Proc Natl Acad Sci US A. 2007 Mar 20; 104 (12): 5181-6. Epub 2007 Mar 9.
Ventura R, Morrone C, Puglisi-Allegra S.
Fuente
Fundación Santa Lucía, Centro Europeo para la Investigación del Cerebro (CERC), Via del Fosso di Fiorano 65, 00143 Roma, Italia. [email protected]
Resumen
La evidencia reciente sugiere que los estímulos gratificantes y aversivos afectan las mismas áreas del cerebro, incluyendo la corteza prefrontal medial y el núcleo accumbens. Aunque se sabe que el núcleo accumbens responde a estímulos salientes, independientemente de su valencia hedónica, con un aumento selectivo de la liberación de dopamina, se sabe poco sobre el papel de la corteza prefrontal en la motivación relacionada con la recompensa y la aversión o sobre los neurotransmisores involucrados. Aquí encontramos que el agotamiento selectivo de norepinefrina en la corteza prefrontal medial de ratones abolió el aumento en la liberación de norepinefrina por parte de la corteza prefrontal y la dopamina por núcleo accumbens inducida por los alimentos, la cocaína o el cloruro de litio y el condicionamiento deteriorado del lugar inducido por ambos litio Cloruro (aversión) y alimentos o cocaína (preferencia). Esta es una evidencia de que la transmisión de norepinefrina cortical prefrontal es necesaria para la atribución de prominencia motivacional a los estímulos relacionados tanto con la recompensa como con la aversión mediante la modulación de la dopamina en el núcleo accumbens, un área del cerebro involucrada en todas las conductas motivadas.
Tanto los animales como los humanos tienen una propensión a buscar recompensas y evitar castigos. Este comportamiento claramente adaptativo implica la capacidad de representar el valor de recompensar y castigar los estímulos, establecer predicciones sobre ellos y usar estas predicciones para guiar el comportamiento (1). En la medida en que las emociones pueden definirse como "estados provocados por refuerzos (recompensas y castigos)" (2), la comprensión de las áreas del cerebro involucradas en el procesamiento de estímulos gratificantes o aversivos salientes motivacionales puede ser relevante para comprender numerosos déficits emocionales en los seres humanos.
Los datos recientes indican que el núcleo accumbens (NAc) y la corteza prefrontal (pFC) constituyen un sustrato común para procesar los estímulos gratificantes y aversivos (3 – 7). El cuerpo estriado ventral (o NAc) está involucrado en el procesamiento de la información que subyace en el control motivacional de la conducta dirigida hacia el objetivo, y los estudios en humanos y animales respaldan el papel general de esta área del cerebro en el procesamiento de estímulos tanto gratificantes como aversivos, independientemente de la valencia (3 – 8) ).
Además, una gran cantidad de evidencia sugiere que el pFC está directamente involucrado en el comportamiento dirigido hacia el objetivo, así como en el procesamiento afectivo (1, 9). Sin embargo, aunque se propuso la transmisión de dopamina en NAc para mediar en un proceso de "prominencia motivacional" compartido en valencia positiva y negativa (3, 6), aún se desconoce el papel de la pFC en este proceso y el sustrato neuroquímico involucrado.
La transmisión de norepinefrina en pFC es activada por estímulos aversivos (10, 11) y por estímulos apetitivos aversivos y condicionados (12, 13). Además, recientemente se demostró que la norepinefrina en pFC medial (mpFC) está involucrada en los efectos gratificantes de algunas drogas comúnmente abusadas a través de su acción moduladora sobre la liberación de dopamina en NAc (14, 15). Esto sugiere que la transmisión de norepinefrina cortical prefrontal involucra a la dopamina accumbal para procesar los estímulos salientes motivacionales.
Aquí, utilizando ratones, nos propusimos evaluar si el sistema de dopamina cortical prefrontal norepinefrina / mesoaccumbens es un sustrato neural común involucrado en el procesamiento de estímulos afectivamente positivos y negativos. En particular, investigamos si la norepinefrina en mpFC, a través de su acción moduladora en el sistema mesolímbico dopaminérgico, es necesaria para la atribución de la atención motivacional a los estímulos relacionados con la recompensa y la aversión.
Debido a que la experiencia es un determinante importante del impacto motivacional de cualquier estímulo dado (7), evaluamos los efectos de la primera exposición a estímulos naturales (alimentos palatables, chocolate con leche) y farmacológicos (cocaína) gratificantes y a un estímulo farmacológico aversivo [cloruro de litio (LiCl)] en la norepinefrina cortical prefrontal y la liberación de dopamina accumbal por microdiálisis intracerebral. Además, para determinar si la transmisión prefrontal de norepinefrina gobierna el aumento del flujo de dopamina accumbal inducida por la primera exposición a estos estímulos salientes de motivación, también evaluamos los efectos del agotamiento selectivo de norepinefrina en mpFC en la liberación de dopamina en NAc y en la liberación de norepinefrina en mpFC inducida por primera exposición a estos estímulos.
