Cdk5 fosforila el receptor de dopamina D2 y atenúa la señalización descendente (2013)

Comentarios: Parece mostrar que Cdk5 causa una disminución de la regulación de los receptores D2 de dopamina. Sorprendentemente, el factor de traducción deltafosb induce la producción de Cdk5.


Jeong J, Park YU, Kim DK, Lee S, Kwak Y, et al. (2013) PLoS ONE 8 (12): e84482. doi: 10.1371 / journal.pone.0084482

Resumen

El receptor D2 de dopamina (DRD2) es un receptor clave que media las funciones cerebrales asociadas con la dopamina, como el estado de ánimo, la recompensa y la emoción. La quinasa 5 dependiente de ciclina (Cdk5) es una serina / treonina quinasa dirigida por prolina cuya función se ha implicado en el circuito de recompensa cerebral. En este estudio, revelamos que el residuo de serina 321 (S321) en el tercer ciclo intracelular de DRD2 (D2i3) es un sitio regulador novedoso de Cdk5. Cdk5 dependiente de la fosforilación de S321 en el D2i3 se observó en in vitro y sistemas de cultivo celular.

También observamos que la fosforilación de S321 afectó la expresión de la superficie estimulada por agonistas de DRD2 y disminuyó el acoplamiento de la proteína G a DRD2. Además, la vía de cAMP descendente se vio afectada en el sistema heterólogo y en los cultivos neuronales primarios de embriones knockout p35 probablemente debido a la actividad inhibitoria reducida de DRD2. Estos resultados indican que la fosforilación de S5 mediada por Cdk321 inhibe la función DRD2, lo que proporciona un nuevo mecanismo regulador para la señalización de dopamina.

Figuras

Cita: Jeong J, Park YU, Kim DK, Lee S, Kwak Y, et al. (2013) Cdk5 fosforila el receptor D2 de dopamina y atenúa la señalización en sentido descendente. PLoS ONE 8 (12): e84482. doi: 10.1371 / journal.pone.0084482

Editor: James Porter, Universidad de Dakota del Norte, Estados Unidos de América

Recibido: Mayo 20, 2013; Aceptado: Noviembre 14, 2013; Publicado: 31 diciembre 2013

Copyright: © 2013 Jeong et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la Licencia Creative Commons, que permite el uso, la distribución y la reproducción sin restricciones en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente estén acreditados.

Fondos: Este trabajo fue apoyado por los subsidios (NRF-2012R1A2A2A01012923 y NRF-2012R1A4A1028200) de parte del gobierno de Corea (MSIP), Esta información ha sido validada para usted en este momento. Programa de Investigación Básica de MSIP (2012-2). SKP recibió los Premios de Jóvenes Investigadores de la Alianza Nacional para la Investigación sobre la Esquizofrenia y la Depresión (NARSAD) de 1 y 2033117. Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Conflicto de intereses: Los autores han declarado que no existen intereses en pugna.

Introducción

La señalización de la dopamina está involucrada en varias funciones cerebrales, incluida la coordinación motora, el control del estado de ánimo y los mecanismos de recompensa [ 1 ]. Un componente importante de la señalización de dopamina en vertebrados es ejercido por neuronas espinosas del medio estriado (MSN) que expresan selectivamente un subconjunto de receptores de dopamina y reciben información dopaminérgica principalmente del área ventral tegmental (VTA) y la sustancia negra (SN)) [ 2 ]. Los receptores de dopamina son receptores acoplados a la proteína G (GPCR) con siete dominios transmembrana y constan de dos subtipos, D1-like y D2-like, que median acciones recíprocas en la señalización de dopamina [ 1 ]. Por ejemplo, los receptores similares a D1 de dopamina (D1, D5) activan la adenilil ciclasa a través de Gαs e incrementa el nivel intracelular de AMPc, pero los receptores similares a D2 de dopamina (D2, D3, D4) inhiben la adenilil ciclasa a través de Gαi y disminuir el nivel intracelular de cAMP. [ 1 ], [ 3 ].

Entre los receptores de dopamina, el receptor D2 (DRD2) está implicado en la fisiopatología de múltiples trastornos psiquiátricos mayores, incluida la esquizofrenia y la adicción a las drogas. [ 4 ], de modo que muchos fármacos antipsicóticos se dirijan al menos parcialmente a DRD2. También se sabe que la actividad DRD2 se correlaciona bien con las consecuencias de comportamiento de las drogas de abuso en modelos animales. [ 5 ]. Los antidepresivos y la eficacia del estabilizador del estado de ánimo también se han relacionado con alteraciones en la expresión de la superficie celular de DRD2 o señalización intracelular descendente mediada por PKA, ERK y GSK3 [ 1 ], [ 4 ], [ 6 ]. A pesar de estos roles críticos para DRD2 en el cerebro, los mecanismos reguladores detallados que confieren heterogeneidad y complejidad a las propiedades de DRD2 no se comprenden completamente.

