntos de datos) y corresponden al momento en que la cantidad de proteína restante es 50% del original. En todas las figuras, los resultados mostrados son representativos de al menos dos o tres experimentos independientes. En todos los gráficos, los datos que se muestran son promedios ± SEM (3 ≤ n ≤16). La significación estadística de las diferencias se evaluó utilizando un no pareado. t prueba, corregida para comparaciones múltiples, y los asteriscos indican p ≤ 0.05.

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Resultados

ΔFosB es un factor de transcripción inusualmente estable

Aunque hemos especulado anteriormente que ΔFosB es un factor de transcripción relativamente estable (Nestler et al., 2001), un análisis directo del perfil de rotación de la proteína no se ha realizado hasta la fecha. Para abordar esta pregunta, realizamos experimentos de pulso-persecución con células PC12, que se han utilizado ampliamente como una línea celular similar a una neurona, en la que FosB se expresó de forma transitoria a través de una infección con un virus del herpes simple recombinante (VHS-FOSB). Las proteínas recién sintetizadas se marcaron metabólicamente con 35S-Met / Cys, y el patrón de degradación de 35ΔFosB marcado en S (35S-ΔFosB) se controló mediante inmunoprecipitación de lisados ​​celulares obtenidos en diversos puntos de tiempo después de la eliminación de los aminoácidos radiomarcados. El análisis de los inmunoprecipitados por SDS-PAGE y autorradiografía reveló que la vida media de ΔFosB en células PC12 es ∼10 h ( ). Estos hallazgos muestran que la vida media de ΔFosB es más alta que la de la mayoría de los factores de transcripción inducibles (ver Discusión), incluyendo FosB de longitud completa, cuya vida media en cultivo celular se ha reportado como min90 min (Dobrazanski y otros, 1991; Carle et al. 2004). Además, vale la pena señalar que la degradación de ΔFosB no se ajusta a una curva de disminución exponencial de primer grado, sino que es bifásica, comenzando con una tasa de degradación más lenta. Esto sugiere la existencia de más de una especie de ΔFosB y / o más de una ruta de degradación.

Figura 1.

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Figura 1.

ΔFosB es un factor de transcripción inusualmente estable. La vida media de ΔFosB es ∼10 h en cultivo celular. El ΔFosB se expresó en células PC12 mediante una infección con HSV-ΔFosB o una transfección transitoria con un plásmido que contenía ΔFosB, y las células se sometieron a experimentos de pulso-persecución como se describe en Materiales y Métodos. Se obtuvieron resultados equivalentes independientemente del método utilizado para sobreexpresar ΔFosB. La figura muestra el curso del tiempo (y el autorradiograma representativo) de la degradación de ΔFosB. Los datos representados son el promedio ± SEM de al menos 15 puntos de datos individuales obtenidos de al menos cinco experimentos independientes. Para comparación, se indica la vida media informada de FosB de longitud completa.

ΔFosB es una fosfoproteína en el cerebro

Hemos planteado la hipótesis de que la modificación postraduccional de ΔFosB puede contribuir a su estabilidad aparente. Debido a que se ha demostrado que la fosforilación modula la actividad de los factores de transcripción de muchas maneras, incluida su estabilidad (para una revisión, ver Desterro et al., 2000; Whitmarsh y Davis, 2000), investigamos si ΔFosB es una fosfoproteína. Con este fin, se indujo la expresión de ΔFosB en el cerebro de rata utilizando ECS crónica, un tratamiento conocido por inducir altos niveles de ΔFosB, particularmente en la corteza frontal (Hope et al., 1994a). Un día después del último tratamiento con ECS, cuando los niveles de FosB permanecen altos, se prepararon cortes corticales frontales delgados y se marcaron metabólicamente con 32P-ortofosfato. Un conjunto paralelo de cortes no fue radiomarcado, y estos se utilizaron para detectar los niveles totales de ΔFosB. Después de la inmunoprecipitación con un anticuerpo específico anti-FosB / ΔFosB y la separación de las proteínas inmunoprecipitadas por SDS-PAGE, fosforilada 32El ΔFosB marcado con P se detectó mediante autorradiografía, mientras que el ΔFosB total se detectó mediante inmunotransferencia. Este análisis reveló que ΔFosB se fosforila en el cerebro, como lo demuestra un específico 32Banda marcada con P de ∼35 kDa presente en las muestras de cerebro tratadas crónicamente, pero es virtualmente indetectable en los controles tratados de manera simulada ( A). Esto es consistente con el hecho de que, en ausencia de estimulación crónica, los niveles basales de ΔFosB son muy bajos. La especificidad de la reacción de inmunoprecipitación se ilustra por la falta de señal en el precipitado de IgG no inmune.

Figura 2.

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Figura 2.

