Más uno. 2014 Jul 29; 9 (7): e102524. doi: 10.1371 / journal.pone.0102524. eCollection 2014.
Resumen
La exposición crónica a la cocaína en adictos humanos y en modelos de adicción a roedores reduce la actividad cortical prefrontal, lo que posteriormente desregula el procesamiento de la recompensa y la función ejecutiva de orden superior. El efecto neto de este bloqueo de comportamiento deteriorado es una mayor vulnerabilidad a la recaída. Anteriormente, hemos demostrado que los aumentos inducidos por la cocaína en la expresión del factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) en la corteza prefrontal medial (PFC) es un mecanismo neuroadaptativo que atenúa la eficacia de refuerzo de la cocaína. Como se sabe que el BDNF afecta la supervivencia neuronal y la plasticidad sináptica, probamos la hipótesis de que la abstinencia de la autoadministración de cocaína llevaría a alteraciones en la morfología neuronal y la densidad sináptica en el PFC. Utilizando una técnica novedosa, tomografía de matriz y tinción de Golgi, se analizaron los cambios morfológicos en el PFC de rata después de 14 días de autoadministración de cocaína y 7 días de abstinencia forzada. Nuestros resultados indican que la ramificación dendrítica general y la densidad sináptica total se reducen significativamente en el PFC de rata. En contraste, la densidad de las espinas dendríticas delgadas aumenta significativamente en las neuronas piramidales de la capa V del PFC. Estos hallazgos indican que se producen cambios estructurales dinámicos durante la abstinencia de la cocaína que pueden contribuir a la hipoactividad observada del PFC en individuos adictos a la cocaína.
Introducción
Se propone que las alteraciones en la plasticidad estructural dentro del circuito de recompensa son mecanismos clave que contribuyen a la poderosa capacidad de la cocaína para mantener el comportamiento de búsqueda de drogas (revisado en [ 1 ]). Estudios previos han demostrado un aumento en la arborización dendrítica y la densidad de la columna vertebral en el núcleo accumbens (NAc) [ 2 ]–[ 4 ], área tegmental ventral [ 5 ], y la corteza prefrontal (PFC) [ 6 ] Después de la exposición a la cocaína. Si bien la mayoría de los estudios se han centrado en los cambios estructurales asociados con la actividad disfuncional de la NAc, muchos menos estudios han examinado las alteraciones en el PFC. Varias líneas de evidencia demuestran la disfunción del PFC luego de la exposición crónica a la cocaína en ambos adictos humanos [ 7 ], [ 8 ] y en modelos de roedores de la adicción. [ 9 ], [ 10 ]. Por lo tanto, caracterizar los cambios estructurales que ocurren en el PFC es pertinente para comprender los eventos moleculares que subyacen a la adicción.
El PFC regula el control de los impulsos y la toma de decisiones y, por lo tanto, juega un papel importante en la capacidad de un individuo para controlar el comportamiento, particularmente en la drogodependencia. [ 8 ], [ 11 ]. Por ejemplo, en individuos adictos a la cocaína, la disminución de la activación de la corteza prefrontal se asocia con el retiro de drogas y las respuestas ejecutivas de orden superior interrumpidas [ 7 ], [ 8 ], lo que puede aumentar la vulnerabilidad a la recaída. En roedores, el aumento de la actividad neuronal en el PFC se asocia con la ingesta de cocaína [ 9 ], [ 10 ], comportamiento compulsivo de búsqueda de drogas [ 12 ], y el restablecimiento de la cocaína después de la retirada [ 13 ]–[ 15 ]. Además, la biestabilidad de la membrana se elimina en el PFC después de la administración crónica de cocaína. [ 16 ]. Finalmente, la actividad metabólica inducida por fármacos en el PFC se reduce en ratas a las que se administra una inyección de prueba durante el retiro de la autoadministración de cocaína. [ 9 ], [ 17 ]. En conjunto, estos estudios indican que la cocaína crónica induce cambios funcionales profundos en la PFC que pueden estar asociados con un aumento en el número de sinapsis inhibitorias y / o una reducción de las sinapsis excitatorias en la PFC. Sin embargo, las alteraciones morfológicas que se producen en el PFC después del uso crónico de drogas no se han dilucidado.