Las líneas de evidencia convergentes indican que múltiples modificaciones postraduccionales están involucradas en el ajuste fino de la actividad DRD2. La glicosilación extensa de DRD2 se reveló en los primeros estudios de etiquetado de afinidad fotográfica [ 7 ], y la formación de enlaces disulfuro dentro de DRD2 también se identificó como una modificación importante para la unión del ligando [ 8 ]. Además, los sitios de fosforilación de DRD2 se identificaron inicialmente por in vitro Ensayo con radioisótopos, que proporciona rutas para varias vías reguladoras mediadas por varias quinasas. [ 9 ]. De hecho, la proteína quinasa C (PKC) regula la movilización mediada por DRD2 del calcio intracelular y modula la interacción de DRD2 con las proteínas del citoesqueleto. [ 10 ]. La fosforilación por GPCR quinasa 2 (GRK2) regula los patrones de resensibilización inducidos por agonistas de DRD2 [ 11 ].

La quinasa 5 dependiente de ciclina (Cdk5) es una serina / treonina quinasa dirigida por prolina que tiene actividad preferencial debido a la expresión específica del cerebro de sus activadores esenciales, p35 y p39 [ 12 ]. Cdk5 está involucrado en varios procesos neuronales, que incluyen la migración neuronal y la guía de axones, y los ratones nulos Cdk5 y p35 muestran defectos en las capas corticales [ 13 ]. Recientemente, se demostró que la fosforilación de WAVE1 y efexina por Cdk5 regula la morfogénesis de la columna dendrítica [ 14 ]. Además, Cdk5 también regula los niveles de expresión en la superficie del receptor NMDA, NR2B y las corrientes de NMDA mediadas por NR2A. [ 15 ], [ 16 ]. Cabe destacar que múltiples evidencias sugieren una relación íntima entre Cdk5 y el sistema de dopamina. Cdk5 fosforila la tirosina hidroxilasa (TH), regula su estabilidad y mantiene la homeostasis dopaminérgica. [ 17 ]. En las neuronas postsinápticas, cuando el residuo T75 de la dopamina y la fosfoproteína regulada por AMP-32kD (DARPP-32) se fosforila por Cdk5, puede inhibir la actividad de la PKA y, por lo tanto, inhibir la dopamina. [ 18 ]. Curiosamente, cuando la cocaína, un agonista indirecto de los receptores de dopamina, se administra de forma crónica en ratas, el ARNm y los niveles de proteína de Cdk5 aumentan en las neuronas espinosas medias. [ 19 ]. En conjunto, Cdk5 parece estar involucrado en adaptaciones sinápticas inducidas por fármacos. En este estudio, mostramos una interacción funcional de DRD2 y Cdk5 que extiende aún más el papel de Cdk5 en la señalización de dopamina.

Materiales y Métodos

Anticuerpos

Los sueros anti-conejo se produjeron contra péptidos que contenían fosfo-serina 321 (pS321) del tercer bucle intracelular de DRD2 (D2i3). Se utilizó fosfo-péptido, CNPDpSPAKPEK (PEPTRON), para hacer una columna conjugada con péptido para la purificación por afinidad (20401, PIERCE). El anticuerpo anti-pS321 se enriqueció con un sistema de purificación por afinidad siguiendo las instrucciones del fabricante. El fosfo-anticuerpo purificado se almacenó en PBS con 0.1% de azida de sodio y 0.1% de gelatina. El anticuerpo anti-ratón anti-Cdk5 (sc-249) y el anticuerpo anti-conejo anti-p35 (sc-820) se usaron para la transferencia de Western e inmunocitoquímica de Cdk5 / p35. Se usó anticuerpo anti-ratón anti-GFP (sc-9996) para la inmunoprecipitación y la transferencia Western de DRD2-GFP. Anticuerpo anti-conejo anti-FLAG (sc-807), anticuerpo anti-conejo anti-HA (sc-805), anticuerpo anti-ratón anti-GST (sc-138) y anticuerpo anti-ratón anti-GAPDH (sc 32293) fueron adquiridos de Santa Cruz Biotechnologies.

Animales

El ratón knockout p35 fue un regalo del Dr. Katsuhiko Mikoshiba en el Instituto de Ciencias del Cerebro RIKEN en Japón y se usó para el cultivo de neuronas primarias. Los conjuntos de cebadores para el genotipado fueron 5′-GGTCTCCTCTTCTGTCAAGAAG, 5′-GCTCTGCTAGACACATACTGTAC y 5′- TCCATCT GCACGAGACTAGT como se describió anteriormente [ 20 ]. Se usaron ratones ICR y ratas Sprague Dawley para la preparación del lisado cerebral. Todos los procedimientos para animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Ciencia y Tecnología de Pohang.

Construcciones de plásmidos

La isoforma DRD2 humana en un vector plasmídico EGFP-N1 y el tercer bucle intracelular de DRD2 (residuos de aminoácidos 212-373, incluidos los residuos de aminoácidos adicionales de 29 exclusivos de la isoforma de pFLAG-CMV-XNXX, fue un vector plásmido pFLAG-CMV-XNXX). Se insertó Cdk2 humano en un vector de plásmido pCMV-HA y se insertó p2 humano en un vector de plásmido pcDNA 5. Se insertó Cdk35 humano bajo un promotor de citomegalovirus (CMV) junto con p3.1 humano en un vector pcDNA 5 para crear un constructo de expresión dual (Cdk35 / p3.1) para inmunocitoquímica, ensayo de internalización del receptor, [35S] -GTPγEnsayo de unión a S, ensayo de unión a radioligando e inmunoensayo enzimático de cAMP.

