Nature Communications
6,
Número de artículo:
8543
doi: 10.1038 / ncomms9543
Recibido
02 de junio de 2015
Aceptados
02 Septiembre 2015
Publicado
Resumen
La insulina activa los receptores de insulina (InsR) en el hipotálamo para indicar la saciedad después de una comida. Sin embargo, el aumento de la incidencia de obesidad, que resulta en niveles de insulina crónicamente elevados, implica que la insulina también puede actuar en centros cerebrales que regulan la motivación y la recompensa. Aquí informamos que la insulina puede amplificar la acción de liberación de dopamina (DA) dependiente del potencial en el núcleo accumbens (NAc) y el caudato-putamen a través de un mecanismo indirecto que involucra a las interneuronas colinérgicas del cuerpo estriado que expresan InsRs. Además, dos manipulaciones crónicas diferentes de la dieta en ratas, la restricción de alimentos (FR) y una dieta obesogénica (OB), alteran de manera opuesta la sensibilidad de la liberación de DA estriatal a la insulina, con una mayor capacidad de respuesta en FR, pero la pérdida de capacidad de respuesta en OB. Los estudios de comportamiento muestran que los niveles de insulina intacta en la capa de NAc son necesarios para adquirir preferencia por el sabor de una solución de glucosa pareada. Juntos, estos datos implican que la señalización de la insulina estriatal mejora la liberación de DA para influir en las elecciones de los alimentos.
De un vistazo
Introducción
Está bien establecido que un aumento sostenido de la insulina plasmática durante y después de una comida activa los receptores de insulina (InsR) en el hipotálamo, lo que proporciona retroalimentación negativa a los circuitos del apetito que disminuye la alimentación.1, 2, 3. La insulina cerebral se deriva principalmente de las células β pancreáticas, con transporte activo del plasma al cerebro en la barrera hematoencefálica4, 5, 6, 7, 8, aunque hay evidencia creciente de síntesis y liberación de insulina neuronal, así como1, 9. En particular, la expresión de InsRs no se limita al hipotálamo, aunque la función de InsRs extra-hipotalámicos sigue sin resolverse.1, 2, 3. Dada la creciente incidencia de obesidad y diabetes tipo II, en la que los niveles circulantes de insulina se elevan constantemente y el transporte de insulina cerebral y la sensibilidad del receptor disminuyen3, 8, 10, 11, es fundamental comprender la función de la insulina en las regiones del cerebro que regulan la motivación y la recompensa. Las regiones cerebrales de particular interés incluyen el núcleo accumbens (NAc), que media los efectos gratificantes de los alimentos y las drogas.12, 13, y el caudate-putamen (CPu), que desempeña un papel en el comportamiento basado en el hábito y el deseo13. Los InsR se expresan a lo largo de estas regiones, con la densidad más alta que ocurre en el NAc3, 14; Los InsR también se expresan mediante neuronas de dopamina (DA) en el cerebro medio, incluidas las del área tegmental ventral (VTA) y la sustancia negra compacta (SNc)15. Los niveles de insulina en el cerebro son proporcionales a las concentraciones de insulina en plasma y a la adiposidad corporal.6, 7, 8, lo que lleva a la hipótesis de que la insulina podría actuar en InsRs en estas regiones del cerebro para influir en la recompensa alimentaria3, 16, 17.
Estudios previos en sinaptosomas del cuerpo estriado, células heterólogas, cortes de cerebro y in vivo han demostrado que la activación de InsRs con insulina conduce a un aumento en la absorción de DA por parte del transportador DA (DAT)18, 19, 20, 21, 22, 23. Este proceso involucra la ruta de señalización de la quinasa PI319, 20, y resulta en la inserción de DAT en la membrana plasmática19. Los niveles de insulina circulante modulan dinámicamente la actividad DAT estriatal, con una disminución de la captación de DA y la expresión de la superficie de la DAT en modelos animales de diabetes y después de la restricción de alimentos (FR)20, 21. Se ha demostrado que los aumentos dependientes de la insulina en la actividad DAT disminuyen la concentración extracelular de DA evocada ([DA]o) en el VTA23, reflejando un cambio en el equilibrio entre la liberación y la captación de DA. De acuerdo con el papel establecido de la insulina en la saciedad, la microinyección aguda de insulina en el VTA puede disminuir la recompensa de los alimentos23, 24, mientras que los ratones que carecen de InsR en las neuronas VTA y SNc DA muestran una mayor ingesta de alimentos y se vuelven obesos25. Aunque la insulina puede inducir una depresión a largo plazo de la entrada excitadora a las neuronas VTA DA24La exposición a la insulina también puede aumentar la tasa de activación de las neuronas DA, posiblemente al disminuir la liberación de DA y la inhibición mediada por los autorreceptores.25. El efecto neto de la insulina en la liberación de DA estriatal es, por lo tanto, difícil de predecir. De hecho, los resultados de los estudios de la influencia de la insulina en la liberación estriatal de DA en ex vivo rebanadas19 y el efecto de la microinyección local de insulina en la NAc en la recompensa de alimentos26 Parece ser contradictorio. Para resolver esto, evaluamos la liberación y absorción de DA axonal en el microambiente intacto de la NAc y la CPu en ex vivo cortes estriatales que utilizan voltametría cíclica de barrido rápido (FCV) y determinaron los efectos de la señalización de insulina en la NAc sobre el comportamiento de recompensa in vivo.
Nuestros estudios muestran que el efecto primario de la insulina en NAc y CPu es mejorar la liberación de DA, a pesar de un aumento simultáneo en la absorción de DA. Esta regulación dinámica de la liberación de DA implica un aumento dependiente de la insulina en la excitabilidad de las interneuronas colinérgicas estriatales (ChIs), lo que conduce a una liberación aumentada de DA a través de la activación de los receptores nicotínicos de acetilcolina (ACh) (nAChRs). La influencia de la insulina en ChIs y en la liberación de DA es mediada por InsRs. En particular, el efecto de la insulina en la liberación de DA se amplifica en cortes de ratas FR, pero se atenúa en ratas con una dieta obesogénica (OB). Estos datos muestran la amplificación de la liberación de DA en ex vivo los cortes de insulina conducen a la predicción de que la insulina podría actuar como una señal de recompensa in vivo. De hecho, los estudios de comportamiento paralelos demuestran un papel para la insulina en la capa de NAc en el condicionamiento de preferencia de sabor. En conjunto, estos hallazgos indican un nuevo papel para la insulina como una señal de recompensa que puede influir en la elección de los alimentos
Resultados
La insulina que actúa en InsR aumenta la liberación de DA estriatal evocada
Examen inicial de evocado localmente [DA]o monitoreado con FCV en ex vivo rodajas estriadas de ratas con ad libitum (AL) el acceso a los alimentos y al agua reveló el hallazgo inesperado de que la aplicación aguda de insulina en un rango de concentraciones fisiológicamente relevantes1, 4 aumento de un solo pulso evocado [DA]o (Fig. 1a – c), con insulina EC50 valores (la concentración a la que el efecto fue medio máximo) de 2 – 12 nM (Fig. 1b). Incrementado evocado [DA]o fue particularmente sorprendente, dado que esto fue acompañado por un aumento significativo en la tasa máxima (Vmax) para la captación mediada por DAT en cada subregión (Tabla 1), lo que llevaría a una disminución competitiva en evocada [DA]ocomo se informó anteriormente22, 23. En cambio, encontramos que evoca [DA].o se amplificó al máximo 20 – 55% por la insulina 30 nM; la región con el mayor efecto proporcional fue la concha NAc, que es la subregión estriatal con la mayor expresión de InsR1, 14. Las rodajas expuestas a la insulina 30 nM en condiciones idénticas no mostraron cambios en el contenido de DA estriatal (Fig. 1a complementaria), lo que implica que la insulina altera la regulación de la liberación dinámica, en lugar de simplemente regular la síntesis de DA. En particular, el efecto de la insulina en evocado [DA]o se perdió a concentraciones suprafisiológicas ≥100 nM (Fig. 1b). Esto no fue el resultado de un aumento en la liberación de la actividad de DAT, ya que el efecto de la insulina en Vmax También se perdió en estas concentraciones (Tabla 1). En general, estos datos muestran que en el microentorno estriado intacto, el efecto predominante de la insulina en evocado [DA]o es aumentar la liberación, a pesar de un aumento simultáneo en la captación de DA.
