La dieta alta en grasa prolongada reduce la recaptación de dopamina sin alterar la expresión del gen DAT (2013)

  • Jackson J. Cone,
  • Elena H. Chartoff,
  • David N. Potter,
  • Stephanie R. Ebner,
  • Mitchell F. Roitman

Compendio

El desarrollo de la obesidad inducida por la dieta (DIO) puede alterar potentemente múltiples aspectos de la señalización de dopamina, incluida la expresión del transportador de dopamina (DAT) y la recaptación de dopamina. Sin embargo, el curso temporal de los cambios inducidos por la dieta en la expresión y función de la DAT y si dichos cambios dependen del desarrollo de la DIO sigue sin resolverse. Aquí, alimentamos a ratas con una dieta alta en grasa (HFD) o baja (LFD) durante las semanas 2 o 6. Después de la exposición a la dieta, las ratas se anestesiaron con uretano y se evaluó la función DAT del estriado estimulando eléctricamente los cuerpos celulares de dopamina en el área tegmental ventral (VTA) y registrando los cambios resultantes en la concentración de dopamina en el estriado ventral usando voltamperometría cíclica de barrido rápido. También cuantificamos el efecto de la HFD en la DAT asociada a la membrana en fracciones de células del estriado de un grupo separado de ratas después de la exposición al mismo protocolo de dieta. En particular, ninguno de nuestros grupos de tratamiento difirió en peso corporal. Encontramos un déficit en la tasa de recaptación de dopamina en ratas HFD en relación con ratas LFD después de 6 pero no de 2 semanas de exposición a la dieta. Además, el aumento en la dopamina evocada después de un desafío farmacológico de la cocaína se atenuó significativamente en la DFH en relación con las ratas LFD. El análisis de transferencia Western reveló que no hubo efecto de la dieta sobre la proteína DAT total. Sin embargo, las semanas 6 de exposición a la HFD redujeron significativamente la isoforma 50 kDa DAT en una fracción asociada a la membrana sinaptosómica, pero no en una fracción asociada con el reciclado de endosomas. Nuestros datos proporcionan evidencia adicional de alteraciones inducidas por la dieta en la recaptación de dopamina independientemente de los cambios en la producción de DAT y demuestran que dichos cambios pueden manifestarse sin el desarrollo de DIO. 

Cita: Cono JJ, Chartoff EH, Potter DN, Ebner SR, Roitman MF (2013) La dieta alta en grasa prolongada reduce la recaptación de dopamina sin alterar la expresión del gen DAT. PLoS ONE 8 (3): e58251. doi: 10.1371 / journal.pone.0058251

Editor: Sidney Arthur Simon, Duke University Medical Center, Estados Unidos de América

Recibido: Octubre 26, 2012; Aceptado: Febrero 5, 2013; Publicado: Marzo 13, 2013

Copyright: © 2013 Cone et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido según los términos de la Licencia de Atribución de Creative Commons, que permite el uso, la distribución y la reproducción sin restricciones en cualquier medio, siempre que se acredite al autor original y la fuente.

Fondos: El proyecto descrito fue apoyado por los Institutos Nacionales de la Salud (NIH) que otorgan DA025634 (MFR) y T32-MH067631 del Programa de Capacitación en Neurociencia Biomédica (JJC). El Centro Nacional para los Recursos de Investigación y el Centro Nacional para el Avance de las Ciencias de la Traducción (NIH) brindaron apoyo adicional a través de la subvención UL1RR029877 (JJC) y el Consorcio Biomédico de Chicago con el apoyo de Searle Funds en The Chicago Community Trust (JJC). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los NIH o del Consorcio Biomédico de Chicago. Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Conflicto de intereses: Los autores han declarado que no existen intereses en pugna.

Introducción

El sobrepeso y la obesidad representan un porcentaje cada vez mayor de las poblaciones de los Estados Unidos y del mundo. [ 1 ], [ 2 ]. Si bien hay muchos caminos hacia la obesidad, tal vez una de las mayores amenazas para el peso corporal saludable es la prevalencia y el consumo de alimentos densamente calóricos y altamente sabrosos. [ 3 ]. De hecho, la densidad de energía (kcal / g) de los alimentos contribuye poderosamente al sobrepeso y la obesidad en adultos. [ 4 ], [ 5 ]. Los alimentos sabrosos evocan la liberación de dopamina en el cuerpo estriado tanto de humanos como de animales no humanos [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ] y las valoraciones subjetivas de la grasa en los alimentos se correlacionan positivamente con la fuerza de las respuestas neuronales en el estriado ventral [ 10 ]. Por lo tanto, la dopamina y el cuerpo estriado parecen contribuir a las preferencias de alimentos densos en energía. Recientemente, se demostró que las diferencias en la dieta pueden causar cambios simultáneos en los circuitos estriatales y en el comportamiento dirigido a los alimentos. [ 11 ]. Sin embargo, tal vez menos apreciada sea la creciente evidencia de que las diferencias en los alimentos ingeridos, especialmente con respecto a la grasa, pueden retroalimentar y alterar la señalización de la dopamina del estriado.

La señalización de dopamina estriada está regulada por varios factores, incluida la producción de dopamina por la enzima tirosina hidroxilasa, los receptores de dopamina pre- y postsinápticos y los transportadores presinápticos de dopamina (DAT), todos los cuales se han relacionado con la obesidad [ 12 ], [ 13 ]. Las alteraciones en el número o función DAT pueden alterar la esfera de influencia de la dopamina liberada y, en consecuencia, la función estriatal [ 14 ], [ 15 ]. Se ha demostrado que la insulina, liberada en respuesta a los alimentos ingeridos, influye en la función DAT [ 16 ], [ 17 ]. Por lo tanto, el DAT es uno de los posibles candidatos para los efectos de la dieta.