In Vitro Ensayo de quinasa

Vinculado a IP in vitro El ensayo de quinasa se realizó como sigue. Un cerebro de ratón completo fue lisado en 3 mL de eritrocitos lisis tampón (ELB) (50 mM Tris (pH 8.0), 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40) por 20 tiempos de un homogeneizador de homogeneizado. . Los lisados ​​se incubaron en hielo durante 30 min, se sonicaron y se centrifugaron a 16,000 × g para 10 min. Los sobrenadantes se inmunoprecipitaron con anticuerpo anti-p35 anti-conejo para obtener un complejo Cdk5 / p35 activo. El complejo Cdk5 / p35 y la proteína de fusión GST purificada se mezclaron con adenosina 5-triposfato, [γ-32P] (NEG-502H, PerkinElmer) e incubado en tampón quinasa (30 mM HEPES (pH 7.2), 10 mM MgCl2, 0.2 mM DTT) para 1 h a temperatura ambiente [ 18 ], [ 21 ]. El complejo Cdk5 / p25 purificado (14 – 516, Millipore) también se usó para in vitro Ensayo de quinasa como se describe anteriormente. El tampón de carga de muestras 2 × se añadió a la mezcla de reacción y se hirvió a 100 ° C. Las muestras se sometieron luego a SDS-PAGE y el gel seco se evaluó mediante autorradiografía.

Cromatografía de líquidos (LC): análisis de espectrometría de masas (MS) / MS

La proteína GST-D2i3 recombinante se analizó mediante LC-MS / MS después de un enlace IP in vitro Ensayo de quinasa. Realizamos la identificación de péptidos de los datos de LC-MS / MS con X !! Tandem (versión Dec-01-2008). Cada archivo de datos RAW se convirtió primero a mzXML utilizando la tubería trans-proteómica (TPP; versión 4.3). Las exploraciones de MS / MS en los mzXML convertidos se sometieron luego a una búsqueda en contra de la base de datos de secuencias de proteínas de ratón UniProt (versión 2010_07) que incluye la secuencia GST-D2i3 utilizando X! Tandem. La tolerancia se estableció en 3 Da para iones precursores y 2 Da para iones fragmentados. Se utilizó especificidad enzimática para tripsina. Se usaron opciones de modificación variable para la carbamidometilación de la cisteína (57.021 Da), la oxidación de la metionina (15.995 Da), la hidrólisis de la asparagina (0.987 Da) y la fosforilación de la serina (79.966 Da).

Inmunoprecipitación

La inmunoprecipitación se realizó en lisados ​​celulares en tampón de lisis ELB. Se añadió anticuerpo anti-GFP a los lisados ​​y se incubó durante 3 h a 4 ° C. Los inmunocomplejos se purificaron utilizando proteína-A agarosa. Los precipitados se incubaron con tampón de carga de muestras de SDS durante 30 min a 37 ° C, y se sometieron a SDS-PAGE y transferencias de Western.

Ensayo de extracción de GST

10 µg de GST purificada y GST – D2i3 se incubaron con lisado de cerebro de rata para 1.5 h a 4 ° C. 30 µL de bolas de Sepharose 4B conjugadas con glutatión (GSH) (17-0756-01, GE Healthcare) equilibradas con tampón de lisis se agregaron y se incubaron para 1 h adicional. Las perlas se recogieron por centrifugación en 2,000 ×g y enjuagado con tampón de lisis 4 veces. [ 22 ], [ 23 ]. Los precipitados se analizaron mediante transferencia de Western usando anticuerpos anti-Cdk5 y anti-p35.

Inmunocitoquimica

Células HEK 293 transfectadas y neuronas del cuerpo estriado cultivadas en cubreobjetos se lavaron una vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se fijaron por inmersión en paraformaldehído con 4 frío / PBS durante 30 mín. El anticuerpo primario se diluyó en la solución de bloqueo (2% suero de caballo y 1% Triton X-100 en PBS). Se utilizaron como anticuerpos secundarios el anticuerpo anti-ratón conjugado con Alexafluor-647 (A20990, Invitrogen) y el anticuerpo anti-conejo conjugado con Alexafluor-568 (A11011, Invitrogen). Hoechst se utilizaron para la tinción del núcleo. Las imágenes se obtuvieron mediante microscopía confocal (Olympus, FluoView-1000).

Ensayo de internalización del receptor

24 h después de la transfección, las células se trataron con quinpirol µM 1 (Q102, Sigma) durante 30 min y 90 min a 37 ° C. Las células se resuspendieron en 2 mL PBS frío y se utilizaron alícuotas de 200 µL para cada reacción. Los tratamientos farmacológicos se llevaron a cabo a temperatura ambiente para 3 h en las siguientes concentraciones; 3 nM [3H] -spiperona (NET-565, PerkinElmer), 3 µM ​​sulpirida (895, TOCRIS), 10 µM ​​haloperidol (H1512, Sigma). Hidrofóbico [3Se usó H] -spiperona para marcar los receptores expresados ​​totales y se usó sulpirida hidrófila para reemplazar el receptor membranoso unido [3Señales de H] -spiperone. Las señales de los receptores asociados a la membrana se calcularon restando los valores de los receptores intracelulares de los valores totales de receptores expresados. Las células se filtraron en un filtro GF / B (Millipore) y se lavaron 3 veces con tampón de lavado (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Los filtros se secaron y la radioactividad residual se midió utilizando un contador de centelleo líquido. [ 24 ].

