Fuente
Departamento de Neurobiología y Células, Escuela de Medicina Keck, Universidad del Sur de California, Los Ángeles, CA 90033, EE. UU.
Resumen
El abuso de esteroides anabolicoandrogénicos (AAS) es generalizado. Además, los AAS son reforzantes, como lo demuestra la autoadministración en roedores. Sin embargo, los receptores que transducen los efectos de refuerzo de AAS no están claros. AAS puede unirse a los receptores de andrógenos nucleares (AR) clásicos o receptores de membrana. Utilizamos dos enfoques para examinar el papel de los AR nucleares en la autoadministración de AAS. Primero, probamos la autoadministración de andrógenos en ratas con la mutación de feminización testicular (Tfm), que interfiere con la unión de andrógenos. Si las RA nucleares son esenciales para la autoadministración de AAS, los machos Tfm no deben autoadministrarse andrógenos. Los machos Tfm y los compañeros de camada de tipo salvaje (WT) se autoadministraron la dihidrotestosterona andrógena no aromatizable (DHT) o el vehículo intracerebroventricular (ICV) en programas de proporción fija (FR) hasta FR5. Ambas ratas Tfm y WT adquirieron una preferencia por el golpe nasal activo durante la autoadministración de DHT (respuestas 66.4 +/- 9.6 / 4 h para Tfm y 79.2 +/- 11.5 para respuestas WT / 4 h), y picos en la nariz aumentados a medida que Requisito de FR aumentado. Las puntuaciones de preferencia fueron significativamente más bajas en el vehículo autoadministrado de ratas (respuestas 42.3 +/- 5.3 / 4 h para Tfm y respuestas 19.1 +/- 4.0 / 4 h para WT). También probamos la autoadministración de DHT conjugada con albúmina de suero bovino (BSA) en C3 y C17, que se limita a acciones en la superficie celular. Se permitió que los hámsters se autoadministraran los conjugados DHT, BSA y DHT-BSA durante los días 15 en FR1. Los hamsters mostraron una preferencia significativa por DHT (18.0 +/- 4.1 respuestas / 4 h) o DHT-BSA conjugados (10.0 +/- 3.7 respuestas / 4 hy 21.0 +/- 7.2 respuestas / 4 h), pero no por BSA (2.5 +/ -2.4 respuestas / 4 h). En conjunto, estos datos demuestran que las AR nucleares no son necesarias para la autoadministración de andrógenos. Además, la autoadministración de andrógenos puede estar mediada por receptores de membrana plasmática.
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Los esteroides anabolicoandrogénicos (AAS) son drogas de abuso. Estos derivados de testosterona (T) se utilizan con fines atléticos y estéticos (Yesalis et al., 1993). Los efectos secundarios van desde el hipogonadismo y la ginecomastia hasta la disfunción cardíaca y hepática (Leshner, xnumx). Además, se está acumulando evidencia de que el abuso de AAS causa alteraciones en el estado de ánimo (Papa y Katz, 1994), agresión (Choi y el Papa, 1994, Kouri et al., 1995), y puede producir dependencia (Brower et al., 1991, Brower, 2002). A pesar de las crecientes preocupaciones, los mecanismos subyacentes del abuso de AAS no se han comprendido bien.
En los seres humanos, se argumenta que el inicio del uso de AAS está motivado en gran medida por efectos anabólicos, pero algunos abusadores eventualmente desarrollan dependencia (Brower, 2002). La evidencia de la investigación con animales apoya esta hipótesis. AAS induce la preferencia de lugar condicionada (CPP) en ratones (Arnedo et al., 2000) y ratas (Packard et al., 1997, Packard et al., 1998, Frye et al., 2002). Además, los hámsters consumen voluntariamente AAS por vía oral (Madera, 2002), intravenoso (Wood et al., 2004), y la autoadministración intracerebroventricular (ICV) (DiMeo y Madera, 2004, Triemstra y madera, 2004, Wood et al., 2004, DiMeo y Madera, 2006b).
Si bien la autoadministración de ICV sugiere sitios de acción centrales, las hormonas y receptores específicos que median el refuerzo de AAS no están claros. La evidencia actual sugiere que los efectos de refuerzo de T están mediados por los andrógenos, en lugar de a través de los estrógenos después de la aromatización. Los hámsters machos se autoadministrarán dihidrotestosterona (DHT; DiMeo y Madera, 2006b) y otros andrógenos no aromatizables (Ballard y madera, 2005). Además, la autoadministración de T está bloqueada por la flutamida anti-andrógeno (Peters y madera, 2004). La pregunta ahora es: ¿cómo se transduce la señal androgénica en el cerebro?
El receptor de andrógenos (AR) es un receptor esteroide nuclear clásico que funciona como un factor de transcripción. Las RA son escasas en estructuras asociadas con el abuso de drogas, como el núcleo accumbens (Acb) y el área tegmental ventral (VTA; Simerly et al., 1990, Madera y Newman, 1999). También hay evidencia de que los esteroides gonadales actúan a través de los receptores de la superficie celular (Mermelstein et al., 1996, Zhu et al., 2003, Thomas et al., 2006, Vasudevan y Pfaff, 2007).