Recientemente, se han explorado las correlaciones entre la obesidad y la disponibilidad de DAT, así como las alteraciones inducidas por la dieta de la función de DAT. El índice de masa corporal (IMC) se correlaciona negativamente con la disponibilidad de DAT en el cuerpo estriado humano [ 18 ]. La unión a DAT, y por lo tanto la disponibilidad, se reduce en ratones alimentados con dieta alta en grasas (HFD) [ 19 ]. La obesidad inducida por DMF (DIO) se asocia con una tasa reducida de recaptación de dopamina por el DAT en ratas [ 20 ]. En conjunto, estos estudios sugieren que la obesidad establecida por el consumo de HFD puede influir poderosamente en los reguladores presinápticos críticos de la señalización de la dopamina, especialmente en el DAT. Sin embargo, el curso temporal de las alteraciones inducidas por la dieta en la señalización de dopamina y si el desarrollo de DIO es un requisito para que los cambios se manifiesten sigue siendo desconocido. Probamos la función DAT evocando la liberación de dopamina en el estriado ventral y cuantificando su tasa de recaptación en ratas utilizando voltametría cíclica de exploración rápida. Para determinar si la disminución de la recaptación de dopamina fue causada por la reducción de la expresión del gen DAT, medimos el ARNm de DAT en el área tegmental ventral y la sustancia negra mediante qRT-PCR en tiempo real. Además, utilizamos un procedimiento de fraccionamiento bioquímico y un análisis de transferencia de Western para evaluar los niveles de DAT del estriado en membranas sinaptosomales y endosómicas crudas. Las ratas tenían 2 o 6 semanas de dieta alta o baja en grasas, pero todas las mediciones se realizaron en ausencia de DIO. Nuestros resultados sugieren que el consumo prolongado de HFD, independiente de DIO, disminuye la tasa de recaptación de dopamina en el cuerpo estriado ventral sin disminuir la expresión de DAT.

Materiales y Métodos

Declaración de Ética

Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de la Salud. El protocolo fue aprobado por el Comité de Cuidado Animal en la Universidad de Illinois, Chicago. Toda la cirugía se realizó bajo anestesia con uretano, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento.

Materias

Se utilizaron ratas Sprague-Dawley macho estándar (n = 67), de aproximadamente 2 meses y con un peso de 225-275 g al llegar. Los animales se alojaron individualmente en jaulas de plástico (26.5 × 50 × 20 cm) en un ambiente controlado por temperatura (22 ° C) y humedad (30%) en un 12∶12 h light: ciclo oscuro (luces encendidas en 07∶00 h). Ratas aclimatadas a la instalación durante una semana con ad libitum Acceso a chow estándar de laboratorio y agua.

Ingesta de alimentos y mediciones de peso corporal

Después de la aclimatación, las ratas se pesaron y se asignaron al azar a los grupos 1 de 4 que se compensaron para el peso corporal inicial. Dos grupos se mantuvieron con una dieta baja en grasas (LFD; Research Diets, New Brunswick, NJ; D12450B; 10% de kilocalorías de grasa (3.85 kcal / g)). Los otros grupos de 2 se mantuvieron en HFD (Dietas de investigación; D12492; 60% de kilocalorías de la grasa (5.24 kcal / g)). Para cada dieta, las ratas se mantuvieron durante 2 o 6 semanas (semanas). Por lo tanto, los grupos 4 fueron: LFD-2 wk (n = 18), HFD-2 wk (n = 16), LFD-6 wk (n = 16) y HFD-6 wk (n = 17). Todos los grupos tuvieron ad libitum Acceso al agua. La ingesta de alimentos y las mediciones de peso corporal se realizaron tres veces por semana y los datos se informaron por separado para ratas sometidas a registros voltamétricos o análisis de proteína / mensaje DAT.

Procedimientos Quirúrgicos y Mediciones de Dopamina.

Después de la exposición a la dieta, se preparó un subconjunto de ratas que no difirieron en peso corporal para registros voltamétricos (LFD-2 semanas (n = 8), HFD-2 semanas (n = 6), LFD-6 semanas (n = 6) , y HFD-6 semanas (n = 7)) bajo anestesia de uretano (1.5 g / kg) [como en 9,21, 1.3]. Se colocó una cánula guía (Bioanalytical Systems, West Lafayette, IL) por encima del estriado ventral (1.5 mm anterior, 0.4 mm lateral del bregma), se implantó un electrodo de referencia de alambre de plata clorada (Ag / AgCl) en la corteza contralateral y ambos se fijado al cráneo con tornillos de acero inoxidable y cemento dental. Se insertó un micromanipulador que contenía un electrodo de fibra de carbono (CFE) en la cánula guía y se bajó el electrodo en el estriado ventral. El CFE y el electrodo de referencia se conectaron a un headstage y el potencial del CFE se escaneó de −1.3 a +400 V (frente a Ag / AgCl) y viceversa (10 V / s; 5.2 Hz). Luego se bajó gradualmente un electrodo de estimulación bipolar (Plastics One, Roanoke, VA) en el área tegmental ventral / sustancia negra pars compacta (VTA / SNpc; 1.0 mm posterior, 7.0 mm lateral e inicialmente 0.2 mm ventral desde bregma) en incrementos de 60 mm . En cada incremento, se entregó un tren de pulsos de corriente (4 pulsos, 60 ms por pulso, 400 Hz, XNUMX µA). Cuando el electrodo estimulante se coloca en el VTA / SNpc y el CFE está en el cuerpo estriado, la estimulación evoca de manera confiable la liberación de dopamina, extraída de datos voltamétricos mediante análisis de componentes principales [ 9 ], [ 22 ]; y se convierte en concentración después de que cada CFE se calibra en un sistema de inyección de flujo después de cada experimento [ 23 ]. La posición del electrodo de estimulación se optimizó para la liberación máxima. La CFE se dejó equilibrar durante 10 min antes de comenzar el experimento. La liberación de dopamina se evocó mediante la estimulación eléctrica de VTA / SNpc (los mismos parámetros anteriores), y los cambios resultantes en la concentración de dopamina se calcularon de −5 s a 10 s en relación con la estimulación. Inmediatamente después de la estimulación, a las ratas se les inyectó clorhidrato de cocaína disuelto en 0.9% de solución salina (10 mg / kg ip) y, una vez más tarde, se repitió la estimulación. Los voltajes aplicados, la adquisición de datos y el análisis se realizaron utilizando un software escrito en LabVIEW (National Instruments, Austin, TX, EE. UU.) [ 22 ].

