Receptores de dopamina D2 en disfunción de recompensa similar a la adicción y alimentación compulsiva en ratas obesas (2010)

Comentario: Este estudio demuestra que cuando a un animal se le da acceso ilimitado, un fuerte reforzador natural (alimento muy estimulante) puede causar una disminución en los receptores D2. Esta disminución se observó en casi todas las ratas y se produjo con bastante rapidez. Cuando se eliminó la comida "muy sabrosa", las ratas se negaron a comer comida normal. Las ratas continuaron atracones (cuando podían) a pesar de emparejar las descargas eléctricas con el consumo de alimentos "altamente apetitosos".

• Estudio completo

Nat Neurosci. 2010 mayo; 13(5): 635-641. Publicado en línea 2010 marzo 28. doi  10.1038 / nn.2519

Compendio

Encontramos que el desarrollo de la obesidad se combinó con la aparición de un déficit cada vez más grave en las respuestas de recompensa neuronal. Los cambios similares en la homeostasis de la recompensa inducida por la cocaína o la heroína se consideran cruciales para desencadenar la transición de la ingesta de drogas casual a la compulsiva. En consecuencia, detectamos un comportamiento de alimentación de tipo compulsivo en ratas obesas pero no magras, medido como un consumo aceptable de alimento que fue resistente a la interrupción por un estímulo condicionado aversivo. Los receptores D2 de la dopamina estriatal (D2Rs) se regularon a la baja en ratas obesas, como se ha informado en humanos adictos a las drogas. Además, el derribo mediado por lentivirus de los D2R del cuerpo estriado aceleró rápidamente el desarrollo de déficits de recompensas similares a la adicción y el inicio de la búsqueda compulsiva de alimentos en ratas con acceso extendido a alimentos sabrosos ricos en grasas. Estos datos demuestran que el consumo excesivo de alimentos sabrosos desencadena respuestas neuroadaptativas similares a la adicción en los circuitos de recompensa cerebral e impulsa el desarrollo de una alimentación compulsiva. Por lo tanto, los mecanismos hedónicos comunes pueden ser la base de la obesidad y la adicción a las drogas.

Introducción

La alimentación está influenciada por el placer y la recompensa, y la obtención de recompensas alimentarias puede motivar poderosamente el consumo1, 2. Sin embargo, los mecanismos hedónicos que contribuyen a la obesidad siguen siendo poco conocidos. En los seres humanos hiperfágicos con deficiencia congénita de leptina, la actividad en el cuerpo estriado dorsal y ventral, que son componentes centrales de los circuitos de recompensa del cerebro, aumenta notablemente en respuesta a las imágenes de los alimentos3, y la terapia de reemplazo de leptina atenúa tanto la actividad estriatal como el 'gusto' autoinformado por la comida3 . Esto sugiere que el cuerpo estriado es importante en los aspectos hedónicos de la conducta alimentaria. Recientemente se demostró que la activación del cuerpo estriado en respuesta a alimentos muy apetecibles se atenúa en individuos obesos en comparación con los controles delgados4. Además, la hipofunción del cuerpo estriado dorsal y el aumento de peso a largo plazo son más pronunciados en individuos con el alelo TaqIA del locus del gen DRD2-ANKK1, lo que da como resultado una disminución de la expresión de D2R estriatal y se ha demostrado que predispone a los individuos a trastornos por dependencia de sustancias4, 5. Estas y otras observaciones similares han llevado a la propuesta de que los déficits en el procesamiento de la recompensa pueden ser un factor de riesgo importante para el desarrollo de la obesidad y que los individuos obesos pueden consumir compulsivamente alimentos sabrosos para compensar la hiposensibilidad de la recompensa6. En particular, no está claro si los déficits en el procesamiento de la recompensa son constitutivos y preceden a la obesidad, o si el consumo excesivo de alimentos sabrosos puede generar disfunción de la recompensa y contribuir así a la obesidad inducida por la dieta.

Una característica definitoria de los individuos con sobrepeso y obesos es que continúan comiendo en exceso a pesar de las consecuencias negativas y sociales bien conocidas. De hecho, muchas personas con sobrepeso expresan el deseo de limitar su consumo de alimentos, pero luchan por controlar su consumo y consumen repetidamente más allá de sus requerimientos de energía 7, 8. El desarrollo de un comportamiento de alimentación que es insensible al resultado negativo es análogo al comportamiento compulsivo de consumo de drogas observado en los adictos a las drogas humanas, que es igualmente impermeable a las consecuencias negativas 9. Aquí investigamos los efectos del acceso extendido a una dieta rica en grasas aceptable para la sensibilidad de los sistemas de recompensa cerebral en ratas. También examinamos el vínculo entre la desregulación hedónica inducida por la dieta y la aparición de la búsqueda compulsiva de alimentos. Finalmente, investigamos el papel de los D2R estriatales en estas respuestas de comportamiento similares a las de las adicciones.

Déficit similar a la adicción en las ratas obesas

Para probar los efectos del acceso restringido o extendido a una dieta rica en grasas apetitosa, preparamos ratas Wistar macho (300-350 g) con un electrodo estimulante bipolar en el hipotálamo lateral y las entrenamos durante 10-14 d en una prueba discreta procedimiento de recompensa de estimulación cerebral de umbral actual (BSR) hasta que se establecieron umbrales de recompensa estables4. En el procedimiento BSR, las ratas responden enérgicamente para obtener una autoestimulación eléctrica gratificante a través del electrodo de estimulación permanente, con la mínima intensidad de estimulación que mantiene la conducta de autoestimulación denominada umbral de recompensa10. Debido a que los umbrales de recompensa permanecen estables e inalterados durante períodos prolongados en las condiciones iniciales, este procedimiento proporciona una medida sensible de la capacidad de respuesta de los sistemas de recompensa del cerebro. Después del establecimiento de umbrales de BSR estables (definidos como una variación <10% en los umbrales en tres sesiones consecutivas), asignamos ratas a tres grupos que no mostraron diferencias en los pesos corporales medios o los umbrales de recompensa entre los grupos. A los tres grupos se les dio acceso diferencial a una dieta 'estilo cafetería' que consistía en alimentos sabrosos ricos en energía fácilmente disponibles para el consumo humano (ver Métodos en línea). Las ratas tuvieron 0 h (ratas de solo comida; n = 9), 1 h (ratas de acceso restringido; n = 11) o 18-23 h (ratas de acceso extendido; n = 11) acceso a la dieta por día para 40 días consecutivos. Se sabe que las dietas de cafetería provocan obesidad inducida por la dieta en ratas11. Todas las ratas también tuvieron acceso ad libitum a la comida de laboratorio estándar, con umbrales de recompensa, aumento de peso e ingesta calórica registrada en todo momento.

