Jonathan P. Fadok, 1,2 Tavis MK Dickerson, 2 y Richard D. Palmiter2 *
J Neurosci. Manuscrito del autor; Disponible en PMC 2010 March 9.
Publicado en forma final editada como:
J Neurosci. 2009 septiembre 9; 29 (36): 11089 – 11097.
doi: 10.1523 / JNEUROSCI.1616-09.2009.
Programa de posgrado 1 en neurobiología y comportamiento, Universidad de Washington, Seattle, WA 98195
2 Departamento de Bioquímica e Instituto Médico Howard Hughes, Universidad de Washington, Seattle, WA, 98195
* La correspondencia debe dirigirse a: Richard D. Palmiter, HHMI y Departamento de Bioquímica, Box 357370, Universidad de Washington, Seattle, WA 98195. Email: [email protected]
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Resumen
La dopamina (DA) está implicada en muchos comportamientos, incluida la función motora, la cognición y el procesamiento de recompensas; sin embargo, el papel de la DA en el procesamiento del miedo sigue siendo equívoco. Para examinar el papel de la DA en el aprendizaje relacionado con el miedo, se probaron ratones deficientes en dopamina (DD) en un paradigma de sobresalto potenciado por el miedo. La síntesis de DA se puede restaurar en ratones DD mediante la administración de 3, 4-dihidroxi-L-fenilalanina (L-Dopa), lo que permite la evaluación del procesamiento del miedo en un estado agotado o repleto de DA. El sobresalto potenciado por el miedo estaba ausente en los ratones con DD pero se pudo restaurar mediante la administración de L-Dopa inmediatamente después del acondicionamiento del miedo. La restauración selectiva mediada por virus de la síntesis de DA dentro del área tegmental ventral restauró completamente el aprendizaje del miedo en ratones DD y la restauración de la síntesis de DA a las neuronas DA que se proyectaban a la amígdala basolateral restaurada a corto plazo, pero no a la memoria a largo plazo ni a la sensibilización de choque. También demostramos que el receptor DA D1 (D1R) y los receptores similares a D2 son necesarios para el aprendizaje del miedo dependiente de la señal.
Estos hallazgos indican que la DA que actúa sobre múltiples subtipos de receptores dentro de múltiples regiones objetivo facilita la estabilización de la memoria del miedo.
Palabras clave: Dopamina, miedo, miedo asustado, amígdala, receptor D1 de dopamina, receptor D2 de dopamina.
Introducción
El neuromodulador DA es importante para el aprendizaje relacionado con la recompensa y el comportamiento de búsqueda de drogas (Schultz, 2002; Wise, 2004), y la evidencia acumulada sugiere que la DA también puede ser importante para el aprendizaje relacionado con el miedo (Lamont y Kokkinidis, 1998; Guarraci et al ., 1999; Greba y Kokkinidis, 2000; Guarraci et al., 2000; Greba et al., 2001; Pezze y Feldon, 2004; de Oliveira et al., 2006). Las neuronas DA del cerebro medio ventral proyectan áreas cerebrales límbicas importantes para el aprendizaje del miedo, y los niveles de DA en estas áreas cerebrales aumentan durante eventos aversivos (Abercrombie et al., 1989; Kalivas y Duffy, 1995; Doherty y Gratton, 1997; Inglis y Moghaddam , 1999). Además, algunas neuronas DA del cerebro medio aumentan sus tasas de activación a estímulos aversivos y señales predictivas (Guarraci y Kapp, 1999; Horvitz, 2000; Joshua et al., 2008). Además, se ha demostrado que la DA facilita la potenciación a largo plazo, un correlato neural clave de la memoria, en áreas críticas para el aprendizaje del miedo, como el hipocampo y la amígdala (Bissiere et al., 2003; Lemon y Manahan-Vaughan, 2006; Swant y Wagner, 2006).
A pesar del progreso realizado en relación con la fisiología de las neuronas DA con el miedo, el rol preciso de la DA y sus receptores afines en el aprendizaje relacionado con el miedo sigue sin resolverse. Se ha demostrado que las inyecciones de antagonistas de tipo D1R en forma sistémica, o en la amígdala, bloquean la adquisición o la expresión del aprendizaje relacionado con el miedo; sin embargo, otros han demostrado que estos medicamentos no tienen efecto (Guarraci et al., 1999; Greba y Kokkinidis, 2000; de Oliveira et al., 2006). Además, se ha demostrado que los agonistas tipo D1R mejoran o no tienen ningún efecto sobre el condicionamiento del miedo (Guarraci et al., 1999; Greba et al., 2000; Inoue et al., 2000; de Oliveira et al., 2006). Se han encontrado discrepancias análogas en estudios que utilizan agonistas o antagonistas para los receptores similares a D2R (Guarraci et al., 2000; Greba et al., 2001; Ponnusamy et al., 2005; de Oliveira et al., 2006). Estas discrepancias podrían deberse a la metodología de comportamiento, a los efectos de las dosis de los fármacos inyectados o a las diferencias en la elección de los agentes farmacológicos. Por ejemplo, los antagonistas de los receptores DA varían ampliamente en su selectividad, por lo tanto, mientras que algunos estudios pueden ser antagonistas más selectivos de los receptores D2, otros pueden ser antagonistas más generales de los receptores D2, D3 y D4 (Missale et al., 1998).
Para dilucidar el papel de la DA en el aprendizaje relacionado con el miedo, utilizamos ratones que carecen de DA (ratones DD), así como ratones que carecen de los receptores D1R o DA D2 (D2R) y los probamos en un paradigma de sobresalto potenciado por el miedo. El sobresalto potenciado por el miedo es un paradigma de condicionamiento del miedo pavloviano en el que un estímulo neutral provoca aumentos en la respuesta del sobresalto acústico después de los emparejamientos con un choque de pies (Koch, 1999). El sobresalto potenciado por el miedo es un paradigma ideal para estos estudios porque no depende de una evaluación del comportamiento de congelación, que es difícil de medir en ratones DD hipoactivos (Zhou y Palmiter, 1995). Debido a que los ratones DD se pueden estudiar en un estado agotado de DA o repleto de DA, brindan una oportunidad ideal para estudiar el papel de DA en el aprendizaje y la formación de la memoria. Además, al usar la administración mediada por virus de la recombinasa Cre, la señalización de DA se puede restaurar selectivamente a regiones diana específicas mediante la reactivación de un alelo Th de ratones DD (Hnasko et al., 2006). La restauración selectiva de DA a áreas objetivo específicas permite la evaluación de regiones cerebrales reguladas por la señalización de DA durante el acondicionamiento del miedo.