Finalmente, investigamos los efectos del agotamiento prefrontal selectivo noradrenérgico en la preferencia de lugar condicionado (CPP) inducida por chocolate y cocaína y en la aversión de lugar condicionada (CPA) inducida por LiCl. Se eligió un procedimiento de acondicionamiento del lugar para este estudio porque permitió la evaluación de la adquisición de propiedades condicionadas de apetito y aversión a estímulos combinados con recompensas primarias y eventos aversivos y porque una gran cantidad de evidencia muestra que es una medida confiable de los procesos subyacentes. Atribución de atención motivacional a los estímulos (3, 16).
RESULTADOS
Experimento 1.
Para evaluar si la primera exposición a los estímulos salientes tanto gratificantes como aversivos afecta a la norepinefrina prefrontal y al flujo de dopamina accumbal, evaluamos, mediante microdiálisis intracerebral, los efectos de la cocaína sistémica o el consumo de LiCl y chocolate sobre la liberación de norepinefrina en mpFC y el flujo de dopamina en NAc. Además, para determinar si la transmisión noradrenérgica cortical es necesaria para el flujo de dopamina accumbal inducida por la primera exposición a estos estímulos salientes motivacionales, evaluamos los efectos del agotamiento noradrenérgico selectivo en la respuesta de dopamina accumbal inducida por la cocaína, el chocolate y el LiCl. La cocaína, el chocolate y el LiCl produjeron un aumento dependiente del tiempo en el flujo de salida de norepinefrina en mpFC de los grupos tratados de manera simulada, alcanzando un aumento máximo de ≈200% en 40 min, ≈70% en 120 min y ≈100% en 60 min respectivamente (Fig. 1a). Aunque el aumento de la liberación de norepinefrina en el pFC en respuesta a la cocaína se ha informado ampliamente, según sabemos, este es el primer informe sobre el aumento del flujo de salida de norepinefrina inducido por la primera exposición al chocolate o LiCl sistémico dentro de mpFC. Estos estímulos también produjeron un aumento paralelo dependiente del tiempo en el flujo de salida de dopamina en ANc de animales tratados simuladamente (Fig. 1b), de acuerdo con la opinión de que esta área desempeña un papel importante en el procesamiento de estímulos salientes, independientemente de su valencia (3). , 6). También se evaluaron los efectos de este agotamiento en la liberación de norepinefrina en mpFC. El agotamiento de norepinefrina prefrontal se obtuvo por el agotamiento neurotóxico selectivo de los aferentes de norepinefrina cortical prefrontal (grupos agotados en norepinefrina) en mpFC después de la protección de la dopamina por un inhibidor de la captación selectiva. Este método produjo un profundo agotamiento de los niveles tisulares de norepinefrina (≈90%), dejando los niveles tisulares de dopamina prácticamente sin afectar. Los animales de control (grupos tratados de forma simulada) se sometieron al mismo tratamiento que los ratones empobrecidos en norepinefrina pero recibieron vehículo intracerebral. (Los niveles de tejido de norepinefrina fueron los siguientes: grupo tratado de forma simulada, 698 ± 26 ng / g de tejido húmedo; grupo con agotamiento de norepinefrina, 63 ± 17 ng / g de tejido húmedo. Los niveles de tejido de dopamina fueron los siguientes: grupo de tratamiento simulado, 203 ± 18 ng / g de tejido húmedo; grupo empobrecido en norepinefrina, 189 ± 16 ng / g de tejido húmedo.)
Higo. 1.
Depleciones de norepinefrina cortical prefrontal en norepinefrina extracelular en mpFC y dopamina en NAc. Norepinefrina (NE) extracelular en mpFC (a) y dopamina (DA) en NAc (b) de animales tratados de forma simulada o con depleción de norepinefrina inyectados con solución salina, (más…)
El agotamiento selectivo de norepinefrina en mpFC afectó el aumento de la dopamina accumbal y la liberación de norepinefrina cortical prefrontal inducida tanto por los fármacos como por el chocolate (Fig. 1), aunque no afectó significativamente la dopamina extracelular basal en NAc (grupo de tratamiento simulado, 1.35 ± 0.15 pg por grupo). 20 μl; grupo empobrecido en norepinefrina, 1.29 ± 0.18 pg por 20 μl) o norepinefrina extracelular basal en mpFC (grupo tratado de manera simulada, 1.31 ± 0.18 ± 20 en el grupo de personas con 1.26). Los valores basales promedio de dopamina en NAc y de norepinefrina en mpFC para cada grupo [solución salina, cocaína (0.17 mg / kg), LiCl (20 meq / kg) y chocolate] no difirieron significativamente
Nuestros resultados indican que la transmisión noradrenérgica intacta dentro de mpFC es una condición necesaria para la estimulación de la liberación de dopamina inducida por estímulos tanto gratificantes como aversivos dentro de NAc, lo que sugiere su papel principal en la prominencia motivacional.
