Impacto del γ-oryzanol específico del arroz integral en la modulación epigenética de los receptores D2 de la dopamina en el estriado cerebral en la obesidad inducida por la dieta rica en grasas en ratones (2017)

. 2017; 60 (8): 1502 – 1511.

Publicado en línea 2017 Mayo 20. doi  10.1007/s00125-017-4305-4

PMCID: PMC5491592

Resumen

Objetivos / hipótesis

Comer en exceso las grasas dietéticas causa obesidad en humanos y roedores. Estudios recientes en humanos y roedores han demostrado que la adicción a las grasas comparte un mecanismo común con la adicción al alcohol, la nicotina y los narcóticos en términos de una disfunción de los sistemas de recompensa cerebral. Se ha destacado que una dieta rica en grasas (DFH) atenúa la señalización del receptor D2 (D2R) de la dopamina en el estriado, un regulador fundamental del sistema de recompensa cerebral, que resulta en una sobrealimentación hedónica. Anteriormente informamos que el componente bioactivo específico del arroz integral γ-oryzanol atenuaba la preferencia por un DFH a través del control hipotalámico. Por lo tanto, exploramos la posibilidad de que el γ-oryzanol modularía el funcionamiento del sistema de recompensa cerebral en ratones.

Métodos

Los ratones machos C57BL / 6J alimentados con HFD se trataron por vía oral con γ-oryzanol, y se evaluaron los niveles estriatales de moléculas involucradas en la señalización D2R. Se examinó el impacto del γ-oryzanol en la metilación del ADN del promotor D2R y los cambios subsiguientes en las preferencias de grasa en la dieta. Además, se investigaron los efectos de 5-aza-2'-desoxicitidina, un potente inhibidor de las metiltransferasas de ADN (DNMT), sobre la preferencia de alimentos, la señalización de D2R y los niveles de DNMT en el estriado. Los efectos inhibitorios del γ-oryzanol sobre la actividad de los DNMT se evaluaron enzimáticamente in vitro.

Resultados

En el cuerpo estriado de ratones alimentados con una HFD, la producción de D2R se redujo a través de un aumento en la metilación del ADN de la región promotora del D2R. La administración oral de γ-oryzanol disminuyó la expresión y la actividad de las DNMT, restaurando así el nivel de D2R en el cuerpo estriado. La inhibición farmacológica de las DNMT por 5-aza-2'-desoxicitidina también mejoró la preferencia por la grasa en la dieta. De acuerdo con estos hallazgos, los ensayos enzimáticos in vitro demostraron que el γ-oryzanol inhibía la actividad de las DNMT.

Conclusiones / interpretación

Demostramos que el γ-oryzanol mejora la hipermetilación del ADN inducida por HFD de la región promotora de D2R en el estriado de ratones. Nuestro paradigma experimental resalta el γ-oryzanol como una sustancia antiobesidad prometedora con la propiedad distinta de ser un modulador epigenético novedoso.

Material suplementario electronico.

La versión en línea de este artículo (doi: 10.1007 / s00125-017-4305-4) contiene material complementario revisado por pares pero sin editar, que está disponible para usuarios autorizados.

Palabras clave: Metilación del ADN, Dopamina, Epigenética, Comportamiento alimentario, Nutrición, Obesidad, Recompensa, Estriado, Diabetes tipo 2

Introducción

Comer en exceso en individuos obesos comparte, al menos en parte, mecanismos comunes con la adicción al alcohol, la nicotina y los narcóticos []. Además de la regulación hipotalámica y hormonal del apetito, el sistema de recompensa cerebral, en particular la señalización del receptor de dopamina, está estrechamente relacionado con el comportamiento de alimentación adictivo o hedónico []. Un estudio previo en ratas demostró que la caída del receptor D2 de la dopamina estriatal (D2R) por medio de un pasador corto mediado por el lentivirus, el ARN de interferencia inducía rápidamente déficits de recompensa similares a la adicción y la búsqueda de alimentos similares a la compulsión []. Debido a la densidad reducida de D2R, el estriado dorsal responde menos a la recompensa de los alimentos en comparación con los grupos de control magro en humanos obesos y roedores []. De acuerdo con esta noción, la TaqIA alelo de la ANKK1 El locus genético (que codifica la repetición DRD2 / ankyrin y el dominio de cinasa que contiene 1), que disminuye la producción estriatal de D2R, está asociado con un fenotipo obeso en humanos [], mientras que los efectos de la pérdida de peso después de la cirugía bariátrica se asocian con una elevada densidad de D2R del estriado []. Estos datos sugieren fuertemente la importancia del D2R estriado como una nueva diana terapéutica para el tratamiento de la obesidad. Sin embargo, algunos medicamentos que se desarrollaron y que actuaron en el sistema de recompensa cerebral causaron efectos adversos considerables, incluidos serios problemas psiquiátricos, que provocaron su eventual retiro de las clínicas [].

