La optogenética revela un papel para las neuronas espinosas del medio accumbal que expresan los receptores D2 de la dopamina en la sensibilización del comportamiento inducida por la cocaína (2014)

Canción de Shelly Sooyun,^1,† Byeong Jun Kang,^1,† Lei Wen,^2,3,4,† Hyo Jin Lee,¹ Hye-ri Sim,¹ Tae Hyong Kim,¹ Sehyoun Yoon,¹ Bong-June Yoon,¹ George J. Augustine,^2,3,4 y Ja-Hyun Baik^1,*

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Se han propuesto adaptaciones de larga duración inducidas por fármacos dentro del núcleo accumbens (NAc) para contribuir a comportamientos adictivos mediados por fármacos. Aquí hemos utilizado un enfoque optogenético para examinar el papel de las neuronas espinosas del medio NAc (MSN) que expresan los receptores D2 de dopamina (D2Rs) en la sensibilización conductual inducida por cocaína. Los vectores víricos adeno-asociados que codifican channelrhodopsin-2 (ChR2) se administraron en el NAc de ratones transgénicos D2R-Cre. Esto nos permitió fotoestimular de forma selectiva D2R-MSN en NAc. Los D2R-MSN forman circuitos inhibitorios locales, debido a que la fotoestimulación de D2R-MSN provocó corrientes postsinápticas inhibitorias (IPSCs) en los MSN vecinos. La fotoestimulación de NAc D2R-MSN in vivo No afectó ni el inicio ni la expresión de la sensibilización conductual inducida por la cocaína. Sin embargo, la fotoestimulación durante el período de abstinencia de la droga atenuó la expresión de la sensibilización del comportamiento inducida por la cocaína. Estos resultados muestran que los D2R-MSN de NAc desempeñan un papel clave en la plasticidad inducida por el retiro y pueden contribuir a la recaída después del cese del uso indebido de drogas.

Ratones

Los ratones transgénicos D2-Cre BAC en un fondo C57Bl / 6 se obtuvieron de MMRRC (Centros de Recursos Regionales de Ratones Mutantes, B6.FVB (Cg) -Tg (Drd2-cre) ER44Gsat / Mmucd). En experimentos de comportamiento, los compañeros de camada que carecen del transgén D2-Cre se utilizaron como controles para los ratones D2-Cre. Los ratones se mantuvieron en una instalación de barrera libre de patógenos específica en condiciones constantes de temperatura y humedad, y en una luz 12-h, 12-h horario oscuro. El cuidado y manejo de los animales se realizó de acuerdo con los estándares aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Corea y KIST.

Preparación de vectores de virus

pAAV-EF1a-DIO-hChR2 (H134R) -EYFP-WPRE fue proporcionado generosamente por Karl Deisseroth (Stanford Univ.). Para la preparación de AAV, se cultivaron células HEK293T en medio DMEM con antibióticos y FBS. El día antes de la transfección, cuatro placas más allá del 90% de confluencia de las placas de 10-cm se sembraron en cinco placas de 15-cm y se incubaron para 18-22 h o hasta que 60 a 70% de confluencia. Las células HEK293T se transfectaron con pAAV-DIO-ChR2-EYFP, pAAV-DJ y pHelper utilizando reactivo de transfección jetPEI (QBiogene). El cóctel de ADN / DMEM / PEI se agitó en vórtex y se incubó a temperatura ambiente durante 20 min. Después de la incubación, la mezcla de transfección se añadió a cada placa 15 cm. Las células transfectadas se recogieron 48 h después de la transfección y se incubaron con 0.5% de desoxicolato de sodio (Sigma; D6750) y unidades 50 / ml de nucleasa benzonase (Sigma; E1014) a 37 ° C durante 1 h. Después de eliminar los desechos celulares mediante centrifugación a 3000 × g durante 15 min, el sobrenadante se filtró a través de un filtro PVDF de 0.45 mm (Millipore). La purificación de las partículas de AAV-DJ se realizó utilizando columnas de afinidad de heparina HiTrap (GE Healthcare). Para la concentración de AAV, se usaron unidades de filtro centrífugo Amicon ultra-15 con un corte de peso molecular 100,000. Virus concentrados divididos en alícuotas y congelados para su almacenamiento a −80 ° C. Las concentraciones virales finales fueron 3 ~ 6 × 10¹² Partículas de virus por ml para cada AAV.