Experimento 2.
Para investigar si la transmisión prefrontal de norepinefrina es necesaria para adquirir las propiedades condicionales del apetito y aversivas a los estímulos combinados con recompensas primarias y eventos aversivos, evaluamos los efectos del agotamiento de la norepinefrina prefrontal selectiva en el acondicionamiento del lugar.
El agotamiento noradrenérgico prefrontal abolió tanto el CPP inducido por la cocaína y el chocolate como el CPA inducido por el LiCl. Por lo tanto, aunque los animales tratados de forma simulada mostraron una preferencia significativa por el compartimiento de cocaína o de chocolate y una aversión significativa al compartimiento de LiCl (Fig. 2a), los animales agotados en norepinefrina no mostraron preferencia por ninguno de los compartimentos (Fig. 2b ).
Higo. 2.
Depleción de noradrenalina prefrontal cortical en el acondicionamiento del lugar. Efectos del consumo de alimentos (1 g de chocolate con leche; grupo tratado con simulación, n = 8; grupo con depleción de norepinefrina, n = 8) y la inyección sistémica (ip) de solución salina (Sal) (grupo tratado con simulación, (más…)
Tenga en cuenta que en experimentos preliminares observamos que tanto el CPP como el CPA de los animales tratados de manera simulada no se distinguían de los de los animales sin tratamiento previo. Los animales que habían experimentado el emparejamiento de solución salina en ambos compartimentos no mostraron preferencia por ninguno de los compartimientos, independientemente de la condición de la lesión (tratamiento simulado o norepinefrina agotada). El comportamiento de los animales empobrecidos en norepinefrina tratados con cocaína, chocolate o LiCl fue similar al de los animales que experimentaron solo la solución del vehículo durante el entrenamiento; Es decir, no mostraron preferencia por ninguno de los compartimentos.
DISCUSIÓN
Aquí presentamos evidencia de que la transmisión preorontal de norepinefrina cortical, a través de la modulación de la dopamina en NAc, es una condición necesaria para la atribución de la atención motivacional a los estímulos relacionados tanto con la recompensa como con la aversión.
Primero, debido a que la experiencia previa es un determinante importante del impacto motivacional de cualquier estímulo dado (7), evaluamos, mediante microdiálisis intracerebral, los efectos de la primera exposición a cocaína sistémica o LiCl, así como los efectos del consumo de chocolate sobre la noradrenalina o la dopamina. lanzamiento en mpFC y ncc, respectivamente. La cocaína, el chocolate y el LiCl produjeron un aumento dependiente del tiempo en la dopamina accumbal, así como en el flujo de norepinefrina prefrontal de los grupos tratados de forma simulada. Se observó un aumento significativo del desbordamiento de norepinefrina en el mpFC de los animales tratados de forma simulada en 20 min de recibir chocolate; el desbordamiento volvió posteriormente a los niveles de referencia y fue seguido por un gran aumento sostenido. Aunque este aumento bifásico inducido por el chocolate de la norepinefrina en mpFC no fue paralelo al aumento de la dopamina en la NAc, el aumento inicial probablemente estuvo relacionado con el impacto de los alimentos sabrosos y el aumento de la dopamina en la NAc. Por otro lado, el segundo gran aumento podría representar un correlato neuroquímico de la activación cortical necesaria para procesar información espacial relacionada con la búsqueda y la localización de la recompensa de alimentos (17). De hecho, se ha sugerido que un aumento en el flujo de salida de norepinefrina sirve para señalar la presencia de estímulos con una elevada importancia motivacional (17). Por lo tanto, este aumento en el flujo de salida de norepinefrina podría permitir la atención selectiva requerida para buscar alimentos sabrosos adicionales y podría ayudar en la adquisición de propiedades de apetito condicionadas para estímulos combinados con alimentos. Sin embargo, no se puede descartar la publicación de los efectos de la ingesta de alimentos sobre la noradrenalina.