Las modificaciones epigenéticas son críticas no solo para el desarrollo y la diferenciación, sino también porque surgen como resultado de cambios ambientales, incluso en la dieta y el estilo de vida []. La metilación del ADN es un evento epigenético principal para la estabilidad de la expresión génica []. En ratas, la exposición materna a una dieta alta en grasas (DFH) altera de manera intergeneracional la metilación del ADN dentro del sistema de recompensa central en la descendencia, lo que lleva a un consumo excesivo de DFH por parte de las crías []. En particular, las metiltransferasas del ADN (DNMT) desempeñan un papel fundamental en la regulación del comportamiento de alimentación y la actividad física [, ], sugiriendo que los DNMT podrían ser objetivos terapéuticos prometedores para la terapia del síndrome de obesidad-diabetes. Es importante destacar que algunas sustancias naturales derivadas de los alimentos, como el ácido cafeico y la epigalocatequina, actúan como inhibidores de la DNMT [, ].

Recientemente hemos demostrado que el componente bioactivo del arroz integral γ-oryzanol, una mezcla de éster del ácido ferúlico y varios fitoesteroles, atenúa la preferencia por la grasa en la dieta a través de una disminución en el estrés del retículo endoplásmico hipotalámico [ER]]. En ratones y conejos, el γ-oryzanol administrado por vía oral se absorbió rápidamente desde el intestino y se distribuyó principalmente al cerebro [, ]. Tomando en conjunto estos hallazgos, los productos derivados de alimentos naturales que actúan sobre el sistema nervioso central podrían ser una alternativa para mejorar de manera segura la alteración de la conducta alimentaria en la obesidad. En este contexto, probamos la hipótesis de que el γ-oryzanol alteraría el estado de metilación del ADN en el sistema de recompensa cerebral, lo que provocaría una atenuación de la preferencia por un HFD en ratones.

Métodos

Animales

Se alojaron ratones C57BL / 6J machos de siete semanas de edad obtenidos de Charles River Laboratories Japan (Kanagawa, Japón) (3-4 por jaula) en condiciones libres de patógenos específicos a 24 ° C bajo una luz de 12 h / 12 h / ciclo oscuro. Después de una semana de aclimatación, se comparó el peso de los ratones de 8 semanas y se dividieron en dos o tres grupos para someterse a cada experimento. A los ratones se les permitió acceso libre a comida y agua. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética de Experimentos con Animales de la Universidad de Ryukyus (Nos. 5352, 5718 y 5943).

Administración de γ-oryzanol y 5-aza-2′-deoxycytidine

Para evaluar la preferencia por el HFD, se administró γ-oryzanol (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japón) a ratones de 8 de una semana de edad por sonda durante la prueba de elección de alimentos como se describió anteriormente [, ]. Para los otros experimentos, un HFD (D12079B; Research Diets, New Brunswick, NJ, EE. UU.) Que contenía 0.4% γ-oryzanol se fabricó como gránulos. Los componentes de la dieta se muestran en el material electrónico complementario (ESM). 1. Después de 12 semanas de alimentación, se recogió tejido del cuerpo estriado y del hipotálamo. La ingesta diaria de γ-orizanol, estimada a partir de la ingesta media de alimentos de los ratones, fue de aproximadamente 320 μg / g de peso corporal. Las dosis de γ-orizanol se determinaron como se describió anteriormente []. La 5-aza-2′-desoxicitidina (5-aza-dC; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE. UU.) Se inyectó por vía intraperitoneal (0.25 μg / g de peso corporal) tres veces por semana durante 12 semanas [].

Estimación de preferencia por la grasa dietética.

Para evaluar las preferencias de grasa en la dieta, las pruebas de alimentos proporcionaron una opción entre chow y HFD (D12450B y D12451; Dietas de investigación) como se describió anteriormente []. Los componentes de la dieta se muestran en la tabla ESM. 1. Brevemente, a los ratones se les permitió acceso libre a comida y HFD. Se midieron las ingestas de comida y HFD semanalmente y se analizaron los cambios en la preferencia por la grasa dietética. La preferencia HFD se calculó de acuerdo con la fórmula: Preferencia HFD = [(ingesta HFD / ingesta total de alimentos) × 100].

Secuenciación de bisulfito para la metilación del ADN.