Inyección estereotáxica y colocación de fibra óptica.

Los animales se anestesiaron mediante inyecciones ip de 1.6 µl de Zoletil y 0.05 µl de xilacina (Rompun, Bayer) por gramo de peso corporal y se colocaron en un aparato estereotáxico (David Kopf Instruments, Tujunga, CA). Para la inyección de virus, se utilizó una aguja de jeringa de calibre 31 para infundir bilateralmente 2 µl de virus en NAc en un ángulo de 0 ° (AP +1.7; ML ± 1.3; DV -4.5) a una velocidad de 0.1 ul / min. La aguja se dejó en su lugar durante 10 minutos después de la inyección antes de retirarla lentamente. La cánula de fibra óptica para la implantación constaba de un casquillo de zirconia (1.25 mm de diámetro y 4.5 mm de largo) y una punta plana de fibra óptica (200 µm de diámetro). La implantación de la cánula de fibra óptica en NAc para la iluminación de D2-MSN se realizó inmediatamente después de la inyección de virus. Las coordenadas para la implantación de la cánula de fibra óptica fueron un ángulo de 0 ° (AP +1.7; ML ± 1.35; DV -4.2) para apuntar NAc. Para ayudar a anclar la fibra óptica, se anclaron dos tornillos en el cráneo en la parte posterior del sitio de implantación de la cánula de fibra óptica. Para fijar la cánula de fibra óptica en el cráneo, se aplicó C&B Superbond (Sun Medical) a la superficie del cráneo alrededor de la base de la cánula. Una vez endurecido el C&B Superbond, se soltó la cánula del soporte y se aplicó cemento dental (Poly-F, Dentsply) alrededor de la cánula y los tornillos. Para cerrar la incisión alrededor del sitio de canulación, se utilizó adhesivo tisular Vetbond (3 M, 7003449). Después de la implantación, se administró a los ratones una inyección subcutánea de antibióticos (Enrofloxacina, 5 mg / kg, cada 12 h) y analgesia (Carprofeno, 5 mg / kg, cada 24 h) durante 3 días consecutivos.

In vivo fotoestimulacion

Se conectó un cordón de parche de 200 µm a la parte externa de la fibra óptica implantable crónicamente usando un manguito. Las fibras ópticas se unieron a través de un adaptador FC / PC a un diodo láser azul (473 nm, MBL-III 473-150 mW), y se generaron pulsos de luz a través de un estimulador (BNC 575). Para la fotoestimulación de las neuronas que expresan ChR2, el paradigma de estimulación fue la frecuencia de 20 Hz, la duración del pulso de 5 ms y la potencia de luz 2 – 5. La potencia luminosa emitida por el cable de conexión se midió utilizando un medidor de potencia (PM100D) con un sensor de luz S121C.

Análisis de comportamiento

Se realizaron experimentos de comportamiento con ratones machos D2-Cre en las semanas de edad 11-13, con la excepción de los ratones sometidos a análisis electrofisiológicos que eran semanas de edad 5-6. A los ratones de control negativo D2-Cre y Cre negativos se les inyectó un virus y se alojaron individualmente y se les permitió aclimatarse a la jaula hasta la prueba de comportamiento. Para cada manipulación, los ratones se transfirieron a la sala experimental 60 min antes del inicio del experimento para permitir la habituación y reducir el estrés (el brillo de la sala experimental fue 70 lux). Cada aparato experimental se limpió con 70% de etanol entre experimentos para eliminar cualquier posible olor.