El peso aumentó notablemente en ratas con acceso extendido a la dieta de la cafetería en comparación con los grupos de solo acceso o acceso restringido (Fig. 1a). El peso también tendió a aumentar en las ratas de acceso restringido en comparación con las ratas chow-only, pero este efecto no alcanzó significación estadística. El desarrollo de la obesidad en ratas de acceso extendido se asoció estrechamente con un empeoramiento del déficit en la función de recompensa cerebral, que se refleja en umbrales de BSR progresivamente elevados (Fig. 1b). Debido a que no se observaron diferencias en las latencias de respuesta para BSR entre los tres grupos (Fig. 1 complementaria), los déficits en el comportamiento del comportamiento no pueden explicar esta observación. Se han reportado deficiencias similares en la función de recompensa cerebral en ratas con acceso extendido pero no restringido a la autoadministración intravenosa de cocaína o heroína 12, 13, 14. Por lo tanto, el acceso extendido a alimentos sabrosos y ricos en grasas puede inducir déficits similares a la adicción en la función de recompensa cerebral, considerada una fuente importante de motivación que puede conducir a comer en exceso y contribuir al desarrollo de la obesidad1, 6.

Figura 1: Aumento de peso y disfunción de la recompensa en ratas con acceso extendido a una dieta de cafetería.

(a) Aumento de peso medio (± sem) en ratas de acceso restringido, acceso restringido y acceso extendido (interacción de acceso × día: F39,702 = 7.9, P <0.0001; * P <0.05 en comparación con el grupo de solo comida, prueba post hoc). (b) Cambio porcentual medio (± sem) desde los umbrales de recompensa iniciales (interacción de acceso × tiempo: F78,1092 = 1.7, P <0.0005; * P <0.05 en comparación con el grupo de solo comida, prueba post hoc).

Cuando examinamos en detalle el comportamiento de la alimentación (Fig. 2), encontramos que la ingesta calórica diaria total fue similar entre las ratas de solo acceso y de acceso restringido (Fig. 2a, d). Por el contrario, la ingesta calórica total en ratas con acceso extendido fue casi el doble que la de las ratas de acceso restringido y de solo comida (Fig. 2a, d). Aunque las ratas de acceso restringido y solo chow mantuvieron aproximadamente la misma ingesta calórica diaria (Fig. 2a, d), las ratas de acceso restringido obtuvieron solo el ~ 33% de sus calorías diarias del chow (Fig. 2b, d), lo que indica que desarrollaron un comportamiento de alimentación similar al del atracón y consumieron ~ 66% de su ingesta calórica diaria durante su sesión de acceso a 1 h en la cafetería diet15 (Fig. 2d). Las ratas de acceso extendido obtuvieron solo una pequeña fracción (~ 5%) de su ingesta calórica total del chow (Fig. 2b); consumieron la dieta de la cafetería casi exclusivamente (Fig. 2d). El cambio en la preferencia dietética en los grupos de acceso restringido y extendido también se reflejó en un aumento marcado en la ingesta de grasa en comparación con las ratas chow-only (Fig. 2c y Fig. Suplementaria 2). De acuerdo con los informes anteriores de 16, hubo una tendencia a que el consumo de la dieta de la cafetería disminuya con el tiempo en las ratas de acceso extendido. Esto puede reflejar el desarrollo de la tolerancia a la palatabilidad de los alimentos provistos como parte de la dieta de la cafetería a lo largo del tiempo. Sin embargo, la preferencia por la dieta de la cafetería en comparación con el chow estándar se mantuvo sistemáticamente alta en estas ratas (Fig. Complementaria 3). Estos datos demuestran que el acceso extendido pero no restringido a una dieta rica en grasas apetecible induce déficits de recompensa similares a la adicción, la ingesta excesiva y la pérdida del equilibrio de energía homeostática. Por el contrario, el acceso restringido a alimentos sabrosos da lugar a patrones de consumo similares a los atracones, pero no altera el equilibrio de la energía homeostática ni la función de recompensa del cerebro. Sin embargo, es posible que el acceso restringido a la dieta de la cafetería durante más de 40 días consecutivos provoque un aumento de peso significativo y una interrupción de la función de recompensa cerebral.

Figura 2: Patrones de consumo en ratas con acceso extendido a una dieta de cafetería.

(a) Ingesta calórica diaria media (± sem) en ratas de acceso restringido, acceso restringido y acceso extendido (acceso: F1,324 = 100.6, P <0.0001; tiempo: F18,324 = 7.8, P <0.0001; acceso × interacción de tiempo: F18,324 = 4.6, P <0.0001; * P <0.05 en comparación con el grupo de solo comida, prueba post hoc). (b) Ingesta calórica diaria media (± sem) de la comida (acceso: F2,504 = 349.1, P <0.0001; tiempo: F18,504 = 5.9, P <0.0001; interacción acceso × tiempo: F36,504 = 3.52, P <0.0001; * P <0.05 en comparación con el grupo de solo comida, prueba post hoc). (c) Ingesta calórica diaria media (± sem) de grasas (acceso: F2,486 = 118.7, P <0.0001; tiempo: F18,486 = 8.8, P <0.0001; interacción acceso × tiempo: F36,486 = 6.2, P <0.0001; * P <0.05 en comparación con el grupo de solo comida, prueba post hoc). (d) Comparación de la ingesta calórica total media (± sem) y las calorías consumidas exclusivamente de la comida, durante todo el período de acceso de 40 días (acceso: F2,54 = 25.0, P <0.0001; fuente de calorías: F2,54 = 1235.2, P <0.0001; interacción acceso × fuente de calorías: F2,54 = 485.7, P <0.0001; *** P <0.001 en comparación con el total de calorías en el grupo de solo comida, ### P <0.001 en comparación con el total de calorías en el mismo grupo de ratas, prueba post hoc).

Después de 40 d, a las ratas ya no se les permitió el acceso a la dieta apetecible, pero continuaron teniendo acceso ad libitum a la comida estándar de laboratorio. Evaluamos los umbrales de recompensa y el consumo diario de comida durante este período de "abstinencia" obligatorio. Las elevaciones en los umbrales de recompensa persistieron durante al menos 2 semanas en las ratas de acceso extendido cuando ya no tenían acceso a la dieta apetecible (Fig. 3a). Esto contrasta con los déficits relativamente transitorios (~ 48 h) en la función de recompensa reportados en ratas sometidas a abstinencia de cocaína autoadministrada13. También hubo una marcada disminución en la ingesta calórica (Fig.3b) y una disminución gradual en el peso corporal (Fig.3c) en ratas de acceso extendido, y en menor grado en ratas de acceso restringido, durante este período de abstinencia, consistente con informes anteriores11, 15. Después de 14 d de abstinencia, se sacrificaron ratas y se determinó la colocación de electrodos mediante tinción con violeta de cresilo (Fig. 3d).

Figura 3: disfunción de la recompensa persistente e hipofagia durante la abstinencia en ratas con acceso extendido a una dieta de cafetería.

(a) Cambio porcentual medio desde los umbrales de recompensa iniciales (± sem) durante la abstinencia de una dieta rica en grasas apetitosa (acceso: F2,112 = 3.7, P <0.05; tiempo: F4,112 = 2.3, P> 0.05; * P <0.05 en comparación con el grupo de solo comida, prueba post hoc). (b) Ingesta calórica media (± sem) en el último día de acceso a la dieta alta en grasas (línea de base) y durante los 14 días de abstinencia cuando solo se disponía de comida estándar (acceso: F2,168 = 41.7, P <0.0001 ; tiempo: F6,168 = 65.6, P <0.0001; interacción de acceso × tiempo: F12,168 = 38.3, P <0.0001; * P <0.05 comparado con el grupo de solo comida, prueba post hoc). (c) Cambio en el peso corporal medio (± sem) en comparación con el peso corporal en el último día de acceso a la dieta alta en grasas (línea de base) y durante los 14 días de abstinencia cuando solo se disponía de comida estándar (acceso: F1,126 = 37.2, P <0.0001; tiempo: F7,126 = 3.1, P <0.01; interacción acceso × tiempo: F7,126 = 40.9, P <0.0001; * P <0.05 en comparación con el grupo de solo comida, prueba post hoc). (d) Reconstrucción histológica de la ubicación de los electrodos estimulantes de BSR en el hipotálamo lateral de ratas de solo comida (triángulos), acceso restringido (cuadrados) y acceso extendido (círculos).