En el presente estudio, utilizamos dos enfoques para determinar el papel de la AR nuclear clásica en el refuerzo de andrógenos. Para minimizar la posible activación de los receptores de estrógeno (ER), probamos la autoadministración de DHT. En el primer experimento, las ratas con la mutación de feminización testicular (Tfm) se analizaron para ICV autoadministración de DHT. Tfm es una sustitución de base única que da como resultado AR defectuosos con una unión limitada al ligando (Yarbrough et al., 1990). Las ratas Tfm macho exhiben un fenotipo externo femenino debido a una estimulación androgénica insuficiente durante el desarrollo (Zuloaga et al., 2008b). Si se requieren AR nucleares funcionales para el refuerzo de AAS, las ratas Tfm no deben autoadministrarse DHT. En cambio, las ratas Tfm pudieron adquirir la autoadministración de DHT. En el segundo experimento, probamos la autoadministración por ICV de formas de DHT impermeables a la membrana en hámsters. Cuando la DHT se conjuga con la albúmina de suero bovino (BSA), sus acciones se restringen a los receptores de la superficie celular. Si se requieren AR nucleares para el refuerzo de andrógenos, los hámsters no deben autoadministrarse DHT conjugado a BSA. Por el contrario, los hámsters mostraron una clara preferencia por la DHT conjugada a BSA. Juntos, estos estudios muestran que las AR nucleares no son necesarias para la autoadministración de andrógenos. En cambio, el refuerzo de andrógenos puede estar mediado por ARs de membrana.
Métodos y Materiales
Materias
Las ratas
Las ratas Tfm macho adultas y los compañeros de camada de tipo salvaje (WT) se obtuvieron de una colonia en la Universidad Estatal de Michigan. Su genotipo fue verificado por PCR, similar a los métodos descritos anteriormente (Fernandez et al., 2003). En resumen, los clips de oreja se digirieron durante la noche a 55 ° C en un tampón de lisis que contiene proteinasa K, luego se inactivaron por calor a 95 ° durante 30 minutos. AR se amplificó utilizando el cebador directo 5'-GCAACTTGCATGTGGATGA-3 'y el cebador inverso 5'-TGAAAACCAGGTCAGGTGC-3', produciendo un producto 135bp. Las muestras amplificadas fueron luego digeridas con la enzima de restricción Sau96I (R0165L, New England BioLabs, Ipswich, MA) durante la noche a 37 ° C y se ejecutaron en un gel de agarosa 3%. Solo el WT AR se corta con esta enzima de restricción, dejando dos bandas por debajo de 100bp, mientras que el Tfm AR permanece sin cortar. Los animales de Tfm también fueron verificados por fenotipo, por la presencia de pezones, distancia anigenital femenina y testículos abdominales. Las ratas Tfm se han utilizado anteriormente para demostrar los efectos androgénicos no genómicos en el hipocampo (MacLusky et al., 2006). Al comienzo del experimento, las ratas WT tenían entre 75 a 140 días, y las ratas Tfm tenían entre 75 a 138 días.
Hámsters
Hámsters sirios machos adultos (130 - 150 g) se obtuvieron de Charles River Laboratories (Wilmington, MA). Los animales se alojaron individualmente en un ciclo de luz invertido (14L: 10D) con comida y agua disponibles ad libitum. Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por los comités institucionales de cuidado y uso de animales de las instituciones respectivas y se realizaron de acuerdo con los Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio. (Consejo Nacional de Investigación, 1996).
La cirugía
Todos los animales fueron implantados con una cánula guía de acero inoxidable 22g (Plastic One, Roanoke, VA) en el ventrículo lateral [rata: AP: 0.7, ML: -1.8, DV: -4.0 -5.0 (Paxinos y Watson, 1998); hamster: AP: + 1.0, ML, + 1.0, DV: -3.0 ∼ -5.0 (Morin Y Madera, 2001), mm de bregma], debajo de Na+ Anestesia con pentobarbital (rata: 50 mg / kg, hámster: 100mg / kg) como se describió anteriormente (Wood et al., 2004). Todos los procedimientos quirúrgicos se realizaron en condiciones asépticas según Principios del cuidado de animales de laboratorio (NIH, 1985). Se permitió que los animales se recuperaran durante al menos una semana después de la cirugía antes del ensayo.