Sensibilización a la cocaína

Para el inicio de la sensibilización a la cocaína, los ratones se habituaron a inyecciones de solución salina (ip) durante 3 días consecutivos y luego se inyectaron con solución salina o cocaína (15 mg kg)^-1, ip) para 5 días consecutivos. Los ratones se inyectaron por vía intraperitoneal (ip) con clorhidrato de cocaína (Johnson Mattney, Edimburgo, Reino Unido) disuelto en solución salina (0.9% NaCl) o solución salina con una aguja 30 G. Inmediatamente después de cada inyección, los ratones se analizaron para determinar la actividad locomotora horizontal en una cámara de campo abierto durante 30 mín. Para medir el efecto de la fotoestimulación en el inicio y la expresión de la sensibilización (Figura (Figura 5), 5), a los ratones se les dio iluminación de luz azul bilateralmente a través de dos cables de parche de fibra óptica en el NAc durante cuatro períodos de 3-min durante las sesiones mínimas de 30 en jaulas. Se retiraron los cables de conexión de la cánula de fibra óptica ubicada en el cráneo del ratón y a los ratones se les dio al menos 10 min. Los ratones fueron inyectados con cocaína o solución salina (coc 1d-coc 5d). Después del inicio de la sensibilización, la cocaína se retiró durante 14 días sin ninguna inyección de solución salina. Durante este período de retiro, no se aplicó la fotoestimulación. La expresión de la sensibilización conductual a la cocaína se determinó mediante la inyección de una dosis de desafío del fármaco (10 mg kg).^-1, ip) después de la fotoestimulación de la NAc como se ilustra en la Figura Figura5A.5A. Para medir el efecto de la fotoestimulación durante el período de retiro de la cocaína (Figura (Figura 6), 6), los ratones se sometieron al mismo protocolo de sensibilización que el descrito anteriormente (para la Figura Figura5) 5) excepto se dio la fotoestimulación. Después del inicio de la sensibilización a la cocaína, se aplicó la fotoestimulación a la NAc diariamente para 1 h durante el período de retiro total de los días 14. Después de 14 días de abstinencia, a todos los grupos de ratones se les inyectó la dosis de cocaína de prueba, (10 mg kg^-1).

 

Figura 1 y XNUMX

Fotoestimulación selectiva de neuronas espinosas medias en el núcleo accumbens. (UNA) Expresión selectiva de ChR2 en neuronas NAc D2R mediante el suministro de vectores virales AAV-DIO-ChR2-EYFP. barras de escala: figura de fondo, 1 mm: insertar, 200 µm. (B) Imagenes confocales ...

 

Figura 2 y XNUMX

La fotoestimulación de D2RCre-MSNs impulsa los circuitos inhibitorios locales. (UNA) Imagen confocal de una porción de NAc en vivo, que muestra una neurona llena de colorante que no expresa ChR2 y una célula vecina (punta de flecha) que expresaba ChR2 y podría ser fotoestimulada. (B) IPSC ...

 

Figura 3 y XNUMX

Propiedades de las células NAc. (UNA) Imagen de fluorescencia de dos fotones de neuronas rellenas con Alexa 594. (A1) muestra una neurona del grupo ChR2 + / AP, mientras que (A3) muestra una neurona del grupo ChR2− / IPSC. (A2) y (A4) Son imágenes de gran aumento de la ...

 

Figura 4 y XNUMX

Efectos de la activación optogenética in vivo de D2-MSN en NAc sobre la actividad locomotora basal. (A) Vista sagital de ratones D2 Cre inyectados en el NAc con AAV-DIO-ChR2-EYFP, seguido de un implante bilateral de cánula de fibra óptica. 473 nm estimulación de luz azul ...

 

Figura 5 y XNUMX

Efectos de la activación de D2-MSN durante la sensibilización a la cocaína. (UNA) Esquema experimental para la fotoestimulación de D2-MSN durante el inicio y la expresión de la sensibilización a la cocaína. Se suministró iluminación de luz azul (2 ~ 5 mW, 5 ms, 20 Hz) para cuatro ...

 

Figura 6 y XNUMX

Efectos de la activación de D2-MSN durante la retirada a la exposición repetida a la cocaína. (UNA) Esquema experimental para la fotoestimulación de D2-MSN durante la retirada a la cocaína. Se suministró iluminación de luz azul (2 ~ 5 mW, 5 ms, 20 Hz) durante ocho períodos 3-min ...

Inmunofluorescencia y microscopía láser confocal.