Debido a que la insulina también puede actuar en los receptores 1 del factor de crecimiento similar a la insulina (IGF-1Rs), aunque en concentraciones superiores a 100 nM (ref. 1), intentamos confirmar que el efecto potenciador de la insulina en evocado [DA]o era InsR dependiente. Este resultó ser el caso, ya que el efecto fue prevenido por un inhibidor de InsR intracelular, ácido hidroxi-2-naftalenilmetilfosfónico (HNMPA), y por un antagonista de InsR, S961, pero no por un inhibidor selectivo de IGF-1Rs, picropodophyllina24 (PPP; Fig. 1c, d y Fig. 1b complementario, c). Luego examinamos la participación de la quinasa PI3, que inicia la vía de señalización responsable de la regulación de la DAT dependiente de la insulina.19. A una concentración de 1 μM, el inhibidor de P13K LY249002 solo no tuvo ningún efecto en el [DA] evocado por el picoo or Vmax (n= 29 – sitios 76 (núcleo NAc) por medicamento, P> 0.05, análisis de varianza unidireccional (ANOVA); datos no mostrados), pero evitó el efecto de la insulina en la [DA] evocadao en todas las subregiones estriatales (Fig. 1d y Fig. 1b complementario, c).
Localización de InsRs en axones DA y ChIs
El aumento observado en Vmax para la ingesta de DA con niveles fisiológicos de insulina implica la presencia de InsRs en los axones DA, al igual que los resultados previos en varias preparaciones estriatales18, 19, 20, 21, 22. Aunque la expresión funcional de InsRs en las neuronas DA del cerebro medio ha sido demostrada15, 23, 24, 25No se ha informado la expresión de InsR en los axones DA estriatales. Abordamos esto utilizando la inmunohistoquímica. La inmunorreactividad de InsR densa a lo largo del estriado limitó la evaluación cuantitativa de la localización de InsR en los axones DA, que se identificaron mediante inmunoreactividad para una enzima que sintetiza DA, la tirosina hidroxilasa (TH). Por lo tanto, adoptamos un protocolo previamente reportado.27, lo que implicó contar los puntos InsR que se superponen con los perfiles TH + en la vista de imagen normal y volver a contar después de que la imagen InsR solo se haya girado 90 °. Si la superposición aparente de los perfiles InsR y TH + no es específica, este procedimiento debe proporcionar recuentos estadísticamente similares, ya sea normal o 90 ° fuera de fase. Sin embargo, este análisis mostró una disminución en la superposición de InsR puncta con los perfiles TH + de 14 ± 9% (n= Campos 42, P<0.01, emparejado de dos colas t-prueba; datos no mostrados), confirmando la presencia de InsR en los axones DA. Sin embargo, de manera más intrigante, el inmunolablante InsR del estriado reveló una expresión distintiva de InsR en los cuerpos de células grandes que se identificaron como ChIs estriatales por el coinmunopeliquetado para la colina acetiltransferasa (ChAT), la enzima primaria requerida para la síntesis de ACh. Utilizando criterios electrofisiológicos.28 para identificar los ChI en estudios preliminares de registro de células completas, varias neuronas se rellenaron con biocitina y luego se procesaron para inmunohistoquímica; todos estos (4 / 4) fueron inmunopositivos para InsR y ChAT (Fig. 2a). La evaluación posterior de la co-localización de InsR y ChAT en la NAc confirmó que prácticamente todas las neuronas ChAT + expresaban InsR (96%; n= Neuronas 27 / 28 en cuatro secciones de dos ratas).
La insulina aumenta la excitabilidad del ChI.
Para probar la funcionalidad de InsRs en ChIs estriatales, examinamos el efecto de la insulina en la excitabilidad de ChI utilizando el registro de la pinza de corriente de células completas. La excitabilidad de ChI se evaluó utilizando una serie de pulsos de corriente de despolarización de 3-s para obtener un tren de potenciales de acción que exhibió de manera confiable la adaptación de la frecuencia de picos (Fig. 2b), a menudo con pérdida de clavos al final del pulso actual. Sorprendentemente, la insulina (30 nM) atenuó la adaptación de la frecuencia del pico, lo que resultó en un aumento progresivo en el número de potencial de acción con el tiempo (Fig. 2c), con un aumento máximo (Fig. 2d, e) se ven típicamente entre 20 y 50 mín. de exposición a la insulina. En ausencia de insulina, los ChI de control no mostraron cambios en el número de potenciales de acción evocados (P> 0.05, emparejado de dos colas t-prueba; datos no mostrados); Cuando se compararon con las neuronas de control monitoreadas durante el mismo intervalo de tiempo, las neuronas expuestas a la insulina mostraron un cambio significativamente mayor en el número de potenciales de acción evocados (control n= Pares de estímulos 12 de cuatro neuronas, insulina n= 21 pares de estímulos de siete neuronas, F1,25= 5.63, P<0.05, ANOVA bidireccional de medidas mixtas; datos no mostrados). El efecto de la insulina sobre el aumento del número de potenciales de acción fue evitado por HNMPA pero no por el inhibidor selectivo de IGF-1R PPP (Fig. 2e), lo que demuestra que el aumento de la excitabilidad de ChI por la insulina fue mediado por InsR.
Aumento de la insulina evocada [DA]o requiere nAChRs y ACh
Estudios anteriores han demostrado que ChIs y ACh regulan potentemente la liberación estriatal de DA a través de nAChRs en los axones DA29, 30, 31, 32, 33, 34. La abundante expresión de InsR en los ChI y la mejora en la excitabilidad del ChI observada con la exposición aguda a la insulina sugirieron que estas neuronas podrían ser nuevos objetivos para la insulina que podría conducir a una mayor liberación de DA. Para probar esto, examinamos el efecto de la insulina en presencia de mecamilamina, un antagonista no selectivo de nAChR, o dihydro-β-eritroidina (DHβE), un antagonista selectivo para los nAChR que contienen subunidades β2 (β2 *) que están enriquecidos con Axones DA35. Evocado [DA]o se detectó fácilmente en presencia de estos antagonistas, a pesar de que ambos fármacos disminuyeron la amplitud de [DA]o (por ejemplo, por 13 – 26% en el núcleo NAc), como se informó anteriormente29, 30, 31, 32. En apoyo de un papel para ACh y nAChRs, el efecto de la insulina en evocado [DA]o fue prevenido por mecamylamine o DHβE (Fig. 2f). Para confirmar la participación de la señalización de ACh estriatal en la liberación de DA mejorada con insulina, examinamos el efecto de la insulina en ex vivo cortes estriatales de ratones en los que la expresión de ChAT fue modificada genéticamente en estructuras del cerebro anterior (cerebro anterior) Charla Ratones KO), incluyendo el estriado32. Aunque los ChI están intactos en estos ratones, la síntesis de ACh se suprime, lo que conduce a una disminución, pero aún fácilmente detectable evocada en un solo pulso [DA]o, como se describió anteriormente32. En el control de los compañeros de camada heterocigotos, la insulina (30 nM) aumentó evocado [DA]o en NAc shell y core y en CPu por 37 – 90% (Fig. 2g), superando la amplificación observada en el estriado de rata (por ejemplo, ). Sin embargo, el efecto de la insulina en evocado [DA]o estuvo ausente en todo el complejo estriatal en cerebro anterior Charla Ratones KO, que demuestran que el aumento mediado por la insulina de la liberación de DA requiere ACh estriatal, pero no transmisores co-liberados de ChIs, como el glutamato36.