ΔFosB es una fosfoproteína en el cerebro. A, ΔFosB es fosforilado en el cerebro. El ΔFosB endógeno se indujo en el cerebro de rata mediante el tratamiento crónico con ECS como se describe en Materiales y Métodos. Las rodajas corticales frontales se marcaron metabólicamente con 32PH3PO4 por varias horas. Después de la homogeneización de los cortes, ,FosB se inmunoprecipitó y fosforiló ΔFosB (32P-ΔFosB) se detectó mediante autorradiografía (panel superior). El ΔFosB total en inmunoprecipitados no radiactivos se detectó mediante inmunotransferencia (panel inferior). Como controles negativos, se muestra el inmunoprecipitado de un animal tratado con Sham y de IgG no inmune. BLos sitios de fosforilación del candidato y las cinasas con las correspondientes puntuaciones de predicción para la secuencia de la proteína mouseFosB de ratón se obtuvieron mediante análisis bioinformático. Los sitios candidatos con las puntuaciones de predicción más altas se resaltan en la secuencia de proteínas y se enumeran en la tabla. El dominio de unión al ADN (básico) y la cremallera de leucina están en negrita en la secuencia de la proteína. C, D, La fosforilación de ΔFosB se incrementa por el inhibidor de la fosfatasa OA de Ser / Thr. C, 32Los niveles de P-ΔFosB en inmunoprecipitados de cortes corticales frontales marcados en la ausencia (Ctr) o presencia de 100 ng / ml OA (gráfico y panel superior) se detectaron mediante autorradiografía. El panel inferior muestra el ΔFosB total detectado en inmunoprecipitados de rebanadas sin marcar mediante inmunotransferencia. D, Las células PC12 se infectaron con HSV-ΔFosB o HSV-LacZ (vector) y se marcaron metabólicamente con 32PH3PO4 en ausencia (Ctr) o presencia de 100 ng / ml OA. 32Los niveles de P-ΔFosB en inmunoprecipitados se detectaron mediante autorradiografía (gráfico, panel superior). El panel inferior muestra el ΔFosB total detectado en los lisados ​​celulares mediante inmunotransferencia.

Como primer paso para determinar qué quinasa (s) y sitio (s) están involucrados en la fosforilación de ΔFosB, sometimos su secuencia de aminoácidos a varios análisis bioinformáticos. Esto reveló que, aunque osFosB no contiene sitios candidatos para la fosforilación de Tyr, sí contiene varios sitios de consenso de Ser / Thr quinasa, incluidos tres sitios CaMKII, tres sitios CK2 y dos sitios PKC con puntuaciones de predicción de fosforilación muy altas ( B). Si, como se predijo a través de la bioinformática, ΔFosB solo se fosforila en los residuos de Ser o Thr, entonces su fosforilación debe estar significativamente modulada por la actividad de las fosfatasas de Ser / Thr. Para probar esta hipótesis, etiquetamos cortes corticales frontales con 32P-ortofosfato en presencia o ausencia de OA, un inhibidor de la fosfatasa de la proteína Ser / Thr. Como se muestra en Figura 2 y XNUMXC, OA causó un gran aumento (∼2.5 veces) en 32P-ΔFosB. También causó un pequeño aumento en los niveles totales de ΔFosB, lo que es consistente con informes anteriores que relacionan los efectos carcinogénicos de la OA con su capacidad para inducir varios genes tempranos inmediatos, incluidas las proteínas Fos (Miller et al., 1998; Choe et al., 2004). El resultado neto es un aumento general significativo (∼60%) en los niveles de BFosB fosforilados.

Luego investigamos si, en las células PC12, que son más susceptibles de manipulación experimental, ΔFosB mostró un patrón de fosforilación similar al observado en el cerebro. Expresamos ΔFosB en células PC12 a través de la infección con HSV-ΔFosB y etiquetamos metabólicamente las células con 32P-ortofosfato en presencia o ausencia de OA. La expresión exitosa e inmunoprecipitación de la proteína de las células infectadas con HSV-ΔFosB se muestra por la presencia tanto en la inmunotransferencia ( D, panel inferior) y la autorradiografía (panel superior) de una banda de ∼35 kDa, ausente en las células infectadas con vector. Como se observó en el cerebro, la OA causó un pequeño aumento en los niveles totales de FosB pero un aumento mucho mayor (aproximadamente el doble) en 32P-ΔFosB, que resulta en un aumento neto significativo (∼50%) en la fosforilación de ΔFosB. Además, de acuerdo con las predicciones bioinformáticas, el tratamiento de las células PC12 con un inhibidor de la fosfatasa Tyr no produjo cambios significativos en 32Niveles de P-ΔFosB (datos no mostrados). En conjunto, estos hallazgos revelaron que el ΔFosB se fosforila en los residuos de Ser y / o Thr en el cerebro y en las células PC12 y confirmó que este último es un buen sistema de cultivo celular en el que se seguirán estudiando los perfiles de fosforilación y degradación del ΔFosB.