Materiales y Métodos
Animales y tratamientos
Se generaron ratones DD como se describe (Hnasko et al., 2006). En resumen, los ratones DD (Thfs / fs; DbhTh / +) llevan dos alelos tirosina hidroxilasa (Th) no funcionales, que se han inactivado mediante la inserción de un gen de resistencia a la neomicina (NeoR) flanqueado por sitios lox P en el primer intrón del gen Th . Estos ratones también portan un alelo de β-hidroxilasa (Dbh) de dopamina intacta y un alelo Dbh con una inserción dirigida del gen Th. Los animales de control llevan al menos un alelo Th intacto y un alelo Dbh intacto. Los niveles de catecolaminas no dopaminérgicas son normales en animales DD y los niveles de todas las catecolaminas son normales en animales control (Zhou y Palmiter, 1995; Szczypka et al., 1999). Los ratones se mantuvieron en un fondo genético mixto C57BL / 6 X 129 / Sv. Debido a la hipofagia grave, a los ratones DD se les inyectó diariamente (ip) con L-Dopa a 50 mg / kg a un volumen de 33 μl / g (Zhou y Palmiter, 1995), comenzando aproximadamente el día postnatal 10. Estas inyecciones restauran la función DA para 8 a 10 hr (Szczypka et al., 1999). Se han descrito ratones knockout (KO) y D1R KO (Drago et al., 2; Kelly et al., 1994). Ambas cepas se mantuvieron en un fondo C1997BL / 57. Debido al retraso en el crecimiento en ratones D6R KO, se destetaron a las cuatro semanas y luego se alimentaron con comida humedecida para promover el crecimiento. Todos los animales fueron genotipados por análisis de PCR. Ratones machos y hembras fueron sometidos a pruebas de comportamiento entre las edades de 1 – 2 meses. Todos los ratones se alojaron en un ciclo 5: 12 (claro: oscuro) en un ambiente de temperatura controlada con alimentos (12LJ5; PMI Feeds, St. Louis, MO) y agua disponible a voluntad. Todos los experimentos de comportamiento se llevaron a cabo durante el ciclo de luz. Todos los ratones fueron tratados de acuerdo con las pautas establecidas por los Institutos Nacionales de la Salud y el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Washington.
Para evaluar si otros receptores similares a D2 son importantes para el aprendizaje del miedo, a los ratones D2R KO se les administró la eticloprida antagonista de tipo D2 (Sigma, St. Louis, MO) a 0.5 mg / kg (ip). Eticlopride se disolvió en 0.9% solución salina y se administró a un volumen final de 10 μl / g. Los ratones de tipo salvaje D2R (WT) se inyectaron con un vehículo.
aparato
Se utilizaron cámaras de sobresalto que atenuaban el sonido (SR-Lab, San Diego Instruments, San Diego, CA) para medir la inhibición de prepulso, las respuestas de sobresalto y el sobresalto potenciado por el miedo. Para las respuestas de sobresalto, se tomaron lecturas de 65 1-ms, comenzando en el inicio del pulso. Para medir la respuesta al choque de pies, se tomaron lecturas de 500 1-ms, comenzando en el inicio del choque. La amplitud máxima de la respuesta se usó para calcular la inhibición prepulso, las respuestas de sobresalto, el sobresalto potenciado por el miedo y la reactividad al choque. Un altavoz de alta frecuencia ubicado en el techo de la cámara produjo un sonido de ruido blanco. El sonido de fondo se mantuvo a un nivel constante de 65 dB. Los niveles de sonido se midieron en decibelios (escala A) utilizando un lector de nivel de sonido (RadioShack, Fort Worth, TX). Se usó una unidad de calibración para garantizar la integridad de las lecturas de respuesta de sobresalto (San Diego Instruments, San Diego, CA). Se instaló una luz de 8 vatios en la pared trasera de la caja de sobresalto para usarla como señal.
Curvas de respuesta de sobresalto.
Después de un período de habituación de 5-min, a los animales se les presentaron una serie de siete ensayos con niveles de sonido que aumentaban: de 80 a 120 dB, con un ITI de 30 seg. Esta serie se presentó 10 veces para un total de ensayos 70. En todas las pruebas, excepto en las pruebas nulas en las que no hubo sonido, el pulso de sonido fue 40 msec.
Inhibición Pre-Pulso
A los animales se les dio un período de habituación de 10-min, luego de lo cual a los sujetos se les presentaron ensayos de 5-40-msec, 120-dB, solo pulso. Luego, a los ratones se les presentaron ensayos de 50 de un ensayo de sobresalto solo por pulso, uno de los tres ensayos de prepulso (5, 10 y 15-dB por encima del fondo), o un ensayo nulo en el que no hubo estímulos acústicos. El intervalo entre juicios (ITI) promedió 15 seg (rango 5 – 25 seg). Una prueba de sobresalto consistió en 40-ms, 120-dB pulso de ruido blanco. Los ensayos de prepulse consistieron en un prepulso de duración 20-msec de 70, 75 o 80-dB, que precedió al pulso 40-msec 120-dB por 100 msec. La inhibición de prepulso se calculó para cada nivel de prepulso utilizando la siguiente fórmula:% de inhibición = [(respuesta de sobresalto promedio en la prueba de prepulso / respuesta de sobresalto promedio en la prueba de pulso solo) x 100]. Los ratones DD se probaron en un estado de agotamiento de DA, 18 – 24 hr después de la inyección de L-Dopa.
Temor potenciado por el miedo (paradigma 7-day)
En el día 1 (línea de base), después de un período de habituación 5-min, los ratones recibieron una serie de ensayos 20 ordenados de forma pseudoaleatoria, divididos de manera uniforme entre las condiciones cue y no cue. Para ensayos sin indicios, los animales recibieron un pulso acústico 40-msec, 105-dB. Para los ensayos de señales, los animales recibieron una señal de luz 10-sec, que terminó conjuntamente con un pulso 40-msec, 105-dB. El ITI promedió 120 seg (rango 60 a 180 seg).
La capacitación se realizó en los días 2, 4 y 6. Después de un período de habituación de 10-min, los ratones recibieron presentaciones 10 de la luz indicadora, que terminó conjuntamente con un amortiguador de pies 0.2-mA, 0.5-sec. El ITI promedió 120 seg (rango 60 a 180 seg). Las sesiones de prueba se realizaron en los días 3, 5 y 7 y fueron idénticas a la sesión de referencia descrita anteriormente. Los ratones DD se encontraban en estado de agotamiento de DA, 18 a 24 hr después de su última inyección de L-Dopa, durante el inicio, el entrenamiento y las sesiones de prueba. La L-Dopa se inyectó después de las sesiones de entrenamiento como se indica en las leyendas de las figuras. La siguiente fórmula se usó para calcular el sobresalto potenciado por el miedo:% de potenciación = [(promedio de respuestas en los ensayos de referencia / promedio de respuestas en los ensayos sin referencias-1) × 100].