La recaptación de dopamina

La recaptación de dopamina se modeló utilizando el software de análisis de voltametría de demonios (24; Wake Forest University, Winston-Salem NC). Aquí informamos la constante de descomposición tau como nuestra medida de la tasa de recaptación de dopamina. Tau se deriva de un ajuste de curva exponencial que abarca la mayor parte de la curva de eliminación de dopamina y está altamente correlacionado (r = .9899) con Km, la aparente afinidad de la dopamina por la DAT. [ 24 ]. Para determinar el efecto de la cocaína en la concentración máxima de dopamina, comparamos los valores obtenidos antes y después de la administración (% de variación).

Histología

Después de cada grabación, un electrodo de acero inoxidable (AM Systems #571500, Sequim, WA) se redujo a la misma profundidad que la CFE y se realizó una lesión (10 µA, 4 s) para marcar la ubicación de la grabación. Los cerebros se extrajeron y se almacenaron en 10% de formalina. Se usó microscopía óptica para identificar la ubicación de la lesión en cortes coronales (50 µm) a través del cuerpo estriado. Todas las grabaciones reportadas aquí se hicieron en el estriado ventral. [ 25 ].

Fraccionamiento subcelular del tejido estriatal

Las ratas (LFD-2 wk, HFD-2 wk, LFD-6 wk y HFD-6 wk; n = 10 / grupo; sin diferencia en el peso corporal) se eliminaron por decapitación. El fraccionamiento bioquímico se realizó utilizando el protocolo descrito en [ 26 ], con pequeñas modificaciones. Los cerebros se extrajeron rápidamente, se congelaron en isopentano y se cortaron en rodajas en un criostato (HM505E, Microm, Walldorf, Alemania, −20 ° C) hasta alcanzar el estriado. 1-mm bilateral3 los punzones a través del cuerpo estriado ventral (peso medio del tejido: 15.2 mg) se homogeneizaron para 20 s en 0.8 ml de TEVP helado (10 mM Tris base, 5 mM NaF, 1 mM Na3VO4, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, pH 7.4) + tampón de sacarosa 320 mM. Se guardó una alícuota de 100 µl de homogeneizado total (H). El resto de H se centrifugó a 800 xg durante 10 min a 4 ° C. El sedimento (P1, núcleos y residuos grandes) se resuspendió en 0.2 ml de tampón TEVP y se guardó. El sobrenadante (S1) se retiró y se colocó en un tubo limpio sobre hielo. S1 se centrifugó a 9200 × g durante 15 min a 4 ° C para generar un sedimento (P2, membranas sinaptosómicas crudas) y un sobrenadante (S2). P2 se enjuagó una vez en el tampón de sacarosa TEVP + 35.6 mM y luego se resuspendió en 0.25 ml de tampón de sacarosa TEVP + 35.6 mM, se agitó con vórtex para 3 sy se lisó hipoestéticamente manteniendo la muestra en hielo durante 30 min. El sobrenadante (S2) se recogió y se centrifugó a 165,000 xg para que 2 h generara un sedimento (P3, membranas ligeras, endosomas de reciclaje) que se resuspendió en TEVP (0.1 ml) y se guardó. Todas las muestras se mantuvieron a -80 ° C hasta la electroforesis en gel de poliacrilamida.

Electroforesis en gel y Western Blotting

El contenido de proteína se determinó usando el kit de ensayo de proteína Bio-Rad DC (Hercules, CA) y la concentración de cada muestra se ajustó a 0.3 mg / ml de proteína. Se añadieron tampón de muestra NuPAGE LDS (dodecil sulfato de litio) (Invitrogen, Carlsbad, CA) y ditiotreitol 50 mM a cada muestra antes de calentar a 70ºC durante 10 min. Para cargar cantidades equivalentes de proteína para cada fracción, se cargaron 3 µg de cada muestra en geles NuPAGE Novex 4–12% Bis-Tris (Invitrogen) para la separación por electroforesis en gel. Las proteínas se transfirieron posteriormente a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) (PerkinElmer Life Sciences, Boston, MA). Los sitios de unión inespecíficos se bloquearon durante 2 horas a temperatura ambiente en tampón de bloqueo (leche desnatada en polvo al 5% en PBS y Tween 0.02 al 20% [PBS-T]). Luego se incubaron las transferencias en el anticuerpo primario (1∶3000 anti-NR2B monoclonal de ratón [# 05–920, Millipore], 1∶5000 anti-DAT de conejo [# AB2231, Millipore] y 1∶1000 receptor monoclonal de anti-transferrina de ratón ( TfR) [# 13-6800, Invitrogen]. Las transferencias se cortaron en 3 partes: pesos alto (> 97 kDa), medio (46-97 kDa) y bajo (<46 kDa) y cada parte se probó con un anticuerpo que reconocía una proteína dentro de ese rango de peso. Los pesos moleculares aparentes de los anticuerpos utilizados son: NR2B, 180 kDa; DAT, 75, 64 y 50 kDa; TrfR, 95 kDa. Después de sondear transferencias de rango de peso medio para DAT, los anticuerpos se separaron por incubación con tampón de separación (Tris 62.5 mM, SDS al 2%, β-mercaptoetanol 100 mM, pH 6.8) durante 15 min a 50 ° C.Las transferencias se volvieron a bloquear posteriormente y se sondaron con anti-TfR. SeeBlue Plus 2 (Invitrogen) pre Se corrieron patrones teñidos para la estimación del peso molecular.