Aunque el aumento de la liberación de dopamina en NAc inducida por estímulos gratificantes o aversivos y el aumento de la liberación de norepinefrina en el pFC en respuesta a la cocaína se han informado ampliamente, este es el primer informe sobre el aumento del flujo de salida de norepinefrina inducido por la exposición al chocolate o LiCl en el mpFC. Lo más importante es que aquí mostramos que la transmisión noradrenérgica cortical prefrontal es necesaria para el flujo de dopamina accumbal inducida por la primera exposición a estos estímulos de motivación sobresaliente. De hecho, no fue evidente un aumento significativo en el flujo de norepinefrina prefrontal y dopamina accumbal, inducido por estos estímulos, en ratones empobrecidos en norepinefrina. La norepinefrina en mpFC puede activar la liberación de dopamina mesoaccumbens a través de la proyección cortical prefrontal excitadora a las células de dopamina del área tegmental ventral (18, 19) y / oa través de las proyecciones glutamatérgicas corticoaccumbales (20). Además, puede preverse un papel de las proyecciones de pFC en el locus coeruleus para ejercer una influencia excitadora porque se ha demostrado que este núcleo activa las neuronas dopaminérgicas del área tegmental ventral (21-23), lo que podría conducir a un aumento de la liberación de dopamina en NAc.
Por lo tanto, nuestros resultados, de acuerdo con informes anteriores, muestran que tanto los estímulos no condicionados como los estímulos aversivos aumentan el flujo de norepinefrina en mpFC (10 – 15), así como la liberación de dopamina en NAc (3, 24). Sin embargo, lo más importante es que demuestran que la transmisión noradrenérgica intacta dentro de mpFC es una condición necesaria para la estimulación de la liberación de dopamina inducida por estímulos farmacológicos y naturales gratificantes y adversos dentro de NAc. Por lo tanto, apuntan a norepinefrina prefrontal. y la transmisión de dopamina accumbal como un sistema neural cuya activación por estímulos gratificantes y aversivos no condicionados es probablemente un sustrato para la atención motivacional. Esta visión está respaldada por los resultados de experimentos conductuales sobre los efectos del agotamiento de norepinefrina prefrontal en el condicionamiento del lugar inducido por cocaína, chocolate o LiCl.
Por lo tanto, el segundo hallazgo importante de este estudio es que el agotamiento de la norepinefrina cortical prefrontal perjudica tanto la CPP inducida por la cocaína o los alimentos como la CPA inducida por el LiCl. Aunque los animales tratados de forma simulada mostraron una preferencia significativa por el compartimiento de cocaína o chocolate y una aversión significativa al compartimiento de LiCl, los animales empobrecidos en norepinefrina no mostraron preferencia por ninguno de los compartimientos, lo que demuestra que es necesaria la transmisión intacta de la noradrenal cortical prefrontal intacta para la adquisición de propiedades condicionadas a estímulos combinados con eventos primarios de recompensa o aversivos en un procedimiento de acondicionamiento de lugares.
Los resultados actuales indican que, en los ratones con insuficiencia de noradrenalina cortical prefrontal, la falta de liberación de norepinefrina inducida por la exposición a estímulos gratificantes y aversivos (cocaína, comida o LiCl, estímulo no condicionado) impidió la importancia motivacional atribuible a un estímulo condicionado (patrón espacial) durante Las sesiones de maridaje. Además, tenga en cuenta que el agotamiento de norepinefrina prefrontal no interfirió con los procesos asociativos o mnemónicos porque, como se mostró anteriormente, los animales con agotamiento de norepinefrina demostraron ser capaces de aprender una tarea de evitación pasiva (15) y de asociar el contexto con los efectos de la droga (14). Sin embargo, es necesario realizar más investigaciones para comprender la naturaleza precisa de las deficiencias de los animales con insuficiencia de noradrenalina cortical prefrontal.
Se considera que la transmisión dopaminérgica dentro de NAc media el impacto hedónico de la recompensa o algunos aspectos del aprendizaje por recompensa (ver ref. 25 para revisión). Nuestros resultados, de acuerdo con una visión diferente (3), muestran que la transmisión de dopamina en NAc desempeña un papel tanto en el comportamiento motivado de manera positiva como aversiva; Sin embargo, lo más importante es que demuestran que este proceso motivacional se rige por la norepinefrina cortical prefrontal. De hecho, el agotamiento de norepinefrina prefrontal selectivo produce el bloqueo tanto de la CPP inducida por cocaína como de chocolate y el CPA inducido por LiCl y el deterioro de la liberación de dopamina en NAc inducida por estos estímulos salientes en ratones de control, lo que demuestra que la transmisión prefrontal noradrenérgica, a través de la modulación La liberación de dopamina dentro de NAc es una condición necesaria para el procesamiento motivacional de los estímulos relacionados tanto con la recompensa como con la aversión.