Para la inmunofluorescencia, los ratones se anestesiaron con Zoletil (Virbac, 1.6 µl / g, por vía intraperitoneal) y 0.05 µl / g de Rompun (Bayer) y se perfundieron con solución de 0.1 M PBS esterilizada con filtro, seguida de una fijación con 4% paraformaldehído / PBS solución (sigma). Luego se extrajo el cerebro y se fijó posteriormente para 4 h con un fijador frío como el anterior. Los cerebros se deshidrataron luego en 30% de sacarosa / 0.1 M PBS durante los días 2. Luego se congelaron los cerebros y se prepararon secciones coronales consecutivas de 40-µm de espesor en un criostato (Leica CM 1900, Alemania). Las secciones (40 µm) se bloquearon para 1 h en 0.1 M PBS que contenía 5% de suero normal de cabra y 0.2% Triton X-100 y se incubaron con un anticuerpo policlonal de conejo anti-D2R (1: 500, Millipore, AB5084P) en 4CXX. Después de los lavados con PBS que contenía 0.2% Triton X-100, las muestras se incubaron a temperatura ambiente para 1 h con IgG anti-conejo de cabra Alexa Fluor 568 (1: 500; Molecular Probes, Eugene, OR, USA) y 0.2 µl / ml 4, 6-diamidino-2-fenil-indol HCl (DAPI; Sigma, St. Louis, MO, EE. UU.) En PBS que contiene 1% de suero normal de cabra y 0.2% Triton X-100. Como control negativo, las muestras se incubaron con DAPI y el anticuerpo secundario solamente. Las secciones se examinaron en un sistema de escaneo láser confocal de agua C1 Plan Apo × 40 / 1.4 (LSM 700, Zeiss, Berlín, Alemania).

Electrofisiología y fotoestimulación en rodajas de núcleo accumbens.

Los ratones se utilizaron para experimentos 4 semanas después de la inyección del virus, para lograr la expresión óptima de ChR2-EYFP. Los ratones se anestesiaron y decapitaron para la preparación de cortes de cerebro agudos. El cerebro se retiró rápidamente y se colocó inmediatamente en una solución de corte enfriada con hielo que contenía (en mM) sacarosa 250, NaHCO 26₃, 10 D-Glucosa, 3 Myo-inositol, 2.5 KCl, 2 Na-piruvato, 1.25 NaH₂PO₄, Ácido ascórbico 0.5, ácido kynurenic 1 y MgCl 7₂ que se burbujeaba con 95% O₂/ 5% CO₂ (pH = 7.4). Se prepararon cortes cerebrales coronales (250 µm de espesor) que contenían el NAc utilizando un vibratome (Leica VT 1200 S) y luego se incubaron en líquido cefalorraquídeo (ACSF) gasificado que contenía (en mM): 11 D-glucosa, 125 NaCl, 25 NaHCO₃, 1.25 NaH₂PO₄, 2.5 KCl, 1.25 MgCl₂ y 2.5 CaCl₂ en 34 ° C para 1 h antes de grabar. Las rebanadas se transfirieron a una cámara de registro de inmersión en la que O₂La solución de ACSF saturada se superfundió continuamente. Las células en NAc y VTA se visualizaron utilizando un microscopio fotónico 2 (Olympus FV1000 MPE, Tokio, Japón) equipado con una lente de inmersión en agua 25X y óptica DIC infrarroja. Se obtuvieron grabaciones de parches de células completas a partir de células NAc con un amplificador Multiclamp 700B y un digitalizador Digidata 1440A (Molecular Devices, LLC). Los datos se tomaron muestras utilizando el software pCLAMP 10.2 y se analizaron posteriormente utilizando el software Clampfit 10.2 (Molecular Devices, LLC). Los electrodos de parche con resistencias entre 3 y 5 MΩ se llenaron con una solución interna que contenía (en mM): K-gluconato de 130, NaCl de 2, MgCl de 2₂, 20 HEPES, 4 Na₂ATP, 0.4 Na₃GTP, 0.5 EGTA y 10 Na₂- fosfocreatina, con pH ajustado a 7.3 con KOH 1 N. Se aplicó en baño bicuculline (10 µM) al corte de cerebro para bloquear los receptores GABA en un subconjunto de experimentos.

Las células NAc que expresan ChR2-EYFP se fotoestimularon mediante una fuente de luz LED (460 ± 27 nm, UHP-Mic-LED-460, Prizmatix). La luz azul del LED se filtró y atenuó aún más mediante un cubo de filtro equipado con un filtro de excitación (470 – 495 nm); destellos de luz (duración de 10 ms, 0.0366 – 0.354 mW / mm²) se entregaron a la porción de cerebro a través de la lente del objetivo 25X a las frecuencias de 5 – 40 Hz. En un subconjunto de experimentos, las fotocorrientes se midieron en células que expresan ChR2 en respuesta a los destellos de luz de la duración de 2.

Análisis estadístico

Los datos se presentan como medias ± sem y se analizaron con los estudiantes de dos colas. t-test, o con análisis de varianza bidireccional seguido de Bonferroni post hoc prueba. UNA P-valor de <0.05 se consideró estadísticamente significativo.