El ADN se purificó usando un kit DNeasy Blood & Tissue (QIAGEN, Tokio, Japón). La solución de ADN se mezcló con 3 mol / l de NaOH recién preparado, se incubó a 37ºC durante 15 min y se añadió a 5.3 mol / l de urea, 1.7 mol / l de bisulfito de sodio y 4.9 mmol / l de hidroquinona. La solución se sometió a 15 ciclos de desnaturalización a 95 ° C durante 30 sy incubación a 50 ° C durante 15 min []. El ADN tratado con bisulfito se purificó utilizando el kit de purificación de PCR MinElute (QIAGEN) y se amplificó mediante PCR utilizando un kit de PCR para PCR ReadyMix de KAC HiFi HotStart + ReadyMix (KAPA Biosystems, Woburn, MA, EE. UU.) Y cebadores alrededor del sitio CpG de la región promotora de D2R . Las secuencias de los cebadores fueron las siguientes: cebador directo, 5′-GTAAGAATTGGTTGGTTGGAGTTAAAA-3 '; cebador inverso, 5′-ACCCTACCCTCTAAAACCACAACTAC-3 ′. A continuación, las secuencias de adaptador se agregaron y se limpiaron utilizando Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Brea, CA, EE. UU.). Las muestras se agruparon y cargaron en un GS Junior (Roche Diagnostics, Tokio, Japón) para secuenciar de acuerdo con el protocolo del fabricante. El nivel de metilación se expresó como el porcentaje de citosinas metiladas en todos los residuos de citosinas.

Ensayo de actividad DNMT

El ensayo de actividad enzimática DNMT se realizó utilizando un kit de ensayo de actividad / inhibición de metiltransferasa de ADN EpiQuik (Epigentek Group, Brooklyn, NY, EE. UU.) Y un kit de ensayo de metiltransferasa de EPIgeneous (Cisbio Japón, Chiba, Japón) de acuerdo con los protocolos del fabricante.

Para evaluar la actividad inhibitoria de cada compuesto en la metilación del ADN, la formación de S-adenosil-20-homocisteína (SAH) se midió en presencia de cada compuesto (XNUMX μmol / l para ensayos de detección), S-adenosil metionina (SAM; 10 μmol / l) y sustrato DNMT (4 ng / μl) a 37 ° C durante 90 min. Para evaluar la cinética de Michaelis-Menten, se incubó DNMT1 (20 μmol / l) con γ-orizanol, SAM (5 μmol / l) y la concentración indicada de poli dI-dC a 37 ° C durante 90 min. Se incubaron DNMT3a (100 µmol / l) y DNMT3b (100 µmol / l) con γ-orizanol, SAM (5 µmol / l) y la concentración indicada de poli dG · dC a 37 ° C durante 120 min. Los ensayos se realizaron por cuadruplicado. La proteína extraída (0.75 mg / ml) se incubó con SAM (5 μmol / l), poli dI-dC (5 μg / ml) y poli dG · dC (5 μg / ml) a 40 ° C durante 120 min, y Se midió la formación de SAH.

Ensayo de actividad del receptor γ relacionado con el estrógeno

La actividad antagonista potencial de γ-orizanol sobre el receptor-γ relacionado con estrógenos (ERRγ) se evaluó utilizando el Sistema de ensayo del indicador gamma del receptor relacionado con estrógenos humanos (INDIGO Bioscience, State College, PA, EE. UU.) De acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, se expusieron células indicadoras de mamíferos no humanos que expresan constitutivamente ERRγ activo a las concentraciones indicadas de cada compuesto durante 24 h por triplicado.

Western blotting

Esto se realizó como se describió anteriormente [] con anticuerpos contra D2R (1: 500, conejo), transportador de dopamina (DAT; 1: 500, conejo), tirosina hidroxilasa (TH; 1: 1000, conejo) (AB5084P, AB1591P y AB152, Merck Millipore, Billerica, MA, EE. UU.), Transductor de señal y activador de la transcripción 3α (STAT3α; 1: 1000, conejo), DNMT1 (1: 1000, conejo), DNMT3a (1: 1000, conejo) (núms. 8768, 5032 y 3598; Cell Signaling Technology, Tokio, Japón), DNMT3b (1 μg / ml, conejo), ERRγ (1: 1000, conejo) y β-actina (1: 10,000, ratón) (ab16049, ab128930 y ab6276; Abcam, Cambridge, MA, EE. UU.).

PCR cuantitativa en tiempo real

La expresión génica se examinó como se describió anteriormente []. Los niveles de ARNm se normalizaron a Rn18s (18S rRNA). Los conjuntos de cebadores utilizados para los análisis de PCR cuantitativos en tiempo real se resumen en la Tabla ESM 2.

análisis estadístico

Los datos se expresan como media ± SEM. Se utilizaron ANOVA de una vía y ANOVA de medidas repetidas seguidos de pruebas de comparación múltiple (método de Bonferroni-Dunn) cuando fue aplicable. Del estudiante t Se utilizó la prueba para analizar las diferencias entre dos grupos. Las diferencias fueron consideradas significativas a p <0.05.