Preparación de la membrana celular

Las células confluentes en placas de cultivo 100 mm después de la transfección se lavaron con PBS enfriado con hielo y se recogieron en tampón HME 1 mL (HEPES mNX XXUMX (pH 25), MgCl mM 7.5)2, 1 mM EDTA). Los lisados ​​homogeneizados se centrifugaron con 500 x g durante 15 min y los sobrenadantes se centrifugaron posteriormente con 36,000 x g durante 30 min. Las bolitas resuspendidas en tampón HME se usaron para ensayos.

[35S] -GTPγEnsayo de unión S

Las fracciones de la membrana celular se preincubaron con 1 µM ​​quinpirol (Q102, Sigma) en el tampón de ensayo (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl).2, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA y 0.01 mM GDP) para 10 mín. El35S] -GTPγSe añadió S (NET-030H, PerkinElmer) a la concentración final de 3 nM en 30 µL y se incubó adicionalmente durante 90 min. 170 µL de tampón helado (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, y se agregó 0.1 mM GTP) para detener la reacción. Las membranas se filtraron en un filtro GF / B (Millipore) y se lavaron 3 veces con tampón de lavado (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Los filtros se secaron y la radioactividad se midió utilizando el contador de centelleo. [ 25 ], [ 26 ].

Ensayo de unión de radioligando

Las membranas celulares preparadas se incubaron con 0.01 nM [3H] -spiperona (NET-565, PerkinElmer) y concentraciones crecientes de quinpirol (Q102, Sigma) para 30 min en el tampón de ensayo (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA). Las membranas se filtraron en un filtro GF / B (Millipore) y se lavaron 3 veces con tampón de lavado (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). La reacción se terminó por filtración rápida a través de filtros GF / C. La radioactividad residual se midió utilizando un contador de centelleo líquido. [ 27 ][ 29 ].

inmunoensayo de enzimas de cAMP

Las células HEK 293 transfectadas se trataron previamente con rolipram µM 10 (R6520, Sigma) para 1 h, y luego se trataron con forskolina XMUMM µM (F0.1, Sigma) y concentraciones crecientes de quinpirol (Q6886, Sigma) para 102 min. Las neuronas estriadas cultivadas primarias se trataron con rolipram µN 30 para 10 h, y luego con dopamina µM 1 µm para 1 h [ 22 ]. Los lisados ​​celulares se prepararon con 0.1 M HCl y los niveles de cAMP se detectaron mediante el kit de inmunoensayo enzimático cAMP (Sapphire Bioscience) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Neurona estriada cultivada primaria

El área estriada se aisló del cerebro embrionario de ratón (E15). El tejido disecado se disocia en medios esenciales mínimos (MEM) (11095, Invitrogen) que contienen 0.25% de tripsina (T4549-100, Sigma) y 0.1% DNasa I para 6 min a 37 ° C. Las células se volvieron a suspender en el medio de recubrimiento (MEM con 0.01 M HEPES (pH 7.4) y 10% (vol / vol) de suero de caballo (16050-122, GIBCO)). Las neuronas fueron cultivadas por 7 días. in vitro (DIV 7) en MEM con suplemento de B27 (17504-044, Invitrogen) antes de aplicarse a inmunoensayos de enzimas de AMPc.

Resultados

Cdk5 fosforila la serina 321 en el tercer ciclo intracelular de DRD2 in vitro

Para identificar nuevos sustratos Cdk5, se realizó una búsqueda sistemática utilizando (S / T) PX (K / H / R) como las secuencias de consenso de reconocimiento Cdk5 [ 30 ] e identificó DRD2 como un sustrato candidato. La secuencia de consenso, incluida la serina 321, se encuentra en el tercer bucle intracelular de DRD2 (D2i3) donde se han implicado varios mecanismos reguladores [ 3 ], [ 10 ], [ 11 ]. La secuencia se conserva evolutivamente en DRD2 en vertebrados, lo que implica una importancia funcional del residuo (Fig. 1A).

uña del pulgar

Figura 1. Cdk5 fosforila la serina 321 en el tercer ciclo intracelular de DRD2 in vitro.

(A) Alineación de la secuencia de aminoácidos que muestra las regiones conservadas del DRD2 de varias especies (sombreadas). El sitio potencial de fosforilación de Cdk5 se indica con un asterisco. (B) IP vinculado in vitro Ensayo de quinasa con proteínas mutantes GST-D2i3 y GST-D2i3 recombinantes. El complejo Cdk5 / p35 enriquecido a partir de extracto de cerebro de ratón mediante inmunoprecipitación anti-p35 se utilizó para las reacciones de la quinasa. Se muestra una autorradiografía de proteínas fosforiladas junto con la tinción con azul brillante de Coomassie del mismo gel. La punta de flecha indica la señal radiactiva correspondiente a GST-D2i3s y la punta de flecha abierta indica señales radioactivas de p35. (C) Espectro de MS / MS del fragmento de péptido fosforilado de D2i3. Los patrones de fragmentación teóricos se muestran debajo del espectro. Entre todos los iones de fragmentos, los iones y y b detectados se indican en el espectro. Ellos6 e y7 Los iones indican fuertemente la fosforilación de la serina 321. (RE) In vitro Ensayo de quinasa con complejo Cdk5 / GST-p25 purificado utilizando proteínas mutantes GST-D2i3 y GST-D2i3. Las proteínas fosforiladas se mostraron en una autorradiografía, junto con la tinción con azul brillante de Coomassie. La punta de flecha indica la señal radioactiva correspondiente a GST-D2i3 y la punta de flecha abierta indica señales radioactivas de GST-p25.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g001

