Descodificación de circuitos neurales que controlan la búsqueda compulsiva de sacarosa (2015) (MECANISMO DE BINGO)

Con el fin de identificar las neuronas de LH que proporcionan entrada monosináptica al VTA in vivo y observar su actividad durante los comportamientos que se mueven libremente, utilizamos una estrategia de virus dual para expresar selectivamente la canalrodopsina-2 (ChR2) en las neuronas de LH que proporcionan entrada monosináptica al VTA (Figuras 1A y S1). Inyectamos un vector viral adenoasociado (AAV).₅) que lleva ChR2-eYFP en una construcción de marco de lectura abierto (DIO) doble invertido dependiente de Cre-recombinasa en la LH para infectar somas locales e inyectaron un virus del herpes simple (HSV) que viajaba retrógradamente y que llevaba Cre-recombinasa en el VTA. La recombinación posterior permitió la expresión de opsina y fluoróforo de forma selectiva en las neuronas de LH que proporcionan una entrada monosináptica al VTA. Para confirmar nuestro enfoque, realizamos grabaciones de pinza de parche de células enteras ex vivo en cortes de cerebro horizontales que contienen la LH y se registraron a partir de neuronas que expresan ChR2-eYFP, así como neuronas vecinas de LH que eran negativas para ChR2-eYFP (Figura 1SEGUNDO). Las latencias de los picos evocados por la luz, medidas desde el inicio del pulso de luz hasta el pico del potencial de acción, variaron de 3 a 8 ms (Figura 1C). También encontramos que ninguna de las células que no expresan (ChR2-negativas) registradas mostró respuestas excitadoras a la fotoestimulación (n = 14; Figura 1C), a pesar de su proximidad a las células que expresan ChR2.

Para realizar una fotoidentificación mediada optogenéticamente in vivo, se implantó un optrodo en la LH para registrar la actividad neuronal durante una tarea de búsqueda de sacarosa. En la misma sesión de grabación, proporcionamos varios patrones de fotoestimulación para identificar neuronas LH-VTA que expresan ChR2 (Figuras 1D y S1). Examinamos la distribución de las latencias de la fotorrespuesta excitadora en todas las neuronas LH que muestran un cambio temporal en la velocidad de disparo en respuesta a la iluminación y observamos una distribución bimodal (Figura 1MI). Observamos una población de neuronas durante grabaciones in vivo con latencias en un rango de 3 a 8 ms. Esto fue idéntico al rango de latencia encontrado en las neuronas LH-VTA que expresan ChR2 cuando registramos ex vivo. A estas unidades las denominamos unidades de "Tipo 1" (Figuras 1C, 1E y 1F). Además, había una población distinta de células con latencias de fotorrespuesta de ~ 100 ms (Figuras 1E y 1G), y denominamos estas unidades "Tipo 2". También observamos neuronas que fueron inhibidas en respuesta a la fotoestimulación de las neuronas LH-VTA (Figura S2), y denominamos estas unidades "Tipo 3". Comparamos la duración del potencial de acción (medida desde el pico al valle) y las tasas de disparo medias de las unidades Tipo 1 y Tipo 2, así como las que no mostraron una respuesta fotográfica (Figura 1H). La distribución de duraciones del potencial de acción de Tipo 1 (Figura 1I) y Tipo 2 (Figura 1J) muestra que la mayoría de las unidades de Tipo 1 tienen una duración de potencial de acción inferior a 500 μs (84%; n = 16/19, distribución binomial, p = 0.002).

Aunque las unidades de Tipo 1 cumplen los criterios estándar para ser clasificadas como que expresan ChR2 (Cohen et al., 2012, Zhang et al., 2013), no estaba claro si la fotorrespuesta de latencia más larga de las unidades de Tipo 2 era indicativa de neuronas que expresaban ChR2 que respondían más lentamente a la fotoestimulación, o si este efecto se debió a la actividad de la red. Dado que las neuronas de LH que expresan ChR2 (Tipo 1) se proyectan directamente al VTA, una posibilidad era que las neuronas de Tipo 2 estuvieran recibiendo retroalimentación del VTA (Figura 1K). Otra posibilidad era que las neuronas de Tipo 2 se activaban mediante colaterales de axón de las neuronas de Tipo 1 (Figura 1L). Para diferenciar entre estos dos posibles modelos de circuito, inhibimos el VTA junto con la fotoidentificación en la LH.