La influencia de la insulina en evocada [DA]o es dependiente de la dieta
Las concentraciones de insulina en plasma y cerebro son proporcionales a la adiposidad corporal.6, 7, 8, y podría conducir a cambios compensatorios en la sensibilidad del cerebro a la insulina. Por lo tanto, probamos la hipótesis de que la dieta influye en la capacidad de la insulina para promover la liberación de DA, utilizando rodajas estriatales de ratas mantenidas en controles crónicos o de dieta OB versus controles de AL. Como era de esperar, los niveles de insulina en plasma se correlacionaron con el peso corporal, con menor insulina en FR que en ratas AL o OB (Fig. 3a y Tabla 2). A pesar de estas diferencias en la insulina circulante, se evoca el pico [DA]o en NAc shell y core, y CPu fue significativamente menor en ex vivo Rodajas estriadas de ambos grupos de dieta en comparación con AL (Fig. 3b y Fig. Suplementaria 2 a, b), lo que implica que los factores además de la insulina gobiernan la evocación absoluta [DA]o. El contenido de DA estriado no difirió entre los grupos de dieta, lo que indica un cambio en la regulación de la liberación en lugar de en la síntesis de DA (Fig. 2c suplementario). De acuerdo con un cambio en la regulación dinámica, la sensibilidad de la liberación estriatal de DA a la insulina fue marcadamente dependiente de la dieta. En ratas FR, las concentraciones de insulina ≤1 nM, que no tuvieron efecto en AL (Fig. 1b), aumentado evocado [DA]o (Fig. 3c), reflejando una mayor sensibilidad a la insulina, con EC50 valores en el estriado FR (0.4 – 0.6 nM) que fueron aproximadamente un orden de magnitud más bajo que en AL (compare Higos 1b y 3c). En un contraste sorprendente, el efecto de la insulina se perdió en OB striatum; incluso la insulina 30 nM, que tuvo un efecto máximo en el estriado AL (Fig. 1b), no tuvo efecto en OB (Fig. 3c).
Estos datos implican una relación inversa entre la sensibilidad InsR estriatal y la adiposidad corporal. Sin embargo, alternativamente, estas diferencias dependientes de la dieta podrían reflejar una sensibilidad alterada al nAChR. Por lo tanto, determinamos la respuesta de concentración a la nicotina en el núcleo de NAc de cada grupo de dieta. La nicotina causa la desensibilización de nAChR, que puede cuantificarse comparando la proporción de [DA]o evocado por un breve tren de cinco pulsos en 100 Hz a [DA] de un solo impulso evocadoo (5 p: relación 1 p) como índice de activación / desensibilización nAChR30, 31. Usando este enfoque, no encontramos diferencias entre los grupos de dieta en la sensibilidad nAChR en el núcleo de NAc (Fig. Complementaria 3a – c). Además, la proporción de control 5 p: 1 p no difirió entre los grupos de dieta en el núcleo de NAc (Fig. 3d complementaria) o CPu (no ilustrado), lo que implica que la dieta no altera la regulación de liberación de DA dependiente de nAChR. Por lo tanto, la sensibilidad InsR estriatal parece aumentar en ratas FR versus AL, pero ausente en ratas OB, con pérdida de regulación de la liberación de DA estriatal en concentraciones fisiológicas de insulina.
NAc shell insulina modula la preferencia de sabor condicionado
Las preferencias alimentarias son generadas por factores pre y post ingestivos; los mecanismos para cada uno no se resuelven completamente, pero la evidencia actual implica la señalización NAc DA en ambos37, 38. Dado que los niveles de insulina en el plasma y el líquido cefalorraquídeo (LCR) aumentan rápidamente después de la elevación periférica de la glucosa6, y que se puede detectar un aumento de la insulina en el cuerpo estriado dentro de 5 min de la elevación de insulina en plasma7Es lógico suponer que la liberación de insulina periférica durante una comida podría mejorar la liberación de NAc DA y contribuir a los mecanismos de recompensa post-ingestivos. Adaptamos un protocolo de preferencia de sabor previamente descrito.37 con soluciones de glucosa endulzadas con sacarina en ratas para probar la hipótesis de que el bloqueo del efecto de la insulina endógena mediante la aplicación local de un anticuerpo de insulina (InsAb) en la NAc disminuiría la preferencia por el sabor pareado. La eficacia del InsAb para bloquear los efectos de la insulina se probó en una in vitro Ensayo de la captación de DA en los sinaptosomas estriados. La insulina (30 nM) causó un aumento significativo en Vmax en sinaptosomas de NAc o CPu (Fig. 4 suplementario), consistente con nuestro Vmax datos de cortes estriatales (Tabla 1) y con estudios previos.18, 19, 20, 21, 22, 23. En ausencia de insulina, ni InsAb ni un anticuerpo de control inmunoglobulina G (IgG) alteraron la Vmax para la captación de DA versus control. En presencia de IgG, la insulina todavía causó un aumento significativo en Vmax; sin embargo, el efecto de la insulina en Vmax se perdió en presencia de Insab (Fig. 4 suplementario).
Para minimizar el daño al tejido y preservar la sensibilidad del tejido objetivo, se probaron dos grupos de sujetos en los cuales alternamos la microinyección intra-NAc con un procedimiento de microinyección simulada, en lugar de utilizar un solo grupo de sujetos y emparejar una solución con sabor con InsAb y otro con vehículo. En consecuencia, durante las sesiones de acondicionamiento de una botella, el grupo experimental recibió microinyecciones de InsAb combinadas con uno de dos sabores, y en sesiones alternas, microinyecciones simuladas combinadas con el otro sabor (Fig. 4a, izquierda). El grupo de control recibió microinyecciones simuladas alternadas con microinyecciones de solución salina tamponada con fosfato (PBS) o IgG. Ambas soluciones con sabor contenían glucosa durante el acondicionamiento. No se esperaba una preferencia diferencial entre los sabores en el grupo de microinyección de control, mientras que se esperaba que la preferencia se desplazara hacia el sabor pareado de microinyección simulada en el grupo de microinyección de InsAb.
Durante las sesiones de acondicionamiento de una botella, la microinyección de InsAb redujo significativamente el consumo en comparación con el vehículo durante la tercera y cuarta infusiones (Fig. 4b). Por el contrario, ambos grupos consumieron el mismo volumen de solución durante las cuatro sesiones de inyección simulada (F3,111= 0.127, P>0.05, ANOVA bidireccional mixta) (Fig. 4b). Después de un total de ocho sesiones de acondicionamiento, se evaluó la preferencia de sabor en una prueba de dos botellas en la que las ratas tuvieron acceso a ambas soluciones de sabor simultáneamente (Fig. 4a). El análisis estadístico reveló una interacción significativa entre el sabor y el tratamiento de microinyección recibido durante el acondicionamiento (Fig. 4c). El grupo InsAb consumió significativamente menos del sabor emparejado InsAb en comparación con el sabor emparejado simulado (Fig. 4c), mientras que el grupo de vehículos no mostró preferencia de sabor (Fig. 4c), lo que implica que la señalización intacta de la insulina contribuyó a la selección de una solución calórica dulce. En comparación con el vehículo, las ratas con microinyección InsAb bebieron significativamente menos del sabor emparejado en infusión y significativamente más del sabor emparejado en inyección simulada (Fig. 4c). Microinyección de IgG (t(9) = 0.792. P>0.05, protegido t-pruebas) o PBS (t(9) = 0.442. P>0.05, protegido t-pruebas) no tuvieron efecto en la preferencia de sabor (datos no mostrados), argumentando en contra de la posibilidad de que un efecto no específico de la microinyección de InsAb redujera el consumo o la preferencia de sabor. También se debe tener en cuenta que la preferencia del grupo InsAb en la prueba no es una preferencia por el sabor menos novedoso, ya que no hubo interacción entre la sesión y el tipo de sesión (infusión real versus infusión simulada) para el grupo InsAb (F3,54= 1.584, P> 0.05, ANOVA bidireccional). Es decir, el grupo InsAb no consumió más del sabor emparejado con infusión simulada en comparación con el sabor emparejado con infusión InsAb; más bien, las diferencias entre los grupos de tratamiento solo surgieron durante las sesiones de acondicionamiento de infusión. En general, estos datos indican que la insulina en el NAc juega un papel en el refuerzo de la preferencia por un sabor que indica una carga glucémica.