Resultados

La inhibición farmacológica de las DNMT por 5-aza-dC atenuó la preferencia por la grasa dietética en ratones

En ratones alimentados con HFD, la metilación del ADN en la región promotora de D2R en el cuerpo estriado se aumentó significativamente en comparación con los ratones alimentados con una dieta Chow (Fig. (Fig. 1a) .1una). Por otro lado, la metilación del ADN hipotalámico en la región promotora de D2R fue aparentemente más alta que la del estriado bajo una dieta de chow (p <0.01) (Fig. (Fig. 1a, 1a, f) y no fue alterado por el HFD (Fig. (Fig. 1f) .1F). En ratones alimentados con HFD, la metilación aumentada de ADN en la región promotora de D2R en el cuerpo estriado se normalizó mediante tratamiento con 5-aza-dC, un potente inhibidor de DNMT (Fig. (Fig. 1a) .1una). En contraste, la metilación del ADN en la región promotora de D2R en el hipotálamo no se modificó significativamente por el tratamiento con 5-aza-dC (Fig. (Fig. 1f) .1F). En el cuerpo estriado de ratones machos de 20 semanas alimentados con HFD durante 12 semanas, los niveles de ARNm y proteína de D2R disminuyeron significativamente (Fig. (Fig. 1b, 1b, k, l). Por el contrario, los niveles de dopamina D1 receptores (D1Rs, codificados por Drd1), que actúan de manera opuesta a los D2R en la adenilil ciclasa y la señalización intracelular mediada por AMPc, se mantuvieron sin cambios (Fig. (Fig. 1c) .1do). Además, no hubo cambios en los niveles de otras moléculas relacionadas con la señalización D2R, como TH y DAT a nivel de mRNA y / o proteína (Fig. (Fig. 1d, 1d, e, k, m). Por otro lado, no se observaron cambios aparentes en el hipotálamo, incluso para D2R (Fig. (Fig.1g – m) .1g – m). En particular, los niveles de proteína de D2R y TH en el hipotálamo fueron mucho más bajos que los del estriado (Fig. (Fig. 1l, 1l, m), posiblemente reflejando la importancia relativa de la señalización del receptor de dopamina en el sistema de recompensa cerebral en comparación con el hipotálamo.

  

La inhibición de las DNMT por 5-aza-dC atenúa la preferencia por un HFD mediante el aumento de D2R en el estriado de ratones alimentados con HFD. Niveles de metilación del ADN en la región promotora de D2R en el cuerpo estriado (n = 3) (a) e hipotálamo (n = 3) ...

Para examinar si la metilación del ADN en la región promotora de D2R alteraría la preferencia por la grasa dietética, se analizó el comportamiento de alimentación de los ratones tratados con 5-aza-dC. Como se esperaba, 5-aza-dC aumentó significativamente los niveles de mRNA y proteína para D2R en el estriado de ratones alimentados con HFD (Fig. (Fig. 1b, 1b, k, l). Por otro lado, no hubo efecto en los niveles de Drd1, Th y Slc6a3 (codificando DAT) en el cuerpo estriado, o en niveles de Drd2, Drd1, Th y Slc6a3 en el hipotálamo (fig. (Fig. 1c – e, 1c – e, g – m). Mientras que los ratones tratados con vehículo preferían la HFD, la preferencia por la HFD disminuyó significativamente en los ratones tratados con 5-aza-dC (88% de los valores para los ratones tratados con vehículo) (Fig. (Fig. 1n) .1norte). En consecuencia, el tratamiento con 5-aza-dC redujo la ganancia de peso corporal (Fig. (Fig. 11o).

El γ-oryzanol disminuye los niveles de DNMT en el estriado de ratones alimentados con HFD

Como informamos anteriormente [], la administración oral de γ-oryzanol a ratones machos por sonda atenuó significativamente la preferencia por un HFD (93% de los valores para ratones tratados con vehículo) (Fig. (Fig. 2a), 2a), lo que resulta en una atenuación aparente de la ganancia de peso corporal (Fig. (Fig. 2b) .2segundo). Por lo tanto, exploramos el impacto potencial del γ-oryzanol en la modulación epigenética de los D2R en el cuerpo estriado.

  

Efecto inhibitorio de γ-oryzanol en DNMT en ratones alimentados con HFD. Preferencia HFD (a) y el peso corporal (b) en ratones tratados con γ-oryzanol durante las pruebas de elección de alimentos de chow vs HFD (n = 4 jaulas; tres ratones por jaula). Niveles de ARNm para ...