Basándonos en nuestros modelos de circuito, esperaríamos que la inhibición distal no tuviera ningún efecto sobre las fotorrespuestas de las neuronas LH que expresan ChR2. Sin embargo, si las neuronas LH fotorrespuestas, pero no expresas, se basaron en la retroalimentación del VTA para provocar una respuesta de tiempo limitado a la iluminación (Figura 1K), esperaríamos una atenuación de las fotorrespuestas en estas neuronas con la inhibición de VTA. Expresamos ChR2 en células LH-VTA como anteriormente, pero esta vez también expresamos halorodopsina 3.0 mejorada (NpHR) en el VTA e implantamos una fibra óptica en el VTA además del optrode en LH (Figura 2UNA). Entregamos los mismos patrones de iluminación de luz azul en la LH para las tres épocas, pero también fotoinhibimos el VTA con luz amarilla en la segunda época (Figura 2LA).

Las fotorrespuestas de las unidades Tipo 1 a la iluminación con luz azul en la LH no se vieron afectadas por la fotoinhibición del VTA, que es consistente con la expresión de ChR2 en las neuronas del Tipo 1 LH-VTA (Figura 2SEGUNDO). Por el contrario, la mayoría de las unidades de tipo 2 (87%; n = 13/15, distribución binomial, p = 0.004) mostraron una atenuación significativa de las fotorespuestas a los pulsos de luz azul entregados en la LH tras la fotoinhibición de las neuronas VTA. Las respuestas de las unidades de Tipo 1 y Tipo 2 durante la fotoinhibición de VTA fueron significativamente diferentes (chi-cuadrado = 7.64, p = 0.0057; Figuras 2B y 2C). Estas diferencias también se pueden ver en las puntuaciones máximas de Z durante épocas individuales (Figura 2D) y con la época de encendido amarillo normalizada a la época de apagado amarillo (Figura 2MI). Estos datos sugieren que las neuronas Tipo 2 LH reciben información (directa o indirectamente) del VTA (Figura 1K) en lugar de a través de colaterales de axones locales (Figura 1L).

Habiendo identificado estos dos tipos distintos de neuronas LH en el bucle LH-VTA, quisimos examinar la actividad neuronal que ocurre naturalmente durante una tarea de autoadministración de sacarosa (Figura 3UN). Los ratones fueron entrenados para realizar respuestas de nariz para una señal que predice la entrega de sacarosa en un puerto adyacente (como en Tye et al., 2008). Para permitirnos diferenciar las respuestas neuronales a la señal de nariz y la señal, la señal y la sacarosa se administraron en un programa de refuerzo parcial, en el que el 50% de las señales de nariz se emparejaron con una señal y la entrega de sacarosa.

Las unidades Tipo 1 mostraron respuestas fásicas a la entrada del puerto de sacarosa, como se ve en una unidad Tipo 1 representativa (Figura 3B), así como los datos de población de todas las unidades Tipo 1 (Figura 3DO). Las respuestas fásicas de las unidades Tipo 2, sin embargo, reflejaron principalmente las respuestas a la señal predictiva de recompensa (Figuras 3D y 3E). Los patrones de disparo normalizados de todas las neuronas registradas (n = 198, divididas en unidades de Tipo 1, 2, 3 y que no responden) se muestran para cada componente de la tarea: picos de nariz emparejados con la señal, picos de nariz en ausencia de la señal y entrada del puerto de sacarosaFigura 3F). Todas las unidades de Tipo 1 que mostraron cambios fásicos en la actividad relevantes para la tarea (74%; n = 14/19) fueron excitadas o inhibidas fásicamente por la entrada del puerto de sacarosa, y un pequeño número también mostró inhibición fásica de la señal predictiva de recompensa (Figuras 3B, 3C, y 3G). En contraste, las unidades Tipo 2 fueron más heterogéneas, con neuronas que responden a tareas que codifican la señal de forma selectiva (35%), la entrada de puerto de sacarosa de forma selectiva (26%), o tanto la entrada de entrada y puerto de la señal (12%; Figuras 3D, 3E y 3H). Para ilustrar la fuerza de las respuestas de las unidades Tipo 1 y Tipo 2 a eventos relacionados con tareas, trazamos cada celda en una gráfica tridimensional según la puntuación Z (Figura 3YO). Para mostrar la distribución de los cambios fásicos en la activación a múltiples eventos relacionados con tareas en un nivel cualitativo, trazamos el número de celdas de cada tipo de fotorrespuesta que se incluyó en una categoría determinada (Figura 3J).