Temor potenciado por el miedo (paradigma 3-day)
Los días 1 y 3 (línea de base y prueba) de este paradigma fueron idénticos a los descritos para el paradigma del sobresalto potenciado por el miedo en el día 7. En el día 2 (entrenamiento), los ratones recibieron pares 30 de la luz indicadora 10-sec con un amortiguador de pie 0.2-mA, 0.5-sec. La media de ITI fue 120 sec (rango 60 a 180 sec). Los ratones DD se agotaron por DA durante la línea de base, el entrenamiento y las pruebas.
Memoria de corto plazo
Las sesiones de referencia y de prueba fueron idénticas a las descritas para el paradigma de días de 7. En el día 2, después de un período de habituación 5-min, los ratones recibieron pares 30 de una luz indicadora 10-sec, que terminó conjuntamente con un amortiguador de pie 0.5-sec, 0.2-mA. El ITI promedió 120 seg (rango 60 a 180). Después del entrenamiento, los ratones se colocaron en sus jaulas para 10 min antes de la prueba. La memoria a corto plazo se evaluó utilizando la misma fórmula utilizada para el sobresalto potenciado por el miedo.
Sensibilización al Choque
Las respuestas a la condición sin indicios durante la línea de base de memoria a corto plazo y las sesiones de prueba se promediaron para cada animal y se utilizó la siguiente fórmula para calcular la sensibilización al choque:% de sensibilización = [(respuesta de sobresalto promedio durante la prueba / respuesta de sobresalto promedio en la línea de base 1) × 100].
Restauración mediada por recombinasa de la función del gen Th
Se colocaron ratones anestesiados con isoflurano (1.5-5%) en un instrumento estereotáxico (David Kopf Instruments, Tujunga, CA). Para la restauración de la función del gen Th en el área tegmental ventral, se inyectó el virus AAV1-Cre-GFP recombinante (titulado en 1.2 x 1012 partículas / ml) de manera bilateral en el cerebro medio ventral (coordenadas en mm: 3.5 posterior a Bregma, 0.5 lateral a la línea media , 4.5 ventral a Bregma; 0.5 μl / hemisferio). Para la restauración específica de BLA DA, se inyectó bilateralmente el virus CAV2-Cre recombinante (titulado a 2.1 x partículas 1012 x / ml) (coordenadas en mm: 1.5 posterior a Bregma, 3.25 lateral a la línea media, 5 ventral a Bregma; 0.5 μl / hemisferio) . Se han publicado descripciones detalladas de ambos vectores virales (Hnasko et al., 2006; Zweifel et al., 2008). Los virus se inyectaron durante un período de 10-min utilizando una aguja de jeringa de calibre 32 (Hamilton, Reno, NV) conectada a una bomba de microinfusión (WPI, Sarasota, FL).
Inmunohistoquímica
Después de la anestesia con 50 mg / ml de pentobarbital sódico (0.2-0.3 ml / animal), los ratones se perfundieron transcardialmente con solución salina tamponada con fosfato, seguido de paraformaldehído con 4 en solución salina tamponada con fosfato. Los cerebros disecados se fijaron posteriormente en 4% paraformaldehído durante la noche, se crioprotegieron en 30% sacarosa en solución salina tamponada con fosfato y luego se congelaron rápidamente en isopentano. Las secciones coronales de libre flotación (30 μm) se inmunotinieron con anticuerpos anti-TH de ratón (1: 1000, Chemicon) o anti-TH de conejo (1: 2000, Chemicon). La inmunofluorescencia se logró mediante el uso de anticuerpos secundarios conjugados con Cy2 o Cy3 IgG (1: 200, Jackson ImmunoResearch). Las secciones teñidas se montaron en portaobjetos, se cubrieron con un portaobjetos y se fotografiaron con un microscopio vertical de campo claro (Nikon).
Análisis estadístico
Los análisis realizados incluyeron medidas repetidas y ANOVA de una vía, Fisher post-hoc y pruebas t de Student como se indica en los resultados. El análisis estadístico se realizó utilizando el software Statistica (Statsoft, Tulsa, Oklahoma).
Resultados
Los ratones DD tienen una respuesta de sobresalto acústica intacta y una inhibición prepulso normal
El sobresalto potenciado por el miedo requiere respuestas de sobresalto acústico intactas y activación sensoriomotora. Para determinar si la respuesta de sobresalto acústico se altera en ausencia de DA, se midieron las respuestas de ratones DD agotados en DA (18 a 24 hr después de L-Dopa) a niveles de sonido de múltiples decibeles y se compararon con los controles (Figura 1A). Las medidas repetidas de ANOVA no mostraron un efecto principal del genotipo ni una interacción significativa entre el genotipo y el nivel de sonido.