Para evaluar la capacidad de Cdk5 para fosforilar D2i3, realizamos un enlace IP in vitro Ensayos de quinasa que utilizan un complejo Cdk5 / p35 activo enriquecido a partir de lisado de cerebro de ratón mediante inmunoprecipitación de p35 con proteínas recombinantes purificadas GST-D2i3 (residuos de aminoácidos 212-373) como sustratos. Observamos señales de fosforilación en las proteínas GST-D2i3 y GST-D2i3 S297A purificadas, pero la señal disminuyó significativamente al usar GST-D2i3 S321A (Fig. 1B). Para verificar aún más la fosforilación de la serina 321 en el GST-D2i3, realizamos un análisis LC-MS / MS de las muestras de IP-link in vitro Ensayos de quinasa utilizando espectrometría de masas LTQ XL. Consistentemente, se recuperaron los fospéptidos correspondientes a la masa de péptidos fosfo-serina 321 (Fig. 1C). Teniendo en cuenta que la adquisición dependiente de los datos durante el análisis LC-MS / MS tiende a detectar abundantes proteínas en la muestra [ 31 ], estos datos sugieren que el residuo de serina 321 es el sitio de fosforilación dominante de Cdk5 en la región D2i3. Para probar la fosforilación directa de la serina 321 en el GST-D2i3 por Cdk5, in vitro Se realizó un ensayo de quinasa utilizando el complejo Cdk5 / GST-p25 purificado con proteínas GST-D2i3 recombinantes purificadas. Identificamos una señal de fosforilación significativa en el GST-D2i3 que estaba ausente en el GST-D2i3 S321A (Fig. 1D). En conjunto, estos resultados indican que el residuo D2i3 S321 es un objetivo preferencial para la fosforilación mediada por Cdk5.

Cdk5 fosforila la serina 321 en el tercer ciclo intracelular de DRD2 en células

Para identificar la fosforilación de la serina 321, generamos un anticuerpo específico para la fosfo-serina 321 (pS321). Muestras del IP-link in vitro El ensayo de quinasa se analizó mediante transferencia de Western usando un anticuerpo anti-pS321. Las transferencias mostraron una banda distinta en la reacción de la quinasa que dependía de GST-D2i3 (Fig. 2A). Para verificar la fosforilación potencial de la serina 321 en DRD2 por Cdk5 en las células, los inmunoprecipitados anti-GFP de las células HEK 293 expresan DRD2-GFP y un conjunto de piezas de este tipo. Anticuerpos anti-pS2. Las señales de banda manchadas características por el anticuerpo anti-GFP que se sabe que se deben a la glicosilación excesiva de DRD321 se observan solo en presencia de DRD5-GFP, y el anticuerpo anti-pS35 detectó señales de DRD321 similares solo con la expresión Cdk2 / p2 /Fig. 2B) [ 7 ]. Para verificar aún más la fosforilación de la serina 321 por Cdk5, se generaron D2i3 (FLAG-D2i3) y la forma mutante de D2i3 (FLAG-D2i3 S321A). FLAG-D2i3 y FLAG-D2i3 S321A expresado con o sin HA-Cdk5 y p35 en células HEK 293 se analizaron mediante un ensayo de cambio de movilidad SDS-gel. Se observó un cambio significativo de movilidad dependiente de Cdk5 para FLAG-D2i3, pero no para FLAG-D2i3 S321A (Fig. 2C). También evaluamos el nivel de fosforilación de DRD2 en Ser321 tras la estimulación con agonistas. Las células HEK 293 que expresaban el complejo DRD2-GFP y Cdk5 / p35 se estimularon con quinpirol, y se analizaron inmunoprecipitados anti-GFP de los lisados ​​celulares mediante transferencia de Western usando anticuerpos anti-GFP y anti-pS321. Encontramos que la fosforilación mediada por Cdk5 de DRD2 en Ser321 no se vio afectada por la estimulación agonista, que parece diferente de las fosforilaciones mediadas por GRK y PKC (Fig. 2D) [ 32 ], [ 33 ]. En conjunto, estos resultados indican que Cdk5 puede fosforilar el residuo de serina 321 de DRD2 en el entorno celular.

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Figura 2. Cdk5 fosforila la serina 321 en el tercer bucle intracelular de DRD2 en las células.