Dado el papel bien definido del VTA en el error de predicción de recompensa (p. Ej., La reducción fásica de la activación de la neurona DA en respuesta a la omisión inesperada de una recompensa y la excitación fásica en respuesta a la entrega de recompensa inesperada) (Schultz et al., 1997), investigamos si las neuronas LH codificarían la omisión inesperada de una recompensa de sacarosa. Para hacer esto, registramos la actividad neuronal de las neuronas fotosensibles durante la misma tarea de recompensa de señal en animales bien entrenados, pero omitimos al azar el 30% de las entregas de sacarosa siguiendo la señal (Figura 4LA).

La mayoría de las unidades de Tipo 1 (88%; n = 15/17, distribución binomial, p = 0.001) fueron insensibles a la omisión de recompensas (Figuras 4B y 4D), mientras que un gran subconjunto de unidades de Tipo 2 (67%; n = 12/18) mostró una respuesta significativamente diferente a los ensayos presentados con recompensa y los ensayos omitidos (Figuras 4C y 4D). Llegamos a la conclusión de que las neuronas LH-VTA (Tipo 1) codificaban la acción de ingresar al puerto, ya que estas respuestas de entrada de puerto eran persistentes incluso después de la omisión de la recompensa (Figura 4D), en contraste con las unidades de Tipo 2 (chi-cuadrado = 10.9804, p = 0.0009).

Para determinar si las respuestas del Tipo 1 a la entrada del puerto estaban realmente codificando la respuesta condicionada (CR), a diferencia del comportamiento general de búsqueda de recompensa o exploración, registramos en ratones no entrenados que aún no habían adquirido la tarea. En ratones sin trabajo, entregamos sacarosa al puerto en ausencia de una señal predictiva (entrega de recompensa imprevista) y encontramos que las unidades Tipo 1 no mostraban respuestas fásicas a la entrada del puerto (Figuras 4E, 4F y 4I), coherentes con el modelo en el que las neuronas de Tipo 1 codifican la CR (Figura 4J).

A continuación, para determinar si la actividad de la unidad Tipo 2 es consistente con un perfil de respuesta tipo error de predicción de recompensa, también registramos estas neuronas en animales bien entrenados durante la entrega de recompensa no predicha (Figura 4GRAMO). Encontramos que un subconjunto de unidades de Tipo 2 respondió a entregas de sacarosa impredecibles (50%; Figuras 4G – 4I). En conjunto, los subconjuntos de unidades Tipo 2 son sensibles a la omisión inesperada de recompensas (Figuras 4C y 4D) y entrega de recompensa imprevista (Figuras 4G – 4I), consistente con un perfil de respuesta tipo error de predicción de recompensa.

Como hemos mostrado anteriormente, las unidades Tipo 1 representan un correlato neural de CR. Es importante destacar que el aumento en la velocidad de disparo comienza antes de la RC, aumentando hasta que la CR se haya completado (Figuras 3B, 3C, y 4SEGUNDO). Para determinar si la activación de la vía de LH-VTA podría promover la RC, queríamos probar la capacidad de activación de LH-VTA en la conducción de CR frente a una consecuencia negativa. En ratones de tipo salvaje, expresamos ChR2-eYFP o eYFP solo en cuerpos de células LH e implantamos una fibra óptica sobre el VTA (Figuras 5A y S4). Por el contrario, para probar el papel de la vía LH-VTA en la mediación de la RC o comportamientos relacionados con la alimentación, expresamos bilateralmente NpHR-eYFP o eYFP solo en células LH e implantamos una fibra óptica por encima de VTA (Figuras 5A y S4).