Fotoestimulación selectiva de neuronas espinosas medias en el núcleo accumbens.

Para determinar el papel de NAc D2R-MSN en los comportamientos adictivos mediados por la cocaína, utilizamos un enfoque optogenético para estimular las neuronas NAc D2R. Para controlar selectivamente la actividad de D2R-MSN en NAc por luz, se inyectaron estereotaxicamente vectores virales que codifican AAV-DIO-ChR2-EYFP en la NAc de ratones transgénicos BAC D2R-Cre. 4 semanas después de la inyección viral, se observó una expresión robusta de ChR2-EYFP en la NAc (Figura (Figura 1A) .1A). La especificidad de la expresión de ChR2 en D2R-MSN se confirmó mediante análisis confocal de inmunofluorescencia: la expresión de ChR2 etiquetada con YFP se co-localizó con D2R en NAc (Figura (Figura 1B), 1B), que muestra que ChR2 se expresó en neuronas que expresan D2R en NAc.

Aunque tal enfoque se ha utilizado en otros estudios (por ejemplo, Lobo et al., 2010), los detalles de los procedimientos de inyección de virus varían de un laboratorio a otro, por lo que es importante documentar el control optogenético en nuestras condiciones experimentales específicas. Evaluamos la expresión funcional de ChR2 haciendo grabaciones de pinzamiento de parche de células completas de MSN en cortes de NAc. Los MSN fueron identificados por: (1) un potencial de membrana en reposo (RMP) relativamente hiperpolarizado, típicamente más negativo que −80 mV; (2) un patrón regular de disparo de AP en respuesta a los pulsos de corriente aplicados; (3) latencia prolongada para disparar el primer AP durante un pulso actual; (4) ausencia de un "hundimiento" de voltaje durante la hiperpolarización causada por una corriente de catión activada por hiperpolarización (I_h); y (5) tamaño relativamente pequeño de sus cuerpos celulares (Chang y Kitai, 1985; O'Donnell y Grace, 1993; Le Moine y Bloch, 1996; Taverna et al. 2008). Se aplicó luz azul (470 nm) sobre todo el campo de visión (0.78 mm).²) mientras sujeta el voltaje a los MSN a un potencial de mantenimiento de −69 mV. Algunos MSN expresaron ChR2, evidente como fluorescencia de YFP en sus somata (flechas en las Figuras 1C1, C3). Tales neuronas exhibieron fotocorrientes sustanciales, con estímulos de luz más brillantes que provocaron fotocorrientes más grandes (Figura (Figura 1D) .1D). La relación entre la amplitud de fotocorriente pico y la intensidad de la luz (Figura (Figura 1E) 1E) tenía una sensibilidad a la luz media máxima de 0.054 ± 0.0023 mW / mm² y una amplitud máxima máxima de 1.16 ± 0.16 nA (media ± sem, n = 4).

En condiciones de uso actual, los MSN que expresan ChR2 dispararon AP de forma confiable en respuesta a los trenes de pulsos de luz (duración de 10 ms; Figura Figura 1F) .1F). En estas condiciones, intensidades de luz superiores a 0.1 mW / mm² fueron suficientes para evocar APs (Figura (Figura 1G, 1G, n = 5). Los AP fueron evocados de manera confiable a frecuencias de fotoestimulación de hasta 20 Hz, mientras que a 40 Hz, las respuestas inducidas por la luz sumadas causaron una despolarización sostenida que fue menos efectiva al evocar APs (Figuras 1F, G).