CK2 pero no PKC o CaMKII fosforila ΔFosB in vitro

Como se describió anteriormente, el análisis de la secuencia de aminoácidos de ΔFosB reveló altas puntuaciones de predicción para los sitios de fosforilación de CK2, PKC y CaMKII. Para determinar cuáles de estas cinasas pueden fosforilar ΔFosB, realizamos una serie de in vitro Reacciones de fosforilación utilizando quinasas purificadas y ΔFosB recombinante purificado. Como se muestra en Figura 3 y XNUMXA, de las tres quinasas candidatas, solo CK2 fosforilaba ΔFosB de manera significativa. Además, se analizaron otras quinasas (por ejemplo, GSK3 y p70S6K) pero no pudieron fosforilar significativamente lateFosB (datos no mostrados). La caracterización adicional de la reacción de CK2 por análisis del curso del tiempo reveló que esta quinasa puede catalizar la incorporación de ∼0.5 mol de fosfato por mol de ΔFosB ( B). El hecho de que CK2 pueda fosforilar ΔFosB in vitro una considerable estequiometría (∼50%) sugiere una reacción fisiológicamente relevante. Luego estudiamos la cinética de esta reacción incubando CK2 en presencia de cantidades crecientes de ΔFosB purificado, y determinamos que CK2 fosforila ΔFosB con una Vmax de 5.8 pmol · min-1 · Μg-1 de enzima, un KM de 18.4 μm, y una kgato de 0.2 / s ( C). Los valores obtenidos para estos parámetros cinéticos apoyan aún más la relevancia fisiológica de esta reacción. Por ejemplo, el KM de CK2 para DARPP32, uno de sus sustratos más conocidos, es 3.4 μm, y el kgato es ∼0.3 / s (Girault et al., 1989); el KM para los rangos de ATP de ∼10 – 40 μm (Cochet et al., 1983; Silva-Neto y otros, 2002), y que para la caseína varía de ∼10 – 50 μm (Meggio et al., 1977; Pyerin et al., 1987). En conjunto, estos datos indican que ΔFosB es un sustrato de buena fe para CK2 in vitro.

Figura 3.

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Figura 3.

CK2 pero no PKC o CaMKII fosforila ΔFosB in vitro. La autorradiografía (panel superior) muestra el producto fosforilado, y el gel teñido con Coomassie (panel inferior) muestra el total de ΔFosB presente en la reacción. A, El ΔFosB recombinante purificado fue sometido a in vitro fosforilación por varias quinasas candidatas (tres de las cuales se muestran). BEl curso temporal y los análisis estequiométricos indican que CK2 puede fosforilar ΔFosB in vitro con una estequiometría de ∼50%. CEl análisis cinético de la reacción de CK2 reveló que ΔFosB es un auténtico in vitro sustrato La linealización de la reacción se muestra en una gráfica de doble recíproco (parte inferior), pero los parámetros cinéticos se derivaron de la curva de Michaelis-Menten (parte superior).

CK2 modula la fosforilación y estabilidad de ΔFosB en células intactas

Para evaluar la relevancia fisiológica de la fosforilación de ΔFosB mediada por CK2, se realizó un mapeo comparativo de fosfopéptidos utilizando in vitro ΔFosB fosforilado y fosforilado en células PC12. Después de SDS-PAGE y gel elución de 32P-ΔFosB (de la in vitro reacciones o del inmunoprecipitado de 32Células marcadas con P), la proteína se digirió con tripsina y los fosfopéptidos resultantes se sometieron a separación bidimensional. Este análisis reveló que el fosfopéptido principal de la reacción CK2 comigraba con uno de los dos fosfopéptidos principales de ΔFosB fosforilados en células PC12 ( A), mientras que los fosfopéptidos resultantes de la reacción de PKC o CaMKII (datos no mostrados) no lo hicieron. Hubo un segundo fosfopéptido ΔFosB presente en el mapa de las células PC12, pero debido a la incapacidad de cualquiera de las cinasas que hemos probado para generar un fosfopéptido similar in vitroActualmente no sabemos si este segundo fosfopéptido contiene un sitio de fosforilación diferente del otro fosfopéptido o si representa un péptido tríptico distinto que contiene el mismo sitio de fosforilación.

Figura 4.

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Figura 4.

CK2 modula la fosforilación y estabilidad de ΔFosB en células intactas. A, CK2 pero no PKC parece fosforilar ΔFosB en las células. Mapas bidimensionales de fosfopéptidos de ΔFosB fosforilados por CK2 o PKC in vitro o por células intactas de PC12. Las flechas muestran la migración del péptido fosforilado con CK2 pero no el fosforilado con PKC con uno de los fosfopéptidos ΔFosB obtenidos de las células PC12. B, La fosforilación de ΔFosB en células PC12 aumenta al tratar las células con el potente activador de CK2 (SP) y disminuye con el tratamiento con el inhibidor de CK2 DRB. Por el contrario, la fosforilación de ΔFosB en células PC12 no se vio afectada por el tratamiento con un activador de PKC (PMA) o el inhibidor específico de PKC calphostin-C (Calph). Se muestran un autorradiograma representativo (panel superior) e inmunotransferencia (panel inferior). C – FEfecto de la actividad de CK2 en la estabilidad de ΔFosB. Las figuras muestran el curso del tiempo (y el autorradiograma representativo) de la degradación de ΔFosB. Las células PC12 que expresan transitoriamente ΔFosB se sometieron a experimentos de pulso-persecución realizados en ausencia o presencia del inhibidor de CK2 DRB (C), el activador CK2 spermine (D), o el inhibidor de quinasa de amplio espectro H-8 (E), que se usó para controlar los efectos no específicos de DRB. F, Efecto de derribar la subunidad catalítica de CK2 en la estabilidad de ΔFosB. Las células PC12 se transfectaron con un ARNip no dirigido (Ctr) o ARNsi dirigidos a la rata CK2α y 24 y luego se transfectaron con un plásmido ΔFosB. El panel superior muestra inmunotransferencias de lisados ​​de células completas que muestran el efecto del ARNsi de CK2 en los niveles de proteína CK2 y ΔFosB. La correspondiente inmunotransferencia para β-tubulina se muestra como un control de carga.