D2R estriatales en ratas obesas: papel en los déficits de recompensa

A continuación, probamos la hipótesis de que el consumo excesivo de una dieta de cafetería agradable podría reducir la densidad D2R estriatal, lo que contribuye al desarrollo de una hiposensibilidad de recompensa similar a la adicción. Se permitió el acceso a la dieta de la cafetería a una nueva cohorte de ratas de acceso restringido y de acceso extendido solamente hasta que hubo un aumento estadísticamente significativo en el peso corporal en las ratas de acceso extendido en comparación con el grupo de solo alimento (P <0.05 ; Figura 4a). La expresión estriatal de la forma unida a la membrana supuestamente muy glicosilada (~ 70 kDa) del D2R fue menor en las ratas de acceso extendido que en las ratas de acceso restringido o que solo comen (Fig. 4b; ver Métodos en línea). Cuando dividimos las ratas en cada grupo de acceso en dos subgrupos sobre la base de una división mediana de los pesos corporales (ligeros o pesados), encontramos una clara relación inversa entre el peso corporal y la expresión de D2R estriatal (Fig. 4a, c). No detectamos disminuciones estadísticamente significativas en la expresión de las formas inmaduras no glicosiladas (~ 39 kDa) y citoplásmicas intermediamente glicosiladas (~ 51 kDa) de la D2R (Fig.4 complementaria) 17, lo que indica que la expresión de D2R estriatal en ratas de acceso extendido es probablemente regulado mediante mecanismos postranscripcionales.

Figura 4: el aumento de peso está inversamente relacionado con los niveles de D2R del cuerpo estriado.

(a) Las ratas de solo comida, acceso restringido y acceso extendido se subdividieron en dos grupos por condición de acceso en función de una división media de los pesos corporales: ligeras (L) o pesadas (H). (b) Se recogió todo el complejo estriado de todas las ratas y se midieron los niveles de D2R en cada grupo mediante transferencia Western. La banda D2R asociada a la membrana se resolvió a 70 kDa y el control de carga de proteína se muestra a continuación (β-actina, 43 kDa). Las inmunotransferencias de longitud completa se muestran en la Figura 12 complementaria. (C) Las cantidades relativas de D2R en el cuerpo estriado de ratas de acceso restringido y de acceso extendido se cuantificaron mediante densitometría (F2,6 = 5.2, P <0.05, main efecto del acceso; * P <0.05 y ** P <0.01 en comparación con el grupo L de comida solamente).

A continuación, para probar la relevancia funcional de las reducciones inducidas por la dieta en D2R estriatal a la función de recompensa cerebral, diseñamos y validamos un vector lentiviral para administrar un ARN de interferencia corto (shRNA) para derribar D2R (Lenti-D2Rsh; Fig. 5 y Fig. Suplementaria 5). Los umbrales de recompensa comenzaron a aumentar en ratas tratadas con Lenti-D2Rsh casi inmediatamente después de que se permitiera el acceso extendido a la dieta de la cafetería, mientras que los umbrales de recompensa permanecieron inalterados en ratas de acceso extendido tratadas con un vector de lentivirus vacío (Lenti-control) durante un período relativamente corto de acceso a la dieta de la cafetería (14 d; Fig. 6a). Las latencias de respuesta no se alteraron en ambos grupos de ratas, lo que demuestra que este efecto no fue secundario a los déficits en el desempeño de la tarea (Fig. Suplementaria 6). Los umbrales de recompensa tampoco se modificaron en ratas tratadas con Lenti-D2Rsh o Lenti-control que tuvieron acceso a comida solo durante el mismo período (Fig. 6b).

Los umbrales se mantuvieron persistentemente elevados durante un 15 d adicional de abstinencia cuando todas las ratas tuvieron acceso solo al chow estándar (Fig. Suplementaria 7). El derribo de D2R estriado incrementó la vulnerabilidad a la función de recompensa inducida por la dieta, pero no alteró la actividad de referencia de los sistemas de recompensa cerebral.

Figura 5: Desglose mediado por lentivirus de la expresión D2R estriatal.

(a) Representación gráfica de las áreas estriatales en las que se sobreexpresó Lenti-D2Rsh. Los círculos verdes en el hemisferio estriado izquierdo representan los lugares a los que se dirigieron las infusiones virales. La tinción verde en el hemisferio estriado derecho es una tinción inmunoquímica representativa para la proteína verde fluorescente (GFP) del cerebro de una rata Lenti-D2Rsh. (b) Inmunotransferencia representativa de la expresión de D2R disminuida en el cuerpo estriado de ratas Lenti-D2Rsh. Las inmunotransferencias completas se muestran en la Figura 13 complementaria. (C) Cantidades relativas de D2R en el cuerpo estriado de ratas Lenti-control y Lenti-D2Rsh, cuantificadas por densitometría (* P <0.05 en comparación con el grupo Lenti-control, prueba post hoc ). (d) No se detectó infección de células gliales en el cuerpo estriado por el vector Lenti-D2Rsh. La tinción verde es GFP de virus; el rojo es la proteína ácida fibrilar glial marcadora de astrocitos (GFAP); Los núcleos celulares se destacan mediante tinción DAPI en azul. Las flechas blancas indican un área localizada de gliosis que se encuentra solo en el sitio de inyección del virus en el cuerpo estriado y no en los tejidos circundantes en los que se ha difundido el virus. Incluso en esta área, ninguno de los astrocitos es positivo para GFP. Las flechas amarillas en la imagen ampliada resaltan los astrocitos típicos negativos para GFP que se detectaron. (e) Altos niveles de infección neuronal en el cuerpo estriado por el vector Lenti-D2Rsh. La tinción verde es GFP de virus; el rojo es el marcador nuclear neuronal NeuN; Los núcleos celulares se destacan mediante tinción DAPI en azul. Las flechas amarillas en la imagen ampliada resaltan las neuronas positivas para GFP y NeuN positivas en el cuerpo estriado. (f) Una imagen de mayor aumento de una neurona infectada por virus (positiva para GFP) en el cuerpo estriado de ratas Lenti-D2Rsh que muestra las características morfológicas típicas de neuronas espinosas medianas.

Figura 6: El derribo de D2R estriado aumenta la vulnerabilidad para recompensar la disfunción en ratas con acceso extendido a una dieta de cafetería.