La fosforilación mediada por Cdk5 de la serina 321 se analizó utilizando un anticuerpo anti-pS321. (A) Muestras de IP-link in vitro El ensayo de quinasa utilizando proteínas GST-D2i3 se analizó mediante transferencia de Western (WB) con los anticuerpos indicados. Las puntas de flecha indican GST-D2i3s. (B) DRD2-GFP y DRD2 S321A-GFP se expresaron con o sin HA-Cdk5 y p35 en células HEK 293. Los inmunoprecipitados anti-GFP se analizaron mediante transferencia de Western usando anticuerpos anti-GFP y anti-pS321. El corchete indica señales DRD2 y la punta de flecha abierta indica señales no específicas de los inmunoprecipitados anti-GFP. '% de entrada' es el% de volumen del lisado total para una reacción IP. Las señales endógenas débiles de Cdk5 se indicaron con asteriscos. (C) Ensayo de cambio de movilidad en gel. Las células HEK 293 transfectadas como se indica se analizaron mediante transferencia de Western. (D) Las células HEK 293 transfectadas se trataron con quinpirol y se analizaron los inmunoprecipitados anti-GFP mediante transferencia de Western con anticuerpos anti-GFP y anti-pS321. La punta de flecha abierta indica señales no específicas de inmunoprecipitados anti-GFP.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g002

El Complejo Cdk5 / p35 y DRD2 están asociados físicamente

Investigamos la interacción física potencial entre el complejo Cdk5 / p35 y DRD2 porque se sabe que muchos sustratos Cdk5 están asociados físicamente con el complejo Cdk5 / p35 [ 23 ], [ 34 ], [ 35 ]. Primero, se realizó el experimento de extracción de GST. La proteína GST-D2i3 recombinante purificada se incubó con lisado de cerebro de rata y los precipitados de extracción de GST se analizaron para determinar la transferencia de Western. Como se muestra en Fig. 3A, se identificaron Cdk5 y p35 endógenos en los precipitados desplegables, lo que indica una interacción física entre DRD2 y el complejo Cdk5 / p35 (Fig. 3A). Además, se detectaron HA-Cdk5 y p35 en los inmunoprecipitados anti-GFP de lisados ​​celulares HEK 293 que expresan DRD2-GFP y Cdk5 / p35 (Fig. 3B). Además, realizamos análisis inmunocitoquímicos y observamos que DRD2-GFP, HA-Cdk5 y p35 muestran señales significativas de co-localización en el área membranosa de las células HEK 293 (Fig. 3C, paneles superiores). También investigamos la co-localización de DRD2 y Cdk5 / p35 en el contexto neuronal. Consistentemente, DRD2-GFP también mostró una co-localización significativa con Cdk5 y p35 endógenos en las neuronas estriatales cultivadas (DIV7), además de apoyar los enlaces funcionales entre DRD2 y Cdk5 / p35 (Fig. 3C, paneles inferiores). Los resultados indican que DRD2 y Cdk5 / p35 pueden formar un complejo y, por lo tanto, apoyan la idea de que DRD2 es un sustrato fisiológico de Cdk5.

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Figura 3. Cdk5 / p35 puede formar un complejo con DRD2.

(A) Ensayo de extracción de GST utilizando proteína GST-D2i3 recombinante purificada con extracto de cerebro de rata. Los precipitados de arrastre de GST se sometieron a análisis de transferencia Western. "Perla" indica el precipitado desplegable sin proteínas GST. (B) Inmunoprecipitación de DRD2 y complejo Cdk5 / p35. La IP anti-GFP de los lisados ​​de células transfectadas se sometió a análisis de transferencia de Western. El corchete indica señales DRD2 y la punta de flecha abierta indica señales no específicas de los inmunoprecipitados anti-GFP. Una mancha sobreexpuesta para entradas también se muestra a la derecha. (C) Análisis inmunocitoquímicos de DRD2 y Cdk5 / p35. Las células HEK 293 que expresan DRD2-GFP y Cdk5 / p35 se tiñeron con anticuerpos anti-Cdk5 y anti-p35 (paneles superiores). DRD2-GFP se expresó solo en las neuronas estriadas cultivadas y se tiñó con anticuerpos anti-Cdk5 y anti-p35 (paneles inferiores). Hoechst se utilizaron para la tinción del núcleo. La barra de escala es 5 µm. Todas las imágenes se obtuvieron utilizando microscopía confocal (Olympus, FluoView-1000).

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g003

La fosforilación mediada por Cdk5 de DRD2 atenúa la actividad del receptor

Se ha informado que la fosforilación modula las propiedades críticas de los GPCR, como el acoplamiento de proteínas G, la internalización del receptor, la localización intracelular y la asociación con proteínas moduladoras. [ 9 ], [ 11 ], [ 24 ]. LaLa internalización del receptor inducido por gonistas es un proceso regulador crítico de la transducción de señales. Investigamos la modulación mediada por Cdk5 de la internalización DRD2. Las células HEK 293 que expresan DRD2-GFP y DRD2 S321A-GFP con o sin Cdk5 / p35 se incubaron con 1 µM ​​quinpirol para inducir la internalización de DRD2 estimulada por agonistas (Fig. 4A). El3Las señales de H]-espiperona de las células que expresan DRD2-GFP se redujeron significativamente en el tratamiento con quinpirol min de 30 y se recuperaron en el min de 90. Curiosamente, [3Las señales de H]-espiperona de las células que expresan DRD2-GFP y Cdk5 / p35 también se redujeron en el tratamiento con quinpirol min.Fig. 4A, segunda sección). Por otra parte, [3Las señales de H] -spiperone de las células que expresan DRD2 S321A-GFP se redujeron a 30 min y se recuperaron a 90 min, independientemente de la coexpresión con Cdk5 / p35. Estudios previos han demostrado que el DRD2 internalizado se recicla de nuevo a la membrana plasmática tras una estimulación agonista prolongada [ 11 ]. TSegún parece, la fosforilación de DRD5 mediada por Cdk2 está involucrada en los procesos de resensibilización después de la internalización de DRD2 inducida por agonistas.

uña del pulgar

Figura 4. La fosforilación mediada por Cdk5 atenúa la expresión de superficie de DRD2 y la señalización en sentido descendente.