Para abordar aún más la relevancia fisiológica de CK2 como una quinasa ΔFosB, tratamos las células PC12 que expresan ΔFB con dos fármacos que modulan la actividad de CK2. Como se muestra en Figura 4 y XNUMXB, La fosforilación de ΔFosB se redujo mediante el tratamiento de células PC12 con el inhibidor de CK2 permeable a células DRB (Meggio et al., 1990; Szyszka et al., 1995), y aumentado por el tratamiento con la poliamina espermina, conocido por ser un potente activador de CK2 (Cochet y Chambaz, 1983; Meggio et al., 1983). En contraste, el tratamiento de las células PC12 con el inhibidor de la PKC calphostin-C (Kobayashi et al., 1989; Tamaoki et al., 1990) o el activador PKC PMA (Schmidt y Hecker, 1975; Beh et al., 1989) no dio lugar a cambios significativos en la fosforilación de ΔFosB. En el caso de PMA, el ligero (y no significativo) aumento en 32El P-ΔFosB podría explicarse por un aumento en los niveles totales de ΔFosB causados ​​por este medicamento; de hecho, se ha informado que los ésteres de forbol inducen la expresión de varias proteínas de la familia Fos, incluyendo FosB (Yoza et al., 1992; Suh et al., 2004). Además, el tratamiento de células con el inhibidor de CaMKII permeable a células específico m-AIP (Ishida y Fujisawa, 1995; Stevens et al., 1999) tampoco resultó en una disminución de la fosforilación de ΔFosB (datos no mostrados). Juntos, estos resultados son consistentes con nuestros in vitro los hallazgos e indican que en las células intactas ΔFosB es probablemente fosforilada por CK2 pero no por PKC o CaMKII. El hecho de que la inhibición de CK2 no prevenga completamente la fosforilación de ΔFosB indica la existencia de sitios de fosforilación adicionales en la proteína.

A continuación, examinamos si CK2 desempeña un papel en la facturación de ΔFosB y por lo tanto en su estabilidad. Para este fin, realizamos experimentos de pulso-persecución utilizando células PC12 que expresan ΔFosB tratadas con el inhibidor CK2 o el activador CK2 utilizado en el estudio de fosforilación. Como se muestra en Figura 4 y XNUMXC, el tratamiento de células con el inhibidor de CK2 DRB tuvo un efecto significativo en la tasa de recambio de ΔFosB, evidenciado por el cambio en la forma de su curva de degradación, desde bifásica a una curva que está más cerca de la de una caída exponencial. Por el contrario, la presencia de la espermina activadora CK2 causó una disminución significativa en la tasa de degradación de ΔFosB, lo que llevó a la acumulación de la proteína durante las primeras horas de la persecución ( D).

Como ocurre con muchos activadores e inhibidores de la quinasa, la espermina y la DRB pueden tener efectos metabólicos fuera de la modulación de la actividad de CK2. De hecho, se ha demostrado que la DRB inhibe la quinasa asociada al factor de transcripción IIH (TFIIH) (Yankulov et al., 1995), que resulta en la inhibición de la transcripción mediada por la RNA polimerasa II. Debido a que este efecto podría posiblemente afectar la estabilidad de ΔFosB, analizamos el efecto del inhibidor de la quinasa de amplio espectro H-8 (Hidaka y Kobayashi, 1992) en turnoverFosB recambio a una concentración (200 μm) que inhibe la quinasa asociada a TFIIH pero no CK2 (Yankulov et al., 1995). Como se muestra en Figura 4 y XNUMXE, el tratamiento con H-8 no afectó la tasa de rotación de ΔFosB. Se obtuvieron resultados similares con H-7, otro inhibidor de quinasa de amplio espectro, utilizado en una concentración que inhibe la quinasa asociada a TFIIH pero no con CK2 (datos no mostrados). Estos datos apoyan aún más la interpretación de que la reducción en la estabilidad de ΔFosB causada por DRB es más probable que sea atribuible a la inhibición de CK2.

Para establecer aún más el papel de CK2 en la rotación de ΔFosB, investigamos las consecuencias de derribar CK2 a través de ARNsi. Realizamos estos experimentos con células PC12 que primero se transfectaron con un ARNip de control (no dirigido) o un ARNip que se dirige al ARNm de la subunidad catalítica de CK2 de rata (CK2α) y 24 h más tarde se transfectó con ΔFosB. Como se muestra en Figura 4 y XNUMXF, la transfección con el ARNsi CK2α de manera eficiente y específicamente redujo los niveles de proteína CK2α sin afectar los niveles de ΔFosB (panel superior). El análisis de pulso-persecución reveló que derribar CK2 resultó en un aumento significativo en la tasa de rotación de ΔFosB, como lo demuestra la degradación más rápida de la proteína. El hecho de que la inhibición de la actividad de CK2 (ya sea a través del tratamiento con DRB o siRNA) aumenta la rotación de ΔFosB y da como resultado la desaparición del componente de baja velocidad de la curva bifásica, mientras que la activación de CK2 mejora la fase lenta de la curva, proporciona un fuerte soporte para la idea de que CK2 desempeña un papel en la regulación de la estabilidad de ΔFosB.