Diseñamos una tarea de condicionamiento pavloviano en la que los ratones privados de alimentos tenían que cruzar una rejilla de choque para obtener una recompensa de sacarosa (Figura 5SEGUNDO). En la primera época de "línea de base" (con la cuadrícula de choque apagada), verificamos que cada ratón había adquirido la tarea de aproximación condicionada pavloviana. En la segunda época ("Choque"), la rejilla de choque entregó golpes leves en los pies cada segundo. Finalmente, en la tercera época ("Choque + Luz"), continuamos aplicando descargas en los pies, pero también iluminamos los terminales LH en el VTA con luz azul (10 Hz) en ratones que expresaban ChR2 y controles eYFP combinados y luz amarilla (constante) para ratones que expresan NpHR y sus controles eYFP (Figura 5B).

Observamos un número significativamente mayor de entradas de puerto por señal durante la época de Shock + Light y una puntuación de diferencia significativamente mayor (época de Shock + Light - época de solo choque) en ratones ChR2 en relación con los ratones eYFP (Figura 5C y Película S1). En contraste, la fotoinhibición de la vía de LH-VTA produjo una reducción significativa en las entradas de puerto por cue y las puntuaciones de diferencia en los ratones NpHR en relación con los ratones eYFP (Figura 5D y Película S2). Los experimentos de extinción dentro de la sesión durante los cuales las presentaciones de referencia no fueron seguidas por entregas de sacarosa mostraron tendencias similares en efecto (Figura S4).

Es importante destacar que queríamos determinar si los cambios en la búsqueda de sacarosa que habíamos obtenido fueron causados ​​por cambios en el comportamiento relacionado con la alimentación o sensibilidad al dolor. Observamos que la fotoactivación de la proyección de LH-VTA aumentó significativamente el tiempo dedicado a la alimentación en ratones bien alimentados en el grupo ChR2 (Figura 5MI). Sin embargo, la fotoinhibición de la vía de LH-VTA no redujo significativamente la alimentación (Figura 5F), a pesar de que estos animales fueron privados de alimentos para mejorar nuestra capacidad de detectar una reducción en relación con la época de referencia (en comparación con los animales saciados en Figura 5MI). En ninguno de los ChR2 (Figura 5G) ni grupo NpHR (Figura 5H) ¿Observamos una diferencia en la latencia a la extracción de la cola del agua caliente (Ben-Bassat et al., 1959, Grotto y Sulman, 1967), lo que indica que manipular la proyección de LH-VTA no altera la analgesia?

Para estudiar la composición de los componentes de transmisión rápida de las entradas de LH al VTA que estaban provocando estos efectos, realizamos grabaciones de pinza de parche de células completas de neuronas de VTA en una preparación de corte agudo mientras activamos ópticamente las entradas de LH que expresan ChR2-eYFP (Figuras 6A y S5). Dado que existe una heterogeneidad bien establecida dentro del VTA, que incluye ~ 65% de neuronas DA, ~ 30% de neuronas GABA y ~ 5% de neuronas de glutamato (Margolis et al., 2006, Nair-Roberts et al., 2008, Yamaguchi et al., 2007). al., XNUMX), llenamos las células con biocitina mientras se registraba para permitir la identificación del tipo celular mediante inmunohistoquímica post-hoc para la tirosina hidroxilasa (TH; Figura 6B), además de registrar la corriente de catión activada por hiperpolarización (I_h) y la localización de la celda de mapeo (Figuras 6B y S5).

Primero, registramos en la pinza de corriente durante la fotoestimulación de las entradas de LH que expresan ChR2 y observamos que 23 de las neuronas de 27 mostraron una respuesta de bloqueo de tiempo a la fotoestimulación de las entradas de LH (Figura 6DO). La mayoría de las neuronas DA muestreadas en el VTA recibieron una entrada excitadora neta de la LH (56%), mientras que otro subconjunto mostró una inhibición neta (30%; Figura 6DO). La distribución espacial de estas neuronas DA se mapea en un atlas para cortes horizontales que contienen el VTA (Figura 6D).

Para establecer la contribución monosináptica de las entradas de LH a las neuronas VTA DA, utilizamos un mapeo de circuitos asistido por ChR2, donde se realizaron registros de fijación de voltaje en presencia de tetrodotoxina (TTX) y 4-aminopiridina (4AP; Petreanu et al., 2007) . De acuerdo con nuestras observaciones de los registros de pinza de corriente, observamos que la mayoría de las neuronas VTA DA registradas recibieron exclusivamente entrada monosináptica excitadora de la LH (67%), en comparación con las neuronas VTA DA que recibieron exclusivamente entrada monosináptica inhibitoria (11%), o ambos (22%; Figuras 6E y S6).