(a) Cambio porcentual medio (± sem) desde los umbrales de recompensa iniciales en ratas Lenti-control y Lenti-D2Rsh que tuvieron acceso prolongado a la dieta de cafetería durante 14 días consecutivos (virus: F1,156 = 5.9, P <0.05; tiempo: F13,156 = 2.2, P <0.05; interacción virus × tiempo: F13,156 = 2.2, P <0.05; #P <0.05, efecto de interacción). (b) Cambio porcentual medio (± sem) desde los umbrales de recompensa de la línea de base en ratas Lenti-control y Lenti-D2Rsh que tenían acceso solo para comer. (c) Ingesta calórica media (± sem) de las ratas durante 14 días de solo comida o acceso extendido (acceso: F2,28 = 135.6, *** P <0.0001). (d) Aumento de peso medio (± sem) durante 14 d de solo comida o acceso extendido (acceso: F2,28 = 96.4, P <0.0001; *** P <0.001, efecto principal del acceso).

Encontramos que la ingesta calórica (Fig. 6c) y el aumento de peso (Fig. 6d) fueron similares en Lenti-D2Rsh y en los grupos de control de Lenti correspondientes en condiciones de solo-chow o de acceso extendido (Fig. Suplementarias 8 y 9). Por lo tanto, la caída del D2R estriatal no alteró la preferencia por la dieta de la cafetería ni la ingesta total de calorías cuando los alimentos sabrosos estaban disponibles para el consumo.

Alimentación compulsiva en ratas obesas: papel del D2R estriatal

A continuación, probamos la hipótesis de que la alimentación de tipo compulsivo podría surgir en ratas con acceso extendido a la dieta de la cafetería y que los déficits en la señalización D2R estriatal podrían contribuir a este efecto. A una nueva cohorte de ratas de acceso restringido y de acceso extendido solo se les permitió el acceso a la dieta de la cafetería durante> 40 días hasta que ocurrieron aumentos de peso estadísticamente significativos en las ratas extendidas (P <0.05 en comparación con las ratas de solo alimento; los datos no mostrado). A los tres grupos de ratas se les permitió solo 30 minutos por día de acceso a la dieta de la cafetería durante 5-7 días en una cámara operante hasta que se logró una ingesta estable (definida como una variación <10% en la ingesta diaria). La mitad de las ratas en cada condición de acceso luego fueron expuestas a una luz (estímulo condicionado) emparejada con la administración de descargas en las patas (grupo castigado), mientras que las ratas restantes en cada grupo fueron expuestas a la luz de señal en ausencia de descarga en las patas (grupo impune ). El día de la prueba, examinamos los efectos de la exposición a la luz de señal sola sobre el consumo de alimentos sabrosos (Fig. 7; ver Métodos en línea). Descubrimos que la ingesta calórica media durante las sesiones de referencia de 30 minutos fue mayor en las ratas de acceso restringido y solo para comer que en las ratas de acceso extendido (Fig. 7a, b). Esto sugiere que las ratas de acceso restringido y de solo comida se atragantaron con el alimento sabroso durante las sesiones de acceso intermitentes de 30 minutos, lo que se refleja en el hecho de que estas ratas consumieron ~ 40-50% de su ingesta calórica diaria, típicamente ~ 100 kCal, durante estas sesiones (Fig. 7a, b). Por el contrario, las ratas de acceso extendido parecen resistentes a desarrollar este comportamiento de alimentación similar a un atracón, tal vez porque su historial de acceso casi ilimitado a la comida sabrosa durante más de 40 días consecutivos estableció patrones de alimentación que eran relativamente inflexibles al cambio. En el día de la prueba, no observamos efectos estadísticamente significativos de la repetición de la luz de señal sobre el consumo de alimentos en las ratas impunes de los grupos de solo comida, acceso restringido o acceso extendido en comparación con la ingesta durante el período inicial (Fig. 7a). Por lo tanto, la luz de señal por sí sola no tenía relevancia motivacional. En ratas castigadas, la luz indicadora emparejada por choque disminuyó significativamente la ingesta de alimentos sabrosos en las ratas de acceso restringido y solo para comer. Sin embargo, la luz indicadora no tuvo ningún efecto sobre la ingesta de alimentos apetitosos en las ratas de acceso extendido, lo que demuestra que su consumo era insensible a las señales ambientales aversivas que predecían la adversidad. La ingesta de energía de referencia en las ratas de acceso extendido fue menor que en los otros grupos. Sin embargo, debido a que la ingesta de pienso durante períodos de tiempo similares fue mucho menor (Fig. 7d), es poco probable que esto represente un "efecto piso" que confunda nuestros hallazgos. Juntos, nuestros datos apoyan la idea de que la conducta alimentaria de tipo compulsivo puede surgir en ratas de acceso extendido de una manera análoga a la ingesta compulsiva de cocaína observada en ratas con un historial de acceso prolongado a la droga18.

Figura 7: respuesta de tipo compulsivo para alimentos sabrosos.

(a) Consumo medio (± sem) de dieta apetecible en ratas no castigadas durante las sesiones de referencia de 30 minutos y en el día de la prueba cuando las ratas fueron expuestas a un estímulo condicionado neutro que no se emparejó previamente con un golpe nocivo en el pie (acceso: F2,20 = 5.2, P <0.05; #P <0.05 en comparación con ratas que solo comen). (b) Consumo medio (± sem) de dieta apetecible en ratas castigadas durante las sesiones de referencia de 30 minutos y en el día de la prueba cuando las ratas fueron expuestas a un estímulo condicionado que se emparejó previamente con un golpe nocivo en la pata (acceso: F2,21 = 3.9 , P <0.05; señal: F1,21 = 8.6, P <0.01; interacción acceso × señal: F2,21 = 4.7, P <0.05; * P <0.05 en comparación con la ingesta durante la sesión inicial, #P <0.05 en comparación con ratas solo para comer). (c) Consumo medio (± sem) de dieta apetecible durante las sesiones de referencia de 30 minutos y el día de la prueba en ratas Lenti-control y Lenti-D2Rsh que previamente tenían acceso extendido o solo para comer a una dieta de cafetería (señal: F1,26, 29.7 = 0.0001, P <0.05; * P <0.01, ** P <30 en comparación con la ingesta durante las sesiones de referencia, prueba post hoc). (d) Consumo medio (± sem) de comida durante las sesiones de referencia de 2 minutos y en el día de la prueba en ratas Lenti-control y Lenti-D1,26Rsh que previamente solo tenían comida o acceso prolongado a una dieta de cafetería (señal: F44.9 = 0.0001, P <0.05; * P <0.01, ** P <XNUMX en comparación con la ingesta durante las sesiones de referencia, prueba post hoc).

Finalmente, examinamos los efectos del estímulo condicionado emparejado con castigo sobre la ingesta de alimentos en las ratas Lenti-control y Lenti-D2Rsh que previamente habían tenido acceso a comida solamente o acceso extendido a la dieta de la cafetería (ratas de la Figura 6). Descubrimos que la ingesta inicial de alimentos apetitosos durante las sesiones iniciales de 30 minutos fue igualmente alta (~ 40 kCal) en los cuatro grupos (Fig. 7c). Además, el consumo diario total de pienso (en la jaula doméstica) fue similar entre los cuatro grupos de ratas durante las sesiones de acondicionamiento y el día de la prueba (Fig. 10 complementaria). Por lo tanto, los 14 días de acceso previo a la dieta de la cafetería no fueron suficientes para bloquear el comportamiento de atracón de una manera similar a la observada en ratas que tenían> 40 d de acceso prolongado a la dieta de la cafetería (Fig. 7a, b). El estímulo de luz de señal aversiva interrumpió la ingesta de alimentos apetitosos en ratas Lenti-control y Lenti-D2Rsh que anteriormente tenían acceso solo para comer (Fig. 7c). De manera similar, el estímulo condicionado aversivo interrumpió la ingesta de alimentos apetitosos en las ratas Lenti-control que previamente tenían un acceso prolongado de 14 días a la dieta de la cafetería. Por el contrario, el estímulo condicionado aversivo no tuvo ningún impacto en el consumo de alimentos apetitosos en las ratas Lenti-D2Rsh que previamente tenían un acceso extendido de 14 días a la dieta de la cafetería (Fig. 7c). Los umbrales de BSR permanecieron significativamente elevados en estas ratas cuando se registraron 48 h después de la sesión de prueba, mientras que los umbrales permanecieron estables e inalterados en los otros tres grupos de ratas.