La fotoestimulación de D2R-MSNs acciona circuitos inhibitorios locales

Para investigar las consecuencias de la actividad de D2R-MSN en los circuitos locales en NAc, estimulamos en función de la foto la MSN presináptica que expresa ChR2 mientras medimos las respuestas postsinápticas en las MSN con ChR2 negativo (Figura (Figura 2A) .2A). La neurona mostrada en la figura. Figura2A2A no expresa ChR2, como lo indica la ausencia de fluorescencia de EYFP, así como la ausencia de fotocorrientes de latencia corta como las que se muestran en la Figura Figura1D.1D. Sin embargo, cuando los MSN postsinápticos se mantuvieron como un potencial de −69 mV, la luz de duración de 10 ms destella a las corrientes salientes después de una latencia de 9.0 ± 0.42 ms (Figura (Figura 2B, 2B, n = 15). Para determinar la naturaleza de estas respuestas, el potencial de membrana postsináptico se varió entre −99 mV a −39 mV, mientras se aplicaba un destello de luz (Figura (Figura 2C) .2C). Las respuestas inducidas por la luz variaron con el potencial de membrana (Figura (Figura 2D, 2D, n = 6) e invirtió su polaridad en −81 ± 3.4 mV. Dado que el potencial de equilibrio para los iones cloruro es -80 mV en nuestras condiciones iónicas, las corrientes externas inducidas por la luz podrían deberse al flujo de cloruro mediado por GABA postsináptico_A receptores Para probar esta posibilidad, la GABA._A Se añadió antagonista del receptor bicuculina (10 µM) a la solución externa. Este medicamento bloqueó completamente las respuestas inducidas por la luz (Figura (Figura 2B), 2B), confirmando que las respuestas inducidas por la luz fueron corrientes postsinápticas inhibitorias GABAérgicas (IPSCs).

Según sus respuestas a la fotoestimulación, los MSN que registramos se podrían clasificar en uno de los grupos 4: (1) células que expresan una cantidad suficiente de ChR2 para disparar AP en respuesta a la fotoestimulación (ChR2 + / AP), que se describieron anteriormente; (2) células que expresan una pequeña cantidad de ChR2, que mostró una despolarización por debajo del umbral en respuesta a la luz (ChR2 + / No AP); (3) células silenciosas que no tenían expresión de ChR2 pero que recibían IPSCs inducidas por la luz de MSN presinápticas que expresaban ChR2 (ChR2− / IPSC); y las células negativas (4) ChR2 que no exhibieron IPSCs en respuesta a la fotoestimulación de otros MSN (ChR2− / No IPSC). La proporción relativa de celdas en cada una de estas categorías se muestra en la Figura Figura2E2E (n = 53). En general, casi la mitad de las células (45.3%) expresaron ChR2 (suma de grupos (1) y (2)). Ninguno de los MSN que grabamos mostraba fotocorrientes e IPSC en respuesta a la fotoestimulación; esto indica que los MSN positivos a D2R no inervan a otros miembros de esta misma población celular dentro de la NAc.

Esta clasificación de respuestas a la luz indica que la fotoestimulación de las células ChR2 + / No AP (grupo 2) y las células ChR2− / No IPSC (grupo 4) no generará ninguna señal eléctrica que pueda contribuir a la actividad del circuito. Por lo tanto, para definir los efectos de la fotoestimulación en la función del circuito, caracterizamos en detalle las propiedades de los MSN ChR2 + / AP (grupo 1), que generarán AP cuando la NAc está fotoestimulada, y las células ChR2− / IPSC (grupo 3), que son postsinápticos a los MSN ChR2 + / AP porque reciben IPSCs inducidos por la luz. Las células ChR2 + / AP y ChR2− / IPSC en NAc se identificaron como neuronas espinosas (Figura (Figura 3A) .3A). No hubo diferencias significativas en las propiedades morfológicas o electrofisiológicas de las neuronas en estos dos grupos. Por ejemplo, la somata de las neuronas en esos dos grupos era similar en tamaño (Figura (Figura 3B) .3B). Además, sus RMP (−83.0 ± 1.7 vs. −85.0 ± 1.8 mV; media ± sem; n = 10, figura Figura 3C) 3C) y resistencias de entrada (113 ± 15 vs. 133 ± 13 MΩ, n = 6, figura Figura 3D) 3D) tampoco fueron diferentes (p > 0.05 Student de dos colas t-test) mientras que sus patrones de disparo AP en respuesta a los pulsos actuales (Figuras 3E, F) también fueron similares (p > 0.05 Student de dos colas t-prueba, n = 6). En resumen, la fotoestimulación de D2R-MSN en NAc activa circuitos inhibitorios locales con neuronas postsinápticas que son muy similares a las D2R-MSN pero no expresan D2R.