CK2 fosforila ΔFosB en Ser27

Para comenzar a identificar los sitios en ΔFosB fosforilados por CK2, realizamos un análisis de fosfo-aminoácidos de ΔFosB recombinantes fosforilados por CK2 in vitro y de ΔFosB fosforilado en células PC12. Estos experimentos revelaron que, en ambos casos, el único fosfo-aminoácido detectado fue el fosfo-Ser ( A). Este hallazgo, junto con la estequiometría obtenida para el CK2. in vitro reacción de fosforilación (∼50%) ( B) y la presencia de un solo punto significativo en el mapa del fosfopéptido CK2 ( A), sugiere que la fosforilación de CK2 de ΔFosB está probablemente limitada a un solo residuo de serina. Esta conclusión es consistente con el análisis del sitio de consenso de fosforilación ( B), que predijo solo una serina candidata, es decir, Ser27, para CK2. El análisis taxonómico reveló que Ser27 está altamente conservado a través de la evolución entre los miembros de la familia Fos ( B), sugiriendo que puede tener una importante función fisiológica.

Figura 5.

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Figura 5.

CK2 Phosphorylates ΔFosB en Ser27. A, Análisis de fosfoaminoácido de CK2-fosforilado (in vitro) y PC12 phosphFosB fosforilado en células que muestra que, en ambos casos, el principal residuo fosforilado es la serina. BEl análisis de especies cruzadas de la secuencia de aminoácidos de FosB / ΔFosB reveló una alta conservación de Ser27 entre los miembros de la familia Fos, desde humanos hasta peces cebra (resaltado oscuro). Sin embargo, el residuo ácido en la posición + 3, que se requiere para el sitio de consenso CK2, no se conserva (resaltado claro). CLas células HeLa se transfectaron de forma transitoria con ΔFosB de tipo salvaje (WT) o ΔFosB que contenía una mutación puntual para sustituir a Ser27 con Ala (S27A). Las células se marcaron metabólicamente con 32PH3PO4 y tratado con vehículo o con espermina (SP) para activar CK2. Se muestran un autorradiograma representativo (panel superior) e inmunotransferencia (panel inferior) de los inmunoprecipitados de ΔFosB obtenidos. Se muestra el inmunoprecipitado de células transfectadas de forma simulada (vector).

Para determinar si Ser27 está fosforilado en ΔFosB, mutamos este residuo a Ala y analizamos las consecuencias sobre el estado de fosforilación de la proteína. Para este fin, utilizamos células HeLa (que pueden transfectarse con mayor eficiencia) para expresar de forma transitoria WT o S27A mutante ΔFosB. Aproximadamente 24 h después de la transfección, las células se marcaron metabólicamente con 32Se prepararon orofosfato de p y lisados ​​de células completas. Tras la inmunoprecipitación y SDS-PAGE, 32P-ΔFosB se detectó mediante autorradiografía y el total de ΔFosB por inmunotransferencia. Como se muestra en Figura 5 y XNUMXC (panel inferior), no se detectó ΔFosB en las células transfectadas con vector, mientras que las células transfectadas con WT o S27A mutante ΔFosB expresaron con éxito la proteína. Encontramos que la mutación S27A causó una reducción significativa (∼30%) en 32P--FosB niveles ( C, panel superior y gráfico), lo que indica que en las células vivas, ΔFosB se fosforila en Ser27. En un esfuerzo por establecer si el CK27 en realidad está fosforilado con Ser2, comparamos la capacidad del espina activador CK2 para modular la fosforilación de WT y S27A ΔFosB. Como habíamos observado previamente en células PC12 ( B), el tratamiento de las células HeLa con espermina aumentó significativamente la fosforilación de la proteína WT. El hecho de que este efecto fue significativamente disminuido por la mutación S27A ( C) apoya la interpretación de que Ser27 en ΔFosB es un sustrato fisiológico para CK2.

La fosforilación de Ser27 regula la estabilidad de ΔFosB

Habiendo establecido que la estabilidad de ΔFosB disminuye cuando se inhibe CK2 y se mejora cuando se activa CK2 ( ), y que CK2 fosforila ΔFosB en Ser27 ( ), predijimos que la prevención de la fosforilación de este sitio debería desestabilizar la proteína. Los experimentos de pulso-persecución realizados con células HeLa que expresan de forma transitoria el mutante WT o S27A ΔFosB revelaron que, como se predijo, la mutación S27A produjo un aumento significativo en la tasa de degradación de ΔFosB y una disminución concomitante en la vida media de la proteína ( A). Luego investigamos si este mecanismo regulador también se produce en la línea celular PC12, más parecida a una neurona. Estos experimentos revelaron que, como habíamos observado en células HeLa, la mutación puntual S27A causa una disminución dramática en la vida media de ΔFosB en células PC12 (de ∼11 a ∼4 h) ( B). El hecho de que esta desestabilización es similar a la causada por la inhibición de CK2 o la caída ( ) proporciona apoyo adicional a la idea de que la fosforilación de Ser2 mediada por CK27 regula la estabilidad de ΔFosB. Se obtuvo evidencia adicional del papel regulador de la fosforilación de Ser27 en el recambio de la proteína ΔFosB utilizando un ser27 fosfomimético a la mutación Asp (S27D). La mutación S27D se considera fosfomimética, porque coloca un gran grupo cargado negativamente (carboxilo) en el aminoácido 27 y, por lo tanto, imita en parte la fosforilación de Ser27. Como se muestra en Figura 6 y XNUMXC, la mutación S27D causó el efecto opuesto de la mutación S27A y dio como resultado una proteína significativamente más estable que la proteína WT. Al igual que el efecto obtenido después de la activación de CK2 ( D), la mutación S27D resultó en la acumulación y por lo tanto aumentó los niveles de ΔFosB durante las primeras horas de persecución.