Las inmunotransferencias de proteínas se analizaron con el software Carestream Molecular Imaging Software 5.0. La intensidad neta (la suma de los píxeles dentro de la banda de interés menos la suma de los píxeles de fondo) se determinó para cada banda. Para permitir comparaciones entre transferencias, los datos se normalizaron a los controles de LFD en 2 y 6 wks. Los datos se expresan como la media de inducción del pliegue en comparación con LFD ± SEM.

Reacción en cadena de la polimerasa transcriptasa inversa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR)

Luego de la recolección de los punzones estriatales para el análisis de transferencia Western, los cerebros congelados se seccionaron coronariamente en el microtomo hasta alcanzar el VTA / SN. 1-mm bilateral3 Se hicieron punzones de tejido VTA y SN (peso promedio del tejido = 15.0 mg) y se extrajo el ARN utilizando el kit PureLink RNA Mini (Invitrogen). La calidad y la cantidad de ARN se evaluaron utilizando un Nano Chip de ARN 6000 (Agilent, Santa Clara, CA) en un bioanalizador Agilent 2100. El número de integridad del ARN (RIN) excedió 7 para todas las muestras, lo que indica una alta calidad. Se utilizó un microgramo de ARN total para sintetizar ADNc utilizando el kit de síntesis de ADNc de iScript (BioRad) en un dispositivo ThermoHybaid iCycler (Thermo Scientific). Cebadores específicos para el GETAGCTGGTCAGCCCCTGCTT, cebador de la luz de la pluma de la GTAAGNGXGCGCACCTCCCCTG), a la luz de la luz de la computadora : GCTCCTGTGCACACCATTTTCCC) los genes (números de acceso de Genbank NM_6, NM_3 y NM_012694) se diseñaron utilizando NCBI Primer-BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) y comprado de Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa). El análisis de la curva de fusión y la electroforesis en gel de poliacrilamida confirmaron la especificidad de los cebadores. Los amplicones DAT, β-actina y Tbp tienen una longitud de pares de bases 266, 182 y 136, respectivamente.

Se utilizó un kit Q-PCR (iQ SybrGreen Supermix, BioRad). La reacción se llevó a cabo en un sistema de detección por PCR en tiempo real MyiQ de un solo color (BioRad) en un volumen de 20 µl, con 2 µL de cebadores directos e inversos de 3 µM ​​y una muestra de ADNc de 4 µL diluida 1∶10. Las condiciones de los ciclos de PCR fueron 95 ° C para 5 min; 40 realiza ciclos a 94 ° C para 15 s, 60 ° para 15 s, 72 ° C para 15 s. Los datos se recopilaron a una temperatura de lectura de 84 ° C para 15 s en función de las temperaturas de fusión del amplicón. Se generaron curvas de dilución estándar para cada conjunto de cebadores mediante la dilución en serie (1.00, 0.2, 0.04 y 0.008-fold) un stock de cDNA maestro que comprende una mezcla igual de cDNA de todos los grupos de tratamiento. El registro10 de los valores de dilución se representaron frente a los valores del ciclo umbral para las curvas estándar. El software del sistema óptico MyiQ (BioRad) se utilizó para analizar los datos. Las muestras que no contenían plantilla de ADNc y muestras de reacciones de ADNc que no contenían transcriptasa inversa se procesaron como controles para la contaminación y amplificación del ADN genómico, respectivamente. Los valores informados se normalizaron a los valores promedio de los estándares internos ß-actina y Tbp para cada muestra. Los datos se expresan como niveles relativos medios de DAT / estándares internos mRNA ± SEM.

Análisis estadístico

La expresión DAT cambia dinámicamente durante el ciclo de vida en ambos humanos [ 27 ] y ratas [ 28 ], [ 29 ]. Además, la dopamina y la respuesta conductual a la cocaína también cambian a medida que las ratas jóvenes maduran. [ 30 ]. Por lo tanto, las mediciones de DAT podrían variar en función de la edad y prohibir las comparaciones significativas entre los grupos de 2 wk y 6 wk. Por lo tanto, las medias grupales para la ingesta de alimentos, el peso corporal, la concentración máxima de dopamina, tau, el% de cambio y la expresión génica relativa se compararon por separado para los grupos de 2 y 6 wk utilizando la prueba t de Student no pareada. Para los análisis de transferencia Western, las diferencias grupales en la intensidad de la banda DAT normalizada se compararon por separado para los grupos de semana 2 y 6 utilizando ANOVA de medidas repetidas de dos vías (dieta Xfraction). Todos los análisis estadísticos se realizaron en Graph Pad 5 (Prism Inc.).