Estimulación optogenética de NAc D2R-MSN en la sensibilización del comportamiento inducida por cocaína

A continuación examinamos las consecuencias de comportamiento de in vivo Fotoestimulacion de NAc D2R-MSNs. Debido a que la fotoestimulación de D2R-MSN en el cuerpo estriado dorsal disminuye la actividad locomotora (Kravitz et al., 2010), comenzamos por caracterizar los efectos de la activación de accumbens D2R-MSN en la actividad locomotora basal. Para este propósito, los ratones D2R-Cre se inyectaron con el virus DIO-AAV-ChR2-EYFP bilateralmente en el NAc (D2-Cre (+) NAc-ChR2). Los D2R-MSN se fotoestimularon con luz azul (473 nm, 5 ms de duración de pulso, 20 Hz) entregados al NAc a través de una fibra óptica. Se aplicaron photostimuli durante cuatro períodos de duración 3-min dentro de la sesión 50 min cuando los ratones se mantuvieron en la cámara de registro de actividad locomotora (Figura (Figura 4A) .4A). Paralelamente, como control se inyectaron virus de la camada que no eran Cre WT de manera similar y recibieron una iluminación de luz azul similar. Los ratones D2-Cre (+) NAc-ChR2 mostraron un nivel comparable o ligeramente elevado de actividad locomotora basal en comparación con el control D2R-Cre (-) NAc-ChR2 ratones (Figuras 4B, C). La fotoestimulación de D2R-MSN en ratones D2-Cre (+) NAc-ChR2 causó una disminución significativa en la actividad locomotora que se recuperó después de que se detuvo el estímulo luminoso (Figura (Figura 4B) .4B). No se observaron efectos de este tipo en los ratones de control D2R-Cre (-) NAc-ChR2 (Figuras 4B, C), lo que indica que los efectos de la fotoestimulación fueron causados ​​por la activación de ChR2, en lugar de posibles efectos no específicos, como el calentamiento del tejido cerebral. Por lo tanto, nuestros datos indicaron que la fotoestimulación de D2R-MSN en NAc provocó una disminución en la actividad locomotora.

Estos resultados establecieron nuestra capacidad para controlar la actividad de D2R-MSN dentro de NAc in vivo. A continuación, utilizamos esta capacidad para examinar la influencia de la actividad de D2R-MSN en la sensibilización del comportamiento a la administración repetida de cocaína. La sensibilización conductual se refiere al proceso que permite una exposición inicial a los psicoestimulantes, como la cocaína, para mejorar la capacidad de las exposiciones posteriores a las drogas para estimular la actividad locomotora. Este proceso se puede separar en fases de iniciación y expresión: la iniciación describe los eventos neuronales inmediatos que inducen la sensibilización del comportamiento (Vanderschuren y Kalivas, 2000; Sim et al. 2013), aunque se sabe que la expresión es una forma duradera de plasticidad del comportamiento que persiste después de la retirada de drogas (Vanderschuren y Kalivas, 2000; Sim et al. 2013). Por lo tanto, examinamos la sensibilización conductual inducida por la cocaína durante inyecciones repetidas intraperitoneales (ip) de cocaína, mientras utilizamos optogenéticos para controlar la actividad de D2R-MSN en NAc durante cada una de estas fases.

Después de acostumbrarse a la inyección de solución salina durante 3 días, a los ratones se les inyectó cocaína (15 mg / kg) en 5 días consecutivos y se registraron las respuestas locomotoras para 30 min después de cada inyección (Figura (Figura 5A) .5A). Photostimuli se administraron durante las sesiones mínimas de 30 antes de la inyección de cocaína, intercalando períodos mínimos de iluminación de 3 con períodos mínimos de 5 en los que se apagó la luz (Figura (Figura 5A) .5A). Dado que la fotoestimulación de D2R-MSN en NAc disminuye la actividad locomotora basal (Figura (Figura 4), 4), se administraron fotostimuli inmediatamente antes de la administración de cocaína para evitar una posible interferencia con las respuestas de comportamiento a la inyección de cocaína.

Tanto los ratones D2-Cre (-) NAc-ChR2 de control como los ratones D2-Cre (+) NAc-ChR2 mostraron un marcado aumento en la actividad locomotora en respuesta a las inyecciones repetidas de cocaína (Figura 5B), 5B), indicando iniciación de sensibilización. La fotoestimulación de D2R-MSN en NAc no pareció afectar el inicio de la sensibilización conductual, porque la sensibilización conductual inducida por cocaína fue similar en los ratones D2-Cre (+) NAc-ChR2 y en los ratones control D2-Cre (-) NAc-ChR2.