(A) DRD2 expresión en superficie medida por [3Ensayo de unión de H] -spiperona. Las células HEK293 transfectadas se estimularon con quinpirol µN 1 durante el tiempo indicado y se recolectaron, seguido de 3 nM [3Tratamiento con H] -espiperona durante 3 h. Se midió la radiactividad y se calcularon las señales de superficie. Las barras de error representan la media ± SE (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01; ANOVA unidireccional con prueba post hoc de Dunnett: comparar todas las columnas con la columna de control). (B) [35S] -GTPγEnsayo de unión S Las membranas celulares se prepararon a partir de las células transfectadas como se indica. Las preparaciones de membrana se incubaron con 1 µM ​​de quinpirol seguido de 3 nM [35S] -GTPγS durante 90 min. Las barras de error representan la media ± SE (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001; ANOVA de una vía con prueba post hoc de Bonferroni: comparar todos los pares de columnas). (C) Compitiendo con quinpirol [3Ensayo de unión de H] -spiperona. Las preparaciones de membrana de células transfectadas se incubaron con 0.01 nM [3H] -espiperona y concentraciones crecientes de quinpirol durante 30 min. La regresión no lineal se obtuvo mediante GraphPad. Las barras de error indican la media ± SE (n = 3). (D) Inmunoensayos enzimáticos de AMPc en células HEK 293 transfectadas. Las células transfectadas se pretrataron con rolipram 10 µM durante 1 h, y posteriormente se trataron conjuntamente con forskolina 0.1 µM y concentraciones crecientes de quinpirol durante 30 min. La regresión no lineal se obtuvo mediante GraphPad. Las barras de error representan la media ± SE (n = 4; ** p <0.01; dos colas t-pruebas). (E) Se trataron neuronas estriadas cultivadas de embriones de tipo silvestre y p35 knockout (DIV 7) con rolipram µN de 10 para 1 h seguido de dopamina µM 1 para 1 h. Las barras de error representan la media ± SE (n = 4; **p<0.01; dos colas t-pruebas).

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También evaluamos un cambio potencial del acoplamiento de la proteína G estimulada por agonistas a DRD2 asociado con la fosforilación mediada por Cdk5 usando [35S] -GTPγEnsayo de unión S [ 25 ], [ 26 ]. DRD2-GFP y DRD2 S321A-GFP con o sin Cdk5 / p35 se expresaron en células HEK 293. Las membranas se prepararon y estimularon con 1 µM ​​de quinpirol y se permitieron además [35S] -GTPγIncorporacion s La membrana celular que expresa DRD2-GFP y Cdk5 / p35 mostró un deterioro significativo [35S] -GTPγUnión S en comparación con todas las otras membranas celulares (Fig. 4B). Estos resultados indican que la fosforilación mediada por Cdk5 regula a la baja la unión de la proteína G estimulada por agonistas en DRD2.

Además, quinpirol compitiendo [3Se realizaron ensayos de unión de H] -spiperona para investigar cualquier cambio potencial en la afinidad de los agonistas en DRD2 mediante fosforilación mediada por Cdk5. Unión competitiva de [3Se midió la H] -spiperona tras el tratamiento de concentraciones crecientes de quinpirol a la preparación de membrana a partir de transfectados. Unión competitiva de quinpirol y [3H] -spiperone en DRD2-GFP y DRD2 S321A-GFP hizo logk similari valores (−9.789 para DRD2-GFP; −9.691 para DRD2 S321A-GFP), lo que indica que la afinidad del ligando a DRD2 no se ve afectada significativamente por la fosforilación mediada por Cdk5 en DRD2 (Fig. 4C).

La fosforilación mediada por Cdk5 regula a la baja la ruta de señalización DRD2-cAMP

A continuación, investigamos si la modificación de DRD2 por Cdk5 afecta las vías de señalización descendentes. Supervisamos la inhibición mediada por DRD2 de la producción de cAMP estimulada por forskolina por la adenilil ciclasa en las células que expresan DRD2-GFP y DRD2 S321A-GFP utilizando un inmunoensayo enzimático de cAMP. Las células que expresan DRD2 mostraron niveles reducidos de cAMP en respuesta a quinpirol de una manera dependiente de la dosis. Sorprendentemente, la coexpresión de Cdk5 / p35 redujo significativamente la inhibición máxima de la formación de cAMP (Fig. 4D, panel izquierdo). Por otro lado, en las células que expresan DRD2 S321A-GFP, las formaciones de cAMP se inhibieron eficazmente en respuesta al tratamiento con quinpirol independientemente de la expresión de Cdk5 / p35 (Fig. 4D, panel derecho). Estos resultados indican que la fosforilación de DRD5 mediada por Cdk2 atenúa la actividad inhibitoria de DRD2 en la vía de señalización de AMPc en sentido descendente. Para confirmar aún más los fenómenos en un entorno más relevante desde el punto de vista fisiológico, utilizamos neuronas de cultivo primario de embriones knockout deficientes en p35, un activador esencial de Cdk5. Las neuronas estriadas cultivadas primarias se trataron con dopamina µM 1 y se analizaron mediante inmunoensayo enzimático cAMP. Las neuronas de ratones knockout para p35 mostraron niveles reducidos de cAMP en comparación con las neuronas de tipo salvaje cuando se estimulan con dopamina (Fig. 4E). Tjuntos, llegamos a la conclusión de que la fosforilación de DRD5 mediada por Cdk2 da como resultado una disminución en el tono inhibitorio en la ruta de cAMP ejercida por DRD2.