Discusión
Informamos aquí que la insulina amplifica la liberación de DA estriatal de una manera dependiente de nAChR mediante la modulación de la excitabilidad ChI a través de InsRs. Nuestros resultados implican que la insulina puede servir como una señal de recompensa, además de su papel establecido en la señal de saciedad. En particular, el efecto de la insulina en la liberación de DA se modula por la dieta, con una sensibilidad notablemente aumentada a la insulina después de la FR, pero con una pérdida completa de la regulación potenciada por la insulina en una dieta OB. Estos cambios parecen reflejar cambios en la sensibilidad de InsR que están inversamente relacionados con los niveles de insulina en circulación, dado que se encontró que los niveles de insulina en plasma dependían de la dieta, pero la sensibilidad a nAChR no lo era. Finalmente, nuestros estudios de preferencia de sabor en animales que se comportan implican que la señalización de la insulina en la concha NAc influye en la preferencia alimenticia, lo que no solo implica la insulina en el aprendizaje relacionado con la comida, sino que también confirma su papel como señal de recompensa.
Net [DA]o refleja el equilibrio entre la liberación de DA y la captación de DA a través de DAT. Evidencia previa que demuestra que la insulina puede regular la actividad DAT.18, 19, 20, 21, 22, 23 llevó a la predicción de que un aumento en la insulina debería causar una disminución neta en la evocación [DA]o a través de una mayor captación de DA. Sin embargo, encontramos que en el cuerpo estriado, el efecto de la insulina es más complejo que esto. Aunque la exposición a la insulina aumentó Vmax para el DAT, el efecto primario de la insulina fue sobre la liberación de DA, no sobre la captación de DA, con un aumento constante de [DA]o a través de un rango fisiológico de concentraciones de insulina en NAc shell y core y en CPu. Aunque el aumento en evocado [DA]o volvió a los niveles de control a una concentración suprafisiológica de 100 nM, Vmax también se mantuvo sin cambios respecto al control, eliminando un efecto predominante en el DAT como una explicación. En cambio, la pérdida del efecto sobre la captación y la liberación implica la desensibilización de InsR o la regulación a la baja de las vías de señalización descendentes a altas concentraciones de insulina. De hecho, los InsR experimentan una rápida endocitosis y degradación después de la unión de la insulina en los tejidos periféricos.1, con evidencia emergente de pérdida de sensibilidad InsR neuronal después de la exposición a corto plazo a niveles altos de insulina o dietas altas en calorías10, 11, 39.
El efecto dominante de la insulina para mejorar la liberación estriatal de DA reportada aquí contrasta con los resultados de otros dos estudios recientes. ex vivo estudios de corte En la primera, la insulina causó una disminución en el desbordamiento eléctrico evocado de [3H] DA de cortes estriados, aunque aumentó [3H] Desbordamiento de DA se detectó cuando se inhibió el DAT22. Dado que liberado [3H] DA debe escapar de la captación mediada por DAT en todo el tejido para ser detectado en la solución de superfusión, este protocolo es especialmente sensible a la regulación de DAT. Nuestros resultados que muestran que la insulina mejora la liberación de DA a través de ChIs y la activación de nAChR, además de mejorar la captación mediada por DAT, explicarían el aumento aparentemente paradójico en la mejora de la insulina [3H] Desbordamiento de DA visto cuando se bloquearon los efectos de la competencia en el DAT22. El segundo estudio utilizó FCV para la detección directa de la liberación somatodendrítica de DA en el VTA, pero también encontró un efecto predominante de la insulina en la absorción de DA, que se refleja en la disminución de [DA]o (árbitro. 23). Diferencias en varios factores, desde microcircuitos locales hasta mecanismos de liberación somatodendríticos versus axonales de DA40, podria contribuir a esta diferencia regional. Sin embargo, como se explica más adelante, es probable que los roles de la insulina dependientes de la región sean complementarios, en lugar de contradictorios.
Anteriormente, se había asumido que cualquier función de la regulación dependiente de la insulina de la señalización de DA estaba mediada por la activación directa de InsRs en las neuronas DA. Aquí mostramos que los InsR también se expresan en los ChI estriatales, y que la insulina modula la excitabilidad de ChI para amplificar la liberación de DA estriatal, que puede jugar un papel fundamental en la influencia de la insulina en la dieta. Los ChI estriatales reciben proyecciones de las neuronas de los núcleos intralaminares del tálamo, que muestran disparos en respuesta a estímulos sensoriales salientes y ayudan a impulsar patrones de aumento de pausas en los ChI que son importantes para dirigir la atención, el refuerzo y el aprendizaje asociativo.41. Por lo tanto, la acción de la insulina en InsRs sobre los ChI estriatales podría mejorar el efecto de las señales sensoriales de los alimentos sobre la capacidad de respuesta estriatal al disparo talámico, contribuyendo a una mayor percepción del valor de recompensa de una comida ingerida. La promoción directa de la liberación estratificada de DA por la activación de ChI ha llevado a la sugerencia de que los factores que estimulan a los ChI tendrán un papel privilegiado como activadores de la liberación de DA33. Nuestros datos proporcionan la primera evidencia de respaldo de esto, con la excitabilidad de ChI mejorada con insulina y la señalización de ACh que impulsa aumentos dinámicos en la versión DA.
La liberación elevada de DA en presencia de insulina también argumenta en contra de una mejora en la señalización de ACh en un grado que causa la desensibilización del nAChR o la activación del receptor de ACh muscarínico (mAChR), cualquiera de los cuales puede suprimir [DA]o (refs 29, 30, 31, 42). Por lo tanto, los mecanismos informados aquí son distintos de la activación de ACh de mAChRs, que se ha asociado con aversión y saciedad.43.
[DA] de un solo pulso evocadoo fue menor en las ratas FR y OB que en las ratas AL; Aunque estos resultados están en consonancia con informes anteriores.44, 45, 46Nuestros estudios proporcionan la primera comparación sistemática de tres subregiones estriadas en los dos grupos de dieta en un marco de tiempo constante. Los mecanismos subyacentes a los cambios dependientes de la dieta en la liberación de DA no se han dilucidado, y están más allá del alcance de los estudios actuales. Sin embargo, dado que los niveles de insulina en plasma son alterados de manera opuesta por las dietas FR y OB, es poco probable que se evoque una disminución [DA]o En ambos grupos es consecuencia de los niveles de insulina dependientes de la dieta.
Por otro lado, los cambios en la sensibilidad de InsR con la dieta y los niveles de insulina plasmáticos consecuentes en la dieta proporcionan la explicación más probable del aumento de la sensibilidad a la insulina en FR y la pérdida de capacidad de respuesta a la insulina en OB. No hubo pruebas de la explicación alternativa de la alteración de la sensibilidad a nAChR en ratas FR o OB versus AL. Aunque nuestros hallazgos se encuentran entre los primeros en indicar una mayor sensibilidad del InsR estriatal con FR18, la pérdida de peso puede ir acompañada de una disminución de los niveles de insulina en el LCR7, lo que contribuiría a una mayor sensibilidad de la liberación de DA a la insulina en FR. Por el contrario, la pérdida de sensibilidad a la insulina en ratas OB es consistente con la evidencia previa de una disminución de la sensibilidad InsR cerebral inducida por el aumento de peso o las dietas OB3, 10, 11.