Figura 1 y XNUMX
DA es fundamental para el aprendizaje de sobresalto potenciado por el miedo. A, Respuesta de sobresalto acústico del control (n=10, cuadrados negros) y ratones DD (n=10, cuadrados abiertos) a diferentes intensidades de sonido. Las respuestas se informan en unidades arbitrarias. B, la inhibición del prepulso se probó a 3 intensidades de prepulso diferentes en control (n=10, barras negras) y ratones DD (n=10, barras vacías). Los asteriscos indican p<0.05, ANOVA de medidas repetidas. C, Esquema que ilustra el paradigma de sobresalto potenciado por el miedo de 7 días. En los días de referencia y de prueba, los ratones recibieron 10 presentaciones sin señal (presentación de 40 ms de duración de un pulso de sobresalto de 105 dB) y 10 presentaciones de pruebas de señal (señal de luz de 10 segundos que termina con el pulso de sobresalto) en forma pseudoaleatoria. pedido. En los días de entrenamiento, los ratones recibieron 10 emparejamientos de la señal de luz de 10 segundos que terminó simultáneamente con una descarga de 0.5 mA y una duración de 0.2 segundos. El aprendizaje se evaluó en los días de prueba como un porcentaje de potenciación en las pruebas con señales en comparación con las pruebas sin señales. D, los ratones DD (n=10, barras vacías) que recibieron L-Dopa 3 horas después del entrenamiento (días 2 y 4) no lograron aprender (Pruebas 1 y 2). Sin embargo, cuando los ratones DD fueron inyectados inmediatamente después del entrenamiento (día 6), mostraron un sobresalto potenciado por el miedo significativo (Prueba 3). Los asteriscos indican p<0.05, ANOVA de medidas repetidas. E, Mediciones de la reactividad al choque durante las sesiones de entrenamiento (Control n=10, barras negras; DD n=10, barras abiertas). Las respuestas se informan en unidades arbitrarias. F, Esquema que ilustra el paradigma de sobresalto potenciado por miedo de 3 días utilizado para determinar el período de tiempo crítico en el que DA es importante. Los 30 emparejamientos de cue-shock se administraron en un día de entrenamiento y los ratones DD se trataron con L-Dopa inmediatamente, 1 hora o 3 horas después del entrenamiento. G, solo los ratones de control (n = 8, barras negras sólidas, C) y DD inyectados inmediatamente después del entrenamiento (n = 7, rayas verticales, 0 h) exhibieron un sobresalto potenciado por el miedo el día de la prueba. Este nivel de sobresalto potenciado por el miedo fue significativamente más alto que el observado en los ratones DD que recibieron L-Dopa 1 h (n = 6, rayas diagonales) o 3 h (n = 6, barras abiertas) después del entrenamiento. Los asteriscos indican p<0.05 en comparación con la línea de base, post-hoc de Fisher. Todos los valores informados son medias ± DD sin SEMDA y los ratones de control también se probaron en un paradigma de inhibición previa al pulso, que se usa comúnmente para detectar déficits en la activación sensoriomotora. La inhibición prepulso mejoró en ratones DD (Figura 1B; ANOVA de medidas repetidas, genotipo: F1, 18 = 5.37; p <0.05; no se detectó interacción significativa entre el genotipo y el nivel prepulso). Estos datos indican que los ratones DD no tienen déficits en las respuestas de sobresalto o disminuciones en los mecanismos de activación sensoriomotores mientras están en un estado de agotamiento de DA y validan su uso en experimentos de sobresalto potenciados por el miedo.
La dopamina es necesaria en un momento crítico para aprender el sobresalto potenciado por el miedo
Para determinar si DA es necesario para aprender una tarea de condicionamiento de miedo con claves, los ratones DD y de control se sometieron a un paradigma de sobresalto potenciado por miedo de 7 días (Figura 1C). Los ratones DD fueron entrenados y probados en un estado de reducción de DA. Cuando se probaron 24 horas después del entrenamiento, los ratones de control exhibieron un sobresalto potenciado por el miedo después de una sola sesión de entrenamiento que no se observó en los ratones DD (Figura 1D; medidas repetidas ANOVA, genotipo, F1, 18 = 7.4590, p <0.05). Incluso después de una sesión de entrenamiento adicional, los ratones DD no expresaron sobresaltos potenciados por el miedo, mientras que los ratones de control continuaron expresando un aprendizaje sólido. Curiosamente, cuando se les administró L-Dopa inmediatamente después del entrenamiento en el día 6, los ratones DD mostraron un sobresalto potenciado por el miedo que fue significativamente más alto que el valor inicial (ANOVA F1 unidireccional, 18 = 9.1999, p <0.01) y no difirió de los niveles de control ( Figura 1D). La reactividad a las descargas a lo largo de los días de entrenamiento para los ratones DD y de control no fue significativamente diferente entre los genotipos en cualquier día de entrenamiento, lo que indica que el déficit de aprendizaje en los ratones DD no se debió a la incapacidad de sentir la descarga en las patas (Figura 1E). Para caracterizar la ventana de tiempo crítica para la acción de DA, un estudio adicional varió el tiempo de administración de L-Dopa. A los ratones DD y de control se les dio una sesión de entrenamiento que constaba de 30 emparejamientos de descargas de luz (Figura 1F) y luego se les inyectó L-Dopa inmediatamente, 1 hora o 3 horas después del entrenamiento y se evaluaron 24 horas después. Los ratones DD inyectados inmediatamente después del entrenamiento expresaron un fuerte sobresalto potenciado por el miedo el día de la prueba, similar al de los controles, mientras que los ratones DD inyectados con L-Dopa 1 hora o 3 horas después del entrenamiento no mostraron aprendizaje (Figura 1G; ANOVA de medidas repetidas; tratamiento × sesión F3, 23=5.1032, p<0.01). Estos datos indican que el DA es necesario dentro de un período de tiempo finito para el aprendizaje en un paradigma de sobresalto potenciado por el miedo. Sin embargo, DA no es necesario para la expresión de la memoria de miedo con claves, ya que los animales DD siempre se probaron en ausencia de DA. Además, la ausencia de DA no afecta la reactividad al choque.
D1R es necesario para el sobresalto potenciado por el miedo
Para explorar qué receptores DA son necesarios para el sobresalto potenciado por el miedo, primero analizamos ratones D1R KO. Los ratones D1R KO y control, de tipo salvaje (WT) se probaron en múltiples niveles de intensidad de pulso de sobresalto, como se describe para los ratones DD (Figura 2A). No hubo diferencias significativas entre los ratones D1R KO y WT en ningún nivel de sonido probado, lo que indica que los ratones D1R KO tienen una respuesta de sobresalto acústico intacta. De acuerdo con estudios previos, hemos observado una inhibición prepulso intacta en ratones D1R KO (Ralph-Williams et al., 2002). Cuando se probaron en el paradigma de sobresalto potenciado por el miedo de 7 días, los ratones D1R KO no expresaron el aprendizaje en ninguno de los días de prueba (Figura 2B; medidas repetidas ANOVA genotipo × día de prueba F3, 48 = 6.28; p <0.01), mientras que WT los ratones tenían un sobresalto potenciado por el miedo significativo en los días de prueba 2 y 3 (p < 0.05 y p < 0.01, referencia de control frente a la prueba 2 y 3, respectivamente, Fisher post-hoc). Los ratones D1R KO tuvieron una mayor reactividad a las descargas que los WT en los tres días de entrenamiento (Figura 2C; ANOVA de medidas repetidas, genotipo F1, 16 = 10.18; p <0.01; no se observó un genotipo significativo × día de entrenamiento). Por lo tanto, aunque los ratones D1R KO tienen respuestas elevadas a la conmoción en las patas en comparación con los ratones WT, tienen un sobresalto potenciado por el miedo significativamente afectado, incluso después de 3 días de entrenamiento. Estos datos indican un deterioro del aprendizaje en animales D1R KO e implican al D1R en la mediación de los efectos de DA en el condicionamiento del miedo dependiente de la señal. Figura 2 Los ratones D1R KO tienen un aprendizaje significativamente deteriorado. A, Respuesta de sobresalto acústico de ratones D1R WT (n=9, cuadrados negros) y KO (n=9, cuadrados abiertos). B, Resultados del paradigma de sobresalto potenciado por el miedo de 7 días con ratones D1R. Los ratones D1R WT (n=9, barras negras continuas), pero no los ratones D1R KO (n=9, barras abiertas), mostraron sobresaltos potenciados por el miedo el día 3 de la prueba. Los asteriscos indican p<0.01, comparando KO con WT, Fisher después de la hoc. C, Medidas de reactividad de choque. Los ratones D1R KO (n=9, barras vacías) tienen respuestas más altas a la conmoción en las patas que los WT (n=9, barras sólidas). Los asteriscos indican p<0.05, ANOVA de medidas repetidas. Todos los valores informados son medias ± SEM Para respuestas de sobresalto y reactividad de choque, números informados en unidades arbitrarias.