Identificamos las neuronas VTA GABA inyectando un fluoróforo dependiente de Cre (AAV₅-DIO-mCherry) en el VTA de VGAT :: Cre ratones y utilizó la expresión de mCherry para dirigir la grabación de las neuronas VTA GABA (n = 24; Figura 6F). El cuarenta y seis por ciento de las neuronas VTA GABA respondieron con excitación neta, mientras que 54% respondió con inhibición neta, a la fotoestimulación de las entradas de LH que expresan ChR2 (Figura 6SOL). La distribución espacial de estas células se muestra en Figura 6H. Al examinar la entrada monosináptica de la LH (como se describió anteriormente), encontramos que el 18% de las neuronas GABA muestreadas recibió exclusivamente una entrada excitadora y el 9% recibió una entrada exclusivamente inhibitoria (Figura 6YO). Sin embargo, en relación con las neuronas VTA DA, encontramos que más neuronas VTA GABA recibieron GABA tanto excitador mediado por AMPAR como inhibitorio._AEntrada monosináptica mediada por R de la LH (73%; chi-cuadrado = 5.0505, p = 0.0246; Figuras 6yo y S6).

Dado que nuestras grabaciones ex vivo proporcionaron evidencia que respalda la entrada sólida de las proyecciones de LH GABAérgica y glutamatérgica al VTA, a continuación, probamos el papel de cada componente de forma independiente. Para hacer esto, usamos líneas de ratón transgénicas que expresan Cre-recombinasa en neuronas que expresan el transportador 2 de glutamato vesicular (VGLUT2) o el transportador GABA vesicular (VGAT). Inyectamos AAV₅-DIO-ChR2-eYFP o AAV₅-DIO-eYFP en el LH ​​de los ratones VGLUT2 :: Cre y VGAT :: Cre e implantó una fibra óptica sobre el VTA (Figura S7). Estos animales se ejecutaron en cada uno de los ensayos de comportamiento que se muestran en Figura 5.

No observamos diferencias detectables en el número de entradas de puerto realizadas por cada entre los ratones que expresan ChR2 o eYFP en la LH^exceso- Proyección VTA (Figura 7A) o en la LH^GABA- Proyección VTA (Figura 7SEGUNDO). Sin embargo, al analizar el video, notamos comportamientos de roer aberrantes en la LH^GABA-VTA: grupo ChR2 en la iluminación con luz azul (ver Peliculas S3 y S4). En LH^exceso-VTA ratones, aunque hubo una tendencia hacia una reducción en la alimentación durante la fotoestimulación en el grupo ChR2 en comparación con el grupo eYFP, esto no fue estadísticamente significativo (Figura 7DO). En contraste, observamos un aumento robusto en el tiempo dedicado a la alimentación en ratones saciados tras la iluminación en la LH^GABA-VTA: grupo ChR2 relativo a los controles (Figura 7D y Película S3). En ninguno de los grupos de animales hubo un efecto de estimulación de la luz en el ensayo de extracción de cola (Figuras 7E y 7F).

Durante la tarea de alimentación, como lo hicimos durante la tarea de búsqueda de sacarosa, nuevamente notamos secuencias motoras anormales relacionadas con la alimentación que no estaban dirigidas a los alimentos. Filmamos un ratón representativo en la izquierda.^GABA-VTA: grupo ChR2 en una cámara transparente vacía, y con fotoestimulación de 20 Hz, observamos secuencias motoras apetitivas inusuales como lamer y roer el suelo o el espacio vacío (Película S4). Cuantificamos estos comportamientos de "roer" durante la tarea de alimentación en el LH-VTA de tipo salvaje (Figura 7G), LH^exceso-VTA (Figura 7H), y LH^GABA-VTA (Figura 7I) grupos y demostró que LH^GABA-VTA: los ratones ChR2 mordían más que los de tipo salvaje o LH^exceso-VTA: ratones ChR2 cuando se fotoestimulan, en comparación con sus respectivos grupos eYFP (Figura 7J). Consideramos si los comportamientos aberrantes relacionados con la alimentación podrían separarse de la alimentación dirigida de manera apropiada a frecuencias más bajas. Sin embargo, cuando probamos el LH^GABA-VTA: grupo ChR2 con trenes de luz azul de 5 Hz y 10 Hz, observamos una relación proporcional entre la frecuencia de estimulación y tanto la alimentación como el mordisco (Figura 7K)