Nuestro ex vivo los datos de las rebanadas apoyan la hipótesis de que la insulina puede indicar tanto la recompensa como la saciedad. Probamos esta hipótesis bloqueando el efecto de la insulina endógena con microinyección InsAb bilateral en la cubierta de NAc durante el condicionamiento de preferencia de sabor. Consistente con un papel en la recompensa, el bloqueo del efecto de la insulina disminuyó la preferencia por el sabor de una solución pareada que contiene glucosa frente al sabor asociado con la señalización de la insulina intacta. El bloqueo de la insulina en la cubierta de NAc también redujo el consumo de una solución pareada durante el acondicionamiento de una botella, mientras que las microinyecciones simuladas o de control no tuvieron ningún efecto sobre el consumo. Estos datos sugieren que la insulina en la cáscara NAc desempeña un papel en las preferencias alimentarias. Estudios anteriores han demostrado que la señalización DA intacta en la NAc es necesaria para la adquisición del condicionamiento de sabor37, 38, confirmando un papel para NAc DA en la mediación de los efectos de refuerzo de las soluciones nutritivas. En este sentido, la preferencia por la solución de glucosa emparejada con la disponibilidad de insulina intacta discute un efecto primario de la insulina en la absorción de DA mediada por DAT en la capa de NAc, ya que se esperaría que esto disminuya [DA]o y por lo tanto disminuir el consumo del sabor control-emparejado. Nuestros resultados también son consistentes con los de un estudio previo en el que la microinyección de insulina en la capa de NAc aumentó el tiempo en que los animales se comprometieron en la autoadministración oral de sacarosa, con un aumento límite en el consumo de sacarosa.26, que fue opuesta a la consecuencia esperada de una mayor captación de DA. En general, estos datos de comportamiento son consistentes con la influencia predicha de la insulina en los ChI estriatales y la liberación mejorada de DA. Sin embargo, estos resultados no excluyen la participación de otros elementos de microcircuitos estriatales en los comportamientos monitoreados, dada la expresión generalizada de InsR en todo el estriado1, 14.
Los estudios presentados aquí proporcionan la primera evidencia de que la insulina desempeña un papel en la comunicación del valor calórico y, por lo tanto, los efectos gratificantes de una comida, lo que tiene implicaciones importantes para la influencia de la insulina en sujetos con bajo peso y obesos. Varios estudios indican que los efectos post-ingestivos de los alimentos, independientemente de si las vías de transducción del gusto están intactas47Incrementa la liberación de NAc DA y refuerza positivamente el comportamiento.37, 47. Por lo tanto, la respuesta de insulina postabsorbente puede codificar el rendimiento glucémico de una comida y contribuir al refuerzo de las preferencias y comportamientos alimentarios que permiten el consumo. Sin embargo, los cambios extremos en los niveles de insulina circulante y la sensibilidad al InsR central podrían tener un papel en el comportamiento anormal y adaptativo. Por ejemplo, la hipoinsulinemia y la regulación positiva compensatoria de la sensibilidad de InsR en sujetos con FR podrían ser un factor en su disposición para atracarse48. A la inversa, la insensibilidad a la insulina central en la diabetes tipo II o la obesidad, reflejada aquí en ratas OB, podría contribuir a una menor sensación de recompensa después de la ingestión, lo que impulsa la ingesta de alimentos con un alto índice glucémico como compensación49, 50. Por lo tanto, un aumento o una disminución en la sensibilidad a la insulina estriatal podría contribuir a la alimentación patológica, lo que resulta en una alimentación compulsiva y / o obesidad.
En general, nuestros hallazgos revelan un nuevo papel para la insulina como señal de recompensa. Este rol contrasta con su función conocida como señal de saciedad, incluidos los hallazgos recientes de que la insulina microinyectada en el VTA puede disminuir la alimentación hedónica y la preferencia por las señales asociadas con la recompensa de alimentos23, 24. Esto plantea la cuestión de cómo se pueden reconciliar los roles aparentemente opuestos de la insulina en estas funciones dependientes de DA. La respuesta puede ser que estos efectos son complementarios, en lugar de contradictorios. Los resultados actuales indican que la insulina en el cuerpo estriado comunica el valor de recompensa de una comida ingerida. Un doble papel en la señal de saciedad puede simplemente permitir que la insulina sirva para el importante propósito de terminar una comida, mientras que al mismo tiempo establece un recuerdo de sus cualidades nutricionales y, por lo tanto, gratificantes, lo que refuerza la repetición de la conducta de ingesta.
Métodos
Manejo de animales
Los procedimientos para animales se ajustaron a las pautas de los NIH y fueron aprobados por el Comité de Uso y Cuidado de Animales de la Escuela de Medicina de NYU. Todos los animales estaban en 12 h ciclo luz: oscuridad, con luces encendidas de 06: 00 a 18: 00; ex vivo Las rebanadas se prepararon entre 08: 00 y 12: 00. Se realizaron estudios mecanísticos en ratas y ratones AL en ex vivo rodajas de animales alojados en parejas, mientras que las ratas se alojaron individualmente para todas las comparaciones de grupos de dieta y para estudios de comportamiento.
Regimenes de dieta para ratas
Las ratas Sprague-Dawley macho adultas (Taconic) tenían 8-10 semanas de edad al inicio de los regímenes de dieta que duraron 21-30 días. Las ratas se asignaron de forma semi-aleatoria a los grupos de dieta: los sujetos se clasificaron por peso inicial, luego cada trío sucesivo de ratas se distribuyó al azar entre los grupos de dieta. Las ratas AL tuvieron acceso gratuito al chow de ratas durante el mismo período que las ratas pareadas en dietas FR u OB. Todas las ratas tenían acceso libre al agua. La restricción de alimentos se implementó como anteriormente51; brevemente, las ratas recibieron 40 – 50% de la ingesta diaria de AL de la comida estándar para ratas hasta que el peso corporal se redujo en 20%, luego de lo cual se valoró el alimento para mantener este peso. Las ratas OB tuvieron acceso gratuito al chow de ratas y al chocolate Asegurador, un líquido muy apetecible con grasas y azúcares moderadamente altos52.
Forebrain Charla ratones knockout
Ratones con un alelo floxed condicional de Charla (Charlaflox) se cruzaron con una Nkx2.1Cre Línea transgénica para producir ratones en los que la ablación de la síntesis de ACh está restringida al cerebro anterior.32. Compañeros de camada transgénicos no mutantes fueron controles; sus genotipos cre+;Charlaflox / + y Cre-;Charlaflox / flox son referidos como 'heterocigotos'. Ratones machos adultos utilizados para estudios de corte tenían ad libitum Acceso a comida y agua.
Ex vivo Preparación de cortes y soluciones fisiológicas.
Las ratas o los ratones se anestesiaron profundamente con 50 mg kg-1 pentobarbital (intraperitoneal (ip)) y decapitado. Para voltamperometría, se cortaron cortes del cerebro anterior coronal (300 – 400-μm de espesor) en un microtomo de cuchilla vibrante Leica VT1200S (Leica Microsystems; Bannockburn, IL) en CSF (aCSF) artificial con tampón HEPES frío: con hielo (120); NaHCO3 (20); glucosa (10); Ácido HEPES (6.7); KCl (5); Sal de sodio de HEPES (3.3); CaCl2 (2); y MgSO4 (2), equilibrado con 95% O2/ 5% CO2. Las rebanadas se mantuvieron en esta solución a temperatura ambiente durante 1 h antes de la experimentación.30, 32, 53. Para la electrofisiología, después de la anestesia, las ratas se perfundieron transcardialmente con una solución helada que contenía (en mM): sacarosa (225); KCl (2.5); CaCl2 (0.5); MgCl2 (7); NaHCO3 (28); NaH2PO4 (1.25); glucosa (7); ascorbato (1); y piruvato (3), y se equilibró con 95% O2/ 5% CO2. Las rebanadas se cortaron en esta solución, luego se transfirieron a una cámara de recuperación en aCSF modificado que contiene (en mM): NaCl (125); KCl (2.5); NaH2PO4 (1.25); NaHCO3 (25); MgCl2(1); CaCl2 (2); glucosa (25); ascorbato (1); piruvato (3); y myo-inositol (4), equilibrado con 95% O2/ 5% CO2; esta solución estaba inicialmente a 34 ° C, luego se dejó enfriar gradualmente a temperatura ambiente54. Todos los experimentos de voltametría y fisiología se realizaron en una cámara de registro de inmersión a 32 ° C que se sobrefundió a 1.5 ml min.-1 con un CSF que contiene (en mM): NaCl (124); KCl (3.7); NaHCO3 (26); CaCl2 (2.4); MgSO4 (1.3); KH2PO4 (1.3); y glucosa (10), y albúmina de suero bovino (BSA, 0.05 – 0.1 mg ml)-1) equilibrado con 95% O2/ 5% CO2; Las rebanadas se dejaron equilibrar en este entorno durante 30 min antes de la experimentación.