Resultados

HFD promueve un mayor consumo de grasa

Antes del inicio de la exposición a la dieta, no hubo diferencias en el peso corporal inicial en la semana 2 (LFD: 275.22 +/− 4.1 g; HFD: 280.87 +/− 4.8 g; p = 0.37) o 6 semanas (LFD: 287.31 +/− 4.9 g; HFD: 289.44 +/− 5.1 g; 6 semanas p = 0.97) grupos. A pesar de consumir dietas de composición drásticamente diferente, no encontramos diferencias en el peso corporal entre los grupos de dieta después de 2 o 6 semanas (Fig. 1a – b; ambos ns). Tampoco hubo diferencia en el total de calorías consumidas entre los grupos después de las semanas de exposición a la dieta tanto de 2 como de 6 (Fig. 1c – d; ns). Sin embargo, las ratas HFD consumieron significativamente más kcals de la grasa (Fig. 1e – f; 2 wks: t (32) = 25.59; 6 wks: t (31) = 27.54; p<0.0001 para ambas duraciones de dieta).

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Figura 1. Ingesta de alimentos y medidas de peso corporal.

No hubo diferencias entre la DFH y la LFD en el peso corporal final (a – b) o kilocalorías totales consumidas (discos compactos) después de 2 o 6 semanas de exposición a la dieta. (e – f) Las ratas HFD consumieron significativamente más kilocalorías de la grasa que las ratas LFD en las condiciones 2 week y 6 week (***p

http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0058251.g001

El HFD prolongado reduce la tasa de recaptación de DA

Se realizaron grabaciones voltimétricas en el estriado ventral (Figura 2 y XNUMX). Figura 3 y XNUMX muestra los cambios evocados eléctricamente representativos en la concentración de dopamina adquirida de ratas después de 6 semanas de dieta. Al inicio, la magnitud de la dopamina evocada no difirió entre los grupos de dieta y las duraciones de la dieta (Fig. 4a – b, ambos ns). Sin embargo, la inspección de ejemplos individuales sugirió que la tasa de descomposición después de la concentración máxima de dopamina difería entre los grupos de dieta después de 6 semanas de exposición a la dieta (Figura 3 y XNUMX a – b para ejemplos). La tasa de descomposición se debe principalmente a la eliminación de dopamina por la DAT [ 31 ], que modelamos como una exponencial monofásica para determinar tau. No hubo diferencias entre los grupos de dieta después de 2 semanas de exposición a la dieta (Fig. 4c). Sin embargo, después de 6 semanas de exposición a la dieta, tau fue significativamente mayor en ratas HFD-6 wk en comparación con LFD-6 wk (Fig. 4d; t (11) = 2.668; p<0.05). Por lo tanto, 6 semanas de HFD reducen la tasa de depuración de dopamina en el estriado ventral en comparación con los animales que consumieron LFD.

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Figura 2. Verificación histológica de sitios de registro para análisis de recaptación.

Los sitios de grabación para ratas alimentadas con LFD están codificados con triángulos grises y para ratas HFD con círculos negros. Los números indican la distancia en mm anterior a Bregma. Figura adaptada de Paxinos y Watson 2006.

http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0058251.g002

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Figura 3. La estimulación eléctrica del VTA / SNc evoca un pico fásico en la concentración de dopamina.

Ejemplos representativos de datos adquiridos después de 6 semanas de exposición a la dieta. a) El gráfico de color de fondo restado muestra los cambios actuales en diferentes potenciales del electrodo antes de (−5 a 0 en relación con el inicio) y después (de 0.1 a 10 en relación con el inicio) de estimulación eléctrica (STIM) de la VTA / SNc. El tiempo es la abscisa, el potencial del electrodo es la ordenada y los cambios actuales se codifican en falso color. La dopamina [identificada por sus características de oxidación (+ 0.6 V; verde) y reducción (−0.2 V; azul)] aumentó transitoriamente en respuesta a la estimulación en esta rata semanal LFD-6. b) Igual que en a), excepto en una rata de HFD-6 wk. c) La concentración de dopamina en función del tiempo se extrae de la gráfica de colores en a) y la tau se identifica mediante el ajuste de la curva. Dos puntos rojos marcan el pico y la concentración de dopamina en el punto de tiempo cuando se alcanza tau. Tau se indica a la derecha. d) Igual que en c) pero los datos se extraen de b).

http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0058251.g003

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Figura 4. Seis semanas de dieta rica en grasas reduce la tasa de recaptación de dopamina y atenúa la respuesta de la dopamina a la cocaína.

Concentración máxima de dopamina evocada por la estimulación VTA / SNpc después de 2 (a) o semanas 6 (b) De la exposición a la dieta antes de la inyección de cocaína. discos compactos) Tau promedio después de 2 (c) wks o 6 wks (d) de la exposición a la dieta. Tau fue significativamente mayor para las ratas HFD-6 wk en comparación con las ratas LFD-6 wk (*p e – f) Porcentaje de cambio en la concentración máxima de dopamina evocada después de la inyección de cocaína para 2 (e) y 6 (f) semanas de exposición a la dieta. El porcentaje de cambio fue significativamente menor en las semanas de HFD-6 en comparación con las ratas de LFD-6 wk (**p

http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0058251.g004

HFD prolongado disminuye la respuesta de la DA a la cocaína

Para investigar aún más las alteraciones inducidas por la dieta en DAT, inyectamos ratas con el bloqueador DAT de cocaína. La concentración máxima de dopamina después de la estimulación eléctrica es causada por la liberación de dopamina, pero también está limitada por la eliminación simultánea de dopamina por el DAT [ 21 ]. Caracterizamos el efecto de la cocaína en la transmisión de dopamina calculando el cambio en la magnitud de la dopamina evocada en relación con los valores anteriores a la droga (% de cambio). Dos semanas de HFD no afectaron el% de cambio en relación con la LFD (Fig. 4e; ns). Sin embargo, después de 6 semanas de exposición a la dieta, el% de cambio fue significativamente reducido en HFD en relación con LFD (Fig. 4f; t (10) = 4.014; p<0.01). Nuestros resultados sugieren que 6, pero no 2 semanas, de exposición a HFD reduce la respuesta de la dopamina a la cocaína.