El sobresalto potenciado por el miedo está intacto en los ratones D2R KO, pero requiere otros receptores similares a D2
Para explorar si los receptores tipo D2 son necesarios para el sobresalto potenciado por el miedo, los ratones D2R KO y WT se sometieron a la respuesta de sobresalto y a las pruebas de sobresalto potenciadas por el miedo. Los ratones WT y D2R KO tienen respuestas de sobresalto equivalentes en todos los niveles de dB probados, lo que indica que los ratones D2R KO tienen una respuesta de sobresalto acústico intacta (Figura 3A). De manera similar a los ratones D1R KO, hemos observado que los ratones D2R KO tienen una inhibición prepulso intacta (Ralph-Williams et al., 2002). Cuando se probaron en el paradigma del sobresalto potenciado por el miedo de 7 días, tanto los ratones WT como los D2R KO mostraron un sobresalto potenciado por el miedo en niveles equivalentes en todos los días de prueba de 3 (Figura 3B) y la reactividad al choque no fue diferente entre los grupos (Figura 3C). Estos datos indican que D2R no es necesario para aprender el sobresalto potenciado por el miedo.
Figura 3 y XNUMX
Los ratones D2R KO tienen un sobresalto potenciado por el miedo intacto. A, Respuesta de sobresalto acústico de ratones D2R WT (n=8, cuadrados negros) y KO (n=8, cuadrados abiertos). B, Resultados del paradigma de sobresalto potenciado por el miedo de 7 días con ratones D2R. Tanto los ratones WT (n=8, barras sólidas) como los KO (n=8, barras vacías) exhibieron niveles significativos de sobresalto potenciado por el miedo. C, Mediciones de la reactividad al choque durante el entrenamiento (WT, n=8, barras continuas; KO, n=8, barras abiertas). Los ratones D, WT y D2R KO (n = 11 cada uno) se sometieron al paradigma de sobresalto potenciado por el miedo de 3 días. A los ratones D2R KO se les administró eticloprida (0.5 mg/kg) antes del entrenamiento y no expresaron sobresalto potenciado por el miedo en la prueba. Los asteriscos indican p<0.01, KO frente a WT, Fisher post-hoc. Todos los valores informados son la media ± SEM. Para las respuestas de sobresalto y la reactividad a las descargas, las respuestas se informan en unidades arbitrarias. Estudios previos han demostrado que la administración de antagonistas similares a D2, ya sea sistémicamente o directamente en la amígdala, altera el miedo condicionado (Guarraci et al., 2000; Greba et al., 2001; Ponnusamy et al., 2005). Para explorar la discrepancia entre sus resultados y los nuestros, a los ratones D2R KO se les administró el antagonista similar a D2R eticloprida (0.5 mg/kg; administrado por vía ip) antes del entrenamiento en el paradigma de sobresalto potenciado por el miedo de 3 días. Cuando se probaron 24 horas después del entrenamiento, los ratones WT inyectados con vehículo mostraron un fuerte sobresalto potenciado por el miedo, mientras que los ratones D2R KO inyectados con etiloprida no manifestaron aprendizaje (Figura 3D; medidas repetidas ANOVA genotipo × día F1, 20 = 7.5698, p <0.05) . Estos resultados sugieren que, además del D1R, un miembro de la familia de receptores DA tipo D2, pero no el D2R, es esencial para el sobresalto potenciado por el miedo.
La memoria a corto plazo está dañada en los ratones DD y D1R KO
Se requiere DA dentro de una hora después del entrenamiento para aprender el sobresalto potenciado por el miedo. En estos experimentos, la memoria a largo plazo para el sobresalto potenciado por el miedo se analizó 24 horas después del entrenamiento. Nos propusimos probar si también se requiere DA para la memoria a corto plazo. Los animales DD y los controles se sometieron a un paradigma de 2 días que probó la memoria a corto plazo 10 minutos después del entrenamiento (Figura 4A). El día de la prueba, se evaluaron la sensibilización al choque y la memoria a corto plazo. La memoria a corto plazo se definió como aumentos dependientes de la señal en las respuestas de sobresalto, mientras que la sensibilización al shock es una potenciación dependiente del contexto de la respuesta de sobresalto acústico después de la descarga que es independiente de la señal (McNish et al., 1997; Richardson, 2000; Risbrough et al. al., 2008). Los ratones DD tuvieron significativamente menos sensibilización al choque que los controles (Figura 4B, p <0.05; prueba t de Student). De manera similar, los ratones de control demostraron una memoria robusta a corto plazo que estaba ausente en los ratones DD (Figura 4B, p <0.05, DD versus control, prueba t de Student). Estos datos sugieren que se requiere DA para la memoria a corto y largo plazo del sobresalto potenciado por el miedo. Además, la DA es necesaria para el aprendizaje del miedo dependiente del contexto, según lo evaluado por la sensibilización al choque. Estos datos también refuerzan la conclusión anterior de que se requiere DA en un período crítico para la estabilización de la huella de la memoria del condicionamiento del miedo. Figura 4 La memoria a corto plazo y la sensibilización al choque dependen de DA. A. Diseño del paradigma conductual. El día 1, se obtuvieron respuestas de sobresalto iniciales. El día 2, los ratones recibieron los 30 emparejamientos de señal-choque y luego se volvieron a poner en su jaula de casa durante 10 minutos antes de la prueba. B, Los ratones de control (n = 10, barras negras) tienen una sensibilización al choque y un sobresalto potenciado por miedo significativamente mayores en comparación con DD (n = 10, barras abiertas). Los asteriscos denotan p <0.05; Prueba t de Student. Los ratones C, WT (n = 7, barras negras) y D1R KO (n = 7, barras abiertas) tienen sensibilización al choque intacta. Solo WT tiene un sobresalto potenciado por el miedo durante la prueba de memoria a corto plazo. Los asteriscos denotan p <0.05, KO versus WT; Prueba t de Student. Los ratones D, WT (n = 8, barras negras) tienen una sensibilización al choque significativamente mayor que los D2R KO (n = 8, barras abiertas). Los niveles de miedo potenciado son similares entre los ratones KO WT y D2R. Los asteriscos denotan p <0.05, KO versus WT; Prueba t de Student. Todos los valores informados son medias ± SEM Para explorar qué subtipos de receptores median el papel de DA en la memoria a corto plazo y la sensibilización al choque, los ratones D1R y D2R KO se probaron en el mismo paradigma que los ratones DD. Los ratones D1R KO tenían niveles significativamente más bajos de memoria a corto plazo que los ratones WT (Figura 4C, p <0.05; prueba t de Student); sin embargo, no hubo diferencias significativas entre los niveles de sensibilización al choque en D1R KO y ratones de control, lo que indica que el aprendizaje dependiente del contexto estaba intacto. Los ratones D2R KO tenían niveles significativamente más bajos de sensibilización al choque que los WT (Figura 4D, p <0.05; prueba t de Student), sin embargo, no hubo diferencias significativas entre los niveles de memoria a corto plazo de los ratones WT y KO.