En los mamíferos, hay tres DNMT principales: DNMT1, 3a y 3b. DNMT1 funciona para mantener la metilación del ADN, mientras que DNMT3a y 3b desempeñan un papel en la facilitación de la metilación del ADN de novo []. Para explorar el impacto potencial de γ-oryzanol en DNMTs in vivo, evaluamos los niveles de DNMTs en los cerebros de ratones alimentados con HFD. Aunque la HFD per se no tuvo efecto en los niveles de ARNm y proteína de DNMT en el cuerpo estriado o en el hipotálamo, la suplementación con γ-oryzanol disminuyó significativamente los niveles de DNMT en el cuerpo estriado pero no en el hipotálamo (Fig. (Fig. 2c – e, 2c – e, g – i, k – n). Estos datos aumentan la posibilidad de que el γ-oryzanol pueda regular los niveles de DNMT de una manera específica al estriado. De manera similar, 5-aza-dC disminuyó significativamente los niveles de ARNm de DNMT3a y 3b preferentemente en el estriado (ESM Fig. 1anuncio).

Sobre la base de un estudio previo que muestra que el nivel de ARNm de DNMT1 fue regulado positivamente, al menos en parte, por el receptor nuclear ERRγ [], examinamos el efecto potencial de γ-oryzanol en la actividad de ERRγ. En células de mamíferos no humanos que expresan constitutivamente ERRγ activo, 4-hidroxi tamoxifeno, un potente agonista inverso de ERRγ, disminuyó notablemente la actividad ERRγ. Es de destacar que el γ-oryzanol disminuyó parcialmente la actividad de ERRγ (una reducción de aproximadamente el 40% del valor innato) (Fig. (Fig. 3a) .3una). Es importante destacar que ERRγ fue altamente expresado en el cuerpo estriado pero no en el hipotálamo (Fig. (Fig.3b – d) .3b – d). Contrariamente a la situación del estriado, el γ-oryzanol aumentó significativamente los niveles de proteína de DNMT1 solo en el hipotálamo (Fig. (Fig. 2k, 2k, l). Estos resultados podrían explicarse, al menos en parte, por nuestro hallazgo de que STAT3α, un regulador positivo del nivel de DNMT1 [], se expresó abundantemente en el hipotálamo pero no en el estriado (Fig. (Fig. 33p.ej).

  

Impacto del γ-oryzanol en la actividad ERRγ y STAT3α. (a) Efecto inhibitorio de γ-oryzanol en ERRγ in vitro. Curvas dosis-respuesta de las actividades de ERRγ con γ-oryzanol (círculos negros), ácido ferúlico ...

Para evaluar más a fondo el impacto del γ-oryzanol en la actividad de los DNMTs in vivo, se evaluó la formación de SAH, un subproducto de la metilación del ADN y también un potente inhibidor de los DNMTs, en ratones tratados con γ-oryzanol alimentados con HFD. No hubo cambios significativos en la formación de SAH ni en el cuerpo estriado ni en el hipotálamo entre los ratones alimentados con HFD y los alimentados con chow (Fig. (Fig. 2f, 2f, j). Cabe destacar que el γ-oryzanol disminuyó significativamente la formación de SAH en el cuerpo estriado (Fig. (Fig. 2f) 2f) pero no en el hipotálamo (fig. (Fig. 2j), 2j), lo que sugiere que el γ-oryzanol puede suprimir la actividad de los DNMT de una manera específica del cuerpo estriado en ratones alimentados con HFD.

Análisis enzimáticos sobre las propiedades inhibitorias de γ-oryzanol para DNMTs in vitro

A continuación, evaluamos el impacto del γ-oryzanol en la actividad de las DNMT in vitro. Se evaluaron las potencias inhibitorias de γ-orzanol, ácido ferúlico, 5-aza-dC, haloperidol (un antagonista de D2R representativo), quinpirol (un agonista de D2R representativo) y SAH frente a DNMT. Como control positivo, SAH atenuó fuertemente las actividades de los DNMT de una manera dependiente de la dosis (Fig. (Fig.4a – f) .4a – f). Como se esperaba, el haloperidol y el quinpirol no mostraron ningún efecto sobre las actividades de los DNMT (Fig. ESM, fig. 2). Es notable que el γ-oryzanol inhibió significativamente las actividades de DNMT1 (IC50 = 3.2 μmol / l), 3a (IC50 = 22.3 μmol / l) y 3b (inhibición máxima 57%) (fig. (Fig.4d – f) .4d – f). En contraste, la actividad inhibitoria del ácido ferúlico, un metabolito del γ-oryzanol, fue mucho más baja que la del γ-oryzanol (Fig. (Fig. 44d – f).

  

Efecto inhibitorio de γ-oryzanol en DNMTs in vitro. Ensayos de detección de alto rendimiento para inhibidores potenciales de DNMT1 (a), DNMT3a (b) y DNMT3b (c). Potenciales inhibidores contra los DNMT para γ-oryzanol, ácido ferúlico (un metabolito de γ-oryzanol), ...