La exposición prolongada a HFD reduce la expresión de la proteína DAT en membranas sinaptosomales

Para determinar si los efectos de la HFD prolongada se debieron a cambios en el número de DAT, se cuantificaron los niveles de proteína DAT en homogeneizados de tejidos totales (fracción H), membranas sinaptosómicas (fracción P2) y endosomas de reciclaje intracelular (fracción P3). DAT es un NGlicoproteína enlazada con un peso molecular aparente de entre 50 y 80 kDa debido al aumento de los niveles de glicosilación a medida que la proteína madura. [ 32 ]. El fraccionamiento se confirmó mediante la expresión enriquecida de la subunidad NR2B del receptor NMDA en la fracción de membrana sinaptosómica y del receptor de transferrina en la fracción endosomal (por ejemplo, transferencia). Fig. 5b). No encontramos diferencias en la proteína DAT total después de las semanas de exposición a la dieta de 2 y 6 (datos no mostrados). Para probar las diferencias específicas de fracciones en la proteína DAT, utilizamos ANOVA de medidas repetidas de dos vías (dieta Xfraction). De acuerdo con los experimentos de voltametría, las semanas de exposición a la dieta de 2 fueron insuficientes para alterar los niveles de cualquiera de las isoformas DAT en las fracciones P2 o P3 ( . c, e, g; todas las ns). Sin embargo, después de 6 semanas de exposición a la dieta, hubo una interacción significativa con la dieta Xfraction (F(1,18) = 8.361, p<0.01); Fig. 5d) para la isoforma 50 kD de la DAT. Por lo tanto, la HFD prolongada redujo significativamente la isoforma 50 kD de la DAT en la fracción P2 y causó una tendencia hacia un aumento en la fracción P3. No encontramos ningún efecto de la dieta o fracción en ninguno de los 64 kD (Fig. 5f; ns) o el 70 kD (Fig. 5h; ns) isoformas DAT.

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Figura 5. El consumo de una dieta alta en grasas disminuye la proteína DAT asociada a la membrana en el estriado ventral.

a) Imagen representativa que muestra los punzones de tejido (2) 1 x 1 mm tomados del estriado ventral que se combinaron para el análisis de la proteína DAT. VStr = cuerpo estriado ventral; DStr = cuerpo estriado dorsal; cc = cuerpo calloso; ac = comisura anterior. b) Representaciones occidentales representativas de los datos presentados en c – h. L = LFD; H = HFD; TfR = receptor de transferrina; NR2B = subunidad NR2B del receptor NMDA. c) No hubo diferencias en la proteína 50 kD DAT para las fracciones P2 o P3 después de las semanas 2 de exposición a la dieta. d) La proteína DAT de 50 kD se reduce significativamente en el P2 (* = p<.05), pero no la fracción P3 del tejido estriatal ventral en las ratas HFD-6 semanas en relación con las ratas LFD-6 semanas. No hubo diferencias en la proteína DAT de 64 kD después de 2 (e) o semanas 6 (f) de la exposición a la dieta. No hubo diferencias en la proteína 70 kD DAT después de 2 (g) o semanas 6 (h) de la exposición a la dieta.

http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0058251.g005

Para determinar si los niveles disminuidos de proteína DAT en la fracción P2 se debieron, en parte, a una reducción en la transcripción DAT, se midieron los niveles de ARNm VTA / SNc DAT en las mismas ratas que anteriormente (Fig. 6a por ejemplo). No observamos diferencias entre los grupos de dieta en el ARNm de DAT del cerebro medio después de la exposición a la dieta con 2 o 6 (Fig. 6b – c; ambos ns). Por lo tanto, es poco probable que las diferencias en los niveles de proteína DAT en el estriado ventral se deban a déficits en la producción de DAT.

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Figura 6. El consumo de una dieta alta en grasas no altera los niveles de ARNm de DAT. una)

Imagen representativa que muestra los punzones de tejido 1 × 1 mm tomados de VTA / SN y combinados para el análisis de ARNm DAT. cp = péndulo cerebral; pc = comisura posterior; MM = núcleo mamilar medial. No hubo diferencias en los niveles relativos de ARNm de DAT después de las semanas 2 (b) o 6 semanas de exposición a la dieta (c).