Drogas
DHT, DHT-carboximetil-oxima (CMO), DHT-CMO-BSA, DHT-hemisuccinate (Hemis) y DHT-Hemis-BSA se obtuvieron de Steraloids (Newport, RI). En DHT-CMO-BSA, DHT se conjuga con BSA en la posición C3 con CMO como enlazador. Del mismo modo, DHT está vinculado a BSA en la posición C17 a través de Hemis para formar DHT-Hemis-BSA. Ambos DHT-CMO-BSA (Gatson et al., 2006) y DHT-Hemis-BSA (Braun y Thomas, 2003) se han utilizado anteriormente para investigar los posibles efectos de los andrógenos en la membrana plasmática. DHT se disolvió en una solución acuosa de 13% β-ciclodextrina (βCD, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) a 1μg / μl. Según lo determinado en nuestro estudio anterior en hamsters, esta dosis produce una respuesta operante robusta durante la autoadministración de ICV (DiMeo y Madera, 2006b). Los derivados de DHT se disolvieron en el mismo vehículo a la concentración molar equivalente de DHT (DHT-CMO: 1.25 μg / μl, DHT-CMO-BSA: 8.7 μg / μl, DHT-Hemis: 1.34 μg / μl, DHT-Hemis-BSA : 8.83μg / μl). BSA (Sigma-Aldrich) se disolvió en el mismo vehículo a 7.45 μg / μl para lograr la concentración molar equivalente de BSA como en DHT-CMO-BSA y DHT-Hemis-BSA. Los medicamentos que contienen BSA se prepararon diariamente inmediatamente antes de su uso para evitar la degradación, y todas las soluciones se filtraron a través de un filtro de 0.22 μm. Estudios anteriores han demostrado que solo una pequeña proporción de esteroides se disocia de BSA (Stevis et al., 1999), y esta cantidad es insuficiente para inducir efectos androgénicos significativos (Lieberherr y Grosse, 1994, Gatson et al., 2006). Del mismo modo, nuestro estudio anterior ha demostrado que la DHT se autoadministra a 1.0 μg / μl, pero no a 0.1 μg / μl (DiMeo y Madera, 2006b). Por tanto, es poco probable que la DHT libre (> 10%) se disocie de BSA en cantidad suficiente para apoyar la autoadministración.
aparato
Se permitió a los animales autoadministrarse el fármaco o la solución de vehículo 4 hrs / día, 5 días / semana en una cámara operante (Med Associates, St. Albans, VT) encerrada en una cámara de atenuación de sonido con ventilación forzada. Cada cámara estaba equipada con una luz de la casa, orificios 2, y una bomba de jeringa controlada por computadora conectada a un giro de líquido en un brazo de equilibrio. Las soluciones de una jeringa de vidrio 100 μl se entregaron al animal a través de un tubo Tygon conectado al eslabón giratorio. La tubería que conecta el eslabón giratorio y la cánula ICV estaba protegida por un resorte de metal. La solución del fármaco o el vehículo se suministró a través de una cánula interna 28-ga insertada en la cánula guía inmediatamente antes de la prueba. Cada infusión suministró 1 μl de solución a 0.2 μl / s. Los orificios de la nariz se ubicaron a 6 cm del piso debajo de la luz de la casa. Uno de los orificios de la nariz fue designado como el orificio activo de la nariz. Una respuesta en este orificio se registró como un golpe nasal activo (R: activo reforzado) y se contabilizó para el requisito de respuesta (FR1 a 5) para activar una infusión. Una vez que se activó la infusión, la luz de la casa se apagó y el orificio activo se iluminó durante la infusión de 5 para ayudar a discriminar el orificio activo de la nariz. Se registró la punción de la nariz en el orificio activo durante este período de tiempo de espera de 5, pero no se contabilizó como refuerzo adicional (NR: activo-no reforzado). Una respuesta en el otro orificio de la nariz se registró como un golpe de nariz inactivo (I), pero no dio como resultado ninguna infusión. La ubicación del orificio de la nariz activa en la parte delantera o trasera de la cámara se equilibró para controlar las preferencias laterales. Los datos fueron registrados por el software WMPC (Med Associate) en una PC con Windows.
ICV autoadministración
Las ratas
La autoadministración de DHT en ratas Tfm y WT siguió un programa de proporción fija ascendente (FR) de FR1 a FR5. Las ratas se entrenaron inicialmente en FR1, donde se reforzó cada respuesta en el golpe de nariz activo. Posteriormente, el número de respuestas necesarias para obtener una infusión se incrementó en uno cada 5 días. En FR5, se necesitaron cinco respuestas en el orificio activo de la nariz para una infusión. En general, las ratas se probaron en FR1 durante los días 10 y de FR2 a FR5 (días 5 cada una), por un total de días 30. Las ratas de cada genotipo se asignaron al azar a grupos de DHT o de vehículo (Veh), y se les permitió autoadministrarse DHT o el vehículo de βCD, respectivamente. Treinta y seis ratas (nWT = 19, nTFM = 17) fueron utilizados en este experimento.
Hámsters
Los hámsters se probaron bajo un programa FR1 para los días 15. En estudios previos, los días 15 de auto-administración de ICV T son suficientes para adquirir una preferencia por el golpe de nariz activo. Los hámsters se asignaron al azar a DHT (n = 8), DHT-CMO (n = 9), DHT-CMO-BSA (n = 10), DHT-Hemis (n = 11), DHT-Hemis-BSA (n = 8) ), o grupos BSA (n = 9).
El análisis de datos
Las ratas
Las puntuaciones diarias de preferencia para el golpe de nariz activo se determinaron restando los golpes de nariz inactivos de la suma de los ataques de nariz activos reforzados y activos no reforzados (R + NR-I). La puntuación media de preferencia se calculó para cada animal a partir de los últimos días 5 de FR1 y durante FR2 a FR5. Además, se comparó el número promedio de refuerzos por sesión para cada animal en cada FR.
Los datos se analizaron mediante ANOVA de 3-way, con genotipo (WT o Tfm), fármaco (DHT o vehículo) y programa de FR (1 ∼ 5) como factores entre sujetos. El programa de FR se trató como un factor intermedio, ya que algunos animales no completaron todos los días de prueba de 30 debido a la obstrucción de la cánula guía ICV. En esos casos, solo los datos de los cronogramas completados se incluyeron en los análisis. El número de animales incluidos en cada condición se muestra en Tabla 1. Un ANOVA de tres vías fue seguido por ANOVA de orden inferior apropiados para efectos simples. La prueba de Newman-Keuls para comparaciones por parejas post-hoc se utilizó cuando fue necesario.