También investigamos las propiedades inhibitorias de γ-oryzanol en DNMT. La formación de HSA se midió para evaluar la actividad inhibitoria de γ-oryzanol en DNMTs in vitro. Los datos sobre la formación de SAH durante la metilación del ADN mediada por DNMT indican un patrón saturable de cinética de Michaelis-Menten tanto para la presencia como para la ausencia de γ-oryzanol (Fig. (Fig.4g – i) .4soldado americano). En la metilación del ADN mediada por DNMT1, el análisis de Eadie-Hofstee demostró que el γ-oryzanol no mostró efectos en el V max de formación de SAH (vehículo, 597 pmol / min; γ-oryzanol 2 μmol / l, 619 pmol / min; γ-oryzanol 20 μmol / l, 608 pmol / min), mientras que γ-oryzanol aparentemente aumentó la K m (vehículo, 0.47 μg / ml; γ-orizanol 2 μmol / l, 0.67 μg / ml; γ-orizanol 20 μmol / l, 0.89 μg / ml) (Fig. (Fig.4j) .4j). Estos resultados sugieren que el γ-oryzanol inhibe el DNMT1, al menos en parte, de manera competitiva. Por otro lado, para la metilación del ADN mediada por DNMT3a- y 3b, el γ-oryzanol disminuyó la V max de formación de HSA (DNMT3a: vehículo, 85.3 pmol / min; γ-orizanol 2 μmol / l, 63.1 pmol / min; γ-orizanol 20 μmol / l, 42.5 pmol / min; DNMT3b: vehículo, 42.3 pmol / min; γ -orizanol 2 μmol / l; 28.0 pmol / min, γ-oryzanol 20 μmol / l, 15.0 pmol / min) y, de manera similar, el K m para esta reacción (DNMT3a: vehículo, 0.0086 μg / ml; γ-oryzanol 2 μmol / l, 0.0080 μg / ml; γ-oryzanol 20 μmol / l, 0.0058 μg / ml; DNMT3b: vehículo, 0.0122 μg / ml; γ- orizanol 2 μmol / l, 0.0097 μg / ml; γ-orizanol 20 μmol / l, 0.0060 μg / ml) (Fig. (Fig. 4k, 4k, l). Estos resultados sugieren que el γ-oryzanol inhibe DNMT3a y 3b al menos en parte de una manera no competitiva.

El γ-oryzanol aumenta los niveles de D2R en el estriado de ratones alimentados con HFD

A continuación, probamos la posibilidad de que el γ-oryzanol aumentaría el contenido de D2R del estriado a través de una inhibición de las DNMT. En ratones alimentados con HFD, la administración oral de γ-oryzanol disminuyó significativamente la metilación del ADN estriatal en la región promotora de los D2R (Fig. (Fig. 5a), 5a), mientras que no hizo esto en el hipotálamo (Fig. (Fig. 5f) .5F). De acuerdo con estos hallazgos, los niveles de ARNm y proteína de D2R se incrementaron recíprocamente (Fig. (Fig. 5b, 5b, g, k, l). Similar a los datos sobre el tratamiento con 5-aza-dC (Fig. (Fig. 1), 1), no hubo efectos aparentes en los niveles de ARN y proteína de Drd1, Th y Slc6a3 (DAT) en el cuerpo estriado, y no hay efectos en los niveles de Drd1, Th y Slc6a3 en el hipotálamo (fig. (Fig. 5c – e, 5c – e, h – k, m).

  

La inhibición de DNMT por γ-oryzanol atenúa la preferencia por un HFD mediante el aumento de D2R en el estriado de ratones alimentados con HFD. Los niveles de metilación del ADN de la región promotora de D2R en el cuerpo estriado (n = 3) (a) e hipotálamo ...

Estudios previos han demostrado que los niveles de D2R y DNMT1 están regulados por el estrés y la inflamación del RE, al menos en parte a través de NF-κB [, , ]. Por lo tanto, examinamos los niveles de ER relacionados con el estrés y los genes relacionados con la inflamación. Como se demostró anteriormente [], la HFD aumentó la expresión de los genes que codifican TNF-α (Tnfa), proteína quimioatrayente de monocitos – 1 (MCP-1) (Ccl2), Proteína homóloga C / EBP (Chopp), DnaJ localizado 4 (ERdj4) (Dnajb9) y la forma empalmada de la proteína de unión X-box 1 (Xbp1s) en el hipotálamo pero no en el estriado (Fig. (Fig. 6) .6). En particular, la suplementación de la DDH con γ-oryzanol disminuyó significativamente la expresión aumentada de Ccl2, Chopp, Dnajb9 y Xbp1s exclusivamente en el hipotálamo pero no en el estriado (Fig. (Fig. 66).