http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0058251.g006

Discusión

El consumo prolongado de HFD puede conducir a DIO y plasticidad dentro del sistema nervioso central. Las neuronas de la dopamina y los receptores de la dopamina del estriado parecen ser un conjunto de objetivos del SNC que se ven afectados por una DFH y en individuos obesos [ 11 ], [ 13 ], [ 33 ]. Aquí informamos que un DFH redujo la tasa de recaptación de dopamina en el cuerpo estriado ventral y este efecto dependió de la duración de la exposición. Es importante destacar que el efecto de HFD en la función DAT se produjo en ausencia de DIO. Si bien no medimos directamente los marcadores de adiposidad corporal en este estudio, los animales se han clasificado tradicionalmente como DIO o resistentes a la dieta basándose únicamente en el aumento de peso corporal después de la exposición a una HFD [ 34 ]. La HFD prolongada atenuó significativamente la capacidad de la cocaína, que interfiere con la DAT, para potenciar la magnitud de la liberación de dopamina. Cuantificamos los niveles de proteína DAT en el estriado ventral mediante el análisis de transferencia Western, distinguiendo entre la DAT localizada dentro de las fracciones subcelulares enriquecidas para la membrana plasmática o los endosomas de reciclaje. Encontramos una reducción significativa en una isoforma inmadura de la DAT asociada con la membrana plasmática. Por lo tanto, la HFD prolongada parece reducir la tasa de recaptación de dopamina a través de la DAT, probablemente al interferir con el tráfico de DAT o tal vez la maduración, pero no al disminuir la expresión del gen DAT o la estabilidad del ARNm de DAT. Además, un período entre dos y seis semanas de exposición a un DFH parece ser el primer punto de inflexión para la plasticidad inducida por la dieta con respecto a la DAT.

La obesidad está correlacionada con múltiples aspectos de la señalización de dopamina del estriado, incluida la disponibilidad de DAT en ambos seres humanos [ 18 ] y ratones [ 19 ]. Sin embargo, solo recientemente se demostró que el desarrollo de DIO altera la tasa de recaptación de dopamina en ratas [ 20 ]. Si bien este estudio demostró un deterioro en la recaptación de dopamina después de la aplicación exógena de dopamina después de solo 4 semanas de HFD, los animales que se mantuvieron en un HFD se seleccionaron en función del aumento de peso inicial y, por lo tanto, podrían representar una población única. De acuerdo con este punto de vista, los animales con HFD continuaron comiendo más calorías y ganando más peso en comparación con los controles de LFD. Otro estudio reciente informó sobre la recaptación de dopamina dañada después de 12 semanas de HFD en ratas criadas [ 35 ]. Sin embargo, hubo diferencias significativas en el peso corporal entre los animales alimentados con una HFD frente a una dieta estándar de laboratorio cuando se realizaron las mediciones de recaptación. Por lo tanto, no quedó claro si las deficiencias en la recaptación de dopamina emergen como resultado directo de, o preceden, el desarrollo de DIO. En contraste con estos informes recientes, no encontramos diferencias en el peso corporal o el consumo total de kcal entre nuestros grupos de dieta cuando se realizaron mediciones de recaptación. Que encontramos diferencias en la recaptación de dopamina después de 6, pero no de 2, las semanas de HFD sugieren que las alteraciones inducidas por la dieta en la recaptación de dopamina son una respuesta a los cambios crónicos, pero no agudos, en la composición de la dieta. Además, nuestros resultados sugieren que, en lugar de ser un resultado de la obesidad, las alteraciones inducidas por la dieta en DAT podrían contribuir al desarrollo de la enfermedad. Los estudios futuros deberán abordar si las poblaciones de animales que son diferencialmente susceptibles a DIO [ 34 ] tienen diferencias preexistentes en la expresión / función de DAT o son diferencialmente susceptibles a los cambios inducidos por la dieta en DAT.

A nuestro entender, este es el primer estudio que demuestra que un DFH reduce la respuesta de la dopamina a la cocaína. Dado el papel de la dopamina en la recompensa de drogas, nuestros resultados son consistentes con el trabajo anterior que demuestra que las ratas alimentadas con un HFD durante aproximadamente 6 semanas son más lentas en adquirir la autoadministración de cocaína que los animales alimentados con una dieta control [ 36 ]. Es importante destacar que este efecto también fue independiente del desarrollo DIO. Además, las ratas criadas selectivamente para la susceptibilidad al DIO muestran una preferencia reducida por el lugar de la cocaína, lo que sugiere que las propiedades gratificantes de la cocaína están debilitadas en estos animales [ 37 ]. La disminución de la respuesta a la cocaína que observamos en las ratas HFD-6 wk podría deberse a la reducción de la disponibilidad de DAT en el estriado. Sin embargo, la cocaína también aumenta la señalización de la dopamina a través de mecanismos no dependientes de DAT. Específicamente, la DFH podría haber afectado la movilización inducida por la cocaína de las vesículas de dopamina de reserva [ 38 ]. La cocaína también atenúa la transmisión de GABA a las neuronas de dopamina dentro del VTA [ 39 ] e induce oscilaciones en la velocidad de disparo de los cuerpos celulares de dopamina [ 40 ]. Cualquiera o todos estos procesos también podrían haber sido afectados por un HFD. La investigación futura tendrá que abordar los mecanismos subyacentes en la forma en que una HFD modifica los aspectos gratificantes de la cocaína y / o el potencial de adaptaciones neuronales inducidas por las drogas. [ 18 ]. El consumo de un HFD atenúa tanto el comportamiento [ 41 ] y la respuesta a la dopamina [ 20 ], [ 42 ] A la anfetamina, que también interfiere con la DAT. Es importante destacar que las ratas cuya ingesta de un HFD se ajustó calóricamente a la de las ratas alimentadas con una dieta de control no desarrollan DIO, pero aún así no desarrollan una preferencia de lugar condicionada por las anfetaminas [ 41 ]. Junto con los datos presentados aquí, parece que el consumo de un HFD desafía la respuesta a los psicoestimulantes. Todas las drogas de abuso influyen en el sistema de dopamina, y se cree que el aumento de la señalización de dopamina inducido por las drogas es crítico para el desarrollo de la adicción [ 43 ]. Por lo tanto, la respuesta reducida a la cocaína en ratas con HFD es consistente con los informes de que los humanos obesos tienen un riesgo significativamente menor de desarrollar un trastorno por abuso de sustancias. [ 44 ]. El trabajo futuro deberá abordar si la calificación subjetiva de la recompensa de cocaína difiere en los individuos obesos en comparación con los controles de peso normal.