Tabla 1
Hámsters
Los medios individuales de R, NR y I se utilizaron para el análisis de datos. La puntuación de preferencia para cada animal se determinó restando la punción nasal inactiva media (I) de la punción nasal activa media (R + NR-I). La puntuación media de preferencia fue analizada con una muestra. t-prueba contra 0 (es decir, sin preferencia) para cada grupo. Además, la cantidad de refuerzos recibidos se promedió para cada animal. El refuerzo medio recibido para cada grupo de fármacos se comparó con el de los controles BSA con un 2 de muestras independientes t-prueba. Los animales que no completaron un mínimo de sesiones 5 se excluyeron del análisis (cada uno de los grupos DHT-Hemis y DHT-Hemis-BSA).
Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando SPSS 12 (SPSS Inc., Chicago, IL). Para todo análisis, p <0.05 se consideró estadísticamente significativo. Los datos se presentan como media ± SEM por sesión de 4 horas.
Resultados
Las ratas WT y Tfm se auto administran DHT
Operante respondiendo
Figs. 1 ilustra la preferencia media por el pinchazo de nariz activo (R + RN - I) en cada FR para los grupos DHT y Veh. Las ratas que se autoadministraron DHT mostraron una mayor preferencia por el pinchazo activo en la nariz (73.1 ± 7.6 resp / 4 h), en comparación con los controles con vehículo (29.8 ± 3.5 resp / 4 h; F1,145 = 31.77, p <0.001). También hubo un efecto principal del horario FR (F4,145 = 4.25, p <0.01), interacción genotipo-fármaco (F1,145 = 5.27, p = 0.02), y una interacción de horario de fármaco-FR (F4,145 = 2.60, p = 0.02). No hubo un efecto principal del genotipo, y otras interacciones no fueron significativas.
Figura 1 y XNUMX
Las pruebas post hoc revelaron que las ratas con DHT autoadministradas mostraron una preferencia significativamente mayor sobre el programa de FR (F4,73 = 4.18, p <0.01), aumentando la preferencia de FR1 (33.4 ± 4.4 resp / 4 h) a FR4 (110.8 ± 26.7 resp / 4 h) y FR5 (106.4 ± 18.9 resp / 4 h). No se observó ningún efecto del genotipo en este grupo (esquema de genotipo-FR: F4,73 = 0.13, ns; genotipo: f1,73 = 0.86, ns).
Por el contrario, las ratas Veh autoadministrado no mostraron cambios en la preferencia sobre el programa de FR (F4,72 = 0.31, ns), y no hay interacción de programación genotipo-FR (F4,72 = 0.12, ns). A diferencia de DHT, las ratas Tfm mostraron una mayor preferencia que WT en este grupo (42.3 ± 5.3 y 19.1 ± 4.0 resps / 4h, respectivamente; F4,72 = 11.81, p <0.01).
Infusiones
El número promedio de infusiones de DHT y Vehículo recibidas en cada FR se muestra en . En general, las ratas recibieron más infusiones cuando se les permitió autoadministrarse DHT (26.9 ± 2.2 μg / 4h) en comparación con el vehículo (15.4 ± 1.9 μl / 4h, F1,145 = 14.70, p <0.001). También hubo un efecto principal del horario FR (F1,145 = 3.32, p = 0.01), y la interacción genotipo-fármaco (F1,145 = 6.41, p = 0.01). Todas las demás interacciones y efectos principales no fueron significativos.
Figura 2 y XNUMX
La ingesta diaria promedio de DHT en todos los programas de FR fue similar en ratas Tfm (24.3 ± 2.9 μg / 4hr) y WT (29.4 ± 3.4 μg / 4h). En ambos grupos, la ingesta de medicamentos se mantuvo constante a medida que aumentaba el programa de FR (F4,73 = 0.54, ns). Durante FR1, Tfm y WT, los machos se autoadministraron DHT en 24.5 ± 2.3 μg / 4h y 37.3 ± 6.7 μg / 4h, respectivamente. Bajo un programa FR5, la autoadministración de DHT promedió 18.3 ± 4.5 μg / 4h para Tfm y 23.9 ± 5.9 μg / 4h para ratas WT. Este grupo no exhibió diferencias basadas en el genotipo o genotipo-FR (F1,73 = 1.17, ns; F4,73 = 0.34, ns, respectivamente).
Por el contrario, en ratas Tfm y WT, el número de infusiones de vehículos disminuyó significativamente a medida que aumentaba el requisito de FR (F4,72 = 4.73, p <0.01). Sorprendentemente, las ratas Tfm se autoadministraron aproximadamente el doble de vehículo (20.7 ± 2.4 μl / 4 h) que las ratas WT (10.7 ± 1.4 μl / 4 h, F1,72 = 7.77, p <0.01). En ratas Tfm en FR1, el número de infusiones de vehículo (39.9 ± 13.2 μl / 4 h) excedió el número de infusiones de DHT (24.5 ± 2.3 μl / 4 h). Sin embargo, al final del experimento, la autoadministración de vehículo había disminuido a 10.3 ± 2.4 µl / 4 h. Asimismo, las ratas WT se autoadministraron 18.6 ± 4.1 μl / 4 h de vehículo en FR1, que se redujo a 6.6 ± 1.8 μl / 4 h en FR5.