  

Expresión de genes relacionados con el estrés proinflamatorio y ER en estriado e hipotálamo. Niveles de ARNm para Tnfa (a, f), Ccl2 (b, g), Chopp (c, h), Dnajb9 (d, i), y la forma empalmada activa de Xbp1 (Xbp1s) (e, j) en el cuerpo estriado (n = 8) ...

Discusión

El principal hallazgo en el presente estudio es que el γ-oryzanol actúa como un potente inhibidor de la DNMT en el estriado de los ratones, atenuando así, al menos en parte, la preferencia por un HFD a través de la modulación epigenética del D2R del estriado. En el estriado de ratones alimentados con HFD, los niveles de D2R disminuyeron significativamente, mientras que los de D1R, TH y DAT no cambiaron (Fig. (Fig. 1b – e, 1b – e, k – m). Estos datos son consistentes con la noción de que la desregulación de D2R estriatal juega un papel crítico en la percepción de la recompensa de los alimentos cuando se trata de un HFD, lo que lleva a un consumo excesivo hedónico de HFD en animales obesos []. En el presente estudio, el tratamiento de ratones alimentados con HFD con 5-aza-dC aumentó significativamente los niveles de D2R del cuerpo estriado (Fig. (Fig. 1b, 1b, k, l) posiblemente a través de una reducción en el nivel de metilación del ADN en la región promotora de D2R (Fig. (Fig. 1a), 1a), y en consecuencia atenuó la preferencia por la grasa dietética (Fig. (Fig. 1n) .1norte). Este hallazgo también apoya un papel crítico de los D2R estriatales en la percepción de la recompensa de alimentos cuando se encuentra en un HFD.

Nuestro ensayo in vitro demostró que la actividad inhibitoria del γ-oryzanol contra los DNMT era aparentemente más fuerte que la de su metabolito ácido ferúlico (Fig. (Fig. 4d – f), 4d – f), sugiriendo la importancia de la estructura completa de γ-oryzanol por su acción inhibitoria sobre las DNMT. En ratones alimentados con HFD, nuestros estudios sugieren que, después de la administración oral, el γ-oryzanol alcanza el cerebro como una estructura completa y disminuye los niveles y las actividades de las DNMT de manera preferencial en el estriado, con la consiguiente disminución de la metilación del ADN en la región promotora de D2R en el cuerpo estriado. Además, nuestros estudios in vitro han demostrado que el γ-oryzanol actúa como un antagonista parcial contra ERRγ, que sirve principalmente como un regulador positivo para la producción de DNMT1 [], y en consecuencia disminuyó la actividad de DNMT1 (Fig. (Fig. 3a) .3una). Es de destacar que ERRγ fue altamente expresado en el estriado pero no en el hipotálamo en ratones (Fig. (Fig. 3b) .3segundo). Estos datos sugieren que el γ-oryzanol tiene el potencial de disminuir el nivel de ARNm de DNMT1, al menos en parte, a través de la inhibición de ERRγ. En contraste con el cuerpo estriado, el γ-oryzanol no mostró ningún efecto sobre el nivel de D2R en el hipotálamo de ratones alimentados con HFD (Fig. (Fig. 5g, 5g, k, l).

Por otro lado, demostramos que el γ-oryzanol aumentó significativamente los niveles de DNMT1 en el hipotálamo, pero no en el estriado (Fig. (Fig. 2k, 2k, l). Se ha demostrado que STAT3 aumenta el contenido de DNMT1 en células de linfoma T malignas []. Notablemente, previamente demostramos que el γ-oryzanol incrementó significativamente la fosforilación de STAT3 inducida por leptina en el hipotálamo de ratones alimentados con HFD []. También se debe tener en cuenta que STAT3α se expresó sustancialmente en el hipotálamo, pero no en el estriado en los ratones (Fig. (Fig.3e – g) .3p.ej). Estos datos nos inducen a especular que la diferencia aparente en el efecto del γ-oryzanol en los niveles de DNMT1 entre el hipotálamo y el estriado puede atribuirse, al menos en parte, al contenido específico de la región de STAT3α y ERRγ en el cerebro de ratones ( Higo. (Fig.3b – g) .3b – g). En conjunto, parece haber un patrón recíproco de expresión de ERRγ y STAT3α entre el cuerpo estriado y el hipotálamo en ratones. Sobre la base de nuestros resultados, es razonable especular que en el estriado, donde la producción de ERRγ es abundante, el γ-oryzanol puede disminuir preferentemente el nivel de mRNA y la actividad enzimática de DNMT1 como un regulador negativo de ERRγ. En contraste, en el hipotálamo, donde la producción de STAT3α es dominante, el γ-oryzanol puede aumentar preferentemente los niveles de DNMT1.