Nuestro análisis de transferencia Western sugiere que el consumo prolongado de una HFD no afecta a la proteína DAT estriatal total, sino que reduce la integración de la isoforma DAT de 50 kDa no glicosilada en las membranas sinaptosómicas. Mientras que la glicosilación DAT mejora la tasa de transporte de dopamina y aumenta la estabilidad de la superficie de la membrana [ 45 ], [ 46 ], [ 47 ], DAT no glicosilado de seres humanos [ 45 ], [ 46 ] así como ratas [ 47 ] Fácilmente transporta dopamina. Además, los experimentos de inmunomarcaje revelan que los niveles de DAT no glicosilados son más altos en el ventral en comparación con el estriado dorsal tanto en monos como en humanos [ 47 ]. En conjunto, estos estudios sugieren que la disminución de los niveles de membrana de 50 kDa DAT podría contribuir al déficit de recaptación que observamos en ratas 6 wk HFD. Nuestros datos son consistentes con un estudio previo que muestra que el consumo de HFD reduce la disponibilidad de DAT en el estriado ventral de ratones [ 19 ]. Sin embargo, este estudio no midió la localización de DAT en diferentes compartimentos intracelulares. Además, nuestros hallazgos son consistentes con un estudio que muestra reducciones en la DAT de la superficie celular en el estriado de ratas DIO [ 20 ]. Este estudio también informó que los niveles totales de proteína DAT no se vieron afectados por la dieta en el modelo DIO. Ampliamos este hallazgo para mostrar que la proteína DAT total tampoco se ve afectada por un HFD en ratas criadas. Por lo tanto, el consumo prolongado de un HFD no altera la expresión de DAT, pero puede interferir con el tráfico o la maduración de DAT.

La falta de diferencias en los niveles de ARNm de VTA / SNpc DAT después de las semanas 2 o 6 de exposición a HFD apoya aún más la idea de que los niveles generales de DAT no se vieron afectados por las manipulaciones de nuestra dieta. Este resultado contrasta con un informe anterior que muestra una reducción del ARNm de DAT en el VTA del ratón después de 17 semanas de consumo de HFD [ 12 ]. Sin embargo, en este estudio, los niveles de ARNm de DAT se midieron después de que los grupos de dieta habían diferido en el peso corporal durante 12 semanas. Por lo tanto, sus resultados probablemente representan adaptaciones de etapa tardía a DIO. En resumen, nuestros datos proporcionan pruebas sólidas de que la exposición a un HFD conduce a cambios funcionales en la recaptación de dopamina del estriado al disminuir los DAT asociados a la membrana sin alterar la expresión total de DAT. Es importante destacar que informamos que las interrupciones inducidas por la dieta en el DAT pueden ocurrir antes del inicio del DIO, lo que sugiere que estas alteraciones podrían contribuir al desarrollo de la obesidad.

Nuestros datos se suman a una creciente literatura que implica a la dieta en la regulación de la función de la dopamina, y proporciona evidencia adicional de que los cambios inducidos por la dieta en la expresión de DAT conducen a cambios funcionalmente relevantes en la señalización de la dopamina. Las alteraciones inducidas por la dieta en la dinámica de la señalización de la dopamina del estriado a través de la DAT pueden tener consecuencias para el comportamiento alimentario. Los estímulos relacionados con los alimentos evocan aumentos fásicos en la dopamina estriatal [ 9 ], [ 48 ], [ 49 ], que probablemente refuercen y refuercen las acciones dirigidas por los alimentos. [ 50 ]. Aquí mostramos que 6 semanas de consumo de HFD prolonga la duración de la liberación de dopamina fásica al disminuir los DAT asociados a la membrana en una región del estriado donde la función de la dopamina es esencial para la ingesta de alimentos [ 51 ]. Las alteraciones dependientes de la dieta en el DAT podrían promover un mecanismo de avance mediante el cual las señales prolongadas de dopamina provocadas por los estímulos de los alimentos aumentan la activación de los receptores D1 de dopamina del estriado de baja afinidad, que son críticos para los comportamientos de aproximación [ 52 ], [ 53 ], [ 54 ]. Con el tiempo, la elevación prolongada de la dopamina estriatal podría promover adaptaciones, como la regulación a la baja de los receptores D2 de dopamina (D2R), que se ha demostrado en modelos de obesidad en humanos y en roedores. [ 11 ], [ 33 ]. Nuestro estudio sugiere que el desarrollo de la obesidad no es un requisito para alterar la recaptación de dopamina. Por lo tanto, las disminuciones relacionadas con la dieta en la DAT de membrana podrían preceder y contribuir a la aparición de la regulación por disminución de D2R, la obesidad y el comportamiento alimentario compulsivo que se desarrolla en el transcurso del consumo de HFD. [ 11 ].

AGRADECIMIENTOS

Queremos agradecer a los Dres. Jamie D. Roitman y James E. McCutcheon por comentarios útiles sobre versiones anteriores del manuscrito. El contenido de este artículo es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los NIH o del Consorcio Biomédico de Chicago.

Contribuciones de autor

Concebido y diseñado los experimentos: JJC EHC MFR. Realizó los experimentos: JJC DNP SRE. Analizó los datos: JJC EHC SRE MFR. Escribió el artículo: JJC EHC MFR.

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