En el presente estudio intentamos examinar si la abstinencia de la cocaína conduce a cambios estructurales en el CPF. Las alteraciones morfológicas se examinaron utilizando un método tradicional, la tinción de Golgi, así como una técnica novedosa, la tomografía de matriz. La tomografía de matriz es un método único que combina la sección de tejido ultrafino con inmunofluorescencia y la reconstrucción de imágenes tridimensionales para permitir la cuantificación precisa de la densidad de sinapsis específica total y del subtipo. [ 18 ], [ 19 ]. Usando estos métodos, nuestros resultados indicaron una plasticidad sustancial en el PFC de rata en respuesta a la abstinencia de la cocaína.
Materiales y Métodos
Animales y vivienda
Se obtuvieron ratas macho Sprague-Dawley (Rattus norvegicus) de 250 a 300 g de Taconic Laboratories (Germantown, NY). Los animales se alojaron individualmente con comida y agua disponibles ad libitum en su jaula doméstica. Todos los protocolos experimentales fueron consistentes con las pautas emitidas por los Institutos Nacionales de Salud de EE. UU. Y fueron aprobados por la Escuela de Medicina Perelman de la Universidad de Pensilvania y el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad de Pensilvania.
La cirugía
Antes de la cirugía, las ratas se anestesiaron con 80 mg / kg de ketamina y 12 mg / kg de xilazina (ip; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Se insertó un catéter silástico permanente (diámetro interior 0.33 mm, diámetro exterior 0.64 mm) en la vena yugular derecha y se suturó en su lugar. Luego se pasó el catéter por vía subcutánea sobre el omóplato y se dirigió a una plataforma de malla de respaldo (CamCath, Cambridge, Reino Unido) que se suturó debajo de la piel directamente sobre las escápulas. Los catéteres se lavaron todos los días con 0.3 ml del antibiótico Timentina (ticarcilina disódica / clavulanato de potasio, 0.93 mg / ml; Henry Schein, Melville, NY) disuelto en solución salina heparinizada (10 U / ml). Los catéteres fueron sellados con obturadores de plástico cuando no estaban en uso.
Autoadministración de cocaína.
A las ratas se les permitió a 7 días recuperarse de la cirugía antes de que comenzara la autoadministración de cocaína. Las ratas se asignaron al azar a uno de dos grupos: animales autoadministrados con cocaína y controles salinos con yugo. Cada rata entrenada para responder a las infusiones de cocaína contingentes se emparejó con un sujeto con yugo que recibió el mismo número y patrón temporal de infusiones que la autoadministrada por la rata de cocaína experimental emparejada. La palanca que presionaba para obtener las ratas con solución salina no tenía consecuencias programadas.
Inicialmente, se colocaron ratas experimentales de cocaína en las cámaras operativas modulares (Med Associates, St. Albans, VT) y se les permitió hacer palanca para infusiones de cocaína por vía intravenosa (0.25 mg de cocaína / 59 µl de solución salina, infusión sobre 5 s) en una Relación 1 (FR1) calendario de refuerzo. Una vez que una rata de cocaína experimental logró al menos 20 infusiones de cocaína en una sola sesión operante bajo el programa FR1, el requisito de respuesta se cambió a un programa de refuerzo FR5. Para responder a ambos programas de proporción fija, el número máximo de infusiones de cocaína se limitó a 30 por sesión de autoadministración diaria y el tiempo de espera de 20 siguió a cada infusión de cocaína, durante el cual se tabularon las respuestas de la palanca activa, pero no tuvieron consecuencias programadas . Se realizaron sesiones diarias de operarios de 2 (días / semana de 7) durante un total de días de 14. Las respuestas realizadas en la palanca inactiva, que no tuvo consecuencias programadas, también se registraron durante las sesiones de entrenamiento FR1 y FR5.
Despues de la xnumxth sesión de operante diaria, ratas con control de cocaína experimental y solución salina yked fueron devueltas a sus jaulas de origen donde se sometieron a 7 días de abstinencia forzada de drogas. En el xnumxth El día de la abstinencia de la cocaína, se extrajeron los cerebros y se diseccionó el PFC en hielo. Se eligieron siete días de abstinencia de cocaína para realizar comparaciones directas con nuestro estudio publicado anteriormente que examinó los cambios inducidos por la cocaína en la expresión de PFC BDNF [ 20 ].
goteo
Las ratas se anestesiaron (100 mg / kg, pentobarbital sódico ip) y se perfundieron con 4% de paraformaldehído enfriado en hielo en 0.1 M PB, pH 7.4 (PFA). Se usó un hemisferio de cada cerebro para la tinción de Golgi y el otro hemisferio para la tomografía de matriz. Los hemisferios de la matriz se fijaron posteriormente en 4% PFA con 2.5% de sacarosa durante 2 horas y los hemisferios de Golgi se fijaron posteriormente para 48 h en 4% PFA.