El peso corporal medio al comienzo de cada programa de FR y el número de animales en cada condición se muestra en Tabla 1. Las ratas WT fueron significativamente más pesadas que las ratas Tfm (F1,174 = 144.62, p <0.001), y todos los grupos aumentaron de peso con el tiempo (F5,174 = 5.59, p <0.001). No hubo efecto de la condición de la droga (DHT vs Veh) sobre el peso corporal (F1, 174 = 0.31, ns), o cualquier interacción. La ingesta de DHT ajustada para el peso corporal fue similar en ambos genotipos tanto en FR1 (WT: 77.9 μg / kg, Tfm: 65.4 μg / kg) como en FR5 (WT: 46.5 μg / kg, Tfm: 42.6 μg / kg).
Los hámsters sirios se auto administran DHT conjugado a BSA
Operante respondiendo
Hámsters autoadministrados DHT y DHT conjugados a BSA, pero no a BSA solo. Fig. 3a muestra la preferencia media (nariz activa-inactiva) por DHT, BSA, DHT-CMO-BSA y DHT-Hemis-BSA, DHT-CMO, DHT-Hemis. De acuerdo con nuestros estudios anteriores, los hámsters desarrollaron una preferencia por el pinchazo activo en la nariz durante la autoadministración de DHT (t7 = 4.34, p <0.01), pero no mostró preferencia al autoadministrarse BSA (t8 = 1.03, ns). Del mismo modo, los hámsters mostraron una preferencia por el golpe activo en la nariz con ambos DHT-CMO-BSA (t9 = 2.71, p = 0.02) y DHT-Hemis-BSA (t7 = 2.92, p = 0.02). Con DHT conectado a los enlazadores solo, los hámsters se autoadministraron DHT-CMO (t8 = 3.91, p <0.01), pero no mostró una preferencia significativa cuando se autoadministra DHT-Hemis (t10 = 1.87, p = 0.09). Con DHT-Hemis, las respuestas en el golpe nasal activo (40.5 ± 10.3 resp / 4h) fueron similares a las de DHT-Hemis-BSA (41.2 ± 11.4 resp / 4h), pero estos hombres también mostraron mayores respuestas para la nariz inactiva -poke (28.7 ± 6.6 resp / 4h) en comparación con los de DHT-Hemis-BSA (20.3 ± 4.4 resp / 4h).
Figura 3 y XNUMX
Infusiones
El número de infusiones recibidas para cada grupo se muestra en Fig. 3b. Los hámsters recibieron significativamente más infusiones de DHT que BSA (t15 = 3.04, p = 0.01). De manera similar, los hamsters recibieron más infusiones cuando se les permitió autoadministrarse DHT-Hemis-BSA (t15 = 2.72, p = 0.02) o DHT-CMO (t16 = 2.70, p = 0.02) comparado con BSA. Los números de infusiones recibidas para los grupos DHT-CMO-BSA (17.2 ± 3.2 μl / 4hr) y DHT-Hemis (22.7 ± 5.9 μl / 4hr) fueron similares a los de DHT, DHT-Hemis-BSA y DHT- autoadministrados. CMO. No obstante, los hámsters no recibieron significativamente más DHT-CMO-BSA (t17 = 1.96, p = 0.07) o DHT-Hemis (t18 = 1.91, p = 0.07) comparado con BSA.
Sobredosis
Once de los hámsters 55 murieron antes de completar todas las sesiones de prueba de 15. Las muertes por sobredosis de andrógenos durante la autoadministración de testosterona han sido descritas previamente (Peters y madera, 2005). En el presente estudio, 2 de los varones 8 (25%) murió durante la autoadministración de DHT, similar al 24% reportado por sobredosis de testosterona (Peters y madera, 2005). La autoadministración de DHT-CMO y DHT-Hemis se asoció con las mayores pérdidas (cada 3 de 8 por grupo, 38%), mientras que hubo pocas muertes entre BSA autoadministrados de hámsters (1 de 9, 11%) o DHT -Hemis-BSA (0 de 8). Al igual que con la sobredosis de testosterona, ninguno de los hámsters en el presente estudio murió durante la autoadministración. En cambio, los hámsters murieron varias horas más tarde en sus jaulas, con depresión locomotora y respiratoria severa.
La sobredosis de testosterona está estrechamente relacionada con la ingesta de testosterona, particularmente la ingesta máxima por sesión (Peters y madera, 2005). compara los puntajes de preferencia, la cantidad de refuerzos recibidos y la ingesta máxima para los hamsters que completaron todas las sesiones de prueba de 15 y los que no lo hicieron. Ambos grupos mostraron una preferencia significativa por el golpe de nariz activo (p <0.05). Sin embargo, la preferencia fue significativamente mayor en los hámsters que murieron durante la autoadministración (25.7 ± 5.2 resp / 4 h) en comparación con los que sobrevivieron (9.5 ± 2.0 resp / 4 h, t53 = 3.42, p <0.01). Los hámsters que no completaron 15 sesiones recibieron más del doble de infusiones por sesión (31.2 ± 5.0 inf / 4h) que los que completaron todas las sesiones (14.8 ± 1.1 inf / 4h, t53 = 5.05, p <0.001). Además, para los hámsters que murieron durante el estudio, la ingesta máxima por sesión fue significativamente mayor (77.0 ± 9.8 inf / 4h) que para los machos que sobrevivieron (36.1 ± 2.9 inf / 4h, t53 = 5.41, p <0.001).