Voltametría cíclica de barrido rápido
Los estudios de liberación de DA evocados se realizaron utilizando FCV en cortes de cerebro32, 53 preparado a partir de ratas macho o Charla ratones knockout del cerebro anterior y controles heterocigotos (semanas 5 – 8). Estudios en Charla los ratones knockout fueron cegados, pero los grupos de dieta de ratas tenían fenotipos obvios que impedían el cegamiento. Las mediciones voltimétricas se realizaron con un voltímetro Millar (disponible por pedido especial al Dr. Julian Miller en St Bartholomew's y la Royal London School of Medicine and Dentistry, Universidad de Londres). Se usó una forma de onda de triángulo convencional para FCV, con un rango de exploración de −0.7 a + 1.3 V (frente a Ag / AgCl), velocidad de exploración de 800 V s-1, e intervalo de muestreo de 100 ms.30, 32, 53. Los datos se adquirieron utilizando una placa DigiData 1200B A / D controlada por el software Clampex 7.0 (Molecular Devices). La liberación de DA se evocó usando un electrodo de estimulación concéntrica; la amplitud del pulso del estímulo fue 0.4 – 0.6 mA y la duración fue 100 μs30, 32, 53. Se usó estimulación local de un solo pulso en el núcleo NAc y la CPu; sin embargo, se utilizó un breve tren de pulsos de alta frecuencia (cinco pulsos a 100 Hz) para amplificar evocado [DA]o en la concha NAc. Ambos paradigmas de estímulo evocan liberación de DA que es potencial de acción y Ca2+ dependiente, no afectado por glutamato y GABA liberados simultáneamente42, 55, y facilitado por ACh simultáneamente lanzado29, 30, 31, 32, 33, 34. Para cuantificar evocado [DA]oLos electrodos se calibraron con concentraciones conocidas de DA a 32 ° C después de cada experimento en aCSF y en presencia de cada fármaco utilizado durante un experimento dado.53.
Experimentos de voltametría para evaluar el efecto de la insulina en evocado [DA]o Se obtuvieron utilizando cualquiera de los dos protocolos. Los experimentos iniciales para determinar el curso del tiempo para el efecto de la insulina (Sigma, I5523) se realizaron monitoreando evocado [DA]o Cada 5 min en un solo sitio. La insulina se aplicó después de evocar consistentemente [DA]o se obtuvo (típicamente medidas 4 – 5); el efecto de la insulina fue máximo después de 50 – 60 min, y luego evocó [DA]o permaneció en este nivel durante la duración del experimento (por lo general, la exposición a la insulina total mínima de 90; Fig. 1c). Posteriormente, el efecto de la insulina se evaluó mediante el registro evocado [DA]o en 4 – 5 sitios discretos en cortes (+ 1.5 mm desde bregma) en cada una de las tres subregiones estriatales en condiciones de control (aCSF o aCSF más medicamento) y nuevamente en el momento del efecto de insulina máximo (muestreo sobre 60 – XUMX min), luego estas muestras fueron promediadas para cada subregión. El efecto de la insulina disminuyó con el tiempo después de la preparación de la rebanada; para minimizar el tiempo ex vivo y para optimizar el uso del animal, típicamente, se probaron dos rebanadas de un animal dado en la cámara de registro al mismo tiempo. Los fármacos utilizados para desafiar el efecto de la insulina se aplicaron 15 min antes de la insulina a través de la superfusión de aCSF, incluido el éster trisacetoximetílico de HNMPA (HNMPA-AM).3; Enzo Life Sciences), S961 (Novo Nordisk), LY294002 (Sigma), picropodofilotoxina (PPP; Tocris), mecamilamina (Tocris) y DHβE (Tocris). Como se describe en Resultados, se probó la posible sensibilidad alterada de los receptores nicotínicos de ACh entre los grupos de dieta comparando la proporción de pico [DA]o evocado por 5 p (100 Hz) con el evocado por 1 p evocado (5 p: relación 1 p)30, 31 en el núcleo de NAc en presencia de 0 – 500 nM nicotina (Sigma).
Determinación de V max de evocado [DA]o transitorios en rodajas de estriado
Para evaluar los cambios inducidos por la insulina en la absorción de DA mediada por DAT, la porción inicial de la fase de caída de la evocada [DA]o Las curvas se ajustaron a la ecuación de Michaelis-Menten para extraer Vmax (constante de velocidad de captación máxima)56. Km (que está inversamente relacionado con la afinidad de la DAT para DA) se fijó en 0.2 μM y se sabe que es similar en las subregiones estriatales57 y no afectado por la insulina (ver Fig. 4 suplementario subtítulo).
Grabación de célula completa
Se prepararon cortes de cerebro desde ratas macho de 29 a 35 de un día; Las condiciones de grabación fueron idénticas a las utilizadas en los estudios de liberación de DA. Celdas completas grabaciones de corriente de abrazadera utilizan métodos convencionales54. Los ChI estriatales se visualizaron utilizando un microscopio Olympus BX51WI (Olympus America, Center Valley, PA) con ópticas de contraste de infrarrojos de interferencia diferencial y un objetivo de inmersión en agua × 40. La solución de la pipeta contenía (en mM): K-gluconato (129); KCl (11); HEPES (10); MgCl2 (2); EGTA (1); N / A2-ATP (2); N / A3-GTP (0.3); y ajustado a pH 7.2 – 7.3 con KOH. Para que las neuronas registradas se evaluaran en cuanto a la inmunorreactividad de ChAT, se incluyó 0.3% de biocitina en la solución de la pipeta y las neuronas se registraron brevemente (~ 5 min) para minimizar la dilución de los contenidos intracelulares. La resistencia de la pipeta fue ~ 3 – 5 MΩ. Las grabaciones se obtuvieron utilizando un amplificador Axopatch 200B (Molecular Devices, Sunnyvale CA) y se filtraron en paso bajo a 2 kHz. Los ChIs fueron identificados por criterios electrofisiológicos establecidos.28; la mayoría eran inicialmente tónicamente activas, pero la actividad disminuía de manera variable después de parchear. Sin embargo, la capacidad de respuesta a la inyección actual fue generalmente robusta y consistente con el tiempo y, por lo tanto, se usó para investigar el efecto de la insulina en la excitabilidad de ChI (ver Resultados). En experimentos para examinar el papel de InsRs e IGF-1Rs en esta respuesta, se aplicó HNMPA o PPP al menos 20 min antes de parchear un ChI. Los efectos máximos de la insulina sola se observaron típicamente después de ~ 16 min de exposición, aunque en algunas células, el aumento no fue máximo hasta 50 min o más. Además, en cuatro de las seis neuronas registradas en PPP, la insulina causó una disminución inicial en el número de picos antes de recuperarse y sobrepasar el número de picos de inicio. En consecuencia, en todos los experimentos, el efecto de la insulina se cuantificó comparando el efecto máximo en el número de picos con el número de picos evocados inmediatamente antes de la aplicación de insulina. La diferencia aparente en el tiempo para alcanzar el efecto máximo podría reflejar una serie de factores, incluida la profundidad de la celda registrada en la división. Los potenciales de acción evocados también se registraron en los ChI en ausencia de insulina en puntos de tiempo comparables.
Cromatografía líquida de alto rendimiento.