Tomados en conjunto, los resultados actuales de los experimentos de comportamiento y microdiálisis demuestran que la transmisión prefrontal de norepinefrina no solo media las propiedades gratificantes de las drogas comúnmente abusadas, como lo sugieren estudios previos (14, 15), sino que también es necesaria para que la salvedad motivacional se atribuya a la recompensa. Los estímulos relacionados con la aversión, que muestran que las drogas adictivas, así como los estímulos farmacológicos aversivos, explotan el mismo mecanismo neurobiológico que los estímulos naturales.
En conclusión, nuestros datos extienden los hallazgos anteriores que apuntan al sistema dopaminérgico mesolímbico como un "sistema de saliencia" involucrado en todos los comportamientos motivados (3, 6, 26). También demuestran que este sistema está bajo control cortical prefrontal de norepinefrina, lo que apoya la opinión de que los estímulos gratificantes y aversivos afectan vías similares en el SNC (7).
Nuestros resultados proporcionan información sobre la neurobiología de la recompensa y la aversión porque muestran que el procesamiento de los estímulos salientes tanto gratificantes como aversivos involucra las mismas áreas del cerebro; es decir, apuntan a la transmisión prefrontal noradrenérgica y dopaminérgica accumbal como un sistema neuronal común. Comprender los sistemas de neurotransmisores activados por estímulos afectuosamente gratificantes o aversivos y sus mecanismos moleculares ayudará a proporcionar una base para dilucidar el funcionamiento de los sistemas neuronales involucrados en emociones positivas y negativas..
MATERIALES Y MÉTODOS
Los animales
Los ratones machos de la cepa C57BL / 6JIco (Charles River Laboratories, Wilmington, MA), que se utilizan comúnmente en el fenotipado neuroconductual, 8-9 semanas de edad en el momento de los experimentos, se alojaron como se describió anteriormente (14, 15). Cada grupo experimental consistió de seis a ocho animales. Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con la legislación nacional italiana (Decreto Legislativo n. 116, 1992) que rige el uso de animales para la investigación.
Drogas.
Hidrato de cloral, 6-hidroxidopamina (6-OHDA), GBR 12909, clorhidrato de cocaína y LiCl se compraron a Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Cocaína (20 mg / kg), LiCl (3.0 meq / kg), hidrato de cloral (350 – 450 mg / kg) y GBR 12909 (15 mg / kg) se disolvieron en solución salina (0.9% NaCl) e inyectaron ip en un Volumen de 10 ml / kg. 6-OHDA se disolvió en solución salina que contenía metabisulfito de sodio (0.1 M). Para los experimentos con alimentos, la recompensa fue el chocolate con leche (1 g; Nestlé, Vevey, Suiza).
Microdiálisis.
Los animales se anestesiaron con hidrato de cloral (450 mg / kg), se montaron en un marco estereotáxico (David Kopf Instruments, Tujunga, CA) equipado con un adaptador de ratón, y se implantaron unilateralmente con una cánula guía (acero inoxidable, diámetro exterior del eje de 0.38 mm) ; Metalant AB, Estocolmo, Suecia) en mpFC o en NAc (14, 15). La longitud de la cánula guía fue 1 mm para mpFC y 4.5 mm para NAc. La cánula guía se fijó con pegamento epóxico y se agregó cemento dental para una mayor estabilización. Las coordenadas de bregma [medidas según los métodos de Franklin y Paxinos (27)] fueron las siguientes: + anteroposterior 2.52 y lateral 0.6 para mpFC y anteroposterior + 1.60 y lateral 0.6 para NAc [principalmente incluyendo la subdivisión de la cáscara (27)]. La sonda (longitud de membrana de diálisis de 2 mm para mpFC y 1 mm para NAc y diámetro exterior de 0.24 mm, sonda de microdiálisis de cuprofano MAB 4; Metalant AB) se introdujo 24 h antes de los experimentos de microdiálisis. Los animales se anestesiaron ligeramente con hidrato de cloral (350 mg / kg) para facilitar la inserción manual de la sonda de microdiálisis en la cánula guía. Los animales fueron devueltos a sus jaulas. La salida y el tubo de la sonda de entrada estaban protegidos por Parafilm aplicado localmente. Las membranas se analizaron para la recuperación in vitro de dopamina y norepinefrina (la recuperación relativa fue la siguiente: dopamina, 10.7 ± 0.82%; norepinefrina, 12.2 ± 0.75%; n = 20) el día antes del uso para verificar la recuperación.