(Fig. Complementaria 11). Para verificar que la resistencia a la supresión inducida por estímulos condicionados de la ingesta de alimentos sabrosos en ratas de acceso extendido Lenti-D2Rsh no fue secundaria a alteraciones en los procesos de condicionamiento clásico, probamos los efectos del estímulo condicionado aversivo en el consumo de alimentos estándar menos sabrosos. Los cuatro grupos de ratas. En contraste con el consumo excesivo de alimentos sabrosos, encontramos que los cuatro grupos de ratas consumieron poco chow (~ 2 kCal) durante las sesiones de línea de base mínimas de 30 (Fig. 7d) y que la ingesta de chow se interrumpió en los cuatro grupos por una magnitud similar al exponerse al estímulo condicionado aversivo (Fig. 7d). Estos datos demuestran que el derribo de los D2R estriatales aceleró notablemente la aparición de alimentos de sabor agradable como compulsivo, pero solo en ratas con un historial de acceso extendido. Además, debido a que la alimentación compulsiva se detectó solo en ratas Lenti-D2Rsh que tenían umbrales BSR elevados, la hipofunción de recompensa inducida por la dieta puede ser un antecedente necesario para la búsqueda compulsiva de alimentos.

Discusión

La facilidad de acceso a alimentos sabrosos ricos en grasa se considera un factor de riesgo ambiental importante para la obesidad 19. Encontramos que el acceso extendido a una dieta de estilo cafetería altamente apetecible resultó en comer en exceso y ganar peso, junto con elevar progresivamente los umbrales de BSR en ratas. Este efecto en los umbrales de BSR puede explicarse por la disminución gradual de la capacidad de respuesta de los circuitos de recompensa cerebral, una interpretación consistente con el hecho de que la restricción de alimentos y la pérdida de peso pueden aumentar 20, mientras que la sobrealimentación aguda puede disminuir transitoriamente 21, respondiendo por BSR en ratas. Este hallazgo representa una extensión del trabajo que muestra que la sobrealimentación aguda de ratas a través de un tubo de alimentación intragástrica 21, y la distensión gástrica o la infusión intravenosa de glucagón que imita la saciedad postprandial 22, 23, 24, disminuye la respuesta para recompensar la hipotensión lateral BSR y aumenta las respuestas de aversión a la la estimulación xnumx. Trabajos anteriores también han demostrado que las ratas que se alimentan por la fuerza repetidamente a través de tubos intragástricos hasta que su peso ha aumentado en ~ 25 g disminuyen de manera similar las tasas de respuesta para BSR, un efecto que persiste hasta que el peso corporal se normalice en 200. Al igual que en estos hallazgos en ratas, la respuesta en gatos por vía hipotalámica lateral fue inhibida por la alimentación previa a saciedad 23, lo que demuestra que las interacciones entre la función de recompensa cerebral y el estado metabólico se conservan y, por lo tanto, es probable que también ocurran en humanos. La facilidad de acceso y el consumo excesivo de las dietas estilo cafetería en humanos se considera un importante contribuyente ambiental a la actual epidemia de obesidad en las sociedades occidentales 26. Nuestros datos muestran que la hipofunción de la recompensa surge en ratas que comen de forma voluntaria una dieta de cafetería apetitosa similar a la que consumen los humanos y que este efecto empeora progresivamente a medida que aumentan de peso. Notablemente, todas las ratas con elevaciones de umbral de recompensa ≥19% tenían electrodos BSR ubicados dentro de ~ 20 μm del fornix dorsolateral. La sensibilidad de las neuronas relacionadas con la recompensa en esta área se ve aumentada por la restricción de alimentos de una manera que es sensible a la hormona leptina derivada de la grasa, y esta región del cerebro se considera un sustrato importante para la recompensa de los alimentos 500. Los circuitos cerebrales que regulan los alimentos hedónicos se inhiben por medio de la publicación de señales predictivas que predicen la saciedad, de acuerdo con estudios de imágenes humanos recientes que muestran que la distensión gástrica 27 y el péptido factor postprandial derivado del intestino YY28-3 (PYY) 36 modulan la actividad de las regiones del cerebro involucrado en el procesamiento de recompensas. Además, los sistemas de recompensa también son inhibidos por el aumento de peso excesivo. Informes recientes indican que la leptina circulante, un regulador clave del balance energético, puede penetrar en los tejidos cerebrales e inhibir la actividad de los circuitos de recompensa 29, 3, 27, 30.

Los déficits de recompensa en ratas con sobrepeso pueden reflejar disminuciones contraadaptativas en la sensibilidad de base de los circuitos de recompensa del cerebro para oponerse a su sobreestimulación por comida apetecible. Dicha hipofunción de recompensa inducida por la dieta puede contribuir al desarrollo de la obesidad al aumentar la motivación para consumir dietas 'obesogénicas' de alta recompensa para evitar o aliviar este estado de recompensa negativa6, 32. Esto podría explicar la hipofagia que observamos en ratas y, en menor grado, en ratas de acceso restringido cuando se retiró la comida apetecible y solo se disponía de la menos apetecible. Tal escenario también es consistente con los datos de estudios de imágenes del cerebro humano en los que la activación atenuada del cuerpo estriado en respuesta a alimentos muy apetecibles, particularmente en individuos con polimorfismos genéticos que se cree que disminuyen la expresión de D2R estriatal, se asocia con un aumento de peso a largo plazo4. No está claro si tal hiposensibilidad a la recompensa en individuos obesos se manifiesta antes del desarrollo de la obesidad y está relacionada únicamente con factores genéticos ("síndrome de deficiencia de recompensa") o si comer en exceso puede causar una interrupción en el procesamiento de la recompensa. Nuestros datos demuestran que el acceso extendido a alimentos sabrosos de alta energía y la posterior ingesta excesiva embota la sensibilidad y, por lo tanto, pueden representar un importante mecanismo hedónico que promueve el desarrollo de la obesidad. Una disfunción de recompensa similar a la reportada aquí en ratas obesas también se detecta en ratas con antecedentes de acceso extendido a la autoadministración de cocaína o heroína por vía intravenosa, pero no en aquellas con antecedentes de acceso restringido12, 13, 14. Además, la transición de Se ha propuesto que la búsqueda de drogas de casual a compulsiva es el resultado de un intento de aliviar el estado persistente de recompensa disminuida inducida por esta disfunción de recompensa inducida por drogas12, 32, 33. Por lo tanto, nuestros datos indican que la obesidad y la adicción a las drogas pueden compartir mecanismos hedónicos subyacentes.