Figura 6.

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Figura 6.

La fosforilación de Ser27 regula la estabilidad de ΔFosB. A, CAnálisis de pulso-persecución que muestra el efecto de la fosforilación de Ser27 en la tasa de rotación de ΔFosB. Se muestran el perfil de degradación y las vidas medias estimadas de ΔFosB (WT) de tipo salvaje, el mutante Ser27 to Ala (S27A) y el ser27 fosfomimético a mutante Asp (S27D). Los mismos hallazgos se obtuvieron en células HeLa (A) y células PC12 (B, C).

La fosforilación de Ser27 estabiliza ΔFosB al prevenir su degradación proteasomal

Para comenzar a dilucidar el mecanismo por el cual la fosforilación de Ser27 estabiliza ΔFosB, examinamos la capacidad de los inhibidores de proteasoma MG132 (Palombella et al., 1994; Tsubuki et al., 1996) y epoxomicina (Hanada et al., 1992; Kim et al., 1999) para modular la tasa de degradación de WT y S27A mutante ΔFosB. Los experimentos de pulsos de persecución se realizaron utilizando células PC12 infectadas con un HSV recombinante que expresaba WT o S27A ΔFosB y se trataron con DMSO o con uno de los dos inhibidores del proteasoma. Estos experimentos revelaron que aunque la tasa de degradación de la proteína WT es relativamente insensible a la presencia de cualquiera de los dos inhibidores del proteasoma ( A), la del mutante S27A es sensible a estos fármacos ( B). Esto indica que, a diferencia de la proteína WT, el mutante S27A es un objetivo de degradación proteasomal. De hecho, el tratamiento de células con MG132 o epoxomicina revirtió completamente el efecto de la mutación S27A en la tasa de degradación de ΔFosB, evidenciado por un aumento en la vida media del mutante S27A de ∼4 a ∼9 h para MG132 y hasta ∼ 12 h para epoxomicina ( B). En conjunto, estos hallazgos indican que la fosforilación de ΔFosB en Ser27 protege a la proteína de la degradación proteasomal y, por lo tanto, es esencial para su inusual estabilidad.

Figura 7.

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Figura 7.

La fosforilación de Ser27 estabiliza ΔFosB al prevenir su degradación proteasomal. A, BAnálisis de pulso-persecución con células PC12 infectadas con HSV que muestran el perfil de degradación y las vidas medias estimadas de ΔFosB de tipo salvaje (A) o S27A ΔFosB (B) en ausencia o presencia de cualquiera de los dos inhibidores del proteasoma [MG132 y epoxomicina (Epoxo)]. Tenga en cuenta el hecho de que ninguno de los fármacos tiene un efecto significativo en el recambio de ΔFosB de tipo salvaje, mientras que el tratamiento de las células con cualquiera de los inhibidores del proteasoma resultó en la estabilización de S27A ΔFosB. C, Un modelo para el papel de la fosforilación de Ser27 en la capacidad de ΔFosB para mediar en la plasticidad cerebral a largo plazo. Una vez inducida, una porción de ΔFosB se estabiliza en el cerebro por la fosforilación de S2 mediada por CK27. Esto resulta en su acumulación, que a su vez resulta en cambios duraderos en la expresión génica. Estos cambios estables en la expresión génica contribuyen a adaptaciones de comportamiento estables. Por el contrario, la desfosforilación de S27 por las fosfatasas de Ser / Thr PP1 y / o PP2A da como resultado la desestabilización de la proteína y su procesamiento por parte de la maquinaria proteasomal.

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Discusión

En el presente estudio, mostramos que ΔFosB tiene una vida media de ∼10 h en cultivo celular, lo que lo hace estable en comparación con FosB de longitud completa y la mayoría de los otros factores de transcripción inducibles, cuyas vidas medias en cultivo celular pueden ser tan cortas Como unos minutos y rara vez superan los 3 h. (Hann y Eisenman, 1984; Dobrazanski y otros, 1991; Roberts y Whitelaw, 1999; Ferrara et al., 2003; Hirata et al., 2004). Además, encontramos que ΔFosB está fosforilado en el cerebro y que su fosforilación es sensible al ácido okadaico inhibidor de PP1 / PP2A. Nuestros estudios de cultivo celular demuestran que la estabilidad de ΔFosB está modulada por CK2, con una mayor actividad de CK2 que estabiliza la proteína. Finalmente, nuestros hallazgos sugieren que CK2 fosforila ΔFosB en una serina del extremo N altamente conservada (S27) y demuestra que la fosforilación de S27 protege a ΔFosB de la degradación proteasomal. Por lo tanto, proponemos un modelo por el cual la fosforilación de ΔFosB en S27 por CK2 es un mecanismo regulador crítico del volumen de negocios de ΔFosB ( C). Dicha estabilización mediada por fosforilación de ΔFosB es funcionalmente importante, porque se ha demostrado que los niveles elevados de ΔFosB en regiones cerebrales particulares regulan directamente numerosos genes neuronales in vivo y ejercer potentes efectos de comportamiento en modelos animales de varios trastornos neuropsiquiátricos (ver Introducción).