La restauración de la DA a la amígdala basolateral es suficiente para permitir la memoria a corto plazo
La amígdala basolateral es crítica para la adquisición de memoria de miedo dependiente de la señal (Maren, 2003; Maren y Quirk, 2004; Sigurdsson et al., 2007). Además, hay evidencia que sugiere un papel importante para la DA en la facilitación de la función de la amígdala basolateral (Rosenkranz y Grace, 2002; Bissiere et al., 2003; Marowsky et al., 2005). Para explorar si se requiere DA en la amígdala basolateral para el sobresalto potenciado por el miedo, se inyectaron bilateralmente ratones DD y ratones de control con un vector CAV2-Cre en la amígdala basolateral (Figura 5A). Este vector se transporta de manera retrógrada desde el sitio de inyección a las neuronas DA, donde restaura la actividad del gen Th (Hnasko et al., 2006). La inmunohistoquímica reveló que había TH en la amígdala basolateral de CAD2-Cre inyectados en ratones DD (Figura 5J), pero ausente en el estriado dorsal y el núcleo accumbens (Figura 5G). La TH se restauró principalmente en un pequeño número de neuronas en las porciones caudales del área tegmental ventral (Figura 5D). En los ratones DD inyectados había típicamente menos de 10 TH-positivas por sección de 30-μm, lo que concuerda con el pequeño número de neuronas DA proyectadas en la amígdala informadas en la literatura (Ford et al., 2006; Lammel et al. , 2008; Margolis et al., 2008).
Figura 5 y XNUMX
Restauración específica de la región de la expresión de TH endógena en ratones DD. A, Esquema que ilustra las coordenadas de inyección para los experimentos de rescate de amígdala basolateral (BLA). Los ratones DD (n = 7) y control (n = 7) se inyectaron bilateralmente en el BLA con vectores CAV2-Cre (0.5 uL / hemisphere). B, Esquema que ilustra las coordenadas de inyección para los experimentos de rescate del área tegmental ventral (VTA). AAV1-Cre-GFP se inyectó bilateralmente (0.5 uL / hemisferio) en el VTA de DD (n = 7) y en los ratones de control (n = 10). Figuras adaptadas de Paxinos y Franklin, 2001. C – E, Comparación de la tinción de TH en corte coronal (aumento 4 ×) que muestra el cerebro medio ventral del control de WT con virus inyectado, DD inyectado con BLA y DD inyectado con VTA. La inmunohistoquímica de C, TH en el cerebro medio de control demuestra la presencia de neuronas DA en el VTA y la sustancia negra compacta (SNpc; indicada por una flecha). D, los ratones DD rescatados con BLA tenían un pequeño número de neuronas TH positivas en el VTA. El recuadro es un aumento de 40 × de la región en caja, que muestra la expresión de TH en el soma y los procesos. E, los ratones DD rescatados con VTA tenían expresión de TH predominantemente en el VTA. Observe la ausencia de tinción de TH en SNpc (indicado por la flecha). F – H, corte coronal (aumento 4 ×) de ratones con control de WT inyectados, rescatados de BLA y rescatados de VTA, que muestran la expresión de TH en el estriado dorsal y el núcleo accumbens. Los controles inyectados con el virus F, WT tienen expresión de TH en toda la totalidad del dorsal (indicado por la flecha) y el estriado ventral. G, no hay expresión de TH detectada en el cuerpo estriado de ratones DD rescatados con BLA. H, los ratones DD rescatados con VTA tienen expresión de TH en el núcleo accumbens, con solo una escasez de tinción en el cuerpo estriado dorsal (indicado por una flecha). I – K, sección coronal (aumento 10 ×) que muestra la expresión de TH en el BLA del control de WT con virus inyectado, el BLA rescatado y el VTA rescatado de ratones.
Los ratones inyectados en la amígdala basolateral se sometieron a un paradigma de sobresalto potenciado por el miedo de 3 días. La memoria a corto plazo y la sensibilización al choque se evaluaron 10 minutos después del entrenamiento y la memoria a largo plazo para el sobresalto potenciado por el miedo se evaluó 24 horas después del entrenamiento (Figura 6A). Curiosamente, solo se restauró la memoria a corto plazo en ratones DD basolaterales inyectados en la amígdala. Los niveles de memoria a corto plazo fueron los mismos que los de los controles, pero los niveles de memoria a largo plazo (p<0.05; prueba t de Student) y sensibilización al choque (p<0.05; prueba t de Student) fueron significativamente más bajos que los controles. Durante el entrenamiento, los niveles de reactividad al choque fueron los mismos entre los grupos (Control: 1613±333 versus DD rescatado con BLA: 1758±260). Estos datos sugieren que las proyecciones de DA a la amígdala basolateral, que emanan principalmente del aspecto caudal del área tegmental ventral, son suficientes para la adquisición a corto plazo de la memoria del miedo con claves, sin embargo, las proyecciones de DA a otras áreas cerebrales corticales o límbicas probablemente sean esenciales para aprendizaje contextual y estabilización a largo plazo del rastro de la memoria del miedo. Figura 6 Los ratones DD rescatados de la amígdala basolateral (BLA) han restaurado la memoria a corto plazo, mientras que los ratones DD rescatados del área tegmental ventral (VTA) han restaurado completamente el aprendizaje. A, el control WT inyectado con virus (n = 7) y los ratones DD rescatados con BLA (n = 7) se sometieron al paradigma de sobresalto potenciado por el miedo de 3 días. Izquierda, la sensibilización a Shock es significativamente menor en los ratones rescatados con BLA. La memoria media a corto plazo (STM) se restauró a niveles de control en ratones rescatados con BLA. Derecha, la memoria a largo plazo (LTM), evaluada 24 horas después del entrenamiento, está ausente en ratones rescatados con BLA. B, Resultados del control WT (n = 10) y ratones DD rescatados con VTA (n = 7) en el paradigma de sobresalto potenciado por miedo de 3 días. Izquierda, la sensibilización a choque en ratones DD rescatados con VTA no fue significativamente diferente del control. Medio y derecho, los niveles de memoria STM y LTM fueron los mismos que los del control en ratones rescatados con VTA. Los asteriscos indican p<0.05, rescate frente a control, prueba t de Student. Todos los valores informados son medias ± SEM
La restauración de TH a las neuronas DA del área tegmental ventral es suficiente para el aprendizaje
Hay dos circuitos principales de DA que emanan del cerebro medio ventral; el circuito mesostriatal, que proviene principalmente de la sustancia negra pars compacta, y el circuito mesocorticolímbico, que se origina principalmente en el área ventral tegmental. El circuito mesocorticolímbico se proyecta ampliamente en núcleos cerebrales que se sabe que son importantes para el condicionamiento del miedo dependiente de la señal, incluida la amígdala basolateral (Bjorklund y Dunnett, 2007; Lammel et al., 2008). Para explorar si se requiere una restauración más completa de la DA mesocorticolímbica para la memoria a largo plazo y la sensibilización a los golpes; DD y los ratones de control fueron inyectados bilateralmente con un vector AAV1-Cre-GFP en el área tegmental ventral para activar específicamente el gen Th endógeno (Figura 5B).