Un estudio reciente demostró que una atenuación de la señalización estriatal D2R inducida por un HFD desregula el comportamiento de alimentación [], sugiriendo la importancia potencial de la inhibición de las DNMT estriatales para el tratamiento de la obesidad. Por otro lado, un estudio previo demostró la posibilidad de que el estado de la metilación del ADN del gen 4 del receptor de melanocortina expresado en núcleos hipotalámicos específicos pudiera modular formas transgeneracionales de obesidad en ratones amarillos viables agutí []. Aunque se requieren estudios adicionales para dilucidar los mecanismos subyacentes, estos estudios sugieren la importancia de la metilación del ADN en tejidos, genes y secuencias en la fisiopatología de la obesidad inducida por HFD.

Recientemente informamos que la HFD aumentó el nivel de D2R en los islotes pancreáticos de ratones [, ]. Es probable que dicho aumento esté mediado, al menos en parte, por el estrés del RE y la inflamación a través de NF-κB, porque hay varios elementos sensibles a NF-κB en la región promotora de D2R [, ]. Además, un estudio reciente ha demostrado que TNF-α y IL-1β aumentan el nivel y la actividad de DNMT1 en tejido adiposo de ratones alimentados con HFD []. Es importante destacar que el presente estudio demostró que la HFD inducía estrés e inflamación en el RE de manera preferencial en el hipotálamo pero no en el cuerpo estriado (Fig. (Fig. 6) .6). Los mecanismos profundos de metilación y desmetilación del ADN en tejidos, regiones y sitios específicos en nuestro paradigma experimental deben esperar una investigación más a fondo.

Junto con nuestro informe anterior que muestra que el γ-oryzanol atenúa la preferencia por un HFD a través de la regulación hipotalámica del estrés ER en ratones [], γ-oryzanol también representa una propiedad única de mejorar la desregulación tanto hedónica como metabólica del comportamiento de alimentación. Debido a que se sabe que algunos medicamentos antiobesidad que se han desarrollado causan efectos adversos críticos [], se anticipa un enfoque basado en alimentos naturales hacia el sistema de recompensa cerebral para tratar la obesidad y el síndrome de diabetes de manera segura []. En este paradigma, el γ-oryzanol es un candidato antiobesidad prometedor con una propiedad distinta de ser un modulador epigenético.

 

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Agradecimientos

Agradecemos a S. Okamoto (Universidad de Ryukyus, Japón) por la revisión del manuscrito. Agradecemos a M. Hirata, H. Kaneshiro, I. Asato y C. Noguchi (Universidad de Ryukyus, Japón) por la asistencia de secretaría.

Abreviaturas

5-aza-dC5-aza-2′-deoxycytidine
D1RDopamina D1 receptor
D2RDopamina D2 receptor
DATTransportador de dopamina
DNMTADN metiltransferasa
ERRetículo endoplásmico
ERRReceptor relacionado con el estrógeno
HFDDieta alta en grasas
SAHS-Adenosil-l-homocisteína
SAMS-Adenosil metionina
STAT3αTransductor de señal y activador de transcripción 3α.
THTirosina hidroxilasa
 

Notas

Disponibilidad de datos

Los conjuntos de datos generados y / o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente en solicitudes razonables.

Oportunidades

Este trabajo fue apoyado en parte por Grants-in-Aid de la Sociedad de Japón para la Promoción de la Ciencia (JSPS; KAKENHI Grant Numbers 15K19520 y 24591338), el Consejo de Ciencia, Tecnología e Innovación (CSTI), Programa de Promoción de Innovación Estratégica Interministerial (SIP) 'Tecnologías para crear la próxima generación de agricultura, silvicultura y pesca', Lotte Foundation, Japan Foundation for Applymymology, New Energy and Industrial Technology Development Organization (NEDO), Project for Formation of Life Science Network (Campo farmacéutico). (Prefectura de Okinawa, Japón) y el Proyecto de Promoción de Agrupación Médica de la Prefectura de Okinawa, Japón, junto con una subvención de la Prefectura de Okinawa para la promoción de la medicina avanzada (Prefectura de Okinawa, Japón).

Dualidad de interes

Los autores declaran que no hay dualidad de interés asociada con este manuscrito.

Declaración de contribución

CK y HM diseñaron la investigación. CK y TK realizaron los experimentos y analizaron los datos. TK, CS-O, CT, MT, MM y KA contribuyeron a la interpretación de los datos. CK y HM escribieron el manuscrito. Todos los autores contribuyeron a la interpretación de los datos. Todos los autores se sumaron a la revisión del manuscrito y aprobaron su versión final. HM es el garante de este trabajo, tuvo acceso completo a todos los datos y asume la plena responsabilidad de la integridad de los datos y la precisión del análisis de los mismos.

Notas a pie de página

 

Material suplementario electronico.

La versión en línea de este artículo (doi: 10.1007 / s00125-017-4305-4) contiene material complementario revisado por pares pero sin editar, que está disponible para usuarios autorizados.

 

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