Aunque la fosforilación es una forma rápida y reversible de regular la actividad transcripcional de ciertos factores de transcripción, como el CREB (proteína de unión al elemento de respuesta cAMP) (Bohmann, 1990), la modulación de la degradación de los factores de transcripción proporciona una forma de regulación aún más potente (menos fácilmente reversible) (Desterro et al., 2000). Los factores de transcripción cuya actividad funcional está regulada al nivel de su degradación incluyen NFκB (Desterro et al., 2000), c-Myc (Sears et al., 1999), y c-Fos (Ferrara et al., 2003), entre otros. En muchos casos, la fosforilación es un regulador clave de la estabilidad de un factor de transcripción, como se ha demostrado para c-Fos (Okazaki y Sagata, 1995; Tsurumi et al., 1995), Antígeno relacionado con Fos-1 (Fra-1) (Vial y Marshall, 2003), Fra-2 (Manabe et al., 2001), c-jun (Fuchs et al., 1996), JunB (Fuchs et al., 1997), ATF2 (Fuchs et al., 2000), y p53 (Buschmann et al., 2001). Por lo tanto, nuestros estudios agregan ΔFosB a esta lista de factores de transcripción cuya actividad funcional se regula a través de su estabilidad dependiente de la fosforilación.

CK2 es una quinasa Ser / Thr ubicua y constitutivamente activa que tiene> 300 supuestos sustratos identificados hasta el momento y está implicada en múltiples procesos biológicos, incluida la muerte celular y la supervivencia (Litchfield, 2003; Unger et al., 2004), respuestas de estrés celular (Yanagawa et al., 1997; Kato et al., 2003), y la reparación del ADN y la remodelación de la cromatina (Barz et al., 2003; Krohn et al., 2003). Más de un tercio de los sustratos putativos de CK2 son proteínas involucradas en la regulación de la expresión génica (Meggio y Pinna, 2003). De hecho, se ha demostrado que CK2 es una quinasa nuclear prominente (Krek et al., 1992) (para una revisión, ver Yu et al., 2001) e interactuar con los dominios bZIP de varios factores de transcripción (Yamaguchi et al., 1998). También se ha demostrado que la fosforilación mediada por CK2 modula la degradación (ya sea mejorándola o disminuyéndola) de muchas proteínas, incluida la IkB (Schwarz et al., 1996), PTEN (Torres y Pulido, 2001), conexión de la lente (Yin et al., 2000), proteína asociada a la cromatina HMG1 (Wisniewski y otros, 1999), y varios factores de transcripción como el HMGB (Stemmer et al., 2002), Myf-5 (Winter et al., 1997), y c-Myc (Channavajhala y Seldin, 2002). CK2 es más abundante en el cerebro (Alcazar et al., 1988; Girault et al., 1990), y su actividad se ha implicado en muchos aspectos de la función cerebral, incluida la supervivencia neuronal (Boehning et al., 2003), diferenciación (Nuthall et al., 2004), función del canal iónico (Jones y Yakel, 2003; Bildl y otros, 2004), y potenciación a largo plazo y plasticidad neuronal (Diaz-Nido et al., 1992; Lieberman y Mody, 1999; Reikhardt y otros, 2003).

A pesar de esta creciente evidencia del papel de CK2 en la regulación de la función neuronal, poco se sabe sobre qué controla su actividad. Se cree que CK2 es constitutivamente activo, y la regulación de su capacidad para fosforilar sustratos específicos se basa principalmente en los cambios en su localización intracelular (p. Ej., Citosol versus núcleo) (Ahmed y Tawfic, 1994; Yu et al., 1999). Esta información plantea una pregunta importante sobre qué señales se requieren para inducir la acumulación de osFosB en el cerebro después de la estimulación crónica ( C). Un requisito es la activación repetida de la FOC gen e inducción del ARNm de ΔFosB (Chen et al., 1995). Nuestros datos indican que la fosforilación de CK2 de ΔFosB es crítica para su estabilidad, lo que sugiere que una segunda señal puede ser necesaria para los efectos a largo plazo de ΔFosB en la expresión génica, es decir, una señal que estimula la fosforilación de la proteína por CK2. Esto podría implicar la activación de CK2 por algún mecanismo desconocido o su translocación al núcleo. Alternativamente, la fosforilación de CK2 de ΔFosB puede ser constitutiva, de modo que a medida que la proteína osFosB se traduce en respuesta a cada estímulo, una parte de ella se fosforila y se estabiliza, de modo que con la estimulación repetida se acumula a niveles altos en las neuronas afectadas.

Nuestros hallazgos muestran que CK2 y S27 probablemente no son la única quinasa y el sitio responsable de la fosforilación de ΔFosB, porque ni la inhibición de CK2 ni la mutación de S27A fueron capaces de prevenir completamente la fosforilación de ΔFosB. De la misma manera, el hecho de que la mutación S27A resulte en una reducción del 30% en fosfo-ΔFosB sostiene que S27 es un sitio de fosforilación importante en la proteína. Sin embargo, estamos investigando otras supuestas quinasas y sitios de fosforilación en ΔFosB. En última instancia, también será importante analizar la fosforilación de S27 y cualquier otro sitio de fosforilación en ΔFosB en el cerebro in vivo después de varios tipos de estimulación crónica, por ejemplo, mediante el uso de espectrometría de masas o anticuerpos fosfoespecíficos.