Tomografía de matriz
Los experimentos de tomografía de matriz se realizaron como se describió anteriormente [ 19 ], [ 21 ]. Brevemente, el tejido fijo de PFA se integró en resina y se cortaron secciones coronales (70 nm) a nivel de mPFC y se recolectaron como una cinta. Las cintas se hidrataron en 50 mM glicina en Tris y se bloquearon en la solución de bloqueo (0.05% Tween / 0.1% de albúmina de suero bovino en Tris buffer (50 mM Tris / 150 mM NaCl, pH 7.6). Las cintas se tiñeron con anticuerpos primarios, GAD65 ( Chemicon), PSD95 (señalización celular) o sinaptofisina (Abcam), en solución de bloqueo durante la noche a 4 ° C. Las cintas se lavaron con tampón Tris y se tiñeron con anticuerpos secundarios en 1![[proporción]](http://www.ncbi.nlm.nih.gov/corehtml/pmc/pmcents/x2236.gif){kind=small}
50 en solución de bloqueo (anti-mouse de cabra Alexa-flour 488 y cy3 de anti-conejo de cabra o cy5 de anti-conejo de burro). Las cintas se tiñeron a contracorriente con DAPI para facilitar la búsqueda de los mismos sitios en cada sección. Las imágenes de escaneo de azulejos se recolectaron utilizando un microscopio de epifluorescencia Zeiss AxioImager Z2. Las imágenes del mismo sitio en cada una de las secciones de serie 20 – 30 por cinta fueron adquiridas en 63x con programas automatizados especializados para tomografía de matriz.
Análisis de tomografía de matriz
Las imágenes en serie de cada cinta se abrieron secuencialmente, se convirtieron en una pila y se alinearon con los complementos MultiStackReg y StackReg (cortesía de B. Busse en la Universidad de Stanford y [ 21 ], [ 22 ]. Se utilizaron cajas de cultivo (19.5 µmx19.5 µm) para seleccionar regiones de interés (ROI) en el neuropilo para la cuantificación. Las selecciones debían excluir cuerpos de células neuronales u otras características oscuras. Para el análisis de imágenes automatizado, los cultivos de interés (o ROI) para la sinaptofisina, la descarboxilasa del ácido glutámico-65 (GAD65) y PSD95 se establecieron automáticamente con algoritmos en ImageJ. Los cultivos se codificaron y el análisis se realizó a ciegas. Se utilizó un programa de detección automatizado basado en el umbral para cuantificar el número de puntos identificados como sinapsis positivas, tal como se describió anteriormente. [ 23 ]. Las densidades de las terminales presinápticas, las terminales postsinápticas excitadoras y el porcentaje de sinapsis GAD-positivas (inhibitorias) se calcularon a partir de un promedio de sitios de muestra de 75 por animal recolectados de dos bloques de tejidos diferentes del PFC (n
=5 cocaína tratada, 5 tratada con solución salina) para un total de 29,154 puncta postsináptica y 53,565 puncta presináptica de los sitios de muestreo de 818 a través de los animales tratados con salina de 5 y 29,662 piquetín presináptico y 17,034 puncta presináptica en todo el mundo Se calcularon los valores medianos para la densidad de sinapsis y el porcentaje de sinapsis inhibitorias por animal y se realizaron pruebas t utilizando las medianas de animales para determinar si había una diferencia entre las medias de los grupos.
Método rápido de Golgi
La tinción de Golgi de una sola sección se realizó como se describió anteriormente [ 24 ], [ 25 ]. Brevemente, el mPFC de un hemisferio de cada animal se cortó en secciones coronales 100 µm y se fijó posteriormente en 1% de tetraóxido de osmio seguido de tres lavados en 0.1 M PB, pH 7.4. Las secciones se incubaron en 3.5% de dicromato de potasio durante la noche, se lavaron brevemente y se infiltraron con 1.5% de nitrato de plata mediante el método de sándwich. [ 25 ]. Las secciones se montaron en portaobjetos recubiertos de gelatina con 20% de sacarosa y se deshidrataron a través de una serie de concentraciones de alcohol seguidas de desengrasado en xileno y cubreobjetos.