La proyección de LH al VTA se ha explorado con estudios de colisión de estimulación eléctrica (Bielajew y Shizgal, 1986) y durante mucho tiempo se ha planteado la hipótesis de que desempeña un papel en el procesamiento de la recompensa (Hoebel y Teitelbaum, 1962, Margules y Olds, 1962). El papel ha sido un reto. Aquí, proporcionamos una disección detallada de cómo los componentes individuales del bucle LH-VTA procesan diferentes aspectos de una tarea relacionada con la recompensa.

A través del uso de etiquetado óptico optogenético (Figura 1), hemos identificado dos poblaciones separadas de neuronas LH: células que envían proyecciones al VTA (Tipo 1) y células que reciben retroalimentación del VTA (Tipo 2; Figura 2), Aunque estas poblaciones no tienen por qué ser mutuamente excluyentes, ya que es posible que las neuronas LH puedan enviar y recibir entradas hacia y desde el VTA. Curiosamente, encontramos que relativamente pocas neuronas fotorreportivas quedaron fuera de la distribución bimodal que encapsula estas dos poblaciones (Figuras S2B y 1MI). Dado esto, en combinación con el largo retraso de latencia en las fotorrespuestas de tipo 2 (~ 100 ms), especulamos que puede haber una vía dominante que contribuya a la actividad de las neuronas de tipo 2. Además, debido a que la DA se une a los receptores acoplados a proteína G, la cinética es más lenta que la mayoría de las sinapsis glutamatérgicas (Girault y Greengard, 2004) y puede explicar este grupo de unidades fotosensibles de latencia de 100 ms. También es posible que el VTA pueda proporcionar retroalimentación indirecta a través de otras regiones distales, a través de regiones intermedias excitadoras como la amígdala, o con desinhibición a través del núcleo accumbens (NAc) o el núcleo del lecho de la estría terminal (BNST).

Curiosamente, mientras que la fotoestimulación de las unidades de Tipo 1 evoca respuestas excitadoras en las unidades de Tipo 2, las unidades de Tipo 1 y 2 muestran distintas propiedades de codificación de comportamiento. Por ejemplo, el número de unidades Tipo 1 y Tipo 2 que codifican selectivamente la señal predictiva de recompensa es significativamente diferente (n = 0/19 Tipo 1 versus n = 12/34 Tipo 2, chi-cuadrado = 8.67, p = 0.003) . Este patrón de respuesta paradójico podría deberse a procesos computacionales en un elemento del circuito intermedio, como el VTA, que puede estar desempeñando un papel activo durante la tarea conductual pero inactivo durante el etiquetado fotográfico. Además, el estado de comportamiento del animal podría influir en cómo se procesan estos datos.

Nuestros experimentos de omisión de recompensa nos permitieron distinguir entre la codificación neural LH de la CR y el consumo del estímulo no condicionado (EE. UU.). En estos experimentos, un subconjunto de unidades Tipo 2 respondió a la señal predictiva de recompensa (CS) y los EE. UU. Y también mostró una disminución en la tasa de activación cuando se omitieron las recompensas esperadas. Además, un subconjunto de unidades Tipo 2 también muestra excitación fásica en la entrega de recompensa inesperada (Figuras 4G y 4H). Estos datos recuerdan la forma en que las neuronas DA en el VTA codifican el error de predicción de recompensa (Cohen et al., 2012, Schultz et al., 1997). Especulamos que las neuronas VTA pueden transmitir señales de error de predicción de recompensa a un subconjunto de neuronas LH, que están bien posicionadas para integrar estas señales para la determinación de una salida de comportamiento apropiada. Específicamente, la LH está fuertemente interconectada con una multitud de otras áreas del cerebro (Berthoud y Münzberg, 2011) y se ha relacionado causalmente con estados homeostáticos como sueño / excitación y hambre / saciedad (Carter et al., 2009, Jennings et al. , 2013).