La sonda de microdiálisis se conectó a una bomba CMA / 100 (Carnegie Medicine, Estocolmo, Suecia) a través de un tubo PE 20 (Metalant AB) y un eslabón giratorio de líquido de doble canal de par ultrabajo (modelo 375 / D / 22QM; Instech Laboratories, Plymouth Meeting, PA) para permitir la libre circulación. Se bombeó líquido cefalorraquídeo artificial (NaCl 147 mM / MgCL 1 mM / CaCl1.2 2 mM / KCl 4 mM) a través de la sonda de diálisis a un caudal constante de 2 µl / min. Los experimentos se llevaron a cabo 22-24 h después de la colocación de la sonda. Cada animal se colocó en una jaula circular provista de equipo de microdiálisis (Instech Laboratories) y con ropa de cama de jaula en el suelo. La perfusión de diálisis se inició 1 h después. Después del inicio de la perfusión de diálisis, los ratones se dejaron tranquilos durante aproximadamente 2 h antes de la recolección de las muestras de referencia. La concentración media de las tres muestras recolectadas inmediatamente antes del tratamiento (<10% de variación) se tomó como concentración basal. Antes de que comenzaran los experimentos de microdiálisis, los ratones fueron asignados a uno de los diferentes tratamientos (solución salina, cocaína, chocolate o LiCl) dentro de cada grupo (tratado de forma simulada o sin norepinefrina). Para los experimentos con alimentos, los animales se colocaron en un programa de privación de alimentos (28) 4 días antes de que comenzaran los experimentos.
El dializado se recogió cada 20 min para 120 (para grupos de cocaína y LiCl) o 160 (para grupos de alimentos) min. Solo se reportan datos de ratones con una cánula colocada correctamente. Las colocaciones se juzgaron por tinción con azul de metileno. Veinte microlitros de las muestras de dializado se analizaron por HPLC. El resto de 20 μl se mantuvo para un posible análisis posterior. Las concentraciones (pg por 20 μl) no se corrigieron para la recuperación de la sonda. El sistema HPLC consistió en un sistema Alliance HPLC (Waters, Milford, MA) y un detector coulométrico (modelo 5200A; Coulochem II, ESA, Chelmsford, MA) provisto de una celda de acondicionamiento (M 5021) y una celda analítica (M 5011) . La celda de acondicionamiento se ajustó a 400 mV, el electrodo 1 se ajustó a 200 mV y el electrodo 2 se ajustó a −250 mV. Se utilizó una columna Nova-Pack C18 (3.9 x 150 mm; Waters) mantenida a 33 ° C. El caudal fue de 1.1 ml / min. La fase móvil fue como se describió anteriormente (14, 15). El límite de detección del ensayo fue 0.1 pg.
Agotamiento de norepinefrina en mpFC.
Anestesia y conjunto quirúrgico se describen anteriormente. Los animales se inyectaron con GBR 12909 (15 mg / kg) 30 min antes de la microinyección de 6-OHDA para proteger las neuronas dopaminérgicas. La inyección bilateral de 6-OHDA (1.5 μg por 0.1 μl para 2 min para cada lado) se realizó en mpFC [las coordenadas fueron + 2.52 anteroposterior, ± 0.6 lateral y −2.0 ventral con respecto a bregma (27)] a través de acero inoxidable cánula (diámetro exterior de 0.15 mm; Unimed, Lausana, Suiza) conectada a una jeringa de 1-μl mediante un tubo de polietileno y accionada por una bomba CMA / 100. La cánula se dejó en su lugar durante un 2 adicional después del final de la infusión. Los animales tratados de forma simulada fueron sometidos al mismo tratamiento pero recibieron vehículo intracerebral. Los animales se utilizaron para microdiálisis o experimentos de comportamiento 7 días después de la cirugía.
Los niveles tisulares de norepinefrina y dopamina en mpFC se evaluaron como se describió previamente (14, 15) para evaluar la extensión del agotamiento.
Lugar acondicionado.
Los experimentos de comportamiento se realizaron utilizando un aparato de acondicionamiento de lugares (14, 15, 29). El aparato comprendía dos cámaras de plexiglás grises (15 × 15 × 20 cm) y un callejón central (15 × 5 × 20 cm). Dos puertas correderas (4 × 20 cm) conectaron el callejón a las cámaras. En cada cámara se utilizaron dos plexiglás negros paralelos (5 × 5 × 20 cm) hechos de plexiglás negro y dispuestos en diferentes patrones (que cubren siempre la misma superficie de la cámara) como estímulos condicionados. Los animales fueron utilizados para experimentos de comportamiento 7 días después de la cirugía. Antes del acondicionamiento, los ratones se asignaron a uno de los diferentes tratamientos (solución salina, cocaína, chocolate o LiCl) dentro de cada grupo (tratamiento simulado o agotado con norepinefrina).