La inmunohistoquímica se utilizó para detectar qué neuronas DA y qué objetivos habían restablecido la expresión de TH. La tinción con TH está ausente en ratones DD no rescatados (Hnasko et al., 2006). La inmunohistoquímica reveló que la restauración de TH en ratones DD inyectados en el área tegmental ventral era altamente específica para el área tegmental ventral y sus objetivos (Figura 5E, H, K). Hubo una escasez de tinción de TH en el estriado dorsal, un objetivo principal de las neuronas DA que emanan de la sustancia negra pars compacta (Figura 5H), mientras que el núcleo accumbens y la amígdala basolateral tenían una expresión robusta de TH (Fig. 5H, K).
Los ratones inyectados en el área tegmental ventral se sometieron al mismo paradigma de sobresalto potenciado por el miedo de 3-día que los ratones inyectados con amígdala basolateral (Figura 6B). La sensibilidad a los choques, la memoria a corto plazo y la memoria a largo plazo se restauraron a los niveles de control en los ratones DD inyectados en el área tegmental ventral. La reactividad al choque durante el entrenamiento fue la misma entre los grupos (Control: 1653 ± 268 versus DD rescatado con VTA: 1602 ± 198). Estos datos sugieren que las proyecciones de DA del área tegmental ventral son suficientes para la formación de memoria de miedo a corto y largo plazo, así como para la sensibilización al choque dependiente del contexto.
Discusión
Estos resultados demuestran que la DA se requiere para el condicionamiento del miedo determinado medido por un sobresalto potenciado por el miedo. Los ratones DD no mostraron un sobresalto potenciado por el miedo a menos que se restaurara la DA inmediatamente después del entrenamiento. Los ratones DD también tienen problemas de memoria a corto plazo y sensibilización al choque. Es importante destacar que la inhibición prepulso no fue menor en los ratones con DD agotados en DA, lo que indica que la activación sensoriomotora no disminuye en ausencia de DA. Investigaciones anteriores han demostrado que los psicoestimulantes que mejoran la transmisión de DA pueden disminuir la inhibición prepulso (Schwarzkopf y otros, 1992; Bubser y Koch, 1994; Ralph y otros, 1999; Swerdlow y otros, 2006; Doherty y otros, 2007) y otros han demostrado que la inhibición farmacológica de los receptores de dopamina aumenta la inhibición prepulso (Schwarzkopf et al., 1993; Depoortere et al., 1997). De acuerdo con estos hallazgos, los ratones DD tuvieron un aumento pequeño pero significativo en la inhibición prepulso sobre los ratones control. Estudios previos también han demostrado que la inhibición farmacológica de los receptores DA puede reducir la respuesta de sobresalto acústico (Davis y Aghajanian, 1976; Schwarzkopf et al., 1993). Los ratones DD empobrecidos en dopamina no tuvieron respuestas de sobresalto acústico significativamente alteradas; sin embargo, hubo una tendencia hacia respuestas reducidas en comparación con los controles, especialmente a altas intensidades de estímulo, en consonancia con informes anteriores (Schwarzkopf et al., 1993).
Los datos presentados aquí demuestran claramente que la DA no es importante para la recuperación o la expresión de la memoria de miedo dependiente de la señal porque los ratones DD no requieren que la DA durante la sesión de prueba exprese un sobresalto potenciado por el miedo que se adquirió previamente inyectando L-Dopa inmediatamente después formación. Además, nuestros experimentos argumentan que no se requiere DA para el procesamiento inicial del estímulo durante el entrenamiento, porque los ratones DD se agotaron de dopamina durante todas las sesiones de entrenamiento. En cambio, nuestros datos sugieren que la DA es necesaria para la estabilización temprana de la traza de la memoria porque los ratones DD no expresan la memoria a corto plazo, y la memoria a largo plazo solo se ve cuando se administra L-Dopa inmediatamente, pero no 1 hr después de formación. Presumiblemente, inyectar ratones DD con L-Dopa inmediatamente después del entrenamiento estabiliza la traza de la memoria, lo que le permite ingresar a una forma a largo plazo. Los estímulos aversivos causan aumentos prolongados en los niveles de DA en regiones cerebrales cruciales para el acondicionamiento del miedo que permitiría tal estabilización de la memoria del miedo (Abercrombie et al., 1989; Kalivas y Duffy, 1995; Doherty y Gratton, 1997; Inglis y Moghaddam, 1999). De acuerdo con nuestros datos, otros han demostrado que las manipulaciones posteriores al entrenamiento de la función DA alteran la memoria relacionada con el miedo (Bernaerts y Tirelli, 2003; Lalumiere et al., 2004; LaLumiere et al., 2005).