Figura 4 y XNUMX
Discusión
La autoadministración de andrógenos puede estar mediada por membrana asociada, pero no por receptores de andrógenos nucleares
El estudio actual demuestra que las RA nucleares clásicas no son esenciales para la autoadministración de andrógenos. Ambas ratas Tfm y WT desarrollaron una preferencia por el golpe nasal activo durante la autoadministración de DHT. Además, pudieron responder al cronograma ascendente de FR aumentando los golpes activos en la nariz, manteniendo así un nivel constante de consumo de drogas independientemente del cronograma de FR. En contraste, las ratas que recibieron el vehículo no respondieron a los cambios en el horario de FR. Sus toques de nariz activos no aumentaron significativamente en respuesta a los cambios en el programa de FR, y recibieron menos infusiones a medida que aumentaba el requisito de respuesta. Debido a que la unión del ligando al receptor de andrógenos nuclear "clásico" está comprometida en los mutantes Tfm, esto apoya nuestra hipótesis de que el refuerzo de andrógenos está mediado a través de vías alternativas.
La respuesta inesperadamente alta para el vehículo por parte de ratas Tfm es poco probable que se deba al propio vehículo. Observamos fenómenos similares en un grupo separado de ratas Tfm que no estaban recibiendo ninguna infusión (datos no mostrados). En su lugar, puede estar relacionado con rasgos de comportamiento feminizados en los machos Tfm. El aumento de los golpes en la nariz de las ratas Tfm puede ser análogo a los mayores descensos de cabeza exploratorios observados en ratas hembras (Marrón y Nemes, 2008). Alternativamente, se sabe que las ratas y ratones Tfm exhiben conductas similares a la ansiedad (Zuloaga y otros, 2006, Zuloaga et al., 2008a). Quizás, los efectos sedantes / ansiolíticos de la DHT (Agren et al., 1999, Arnedo et al., 2000, Frye y Seliga, 2001, Berbos et al., 2002, Peters y madera, 2005) mitigaron los comportamientos de ansiedad cuando las ratas Tfm se autoadministraron DHT.
Además, la autoadministración de conjugados DHT-BSA en hámsters machos proporciona evidencia de que los andrógenos pueden actuar en la membrana plasmática neuronal para tener una acción de refuerzo. Los hámsters mostraron una preferencia significativa por ambos conjugados DHT-BSA. Las dosis autoadministradas están en línea con nuestros estudios previos sobre T, DHT y los esteroides comúnmente abusados (Ballard y madera, 2005, DiMeo y Madera, 2006b). En contraste, los hámsters no mostraron preferencia por BSA solo. Los datos sobre mortalidad y consumo de drogas demuestran que la DHT y sus derivados pueden ser letales, extendiendo nuestros datos anteriores sobre sobredosis de T (Peters y madera, 2005).
El estudio actual revela un patrón específico de especie de respuesta operante. Los hámsters no preferían el golpe activo en la nariz mientras se autoadministaban, como se demostró anteriormente (Johnson y Wood, 2001, Madera, 2002, DiMeo y Madera, 2004, Triemstra y madera, 2004, Wood et al., 2004, Ballard y madera, 2005, DiMeo y Madera, 2006b). Sin embargo, en las ratas, hubo una clara preferencia por la nariz activa sin importar el medicamento recibido. Observamos una tendencia similar en nuestro estudio anterior sobre la autoadministración IV de T en ratas, aunque no fue estadísticamente significativa (Wood et al., 2004). Sobre la base de la diferencia de comportamiento específica de cada especie en la autoadministración, se debe tener cuidado al comparar datos de comportamiento de ratas y hámsters.
Hay varias advertencias que deben ser consideradas en la interpretación del estudio actual. En primer lugar, las AR nucleares con deterioro significativo de la unión del ligando todavía están presentes en ratas Tfm (Yarbrough et al., 1990), a diferencia de los ratones Tfm (He et al., 1991). Es posible que estas AR nucleares mutadas sean suficientes para mediar los efectos de los andrógenos en dosis supra-fisiológicas. Segundo, los conjugados DHT-BSA pueden degradarse in vivo, resultando en DHT libre. Aunque esto no parece ser un problema significativo in vitro (Lieberherr y Grosse, 1994, Gatson et al., 2006), el grado y el curso temporal de la degradación de DHT-BSA in vivo En el cerebro se desconoce actualmente. Finalmente, los conjugados DHT-BSA pueden no penetrar significativamente en el tejido cerebral. DHT-BSA es significativamente más grande que DHT, por lo que es probable que los efectos de DHT-BSA observados en el estudio actual estén mediados en sitios cercanos a los ventrículos.
A pesar de estas advertencias, estos dos enfoques diferentes produjeron resultados consistentes que argumentan fuertemente en contra de la necesidad de AR nuclear en el refuerzo de andrógenos. Además, la autoadministración de conjugados de BSA sugiere que los andrógenos pueden actuar en la membrana plasmática en el refuerzo de andrógenos. A nuestro entender, el presente estudio proporciona la primera in vivo evidencia de efectos relevantes para el comportamiento de los andrógenos en la membrana plasmática.