El procedimiento de entrenamiento para el acondicionamiento del lugar se describió anteriormente (14, 15). Brevemente, en el día 1 (prueba previa), los ratones estuvieron libres para explorar todo el aparato en busca de 20 min. Durante los siguientes días de 8 (fase de acondicionamiento), los ratones se confinaron diariamente por 40 min alternativamente en una de las dos cámaras. Para el acondicionamiento del lugar con estímulos farmacológicos, uno de los patrones se emparejó constantemente con solución salina y el otro con cocaína (20 mg / kg ip, CPP) o LiCl (3.0 meq / kg ip, CPA) durante la fase de acondicionamiento. Estas dosis se eligieron en base a estudios previos que muestran que los ratones C57BL / 6JIco muestran un CPP más fuerte en una dosis de cocaína de 20 mg / kg (30, 31) y una tendencia a la aversión en la prueba de CPA a una dosis de LiCl de 3.0 meq / kg (32). Para los animales en el grupo de control, ambas cámaras se emparejaron con solución salina. Para CPP con alimentos, uno de los patrones se emparejó constantemente con alimentos estándar (1 g de dieta estándar de ratón) y el otro con alimentos sabrosos (1 g de chocolate con leche). Los animales se colocaron en un programa de restricción de alimentos (28) 4 días antes de que comenzara el acondicionamiento. Este horario duró todo el acondicionamiento.
Para todos los experimentos de acondicionamiento del lugar, los emparejamientos se equilibraron de modo que para la mitad de cada grupo experimental el estímulo incondicionado (cocaína, chocolate o LiCl) se emparejó con uno de los dos patrones; para la otra mitad de cada grupo, el estímulo incondicionado se emparejó con el otro patrón. La prueba de la expresión de CPP o CPA se realizó el día 10 usando el procedimiento de prueba previa. Los datos de comportamiento fueron recopilados y analizados por el sistema de seguimiento de video totalmente automatizado EthoVision (Noldus, Wageningen, Países Bajos). Brevemente, el sistema experimental es grabado por una cámara de video CCD. Luego, la señal se digitaliza (mediante un dispositivo de hardware llamado capturador de fotogramas) y se pasa a la memoria de la computadora. Posteriormente, los datos digitales se analizan mediante el software EthoVision para obtener el “tiempo invertido” (en segundos), que se utiliza como datos brutos para las puntuaciones de preferencia en cada sector del aparato por cada sujeto.
Estadísticas.
Lugar acondicionado.
Para los experimentos de acondicionamiento de lugares, se realizaron análisis estadísticos calculando el tiempo (en segundos) empleado en el centro (Centro), medicamentos emparejados con chocolate (emparejados) y solución salina / alimentos emparejados estándar (sin par) en el día del examen. En el caso de los animales que recibieron un emparejamiento salino con ambos compartimentos, el compartimiento emparejado se identificó como el primero al que estaban expuestos.
Efectos del agotamiento de la norepinefrina cortical prefrontal selectiva en el acondicionamiento del lugar.
Los datos de los experimentos de acondicionamiento del lugar se analizaron mediante el uso de ANOVA de medidas repetidas con uno entre el factor (tratamiento previo, dos niveles: tratamiento simulado y agotado por norepinefrina) y uno dentro del factor (emparejamiento, tres niveles: Centro, Pareado y Sin par) para cada tratamiento [ Solución salina / solución salina, solución salina / cocaína (20 mg / kg), solución salina / LiCl (3 meq / kg) y alimentos estándar / chocolate]. Debido a que las comparaciones importantes son aquellas entre los compartimientos emparejados y no emparejados, las comparaciones medias del tiempo pasado en estas cámaras se realizaron utilizando ANOVA de medidas repetidas dentro de cada grupo.
El ANOVA bidireccional reveló una interacción significativa pretratamiento × emparejamiento para la cocaína [F (2, 28) = 3.47; P <0.05], LiCl [F (2, 28) = 4.55; P <0.05] y chocolate [F (2, 28) = 3.5; P <0.05].
El ANOVA de medidas repetidas dentro de cada grupo reveló un efecto significativo del factor de emparejamiento solo para los animales tratados de forma simulada inyectados con cocaína [F (1, 14) = 24.3; P <0.0005], LiCl [F (1, 14) = 10.3; P <0.01], o chocolate [F (1, 14) = 7.31; P <0.05].