El contenido de DA de cortes de estriado de rata (400-μm de espesor) se determinó mediante cromatografía líquida de alto rendimiento con detección electroquímica58. Los pares de rebanadas se equilibraron durante 30 min a 32 ° C en aCSF, y luego se incubó una rebanada por par durante un 60 min adicional a 32 ° C en aCSF, mientras que la otra se incubó en aCSF con 10 o 30 nM insulin. Para las comparaciones de grupos de dieta, el tejido estriado se recolectó entre 30-60 min después de la recuperación. Después de la incubación, se eliminó cuidadosamente el exceso de aCSF de las rodajas, se pesó una muestra de tejido del cuerpo estriado (7-10 mg), se congeló en hielo seco y luego se almacenó a −80 ° C. El día del análisis, las muestras se sonicaron en hielo, eluyente, se desoxigenaron con argón.58, centrifugado en una microcentrífuga para 2 min, y el sobrenadante se inyectó directamente en la columna de HPLC (BAS, West Lafayette, IN); el detector fue un electrodo de carbono vítreo ajustado a 0.7 V frente a Ag / AgCl.
Inmunohistoquímica
Para el etiquetado inmunohistoquímico, las ratas se anestesiaron con pentobarbital sódico (50 mg kg).-1, ip), luego perfundido transcardialmente con PBS (154 mM NaCl en 10 mM buffer fosfato, pH 7.2) seguido de 4% de paraformaldehído en este PBS; Los cerebros se extrajeron y las secciones coronales (20 μm) se cortaron y procesaron de manera convencional27, 59. Las imágenes de inmunofluorescencia se obtuvieron con un microscopio confocal Nikon PM 800 equipado con una cámara digital controlada por el software Spot (Diagnostic Instruments Inc.) y utilizando un objetivo × 100 (apertura numérica = 1.4) o con un microscopio confocal Zeiss LSM 510 utilizando un x 63 Objetivo (apertura numérica = 1.2). Los láseres fueron argón (488 nm), He / Ne (543 nm) y He / Ne (633 nm). Los filtros apropiados para cada láser fueron seleccionados por el software de microscopio confocal. El tamaño del orificio varió según el objetivo utilizado y el grosor de sección seleccionado en zgeneración de pilas; elegimos el valor de orificio óptimo indicado por el software (generalmente 30 μm). Los archivos digitales se analizaron con el software de deconvolución (AutoQuant Imaging), y las imágenes finales se procesaron con Adobe Photoshop 7.0. Todas las imágenes fueron ajustadas para brillo y contraste; Tales ajustes se hicieron uniformemente a todas las partes de la imagen. Los axones estriatales DA se identificaron utilizando dos anticuerpos TH: anticuerpos policlonales AB152 de conejo anti-TH (1: 800) y monoclonales de ratón MAB318 anti-TH (1: 500) (ambos de Chemicon). Se utilizaron tres anticuerpos InsR: sc-57342 y sc-09 (1: 100; Santa Cruz), y PP5 (un regalo de Pfizer). La especificidad de cada uno ha sido demostrada previamente.60, 61, y se confirmó en los presentes estudios por la ausencia de inmunomarcaje con anticuerpos sc-57342 o PP5 en presencia del péptido bloqueante correspondiente. El anticuerpo ChAT fue AB144 (1: 200; Millipore), y la biotina fue de Vector (1: 200). Los anticuerpos secundarios utilizados fueron el anti-conejo burro Alexa 488 (Invitrogen), o el burro anti-conejo Cy2 (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME), el burro anti-cabra Cy3 (Jackson) y el burro anti-ratón Cy5 (Jackson).
Para evaluar la co-localización de InsRs en axones TH +, utilizamos los métodos descritos anteriormente para identificar la presencia de Kir6.2, la subunidad de formación de poros de K sensible a ATP+ canales en los axones DA27. Los puntos representativos de los InsR se distribuyeron a lo largo de las imágenes ajustadas, lo que indica que la superposición con la inmunorreactividad TH puede ocurrir en cierto grado por casualidad. Para probar esta suposición, contamos las superposiciones InsR / TH en campos independientes de 42 en tres secciones inmunolabladas NAc de dos ratas. Los archivos digitales InsR se rotaron 90 ° en sentido horario y se repitieron los conteos; la rotación disminuyó el número de puntos InsR que se co-localizó con TH en la mayoría de los campos (ver Resultados). La disminución del número de superposiciones con rotación.27 indicó la proporción de puntos de InsR en cada campo estriatal asociado con los axones DA.
Glucemia e insulina ELISA
La sangre del tronco se recolectó en el momento de la decapitación para los estudios de corte. La glucosa en sangre se determinó de inmediato con un monitor de glucosa en sangre estándar. Para la insulina, se extrajo sangre adicional en tubos que contenían EDTA y se centrifugó en 1,500g para 15 min; el sobrenadante (plasma) se recolectó y almacenó a -80 ° C hasta su procesamiento con un kit de ELISA para Insulina de Rata ALPCO.
Colocación de la cánula y verificación histológica.
Se anestesiaron cuarenta y un ratas adultas Sprague-Dawley (Taconic y Charles River) que pesaban 350-425 con cetamina (100 mg kg)-1, ip) y xilazina (10 mg kg)-1, ip) e implantado estereotáxicamente con dos cánulas guía crónicas permanentes (calibre 26) colocadas bilateralmente 2.0 mm dorsal a los sitios de infusión en la cáscara interna del NAc62 (1.6 mm anterior a bregma; 2.1 mm lateral a la sutura sagital, puntas en ángulo 8 ° hacia la línea media, 5.8 mm ventral a la superficie del cráneo). Las ratas recibieron banamina (2.0 mg kg)-1, subcutánea) como analgésico postquirúrgico después de la recuperación de la anestesia y la mañana siguiente. Una semana después de la cirugía, las ratas se colocaron en FR (descrito anteriormente) y se mantuvieron en 80% de su peso de recuperación postquirúrgico durante el resto del estudio. La colocación de la cánula se determinó histológicamente después de completar las pruebas de comportamiento. Cada rata se mató con CO2, decapitado y el cerebro extraído y fijado en formalina tamponada al 10% durante> 48 h. Se cortaron secciones coronales congeladas (40 µm de grosor) en un criostato Reichert-Jung, se montaron para descongelar en portaobjetos de vidrio recubiertos de gelatina y se tiñeron con violeta de cresilo. Los datos de una rata determinada se utilizaron solo si ambas cánulas estaban dentro del caparazón de NAc medial62 (incluido el borde del tubérculo de la concha / núcleo o concha / olfativo) (Fig. 5 suplementario); basado en estos criterios, dos ratas fueron excluidas del análisis final.
Pre-exposición condicionante sabor de preferencia.
Las ratas recibieron una sesión durante la noche (en jaula casera) y seis sesiones de preexposición (en cámaras de prueba) de 30-min por día a 0.2% de sacarina sódica (Sigma) en agua con un intervalo de 48-h entre sesiones. Luego, las ratas recibieron dos sesiones 5-min-por día de exposición a 0.2% de sacarina sódica en 0.05% de Kool-Aid de uva o cereza sin azúcar (Kraft Foods) en agua. Para la primera sesión de pre-exposición de Kool-Aid, la mitad de las ratas recibieron una solución con sabor a cereza, y la otra mitad recibió una solución con sabor a uva. Los sabores se invirtieron en la segunda sesión de pre-exposición de Kool-Aid para asegurar que todas las ratas muestrearan cada sabor. La ingesta se midió para todas las sesiones de pre-exposición. Las cámaras de prueba eran jaulas de plástico transparente con ropa de cama nueva. Para todas las sesiones de pre-exposición, las ratas tuvieron acceso a la misma solución en ambos lados de la cámara. A excepción de la sesión previa a la exposición durante la noche, todas las sesiones se llevaron a cabo en una sala de procedimientos conductuales, con un período de habituación de 30-min antes de cualquier entrenamiento o prueba.