La regulación a la baja de la expresión de D2R estriatal es una respuesta neuroadaptativa notable al consumo excesivo de alimentos sabrosos. De hecho, las reducciones en la densidad de D2R estriatal se observan en individuos con sobrepeso 4, 34 y rodents35, 36. A la inversa, los individuos con anorexia nerviosa tienen D2R37 estriado elevado, y la pérdida de peso en individuos obesos después de la cirugía bariátrica (bypass gástrico) se asocia con una mayor densidad de D2R del estriado28. El polimorfismo del gen conocido como el alelo TaqIA A1 da como resultado una disminución de la densidad del D2R del cuerpo estriado, y los individuos que albergan este alelo están representados en exceso en las poblaciones obesas4. El alelo TaqIA también aumenta la vulnerabilidad al alcohol, opioides y adicción a los estimulantes psicomotores38. Las reducciones en la densidad de D2R del estriado, ya sea a través de factores genéticos constitutivos o como consecuencia de comer en exceso, pueden contribuir a los mecanismos neurobiológicos de la obesidad. Encontramos que los niveles estriatales de la isoforma 70 kDa D2R, que se cree refleja el D2R asociado a la membrana, se relacionaron inversamente con el peso corporal en ratas de los grupos de solo acceso, acceso restringido y acceso extendido (Fig. 4). La caída de la expresión de D2R estriatal, más prominente en el estriado dorsolateral (Fig. 5), causó que los umbrales de BSR aumentaran casi inmediatamente después de la exposición a la dieta de la cafetería. La disminución de la expresión de D2R estriatal aceleró rápidamente la aparición de la función hipofunción de recompensa en ratas con acceso extendido a alimentos altamente sabrosos, un hallazgo consistente con los datos de imágenes del cerebro humano que indican que los déficit en la densidad de D2R estriatal contribuyen a recompensar la función hipofunción en individuos obesos

Tres características de las ratas Lenti-D2Rsh también son dignas de mención. Primero, aunque la eliminación del D2R estriado combinada con el acceso extendido a la dieta sabrosa dio como resultado elevar los umbrales de BSR, no hubo diferencias en la ingesta calórica o el aumento de peso en estas ratas en comparación con las ratas de control. Esto podría reflejar el hecho de que las ratas solo tenían 14 d de acceso a la dieta de la cafetería; períodos de acceso más largos podrían haber resultado en un mayor aumento de peso con el tiempo, de manera similar a la mayor susceptibilidad al aumento de peso observada en humanos con déficits en la señalización de D2R del estriado 4. Sin embargo, la ventaja de limitar el acceso a la dieta de la cafetería a solo 14 d es que las ratas de caída con acceso extendido fueron el único grupo que mostró umbrales de BSR elevados, y esto nos permitió evaluar el papel potencial de la función de recompensa en el desarrollo compulsivo comiendo (ver más abajo). En segundo lugar, los umbrales de BSR se mantuvieron estables e inalterados en las ratas de caída que solo tuvieron acceso al chow. Esto indica que la expresión reducida de D2R estriatal por sí sola no fue suficiente para inducir la hiposensibilidad de la recompensa; en cambio, parecía interactuar con el consumo excesivo de alimentos sabrosos para acelerar la aparición de este estado de sensibilidad reducida en la recompensa. Otras respuestas de adaptación en los circuitos de recompensa cerebral podrían, por lo tanto, desencadenar la hiposensibilidad de la recompensa en ratas con acceso extendido a la dieta de la cafetería. Teniendo esto en cuenta, observamos que el agonista de D2R bromocriptina reduce los niveles circulantes de leptina39, y la leptina inhibe la alimentación al menos en parte al inhibir las regiones estriatales que controlan las respuestas hedónicas a los alimentos XUMX, 3, 30. Por lo tanto, es posible que la regulación a la baja de D31R estriado en respuesta al aumento de peso corporal aumente la señalización de leptina y, por lo tanto, aumente los efectos inhibitorios de esta adipocina en los sistemas de recompensa cerebral. Finalmente, notamos que dirigimos nuestros vectores de lentivirus hacia el estriado dorsolateral. Esto se debió principalmente a razones técnicas, ya que la colocación lateral de las cánulas para la administración del virus en el cuerpo estriado nos permitió también acomodar el electrodo de estimulación hipotalámica permanente para la determinación del umbral de BSR. Por lo tanto, es posible que la selección de D2R para derribar en otras áreas del cuerpo estriado, particularmente en las áreas dorsomedial y ventral (núcleo y cáscara del núcleo accumbens), tenga umbrales BSR elevados incluso en ausencia de una dieta aceptable.

El cuerpo estriado dorsolateral ha estado fuertemente implicado en el aprendizaje del tipo de hábitos de estímulo-respuesta, como se refleja en el desarrollo de un comportamiento consumatorio que es insensible a la devaluación por alimentación previa a la saciedad o por apareamiento con estímulos nocivos40. Al apuntar predominantemente al cuerpo estriado dorsolateral, podríamos haber derribado poblaciones de D2R que regulan la vulnerabilidad de la rata al desarrollo de una alimentación compulsiva. De acuerdo con el papel de los D2R estriatales en las conductas compulsivas, el alelo TaqIA del locus del gen DRD2-ANKK1 humano, que da como resultado una densidad D2R estriatal baja5, atenúa la activación estriatal en respuesta a alimentos sabrosos4 y aumenta la vulnerabilidad a la obesidad4, también se asocia con déficits en el aprendizaje para evitar acciones con consecuencias negativas 41. La pérdida del control inhibitorio sobre el comportamiento que puede tener un resultado negativo es un rasgo característico tanto de la obesidad como de la adicción a las drogas, en el que los comportamientos consumatorios persisten a pesar de las consecuencias sociales, sanitarias o económicas negativas. El comportamiento de consumo de cocaína en ratas con antecedentes de consumo excesivo de drogas puede volverse inflexible y resistente a la interrupción por un estímulo condicionado aversivo que predice un resultado negativo (choque en el pie) 18. Del mismo modo, los ratones que anteriormente tenían acceso a una dieta rica en grasas apetitosa pasarán más tiempo en un ambiente aversivo (iluminado con mucha luz) para obtener la comida apetitosa que los ratones que no tenían experiencia con la dieta42. Encontramos que el consumo de alimentos apetitosos en ratas con acceso extendido a la dieta de la cafetería era igualmente insensible a un estímulo condicionado aversivo. De acuerdo con un papel de los D2R estriatales en este efecto, se encontró una alimentación de tipo compulsivo en las ratas derribadas del D2R estriado que previamente tenían un acceso prolongado de 14 días a la dieta de la cafetería, pero no en los grupos de control. Desde una perspectiva de neurocircuitos, el acceso extendido a alimentos apetitosos podría desencadenar plasticidad en las vías corticoestriatales, haciendo que los animales sean más vulnerables al desarrollo de comportamientos de tipo compulsivo, con déficits en la señalización de D2R estriatal que mejoran este proceso. De hecho, la densidad D2R estriatal reducida en individuos obesos se correlaciona con un metabolismo reducido en las áreas corticales prefrontal y orbitofrontal43 que ejercen un control inhibitorio sobre la conducta44.