Como se mencionó anteriormente, S27 en ΔFosB está altamente conservado a lo largo de la evolución y entre otras proteínas de la familia Fos. Sin embargo, el sitio de consenso para CK2 no es: como se muestra en Figura 5 y XNUMXB, solo FosB / ΔFosB (y el xenólogo de pez cebra), pero no c-Fos o Fra-2, poseen un residuo ácido en + 3, un determinante clave de la fosforilación de CK2 (Marin et al., 1986; Meggio et al., 1994). Por lo tanto, la falta de fosforilación de CK2 en S27 puede explicar por qué otras proteínas de la familia Fos no son tan estables como ΔFosB. Sin embargo, esto no explica por qué FosB de longitud completa, que tiene el mismo sitio de consenso CK2 que ΔFosB, no está estabilizado de manera similar. No sabemos si el FKB de longitud completa está fosforilado por CK2 en este residuo conservado. Los únicos informes de FosB (Skinner et al., 1997) y c-fos (Okazaki y Sagata, 1995; Chen et al., 1996) la fosforilación describe los sitios en la región C-terminal de estas proteínas, que está ausente en ΔFosB. La potencial fosforilación de las proteínas de la familia FosB de longitud completa y otras proteínas de Fos por CK2 requiere una investigación directa. Sin embargo, incluso si están fosforiladas, se sabe que las otras proteínas de la familia Fos contienen motivos en sus extremos C que se dirigen a las proteínas para una rápida degradación (Papavassiliou et al., 1992; Jariel-Encontre et al., 1997; Acquaviva et al., 2002). Por ejemplo, se ha demostrado que un tramo de ∼21 residuos presentes en el término C de todas las proteínas de la familia Fos, pero ausente en ΔFosB, actúa como un dominio desestabilizador para c-Fos (Acquaviva et al., 2001). Encontramos que aunque esta secuencia desestabiliza de manera similar FosB de longitud completa (Carle et al., 2004), la ausencia de este dominio en ΔFosB no explica completamente su estabilización. Más bien, la combinación de la ausencia de este dominio C terminal y la fosforilación de Ser27 parece explicar completamente la diferencia aproximadamente cinco veces mayor en la estabilidad entre ΔFosB y FosB.

Aunque la degradación de las proteínas de la familia Fos es compleja y no se comprende completamente, la degradación del proteasoma parece ser la principal vía involucrada (Salvat et al., 1999; Acquaviva et al., 2002; Ferrara et al., 2003). Los datos presentados aquí, en los que los inhibidores del proteasoma no alteran significativamente la tasa de degradación de FosB, sostienen que, a diferencia de otras proteínas de la familia Fos, ΔFosB evade el proteasoma 26S, y esto desempeña un papel central en su estabilización. Por lo tanto, proponemos un esquema por el cual la estabilidad mejorada de ΔFosB es atribuible a la combinación de dos factores principales: (1) la ausencia de un dominio desestabilizador C-terminal y (2) la fosforilación de S27 por CK2.

En resumen, el presente estudio proporciona una visión mecanicista de por qué ΔFosB, un producto del gen temprano inmediato FOCEs, a diferencia de todos los demás miembros de la familia Fos, una proteína relativamente longeva. Aunque se cree que otras proteínas de la familia Fos median en el acoplamiento rápido pero transitorio del estímulo-transcripción (Morgan y Curran, 1995), la estabilidad relativa de ΔFosB le confiere la capacidad de mediar en los cambios transcripcionales de mayor duración inducidos por la estimulación crónica. Esto apoya la opinión de que ΔFosB funciona como un cambio molecular sostenido en el cerebro, convirtiendo gradualmente las respuestas agudas en adaptaciones crónicas. La identificación de la fosforilación de Ser27 como un mecanismo central para la estabilidad de ΔFosB abre nuevos caminos para el desarrollo de medios para regular la función de ΔFosB y, por lo tanto, modular sus efectos a largo plazo sobre la plasticidad neural y conductual.

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Notas a pie de página

  • Recibido 21 de noviembre, 2005.
  • Revisión recibida febrero 21, 2006.
  • Aceptado abril 2, 2006.
  • Este trabajo fue apoyado por una Alianza Nacional para la Investigación sobre la Esquizofrenia y la Depresión Young Investigator Award a PGU, un Instituto Nacional sobre el Abuso de Drogas (NIDA), el Servicio de Investigación Nacional Award a PGU, y las subvenciones del National Institute of Mental Health y NIDA a la EJN. gracias al Dr. James Bibb por su ayuda con el in vitro ensayos de fosforilación, el Dr. Ming-Hu Han por su ayuda en la preparación de cortes de cerebro utilizados para el marcaje metabólico, y el Dr. Rachael Neve por su ayuda con el empaquetamiento de los HSV recombinantes.
  • Dirección actual de G. Rudenko: Instituto de Ciencias de la Vida y Departamento de Farmacología, Universidad de Michigan, 210 Washtenaw Avenue # 3163A, Ann Arbor, MI 48109-2216.
  • La correspondencia debe ser dirigida a Eric J. Nestler, 5323 Harry Hines Boulevard, Dallas, TX 75390-9070. Email: [email protected]

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