Nuestros hallazgos indican que son necesarios múltiples subtipos de receptores de DA para el sobresalto potenciado por el miedo. Los ratones D1R KO carecen de memoria a corto y largo plazo para el sobresalto potenciado por el miedo, lo que sugiere un papel crucial para este subtipo de receptor en la mediación de los efectos de la DA en el aprendizaje del miedo dependiente de la señal. Curiosamente, el aprendizaje de miedo dependiente del contexto estaba intacto en ratones D1R KO. Estos datos corroboran otros estudios que muestran que los antagonistas similares a D1R atenúan el aprendizaje del miedo condicionado por señales sin afectar la sensibilización al choque, y demuestran que las manipulaciones farmacológicas en esos experimentos fueron específicas al D1R (Lamont y Kokkinidis, 1998; Guarraci et al., 1999) . Estos datos también son consistentes con estudios que demuestran un papel crítico para el D1R en otros paradigmas de aprendizaje dependientes de la señal (Smith et al., 1998; Eyny y Horvitz, 2003).
D2R KO tenía un sobresalto intacto potenciado por el miedo, pero carecía de sensibilidad al choque. Greba et al. (2001) han demostrado que el antagonismo intra-amigdlar de D2R condujo a un deterioro de la sensibilización al shock y al sobresalto potenciado por el miedo sin afectar el sobresalto inicial o las respuestas al choque de pies. La activación de D2R conduce a la inducción de potenciación a largo plazo en el BLA, lo que presumiblemente sería vital para la memoria de sobresalto potenciada por el miedo (Bissiere et al., 2003). Nuestros datos demuestran que D2R no es necesario para el aprendizaje del miedo dependiente de la señal, sino que este subtipo de receptor DA es importante para la sensibilización al choque dependiente del contexto. La inyección de ratones D2R KO sistémicamente con el antagonista de tipo D2 eticlopride antes del entrenamiento previno el sobresalto potenciado por el miedo; por lo tanto, es probable que otros receptores similares a D2R, que también son inhibidos por la eticloprida, sean críticos en el sobresalto potenciado por el miedo (Sigala et al., 1997; Bernaerts and Tirelli, 2003; Laviolette et al., 2005; Swant and Wagner , 2006). Por lo tanto, las deficiencias en el aprendizaje dependiente de la señal causadas por antagonistas de tipo D2 en estudios anteriores pueden atribuirse a estos fármacos que inhiben a otros miembros de la familia D2R.
La restauración selectiva de TH endógena específicamente en el área tegmental ventral condujo a una restauración del aprendizaje en ratones DD. La inmunohistoquímica indicó que la TH se restauró en importantes núcleos límbicos, como el núcleo accumbens y la amígdala basolateral, pero no en el estriado dorsal. Además, hubo muy pocas neuronas positivas para TH en la sustancia negra pars compacta. Estos datos indican que la DA de las neuronas del área tegmental ventral es importante para el condicionamiento del miedo contextual y cued.
Los ratones con restauración selectiva de DA a la amígdala basolateral expresaron memoria a corto plazo, pero no memoria a largo plazo o sensibilización al choque. Estudios previos han demostrado que la DA facilita la función de la amígdala mediante alteraciones en el tono inhibidor de GABAergic y este efecto está mediado por el D1R o el D2R (Bissiere y otros, 2003; Kroner y otros, 2005; Marowsky y otros, 2005). Los datos presentados aquí demuestran que la DA en la amígdala basolateral es crítica para la adquisición de memoria a corto plazo para el sobresalto potenciado por el miedo, pero no es suficiente para la estabilidad a largo plazo de la memoria. La restauración de la memoria a corto plazo está mediada por un pequeño número de neuronas DA proyectoras de la amígdala basolateral que emanan del área ventral tegmental. Una restauración más generalizada de la TH endógena en ratones DD rescatados del área tegmental ventral llevó a la memoria intacta a corto y largo plazo; por lo tanto, es probable que la restauración de TH a otros circuitos mesocorticolímbicos requiera establecer una memoria a largo plazo para el sobresalto potenciado por el miedo. Estudios previos sugieren que el núcleo accumbens y la corteza prefrontal también pueden ser objetivos importantes de DA durante el acondicionamiento del miedo (Kalivas y Duffy, 1995; Murphy et al., 2000; Pezze et al., 2003; LaLumiere et al., 2005; Laviolette et al., 2005; Floresco y Tse, 2007). Por lo tanto, es posible que la señalización de DA ya sea en el núcleo accumbens o en la corteza prefrontal sea necesaria para la formación de la memoria a largo plazo.
En resumen, nuestro estudio utilizó una combinación de modelos genéticos de ratón, farmacología y rescate de función específico de la región para demostrar que se requiere DA para el sobresalto potenciado por el miedo, una tarea de condicionamiento del miedo dependiente de la señal. Estos hallazgos enfatizan un papel importante para este neurotransmisor fuera del procesamiento de recompensa. Además, nuestro estudio indica la necesidad de que la DA actúe sobre múltiples receptores de DA simultáneamente en múltiples regiones del cerebro para el condicionamiento del miedo dependiente de la señal. Estudios recientes han revelado que las neuronas DA del área tegmental ventral varían significativamente en sus propiedades moleculares y fisiológicas de acuerdo con la ubicación objetivo (Ford y otros, 2006; Margolis y otros, 2006; Bjorklund y Dunnett, 2007; Lammel y otros, 2008; Margolis et al., 2008). Los experimentos que realizamos en los que el gen Th se reactivó selectivamente en las neuronas DA que se proyectan a la amígdala basolateral revelan que son una población pequeña y selecta de neuronas del área tegmental ventral, en lugar de colaterales de neuronas DA que se proyectan a otras regiones del cerebro. Nuestros datos, combinados con estudios que demuestran la heterogeneidad de las poblaciones de neuronas DA, enfatizan la necesidad de comprender el papel de cada uno de estos circuitos discretos de DA. Ampliar el conocimiento de las muchas funciones conductuales y fisiológicas de la DA para incluir el aprendizaje relacionado con el miedo puede conducir a una mejor comprensión de los trastornos prevalentes relacionados con el miedo, como el trastorno de estrés postraumático, el trastorno obsesivo-compulsivo y el trastorno de ansiedad generalizada.
AGRADECIMIENTOS
Esta investigación fue apoyada en parte por el Servicio de Salud Pública, el Premio del Servicio Nacional de Investigación, T32 GM07270, del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales y los Institutos Nacionales de la NIH (National Institute of General Medical Sciences 'Grant) 4 R25 GM 058501-05. Agradecemos a Ilene Bernstein, Lisa Beutler, Charles Chavkin y Larry Zweifel por sus útiles comentarios sobre el manuscrito, Albert Quintana por su ayuda en histología y Valerie Wall por el mantenimiento de la colonia de ratones. También agradecemos al Dr. Miguel Chillon (Unidad de producción de vectores de CBATEG en la Universitat Autonoma de Barcelona) por CAV2 y Matthew During por el virus AAV1.
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