El comportamiento compulsivo de búsqueda de recompensas se ha discutido principalmente en el contexto de la adicción a las drogas, en el que un paradigma clásico para la búsqueda compulsiva de drogas ha sido examinar el grado en que el comportamiento de búsqueda de drogas persiste ante una consecuencia negativa, como un choque en el pie. (Belin et al., 2008, Pelloux et al., 2007, Vanderschuren y Everitt, 2004). Adaptamos esta tarea para la búsqueda de sacarosa para permitirnos investigar si la activación de la vía LH-VTA era suficiente para promover la búsqueda compulsiva de sacarosa. Dado que una diferencia clara entre las drogas y la recompensa natural es que las recompensas de las drogas no son necesarias para la supervivencia, existe controversia sobre qué comportamientos constituirían un comportamiento compulsivo de búsqueda de sacarosa o de comida. Una interpretación alternativa de nuestros datos es que la activación de la vía LH-VTA simplemente aumenta el impulso motivacional o la necesidad de buscar reforzadores del apetito. Dado que las tasas de obesidad han aumentado en las últimas décadas (Mietus-Snyder y Lustig, 2008), la sobrealimentación compulsiva y la adicción al azúcar son condiciones prevalentes que constituyen una gran amenaza para la salud humana (Avena, 2007). El comportamiento de alimentación en ratones saciados (completamente alimentados) después de la activación de la vía LH-VTA recuerda a los comportamientos alimentarios observados en humanos diagnosticados con trastorno por comer compulsivo (o trastorno por atracón) (DSM-V).

Se ha propuesto que las acciones repetidas conducen a la formación de hábitos, que a su vez conducen a la búsqueda compulsiva de recompensas que caracteriza a la adicción (Everitt y Robbins, 2005). Nuestro descubrimiento de que las neuronas LH-VTA solo codifican la entrada de puerto después del acondicionamiento sugiere que esta vía está codificando selectivamente una respuesta condicionada, no solo una acción motivada. Esto es consistente con nuestras observaciones de que la activación óptica de esta proyección puede promover la búsqueda compulsiva de recompensas ante una consecuencia negativa (Figura 5C), así como en ausencia de necesidad (como se ve en ratones saciados, Figura 5MI). Esta interpretación está respaldada por nuestro descubrimiento de que la fotoinhibición de la vía de LH-VTA reduce selectivamente la búsqueda compulsiva de sacarosa (Figura 5D) pero no reduce la alimentación en ratones con restricción alimentaria (Figura 5F). Uno de los mayores desafíos en el tratamiento de los trastornos compulsivos por comer en exceso o por atracones es el riesgo de alterar las conductas de alimentación en general. Desde una perspectiva traslacional, es posible que hayamos identificado un circuito neuronal específico como un objetivo potencial para el desarrollo de intervenciones terapéuticas para la ingesta compulsiva o la adicción al azúcar sin sacrificar las conductas naturales de alimentación.

Mostramos que además de un componente glutamatérgico LH-VTA (Kempadoo et al., 2013), también hay un componente GABAérgico significativo en la proyección (Leinninger et al., 2009), y que las neuronas LH hacen sinapsis directamente tanto en DA como en Neuronas GABA en el VTA (Figura 6). Sin embargo, existe una diferencia en el balance de la entrada excitatoria / inhibitoria en las neuronas VTA DA y GABA.