En particular, el consumo compulsivo de alimentos sabrosos solo se detectó en las ratas de abatimiento que anteriormente tenían acceso extendido a la dieta de la cafetería, no en las ratas de control que tenían acceso extendido a la dieta de la cafetería durante el mismo período, ni en las ratas de abatimiento que tenían acceso solo para chow La principal diferencia entre las ratas de desactivación con acceso extendido previo y para los otros grupos fueron sus umbrales de BSR persistentemente elevados. Esto podría reflejar los orígenes neurobiológicos comunes de la hipofunción de la recompensa y la aparición de una alimentación de tipo compulsivo, que son fenómenos independientes pero coincidentes en el tiempo. Alternativamente, la hipofunción de recompensa inducida por la dieta podría servir como un sustrato para el refuerzo negativo que facilita el desarrollo de la alimentación compulsiva como 14, 32, 33. Independientemente de los mecanismos subyacentes, nuestros hallazgos demuestran que la respuesta compulsiva similar a la adicción para los alimentos sabrosos puede surgir en ratas obesas, e indican que los déficits en la señalización del estriado D2R aumentan la vulnerabilidad al desarrollo de este comportamiento.

En resumen, encontramos que la sobreestimulación de los sistemas de recompensa cerebral a través del consumo excesivo de alimentos sabrosos y con un alto contenido de energía induce un estado profundo de recompensa por la hiposensibilidad y el desarrollo de una alimentación de tipo compulsivo. Estas respuestas de comportamiento inadaptadas en ratas obesas probablemente surgen de déficits inducidos por la dieta en la señalización del D2R del cuerpo estriado. El consumo excesivo de drogas de abuso reduce de manera similar la densidad de D2R del estriado, induce un estado profundo de hipofunción de recompensa y desencadena la aparición de conductas de consumo de drogas de tipo compulsivo. Por lo tanto, nuestros hallazgos respaldan el trabajo anterior 4, 19, 42, 45, 46, 47 para indicar que la obesidad y la adicción a las drogas pueden surgir de respuestas neuroadaptativas similares en los circuitos de recompensa cerebral.

Métodos

Ratas

Las ratas Wistar macho que pesaban 300-350 g al comienzo de los experimentos se obtuvieron de Charles River. A su llegada, las ratas se alojaron individualmente a temperatura constante en un ciclo de luz-oscuridad 12-h (las luces se encienden en 2200 h). Se permitió el acceso ad libitum a ratas de laboratorio estándar y agua durante la duración del experimento. Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Scripps Florida, y las ratas fueron tratadas de acuerdo con las pautas establecidas por los Institutos Nacionales de Salud con respecto a los principios del cuidado de animales.

Procedimientos quirúrgicos.

Las ratas preparadas con electrodos de estimulación de BSR se anestesiaron primero por inhalación de 1-3% de isoflurano en oxígeno y se colocaron en un marco estereotáxico (Kopf). Se implantaron electrodos bipolares BSR (11 mm de largo) en el hipotálamo lateral posterior (anteroposterior, −0.5 mm desde bregma; mediolateral, ± 1.7 mm desde la línea media; dorsoventral, 8.3 mm desde la dura; barra incisiva ajustada a 5 mm por encima de la línea interaural ) 47. Las ratas que recibieron inyecciones de virus también se prepararon con cánulas de guía bilaterales (calibre 23, 14 mm de largo) colocadas sobre el estriado (anteroposterior, 2.8 mm de bregma; mediolateral, ± 3.1 mm de la línea media; dorsoventral, −2.4 mm de la dura) 48 y rellenos con estiletes 14-mm. Cuatro tornillos de cráneo de acero inoxidable y acrílico dental mantuvieron el electrodo y las cánulas en su lugar. La herida quirúrgica se trató con antibióticos tópicos una vez cada 12 h para 5 d después de la cirugía. A las ratas se les permitió a 7 – 10 d recuperarse de la cirugía y luego se las entrenó en el procedimiento de umbral BSR.

Procedimiento BSR.

Las ratas fueron entrenadas para responder a la estimulación de BSR de acuerdo con un procedimiento de umbral de corriente de ensayo discreto similar al descrito en otros lugares 10, 14. Brevemente, los niveles actuales de BSR se variaron en series descendentes y ascendentes alternas en pasos de 5-μA. En cada sesión de prueba, se presentaron cuatro series descendentes / ascendentes alternas. El umbral para cada serie se definió como el punto medio entre dos intensidades de corriente consecutivas para las cuales las ratas respondieron en al menos tres de los cinco ensayos, y dos intensidades de corriente consecutivas para las cuales las ratas no respondieron en tres o más de los cinco ensayos. El umbral general de la sesión se definió como la media de los umbrales para las cuatro series individuales. Cada sesión de prueba fue de aproximadamente 30 min de duración. Los umbrales de BSR estables se definieron como ≤10% de variación en umbrales en 5 días consecutivos, generalmente establecidos después de 10 – 14 d de entrenamiento. La latencia de respuesta para cada sesión de prueba se definió como la latencia de respuesta media de todas las pruebas durante las cuales se produjo una respuesta positiva.

Envasado y entrega viral.

Se entregó ARN en horquilla corta y se expresó constitutivamente usando el sistema de vector pRNAT-U6.2 / Lenti (GenScript). Las partículas virales se prepararon de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, las células HEK 293FT se transfectaron con el vector que contenía el inserto de ARNhc (5'-GGATCCCGCGCAGCAGTCGAGCTTTCTTCAAGAGAGAAAGCTCGACTGCTGCGCTTTTTTCCAACTCGAG-3 ') o el vector vacío, más ViraPower Packaging Mix (Invitrogen reemplazado 72 h) por 24 h. A continuación, se recogió el sobrenadante y se concentró mediante ultracentrifugación (76,755 g, rotor Beckman Coulter SW 32 TI, 90 min, 4ºC) y se determinó el título viral mediante clasificación de células activadas por fluorescencia de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El virus se dividió en alícuotas y se almacenó en cajas protegidas contra la luz a -80 ° C hasta su uso.

Las ratas con umbrales BSR estables recibieron inyecciones virales bilaterales en tres sitios en el estriado de cada hemisferio cerebral (2 μl por inyección, 1 μl min − 1, 1 min entre inyecciones, un total de seis inyecciones por rata). Se permitió a las ratas al menos 2-3 d recuperación de inyecciones intrastriatales antes de que se reanudara la evaluación del umbral BSR. La evaluación diaria del umbral BSR continuó para 33 d después de las inyecciones de virus para asegurar que se lograra la máxima eliminación del D2R del cuerpo estriado antes de permitir el acceso de las ratas a la dieta de la cafetería. No hubo diferencias en los umbrales de BSR entre las ratas Lenti-control y Lenti-D2Rsh durante estos 33 d (datos no mostrados).

Inmunoblotting.