Discusión

Identificamos DRD2 como un nuevo sustrato de Cdk5. La fosforilación parece regular a la baja la expresión de la superficie de DRD2 al afectar el destino de DRD2 después de la internalización del receptor, lo que reduce la DRD2 Gi-acoplamiento y vía de cAMP descendente. Como el residuo de fosforilación S321 existe tanto en isoformas largas como cortas DRD2, el mecanismo propuesto en este estudio puede ser un modo general de regulación en la señalización mediada por DRD2.

DRD2 en neuronas espinosas medianas no solo ha sido considerado como un subtipo importante de receptor de dopamina, sino que también se ha reconocido por su susceptibilidad a cambios en la disponibilidad en respuesta a estímulos ambientales. La desensibilización y resensibilización inducidas por agonistas de DRD2 se han estudiado ampliamente [ 11 ], [ 24 ]. En particular, una serie de estudios han demostrado que los efectos de la exposición psicoestimulante crónica, como la cocaína y la anfetamina, que elevan el nivel extracelular de dopamina en la sinapsis del estriado, se acompañan de cambios dinámicos de DRD2 postsinápticamente [ 36 ]. De hecho, se sabe que los usuarios crónicos de cocaína tienen niveles reducidos de DRD2 en el área del cuerpo estriado, y la disponibilidad de DRD2 en el núcleo accumbens (NAcc) muestra una correlación negativa con las conductas de búsqueda y refuerzo de drogas en ratones y primates [ 37 ][ 39 ]. Estos hallazgos indican que la funcionalidad de DRD2 es altamente susceptible a la regulación adaptativa o compensatoria en respuesta a diversos estímulos, incluida la exposición crónica a medicamentos. Nuestros resultados muestran que el residuo S321 en el tercer bucle intracelular de DRD2 puede ser fosforilado por Cdk5, lo que resulta en una disminución de la influencia inhibitoria de DRD2 en la ruta del AMPc. Esta interacción propone un nuevo mecanismo regulador asociado con Cdk5 en las neuronas dopaminoceptivas que podría estar vinculado a la naturaleza dinámica de la disponibilidad de la superficie DRD2.

Cabe señalar que se sabe que Cdk5 es un componente clave en la mediación de los cambios adaptativos del entorno neuronal. Por ejemplo, las alteraciones estructurales y funcionales de las espinas dendríticas en las neuronas del circuito límbico son una de las consecuencias de la exposición repetida a los psicoestimulantes. [ 40 ]. Estos cambios van acompañados de varios cambios moleculares, incluida la inducción de la proteína de unión al elemento de respuesta al AMPc (CREB) y ΔFosB, factores de transcripción que muestran una regulación ascendente duradera en respuesta a la administración crónica de cocaína. [ 41 ], [ 42 ]. Es importante destacar que Cdk5 es un objetivo de ΔFosB [ 19 ], y muchos componentes críticos involucrados en la dinámica de la columna dendrítica, como PSD-95, quinasa activada por p21 (PAK), β-catenina y espinofilina, se informaron como sustratos Cdk5 [ 43 ][ 46 ]. Consistentemente, las manipulaciones genéticas o farmacológicas de la actividad de Cdk5 provocan alteraciones de la morfología de la columna dendrítica y las respuestas de comportamiento a la cocaína, lo que implica roles críticos para Cdk5 en los cambios moleculares y morfológicos de los circuitos de dopamina mesolímbicos [ 47 ], [ 48 ]. Nuestros resultados que muestran que DRD2 es un nuevo objetivo de Cdk5 proporciona información adicional sobre los cambios adaptativos del sistema de dopamina en respuesta a exposiciones crónicas a medicamentos debido a la posterior regulación por aumento de Cdk5 mediada por osFosB puede inducir un aumento tónico en la fosforilación de DRD2 . Además, se sabe que DRD2 afecta a numerosos procesos celulares, incluida la regulación de las vías de la quinasa cAMP y MAP y eventos transcripcionales posteriores. [ 42 ], [ 49 ]. Por lo tanto, los hallazgos en este estudio no solo representan una regulación directa de DRD2 por Cdk5, sino que también brindan una nueva perspectiva de las respuestas adaptativas del sistema de dopamina a la exposición crónica a medicamentos.

Contribuciones de autor

Concebido y diseñado los experimentos: JJ YUP DH SKP. Realizó los experimentos: JJ YUP DKK YK. Analizó los datos: JJ YUP DKK SL YK SAL HL YSG DH SKP. Reactivos contribuidos / materiales / herramientas de análisis: YHS. Escribió el papel: JJ SKP.

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