Mientras utilizamos el procesamiento inmunohistoquímico para verificar la identidad de las neuronas VTA, también medimos I_h, una corriente catiónica inespecífica rectificadora internamente activada por hiperpolarización (Lacey et al., 1989, Ungless y Grace, 2012). La presencia de esta corriente se ha utilizado ampliamente en estudios electrofisiológicos para identificar neuronas DA, pero se ha demostrado que está presente solo en subpoblaciones de neuronas DA, delineadas por objetivo de proyección (Lammel et al., 2011). Aunque Fields y sus colegas propusieron previamente en una revisión que "las neuronas de LH hacen sinapsis en las proyecciones de VTA con el PFC, pero no con las que se proyectan en el NAc" (Fields et al., 2007), nuestros datos sugieren que esta controversia se reabra. para una mayor investigación. Aunque observamos un subconjunto de neuronas DA que recibieron excitación neta de la LH y poseían una I muy pequeña_h (De acuerdo con las neuronas DA que proyectan la cáscara medial de mPFC o NAc), también observamos un subconjunto de neuronas DA que recibieron una entrada excitadora neta y mostraron una gran I_h (consistente con las características de las neuronas DA que se proyectan a la capa lateral de la NAc; Figura S5; Lammel et al., 2011). Por el contrario, las neuronas VTA DA que recibieron una entrada inhibitoria neta mostraron una I muy pequeña_h o carecía de esta corriente, lo que concuerda con la noción de que la LH envía una entrada predominantemente inhibitoria sobre las neuronas VTA DA que se proyectan hacia la mPFC o la capa medial de la NAc. También mostramos que las entradas de LH se pueden observar tanto en la VTA medial como lateral, lo que sugiere que la LH proporciona entradas en las neuronas de VTA con diversos objetivos de proyección, ya que se sabe que el objetivo de proyección de VTA corresponde en cierto modo a la ubicación espacial a lo largo de un eje medial-lateral ( Lammel et al., 2008).

El papel de la vía LH-VTA en la promoción de la recompensa se ha atribuido previamente a la transmisión glutamatérgica en el VTA (Kempadoo et al., 2013), ya que a menudo se piensa que el promotor CaMKIIα es selectivo para las neuronas de proyección excitadoras. Sin embargo, nuestros datos muestran claramente que la expresión de ChR2 bajo el control del promotor CaMKIIα también se dirige a las neuronas de proyección GABAérgicas en la LH (Figura 6).

El comportamiento provocado por la fotoestimulación de la LH.^GABA-La vía VTA fue frenética, mal dirigida y mala adaptación (Película S4). Una interpretación es que la activación de la LH.^GABA-La vía VTA envía una señal al ratón que causa el reconocimiento de un reforzador apetitivo. Una interpretación alternativa es que el LH^GABA-La vía VTA podría impulsar la atención de incentivo o un "deseo" intenso, consistente con una señal de enfoque condicionado, pero a un nivel no fisiológico que produce este comportamiento aberrante relacionado con la alimentación (Berridge y Robinson, 2003). De acuerdo con esto, es posible que la activación de la LH^GABA-La proyección VTA en realidad produce sensaciones intensas de deseo o ganas de alimentarse. Sin embargo, nuestros experimentos muestran que la activación de LH^GABA-VTA no produce un aumento en la búsqueda compulsiva de sacarosa, pero es probable que esto se deba a la excesiva mordedura y las conductas apetitivas aberrantes centradas en objetos no alimenticios en la cámara de pruebas. Aunque es difícil determinar la experiencia del ratón durante esta manipulación, está claro que los comportamientos relacionados con la alimentación dirigidos de manera apropiada requieren la activación coordinada de los componentes GABAérgico y glutamatérgico de la vía LH-VTA.

Las manipulaciones optogenéticas y farmacogenéticas son herramientas poderosas para establecer relaciones causales, sin embargo, no revelan las propiedades endógenas y fisiológicas de los elementos del circuito neural. Nuestro estudio unifica la información sobre la conectividad sináptica, la función endógena natural y el papel causal de la vía LH-VTA, proporcionando un nuevo nivel de información sobre cómo se integra la información en este circuito. Estos resultados resaltan la importancia de examinar el papel funcional de las neuronas por la conectividad, además de los marcadores genéticos. Las neuronas LH-VTA codificaron selectivamente la acción de búsqueda de recompensa, pero no codificaron los estímulos ambientales, mientras que los estímulos gratificantes y las señales predictoras de recompensa fueron codificados por una población discreta de neuronas LH aguas abajo del VTA. Además, hemos identificado una proyección específica que está causalmente relacionada con la búsqueda compulsiva de sacarosa y el comportamiento de alimentación. La heterogeneidad en la proyección de LH-VTA es necesaria para proporcionar un equilibrio adaptativo entre la motivación de conducción y la regulación de los comportamientos apetitivos dirigidos adecuadamente. Estos hallazgos proporcionan información relevante para afecciones patológicas como el trastorno compulsivo de comer en exceso, la adicción al azúcar y la obesidad