Después de la inducción de la sensibilización conductual repitiendo dichas inyecciones de cocaína (15 mg / kg) durante los días 5, se retiró el fármaco durante los días 14 y se examinó el grado de expresión de la sensibilización desafiando a los ratones con una dosis más baja de cocaína (10 mg /kg). La expresión de sensibilización es una forma duradera de plasticidad conductual que persiste después de la retirada de drogas (Steketee y Kalivas, 2011; Sim et al. 2013). Para examinar el papel de D2R-MSN en la expresión de la sensibilización, se estimuló la fotoestimulación de NAc inmediatamente antes de la administración de cocaína (Figura (Figura 5A) 5A) y la sensibilización se midió como la cantidad de actividad locomotora inducida por la inyección de cocaína.

En ambos grupos de ratones tratados previamente con cocaína: ratones D2-Cre (-) NAc-ChR2 (D2-Cre (-) :: coc-coc) y D2-Cre (+) NAc-ChR2 (D2-Cre (+): : coc-coc): se produjo una expresión robusta de la sensibilización (Figura (Figura 5C) .5C). El curso temporal de los cambios de locomoción estimulados por la cocaína también fue similar entre los dos grupos (Figura (Figura 5C), 5C), sin diferencia significativa observada entre dos grupos. Tomados en conjunto, estos dos experimentos de fotoestimulación indican que la activación de D2R-MSN en la NAc no afecta el inicio o la expresión de la sensibilización conductual inducida por la cocaína.

Fotoestimulación de NAc D2R-MSN durante la retirada del fármaco

El estrés crónico durante la abstinencia de drogas después de la exposición repetida a la cocaína da como resultado el reclutamiento selectivo de un mecanismo de adaptación dependiente de D2R que controla el aumento inducido por el estrés en la búsqueda de cocaína y los comportamientos de recaída en asociación con cambios en la plasticidad sináptica en la NAc (Sim et al., 2013). Esto indica que los mecanismos activados por la retirada del fármaco son distintos de los implicados en la sensibilización indicada por el fármaco. Por lo tanto, a continuación examinamos si la fotoestimulación de D2R-MSN en NAc durante la extracción de cocaína afecta la expresión de la sensibilización conductual inducida por cocaína.

Después de la inducción de la sensibilización conductual mediante la inyección repetida de cocaína como se indicó anteriormente, los ratones D2-Cre (-) y D2-Cre (+) se subdividieron en dos grupos para el período de retiro del día de 14: un grupo se sometió a una estimulación diaria de luz azul NAc para 1 h (3 min x veces 8), mientras que el otro grupo no lo fue (Figura (Figura 6A) .6A). La fotoestimulación repetida de D2R-MSN en NAc durante la extracción de cocaína no afectó la expresión de la sensibilización en ratones D2-Cre (-) :: coc-coc (Figura (Figura 6B) .6B). Por el contrario, en los ratones D2-Cre (+) :: coc-coc, la expresión de la sensibilización se atenuó significativamente mediante la fotoestimulación repetida durante la retirada del fármaco (Figura (Figura 6B), 6B), aunque el curso temporal de la estimulación de la locomoción inducida por la cocaína no se vio afectado (Figura (Figura 6C) .6C). Por lo tanto, la fotoestimulación de D2R-MSN de NAc durante la abstinencia de drogas redujo la expresión de la sensibilización del comportamiento inducida por la cocaína (interacción cocaína x fotoestimulación F_(1,18) = 11.08, P = 0.0037, figura Figura6B) .6B). Estos datos indican que la activación de MSN D2R-NAc durante el período de abstinencia de drogas influye en la búsqueda de cocaína y en los comportamientos de recaída.

Este trabajo fue apoyado por la subvención de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiada por el Ministerio de Ciencia, TIC y Planificación Futura por el Programa de Investigación del Cerebro (a Ja-Hyun Baik; Subvención No. 2013M3C7A1056101) y por la Tecnología Bio y Médica. Programa de desarrollo (a Ja-Hyun Baik; Subvención No. 2013M3A9D5072550) y el programa World Class Institute (WCI) de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiado por el Ministerio de Ciencia, TIC y Planificación Futura (a George J. Augustine ; WCI 2009-003), así como por una Beca de la Universidad de Corea (a Ja-Hyun Baik) y una beca CRP de la Fundación Nacional de Investigación de Singapur (a George J. Augustine).

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