Los andrógenos ejercen rápidos efectos independientes de AR en la recompensa
Varios otros estudios sobre la recompensa de andrógenos han mostrado resultados consistentes con efectos no genómicos o de membrana plasmática. CPP se desarrolla dentro de 30 min de inyección sistémica de T (Alexander et al., 1994), también se puede inducir un curso de tiempo compatible con los efectos no genómicos agudos de T. CPP con infusiones intra-Acb de T o su metabolito (Packard et al., 1997, Frye et al., 2002), aunque Acb tiene poca AR genómica. Además, el VTA expresa Fos en respuesta a la infusión de ICV T (Dimeo y Madera, 2006a), a pesar de la falta de expresión de AR clásica significativa. El estudio actual no proporciona información sobre el sitio de acción en el cerebro. No obstante, indica que la falta relativa de AR nuclear solo no es razón suficiente para excluir estructuras como Acb y VTA de los sitios potenciales que pueden mediar los efectos androgénicos.
Los efectos rápidos en la membrana plasmática de los esteroides en el estriado dorsal y ventral no se limitan a los andrógenos. Se sabe que las progestinas inducen CPP, posiblemente a través de los receptores de ácido gamma-aminobutírico (GABA) en Acb (Frye, 2007). Los estrógenos también ejercen rápidos efectos mediados por receptores de membrana en el cuerpo estriado dorsal (Mermelstein et al., 1996, Becker y Rudick, 1999). Ya se ha aislado un receptor asociado a la membrana para las progestinas (Zhu et al., 2003), y se está acumulando evidencia de receptores de estrógenos en la superficie celular (revisados en Vasudevan y Pfaff, 2007) y andrógenos (revisados en Thomas et al., 2006). Mientras que los estrógenos también están reforzando (DiMeo y Madera, 2006b), los efectos de refuerzo de T parecen ser predominantemente androgénicos. Los hámsters se auto administran andrógenos no aromatizables, como drostanolone y DHT (Ballard y madera, 2005, DiMeo y Madera, 2006b). Además, la flutamida anti-andrógeno puede bloquear la autoadministración de T (Peters y madera, 2004). Si bien esto puede parecer contradecir el papel de la AR de la membrana que se informó en este estudio, se ha informado que la flutamida también bloquea la activación de la AR de la membrana (Braun y Thomas, 2003, Braun y Thomas, 2004).
Las propiedades de los receptores andrógenos de membrana.
Históricamente, los efectos de los esteroides, incluidos los andrógenos, se consideraron transducidos por procesos mediados por receptores nucleares. Sin embargo, los informes de los efectos rápidos de los andrógenos, presumiblemente mediados por receptores asociados a la membrana, han estado disponibles durante varias décadas. Por ejemplo, en el área preóptica medial, los andrógenos pueden alterar el disparo neuronal en segundos (Yamada, 1979) a minutos (Pfaff y Pfaffmann, 1969). Además, Orsini y sus colegas (Orsini, 1985, Orsini et al., 1985) han mostrado una rápida modificación de la frecuencia de activación neuronal por andrógenos en el hipotálamo lateral (LHA). Este efecto de los andrógenos en el LHA puede ser de particular relevancia para el presente estudio, ya que se sabe que el LHA está involucrado en el circuito de recompensa (Olds y Milner, 1954) y LHA orexin / hipocretina está regulada por los esteroides gonadales (Muschamp et al., 2007).
Los tipos de células con posibles AR de membrana incluyen glial (Gatson et al., 2006), gonadalBraun y Thomas, 2003, Braun y Thomas, 2004), y las células inmunes (Benten et al., 1999, Guo et al., 2002), los miocitos (Estrada et al., 2003), y osteoblastos (Lieberherr y Grosse, 1994). Aunque la identidad molecular aún no se ha determinado, los candidatos para la AR de membrana incluyen receptores de membrana con sitios de unión a esteroides conocidos, como GABA-A (revisado en Lambert et al., 2003) y subunidades NR2 de receptores de ácido N-metil-D-aspártico (Malayev et al., 2002). Alternativamente, Thomas y sus colegas (2004) han reportado evidencia de un nuevo receptor acoplado a proteína G como membrana AR. Además, los efectos de los andrógenos no relacionados con un receptor específico no se pueden excluir en el presente estudio.
Recientes in vitro los estudios sugieren que existen múltiples AR de membrana, o más de un sitio de unión en un solo receptor, como se propuso para el receptor de progesterona de membrana (Ramirez et al., 1996). En muchos tipos de células, la membrana AR parece ser un receptor de membrana acoplado a Gq / o (Lieberherr y Grosse, 1994, Benten et al., 1999, Zhu et al., 1999, Guo et al., 2002, Estrada et al., 2003). Sin embargo, las características de unión a los esteroides y la sensibilidad a los anti-andrógenos de la membrana putativa AR varían mucho según el tipo de célula. Por ejemplo, los anti-andrógenos pueden bloquear los efectos de la DHT en las células ováricas de corvina (Braun y Thomas, 2003, Braun y Thomas, 2004), aunque no son efectivos en otros tipos de células (Lieberherr y Grosse, 1994, Benten et al., 2004, Gatson et al., 2006), o incluso pueden ejercer efectos similares a los agonistas en las células del hipocampo (Lucio, xnumx, Nguyen et al., 2007) y varias líneas celulares de cáncer (Peterziel et al., 1999, Zhu et al., 1999, Evangelou et al., 2000, Papakonstanti et al., 2003). Además, se han notificado diferentes características de unión a T para diferentes órganos en peces (Braun y Thomas, 2004).