Agotamiento de norepinefrina en mpFC.
Los efectos de la depleción prefrontal de norepinefrina sobre los niveles tisulares de dopamina y norepinefrina en mpFC se analizaron mediante ANOVA bidireccional. Los factores fueron los siguientes: lesión (dos niveles: tratamiento simulado y agotamiento de norepinefrina) y experimento (dos niveles: experimento de comportamiento y experimentos de microdiálisis). Se llevaron a cabo comparaciones individuales entre grupos cuando fue apropiado mediante una prueba post hoc, la prueba de rango múltiple de Duncan. Los análisis estadísticos se llevaron a cabo con datos de experimentos de comportamiento y microdiálisis. El ANOVA bidireccional para los efectos de la depleción prefrontal de norepinefrina sobre los niveles tisulares de dopamina y norepinefrina en mpFC mostró un efecto de lesión significativo para la norepinefrina solamente [F (1, 188) = 2.02; P <0.0005], pero sin efectos experimentales.
Microdiálisis.
Los análisis estadísticos se llevaron a cabo con datos brutos (concentraciones de pg por 20 μl). Los efectos de la depleción prefrontal de norepinefrina sobre la liberación de norepinefrina en mpFC o sobre la salida de dopamina en NAc de animales desafiados con cocaína (20 mg / kg) o LiCl (3 meq / kg) se analizaron mediante ANOVA de medidas repetidas con dos factores entre (pretratamiento, dos niveles, tratado de forma simulada y sin noradrenalina, y tratamiento, tres niveles, solución salina, cocaína y LiCl) y uno dentro del factor (tiempo, siete niveles, 0, 20, 40, 60, 80, 100 y 120). Los efectos de la depleción prefrontal de norepinefrina sobre la liberación de norepinefrina en mpFC o sobre el flujo de salida de dopamina en NAc de animales expuestos al chocolate se analizaron mediante ANOVA de medidas repetidas con uno entre el factor (pretratamiento, dos niveles, tratamiento simulado y la norepinefrina agotada) y uno dentro del factor ( tiempo, nueve niveles, 0, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140 y 160). Los efectos simples se evaluaron mediante ANOVA de una vía para cada punto temporal. Se llevaron a cabo comparaciones individuales entre grupos cuando fue apropiado mediante la prueba post hoc, la prueba de rango múltiple de Duncan.
Los análisis estadísticos de los efectos de los estímulos farmacológicos en el flujo de salida prefrontal de norepinefrina revelaron una interacción significativa pretratamiento × tratamiento × tiempo [F (12, 180) = 4.98; P <0.005]. Los análisis estadísticos de los efectos del consumo de chocolate sobre la liberación de norepinefrina revelaron una interacción pretratamiento × tiempo [F (8, 80) = 7.77; P <0.005]. Los análisis de efectos simples revelaron un efecto significativo del tiempo solo para el grupo tratado de forma simulada y una diferencia significativa entre los grupos tratados de forma simulada y los grupos empobrecidos de norepinefrina después de la inyección de cocaína o LiCl, así como después del consumo de chocolate.
Los análisis estadísticos de los efectos de los estímulos farmacológicos sobre el flujo de salida de dopamina accumbal revelaron una interacción significativa pretratamiento × tratamiento × tiempo [F (12, 180) = 10.02; P <0.0005]. Los análisis estadísticos de los datos del chocolate revelaron una interacción significativa pretratamiento × tiempo [F (8, 80) = 2.12; P <0.05]. Los análisis de efectos simples revelaron un efecto significativo del tiempo solo para los grupos tratados de forma simulada y una diferencia significativa entre los grupos tratados de forma simulada y los grupos empobrecidos en norepinefrina después de la inyección de drogas (cocaína o LiCl), así como después del consumo de chocolate.
AGRADECIMIENTOS
Damos las gracias al Dr. E. Catalfamo por la asistencia hábil. Esta investigación fue apoyada por Ministero della Ricerca Scientifica e Tecnologica (PRIN 2005), Università "La Sapienza" Ateneo (2004 / 2005), y Ministero della Salute (Progetto Finalizzato RF03.182P).
ABREVIATURAS
NAc núcleo accumbens
pFC corteza prefrontal
mpFC medial pFC
CPP preferencia lugar condicionado
CPA condicionó el lugar aversión
6-OHDA 6-hidroxidopamina.
NOTAS
Los autores declaran no tener conflicto de intereses.
Este artículo es un envío directo PNAS.
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