Acondicionamiento de una botella
Estudios anteriores han demostrado que la microinyección de InsAb en el hipotálamo ventromedial puede bloquear el efecto de la insulina en el comportamiento de alimentación y la secreción de glucagón.63, 64. Aquí utilizamos este enfoque para evaluar un posible papel de la insulina en el refuerzo de la elección de alimentos. Las ratas se asignaron de forma semi-aleatoria en función del volumen de ingesta promedio previo a la exposición en dos grupos, control o experimental (InsAb). En el grupo de control, las ratas recibieron vehículo (microinyección PBS; 137 mM NaCl y 2.7 mM KCl en 10 mM fosfato tampón) o IgG (Abcam ab81032; 0.5 μg μl-1 en PBS, tal como se recibió) microinyección en envoltura NAc antes de consumir una de las dos soluciones con sabor, y una microinyección simulada antes de consumir la otra solución con sabor. En el grupo experimental, las ratas recibieron una microinyección de concha NAc de InsAb (Abcam ab46707; 0.5 μl de 1 μg μl-1 en PBS, según se recibió) antes de la exposición a una solución con sabor, y una microinyección simulada antes de la exposición a la otra. Se utilizaron dos grupos de sujetos con alternancia entre microinyección de fluido y microinyección simulada, de modo que el número total de microinyecciones se limitó a cuatro, lo que minimiza el posible daño tisular y la pérdida de sensibilidad en el lugar de la microinyección.65. Para la microinyección de fluido, la solución de control o InsAb se cargaron en dos tramos de 30-cm de tubo PE-50 unidos en un extremo a 5 μl de jeringas Hamilton llenas de agua destilada y en el otro extremo a una cánula de inyección de calibre 31, que extendió 2.0 mm más allá de las guías implantadas. Los volúmenes de infusión de 0.5 μl se administraron a través de 90 s a una velocidad de 0.005 μl s-1; el inyector se dejó en su lugar durante ~ 60 s para permitir el tiempo de difusión, luego el inyector se reemplazó con el estilete.
Las ratas se transfirieron directamente a las cámaras de comportamiento dentro de 2 min. Una vez completada la microinyección o microinyección simulada. Las soluciones de acondicionamiento contenían 0.2% de sacarina sódica, 0.05% de uva o cereza sin azúcar Kool-Aid y 0.8% de glucosa. El acceso a la solución se limitó a 30 min por sesión. El sabor emparejado y el lado de la cámara con acceso para beber se asignaron de forma semi-aleatoria y se equilibraron en cada grupo. El intervalo entre microinyecciones fue al menos 72 h, alternando entre sesiones de infusión y simulacros para un total de ocho sesiones de acondicionamiento.
Prueba de preferencia de dos botellas
Cuarenta y ocho horas después de la última sesión de acondicionamiento, las ratas se colocaron en cámaras de prueba con acceso simultáneo a ambos sabores de acondicionamiento; Las soluciones fueron 0.2% de sacarina sódica en 0.05% de uva o cereza Kool-Aid, sin glucosa. Las pruebas se realizaron durante los días 2 (60 min por día). La posición del tubo para beber que contenía una solución de pares simulados o de infusión se alternó para asegurar que cada rata se probara para el consumo de cada solución en ambos lados de la jaula. La ingesta de cada solución con sabor se promedió durante los dos días de prueba para determinar la preferencia.
[3H] Captación de DA en los sinaptosomas del cuerpo estriado para evaluar la eficacia de InsAb
Sinaptosomas estriados21, 66 se prepararon a partir de ratas AL (macho, 350-400 g), con NAc (concha y núcleo) y CPu disecadas y preparadas por separado. El tejido de cada región se homogeneizó en volúmenes 15 de una solución de sacarosa 0.32 M helada en un homogeneizador de vidrio con una maja de teflón accionada por motor; después del aclarado y centrifugación, el sedimento final se resuspendió en sacarosa 0.32 M enfriada con hielo.21, 66. Antes de iniciar el [3H] ensayo de captación de DA66, se incubaron alícuotas sinaptosómicas en un volumen total de 180 μl de tampón de absorción en un agitador durante 15 mín. a 30 ° C en presencia o ausencia de insulina 30 nM, en el vehículo (PBS) o en InsAb (dilución final 1: 500) , en IgG (dilución final 1: 500) o en vehículo. El tampón de captación contenía (en mM): NaCl (122); N / A2HPO4 (3); NaH2PO4 (15); KCl (5); MgSO4 (1.2); glucosa (10), CaCl2 (1); nialamida (0.01); tropolona (0.1); y ácido ascórbico (0.001), pH 7.4. Captación de [3H] DA se inició al dispensar rápidamente 20 μl de cada suspensión sinaptosomal en las placas de pocillos 96 con concentraciones variables de DA (0.003 – 1.0 μM) y [3H] DA (5 nM); después de 5 min en un agitador de placas a 25 ° C, la captación se terminó por filtración en vacío rápida y fría66. Las cuentas por pocillo se convirtieron en pmoles, luego se corrigieron a mg de proteína total por minuto. Todos los ensayos se realizaron por triplicado y se repitieron al menos cuatro veces; Vmax y Km se calcularon utilizando el software Biosoft Kell Radlig (Cambridge, Reino Unido).
análisis estadístico
Los datos se dan como medios ± sem; Se evaluó la significación utilizando alumnas pareadas o no pareadas. t-Pruebas o ANOVA, a menos que se indique lo contrario. Para datos de voltametría, n es el número de sitios de registro, dado que la variabilidad de sitio a sitio dentro de una subregión estriada es mayor que la variabilidad entre animales o entre cortes30, 32, 55, 56; Se anota el número de animal para cada conjunto de datos. La CE50 para el efecto de la insulina y la nicotina en el pico evocado [DA]o se calculó utilizando Prism 6.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Para los datos electrofisiológicos, la significación estadística se evaluó utilizando pares t-pruebas o una prueba de Wilcoxon en Prism 6.0, o una mezcla de ANOVA de dos vías en SAS 9.3 (SAS Institute Inc., Cary, NC). Para evaluar la participación de la insulina en el condicionamiento de preferencia de sabor, se completaron dos estudios completos utilizando protocolos que fueron idénticos, con la excepción del tratamiento con vehículo utilizado. En el primer estudio, las ratas 10 recibieron infusiones de vehículo de PBS y 9 recibieron infusiones de InsAB. En el segundo estudio, las ratas 10 recibieron infusiones de vehículo de IgG y 10 recibieron infusiones de InsAb. No hubo diferencias significativas entre los dos grupos de vehículos (PBS o IgG) durante las sesiones de acondicionamiento de la infusión (F19= 0.619, ANOVA mixto de dos vías) con medidas repetidas en la sesión de acondicionamiento de infusión) o en la prueba (F19= 0.012, ANOVA mixto bidireccional con medidas repetidas en el sabor). En consecuencia, los dos experimentos se combinaron para su análisis. Para este análisis, se utilizó un ANOVA mixto 2 × 4 (con medidas repetidas en el día de acondicionamiento de infusión) para determinar los efectos del tratamiento de microinyección durante el acondicionamiento, seguido de t-pruebas (una cola para determinar en qué sesiones de acondicionamiento el tratamiento con microinyección disminuyó el volumen de admisión). El mismo análisis se completó para las sesiones de condicionamiento simulado. Para determinar el efecto del tratamiento de acondicionamiento durante una prueba de preferencia de sabor de dos botellas, los datos se analizaron utilizando un ANOVA de dos vías mixto (con medidas repetidas en el sabor), seguido de t-pruebas (una cola para probar la hipótesis de que InsAb disminuiría la preferencia).
Información Adicional
Cómo citar este artículo: Stouffer, MA et al. La insulina mejora la liberación de dopamina estriatal mediante la activación de las interneuronas colinérgicas y, por lo tanto, señala la recompensa. Nat. Comun. 6: 8543 doi: 10.1038 / ncomms9543 (2015).
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Agradecimientos
Estos estudios fueron apoyados por las becas NIH DA033811 (MER, KDC y MEAR), NS036362 (MER), DA03956 (KDC) y el Premio al Investigador Independiente NARSAD (KDC). S961 fue un generoso regalo del Dr. Lauge Schaffer, Novo Nordisk. El anticuerpo PP5 fue un generoso regalo de Pfizer. Agradecemos al Dr. Charles Nicholson, Facultad de Medicina de la Universidad de Nueva York por el software que extraemos Vmax valores de los datos de FCV.