Nuestra experiencia con AAS de abuso frecuente indica que las modificaciones importantes en el anillo A (en C2 y / o C3) y en C17 tienden a interferir con la autoadministración (Ballard y madera, 2005). Por ejemplo, el estanozolol, que tiene una modificación importante en C2 y C3, así como un grupo metilo unido a C17, no es autoadministrado. En el estudio actual, los hámsters se autoadministraron BSA conjugado en C3 (DHT-CMO-BSA) y C17 (DHT-Hemis-BSA). Se requieren investigaciones adicionales para dilucidar las características de los andrógenos autoadministrados.
Significación clínica
Los AAS, especialmente los T, son, con mucho, los agentes más comunes para mejorar el rendimiento utilizados por los atletas, ya que representan casi la mitad de las pruebas de dopaje positivas (Agencia Mundial Antidopaje, 2006). Dado el uso tan generalizado, el abuso de AAS tiene consecuencias de salud de gran alcance. Los efectos secundarios cardíacos y hepáticos del abuso de AAS están bien establecidos (Leshner, xnumx). Se ha pensado que estos y los efectos anabólicos de AAS están mediados por la AR nuclear. Sin embargo, los posibles efectos de los andrógenos en AR independientes de la AR sugieren que la influencia de AAS puede extenderse mucho más allá de las estructuras con expresión de AR nuclear.
En cuanto al parecido con otras drogas de abuso, los AAS producen diferentes efectos y tienen diferentes mecanismos de acción frente a los estimulantes. A diferencia de los estimulantes (Graybiel et al., 1990), AAS induce la activación de c-Fos solo en el VTA y no en Acb (Dimeo y Madera, 2006a). Además, los AAS atenúan la liberación de Acb DA inducida por estimulantes (Birgner et al., 2006), e inhibir la liberación de DA de forma aguda (Triemstra et al., 2008). Desde el punto de vista del comportamiento, los AAS no inducen características de activación locomotora de los estimulantes (Peters y madera, 2005).
En cambio, las respuestas de comportamiento al AAS agudo se asemejan a las de los opioides o benzodiacepinas, posiblemente ejerciendo efectos aditivos cuando se toman juntos. La exposición aguda a AAS deprime las funciones autónomas, incluida la respiración y la temperatura corporal (Peters y madera, 2005). La depresión autónoma inducida por AAS recuerda los síntomas de una sobredosis de opioides y es bloqueada por el antagonista de opioides naltrexona (Peters y madera, 2005). Además, la nandrolona, un AAS de uso común, potencia los efectos hipotérmicos de la morfina y exacerba los síntomas de abstinencia a la morfina precipitados con naloxona (Celerier et al., 2003). Además, está bien establecido que los AAS agudos son sedantes / ansiolíticos (Agren et al., 1999, Arnedo et al., 2000, Frye y Seliga, 2001, Berbos et al., 2002, Peters y madera, 2005), posiblemente mediado por sus efectos directos sobre los receptores GABA-A (Masonis y McCarthy, 1995, Masonis y McCarthy, 1996). El aumento del consumo de etanol en ratas tratadas crónicamente con AAS también puede ser un reflejo de la función alterada de GABAergic (Johansson y otros, 2000).
Nuestros hallazgos sobre la sobredosis plantean un problema de salud adicional. Actualmente, la clasificación de AAS como sustancias de control se basa en sus propiedades anabólicas (Ley de Sustancias Controladas, 1991). Sin embargo, el estudio actual demuestra que la eficacia anabólica de AAS no corresponde necesariamente a sus propiedades de refuerzo y riesgos de sobredosis. Además de los conjugados DHT-BSA, el DHT-CMO utilizado en este estudio no es una sustancia controlada, aunque sus propiedades de refuerzo y la mortalidad por su sobredosis parecen ser bastante similares a las de DHT y T (Peters y madera, 2005). El patrón de sobredosis también se parecía al reportado anteriormente para T (Peters y madera, 2005), donde la ingesta alta dio lugar a la mortalidad de 24 a 48 horas más tarde. A la luz de estos hallazgos, los criterios utilizados para programar un esteroide como sustancia controlada pueden requerir revisiones para tener en cuenta su responsabilidad y toxicidad de abuso, además de su potencia anabólica.
Los resultados del estudio actual sugieren que la AR nuclear, la única AR aislada hasta ahora, no es esencial para el refuerzo de andrógenos. En cambio, los resultados sugieren que el refuerzo de andrógenos se transduce en la membrana plasmática. Por lo tanto, se requieren investigaciones adicionales sobre la identidad de la supuesta membrana AR, sus características funcionales y su distribución anatómica para dilucidar el mecanismo subyacente del abuso de AAS y sus implicaciones clínicas.
Notas a pie de página
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