Las ratas murieron aproximadamente 1 h después de su acceso regular a la dieta de la cafetería, y los cerebros se eliminaron rápidamente. Se prepararon secciones cerebrales de ~ 1 – 2 mm de espesor utilizando una matriz cerebral coronal (intervalo de corte de 1-mm; Plastics One) en un bloque de hielo, y se tomaron punzones tisulares del estriado dorsal (bregma: ~ 2.2 a −0.26 mm mm). Los punzones del tejido estriado se recolectaron rápidamente, se congelaron rápidamente y se almacenaron a -80 ° C hasta su uso. Las muestras individuales se descongelaron en hielo y se agruparon cantidades iguales de tejido estriatal sobre la base de una división mediana dependiente del peso de los grupos de acceso (ratas 7-10 por grupo). El tejido se resuspendió en 500 μl de tampón RIPA helado (Thermo Scientific) que contenía ortovanadato de sodio, inhibidores del cóctel de fosfatasa 1 y 2 (Sigma-Aldrich), leupeptina y pepstatina antes de la homogeneización. Los lisados ​​de tejido se hervieron durante 10 min en tampón de muestra y se cargaron en geles SDS 4% –20% o 10% Tris-glycine SDS (Invitrogen). La proteína se transfirió a membranas de nitrocelulosa, se bloqueó por 1 h en ~ 23-25 ° C (5% de leche en polvo no grasa y 0.2% de Tween-20 en PBS, pH 7.4), y se incubó en anticuerpo primario durante la noche a 4 ° C. Los siguientes anticuerpos primarios se diluyeron en solución de bloques: D2R ratón monoclonal (Santa Cruz, 1: 100) o β-actina monoclonal de ratón (Santa Cruz, 1: 200). El reactivo quimioluminiscente ECL se añadió después de la incubación con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (Amersham, 1: 2,000). La forma madura asociada a la membrana de D2DR (~ 70 kDa) 17, 49 se normalizó a un control de carga de proteínas (β-actina; 43 kDa) y se cuantificó por densitometría utilizando el software NIH Image J.

Análisis inmunoquímico.

Las ratas se anestesiaron y se perfundieron transcardialmente con 4% de paraformaldehído en PBS (pH 7.6). Los cerebros se retiraron, se fijaron posteriormente durante la noche y se almacenaron en sacarosa (solución 30% en PBS, pH 7.4) durante al menos 72 h. Se recogieron secciones de tejido congelado (30 μm de espesor) de un microtomo y se bloquearon (3% BSA, 5% de suero normal de cabra y 0.3% Triton X-100 en PBS) para 1 h a ~ 23 – XUMX ° C. Los siguientes anticuerpos primarios se agregaron a la solución de bloque y se incubaron durante la noche a 25 ° C: pollo policlonal a GFP (Abcam, 4: 1); conejo monoclonal a GFAP (Millipore, 1,000: 1); Ratón monoclonal a NeuN (Millipore, 1,000: 1). Las secciones se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con colorante fluorescente a ~ 1,000-23 ° C: colorante anti-pollo-25-nm (Jackson ImmunoResearch, 488: 1), colorante anti-conejo-1,000-nm (Invitrogen, 594: 1: 1,000: 594 ), y colorante anti-ratón-1-nm (Invitrogen, 1000: 61). Las secciones se montaron con medios de montaje Vectashield que contenían DAPI (Vector Labs) y se cubrieron. Las imágenes se tomaron con un microscopio de fluorescencia Olympus BX2 (objetivo × 10) o con un microscopio confocal Olympus (objetivos × 100 y × XNUMX).

Procedimiento de alimentación.

Las ratas se alojaron individualmente en ropa de cama de papel (almohadillas alfa; Shepherd Specialty Papers) para evitar que los productos alimenticios se ensucien con materiales de cama sueltos. La dieta de la cafetería consistía en tocino, salchicha, tarta de queso, bizcocho, glaseado y chocolate, que se pesaron individualmente antes de ponerlos a disposición de las ratas. Los alimentos dietéticos de la cafetería fueron entregados en pequeños recipientes metálicos. Todos los alimentos, incluido el chow estándar de laboratorio, se pesaron nuevamente al finalizar la sesión de alimentación. La ingesta calórica de los diversos macronutrientes se calculó utilizando la información nutricional proporcionada por el fabricante.

Supresión inducida por el comportamiento alimentario.

Los procedimientos de alimentación se llevaron a cabo en cámaras operantes con atenuación del sonido idénticas en dimensiones a las utilizadas en los experimentos de BSR. Las ratas se colocaron en una cámara operativa y tuvieron acceso a la dieta de la cafetería o comida durante 30 min. Los productos alimenticios se entregaron en pequeños recipientes metálicos. Todos los alimentos se pesaron antes y después de las sesiones de alimentación, que se llevaron a cabo durante el período de alimentación normal de las ratas. El consumo de pienso se evaluó mediante el consumo de gránulos de pienso de 45 mg de composición idéntica a la comida proporcionada en las jaulas de las ratas. A continuación, se permitió a las ratas un acceso de 30 minutos por día a la dieta de la cafetería hasta que se logró una ingesta estable (definida como una variación <10% en la ingesta diaria), requiriendo 5-7 días. Después de la estabilización de la ingesta de alimentos apetitosos durante este período de referencia, las ratas en cada condición de acceso se asignaron a dos grupos: castigadas (las que recibieron una descarga en el pie) e impunes (que no recibieron la descarga en el pie). A continuación, las ratas se sometieron a cuatro sesiones de acondicionamiento en días consecutivos en la misma cámara operativa en la que previamente habían tenido acceso al alimento sabroso. Durante las sesiones de acondicionamiento de 30 minutos, se activó una luz indicadora (estímulo condicionado) durante 10 minutos, se apagó durante 10 minutos y luego se volvió a encender durante 10 minutos. Las ratas castigadas recibieron choque en el pie solo durante la presentación de la luz indicadora (0.5 mA durante 1.0 s; 10 estimulaciones con intervalos de ~ 1 min). A las ratas impunes se les presentó la luz de señal de la misma manera, pero sin la descarga de la pata. El día de la prueba, el día después de la última sesión de acondicionamiento, las ratas de los grupos castigados recibieron un choque intermitente en el pie (cinco estimulaciones en total) junto con la activación de la luz indicadora durante 5 minutos. Las ratas impunes fueron nuevamente expuestas a la luz indicadora en ausencia de choque en el pie. Después del período de castigo de 5 minutos, a todas las ratas se les permitió acceder a la comida apetecible durante una sesión de 30 minutos con el estímulo condicionado activado intermitentemente (luz de señal de 10 minutos encendida, luz de señal de 10 minutos apagada, luz de señal de 10 minutos encendida).

Análisis estadístico.

Los umbrales de recompensa de línea de base se definieron como el valor de umbral promedio para el 5 d antes del acceso a la dieta de la cafetería para cada sujeto. Los umbrales de recompensa se expresaron como el cambio porcentual a partir del valor del umbral de referencia. Los datos sobre el porcentaje de los valores de umbral de recompensa de referencia, el aumento de peso, el consumo calórico y el consumo calórico de la grasa se analizaron mediante análisis de varianza de dos factores y medidas repetidas, con acceso (solo chow, acceso restringido o acceso extendido), fuente de calorías ( dieta estándar de chow o cafetería), virus (Lenti-control o Lenti-D2Rsh) y cue (pareados o no pareados con el castigo) como factores entre sujetos y el tiempo como factor dentro de los sujetos. Cuando fue apropiado, los efectos principales en los análisis de varianza se analizaron más a fondo con las pruebas post hoc de Bonferroni. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software GraphPad Prism.

Referencias

Referencias

Correspondencia a:

· Paul J Kenny ([email protected])