Análisis de Golgi
Los portaobjetos de Golgi se codificaron y analizaron de forma ciega y se analizaron todos por el mismo experimentador. Se recolectaron imágenes y trazados neuronales e imágenes representativas de espinas dendríticas utilizando un microscopio Olympus BX51 vertical con una plataforma motorizada integrada (Prior Scientific, Rockland, MA) con un objetivo 20 × 0.7 NA. Para el análisis de ramificación dendrítica, las neuronas 7 se seleccionaron para el análisis por animal. Medimos la longitud y la complejidad de las neuritas utilizando las macros NeuronJ y Advanced Sholl Analysis, respectivamente. El número de intersecciones (puntos de derivación) dentro de círculos concéntricos en radios entre 5 – 250 µm (incluidas las dendritas basales y apicales) se midió y comparó entre grupos. Para el análisis de la densidad de la columna vertebral, se analizaron segmentos de 4-5 de al menos 20 µm de longitud a partir de dendritas basales de tercer orden por neurona de las neuronas 5-7 por animal utilizando un microscopio de epifluorescencia Zeiss AxioImager Z2 con un objetivo de inmersión en aceite 63x con un objetivo de inmersión en aceite XNUMXx. La morfología de la columna vertebral fue clasificada como se describe anteriormente. [ 26 ]. La densidad lineal de la columna vertebral para cada segmento dendrítico y la morfología de la columna vertebral (delgado, rechoncho, hongo, en forma de copa) de cada columna vertebral se compararon entre los grupos. Se utilizó un software de código abierto de los Institutos Nacionales de la Salud (ImageJ) para el análisis de datos de tomografía de matriz y Golgi.
Resultados
La abstinencia de la cocaína reduce la densidad total de sinapsis
La tomografía de matriz se utilizó para medir los cambios en las sinapsis tanto excitatorias como inhibitorias para determinar las alteraciones morfológicas específicas que ocurren en el CPP en respuesta a la abstinencia de la autoadministración de cocaína. La tomografía de matriz es un método de alto rendimiento que permite la cuantificación precisa de las sinapsis total, inhibitoria y excitatoria en estructuras que son demasiado pequeñas para ser identificadas o localizadas adecuadamente con los métodos tradicionales de microscopía confocal [ 19 ]. Como las sinapsis inhibitorias y excitatorias son componentes esenciales del circuito de recompensa de la droga [ 13 ], [ 27 ], [ 28 ] utilizamos esta metodología novedosa para evaluar los cambios morfológicos en el CPP durante la abstinencia de la cocaína. Setenta secciones de PFC nm de un hemisferio cerebral de ratas 5 con solución salina y 5 experimentadas con cocaína se tiñeron con anticuerpos contra PSD95, un marcador excitador postsináptico, sinaptofisina, un marcador presináptico y GAD65, que etiquetan las neuronas inhibitorias y las sinapsis. Las densidades de sinapsis y el porcentaje de sinapsis inhibitorias se determinaron en la capa cortical V (Figura 1A y 1B). Nuestros resultados indican que durante la abstinencia de la cocaína hubo una disminución significativa en la densidad de sinaptofisina (Figura 1C), que mide todos los terminales presinápticos [t (7)=2, p <0.05]. No hubo una disminución significativa en la densidad de sinapsis excitadoras [t (8)=0.48, p=0.32] medido contando el punto de PSD95 (Figura 1D). Curiosamente, hubo una tendencia no significativa hacia un aumento en el porcentaje de sinapsis inhibitorias positivas para GAD65 [t (8)=−1.39, p=0.9] (Figura 2E).
La abstinencia de la cocaína reduce la ramificación dendrítica mientras aumenta transitoriamente la densidad de la columna vertebral en el PFC
El método de Golgi se utilizó para examinar las alteraciones en la ramificación neuronal y la densidad de la columna dendrítica a fin de confirmar los cambios ultraestructurales observados en la densidad de sinapsis (Figura 1 y XNUMX). Realizamos la impregnación rápida de Golgi de una sola sección en un subconjunto de neuronas en el PFC de los otros hemisferios de los mismos animales que se utilizaron para los estudios de tomografía de matriz. Se evaluaron la ramificación dendrítica, el recuento de la columna dendrítica y la morfología de la columna vertebral. Dos neuronas piramidales representativas del PFC de un control salino-yked y una rata expuesta a la cocaína se muestran en Figura 2A. El diagrama de Sholl midió el número de intersecciones (puntos de derivación) dentro de círculos concéntricos en radios entre 5 – 250 µm. Nuestros resultados demuestran que después de 7 días de abstinencia forzada de autoadministración de cocaína hubo una reducción significativa en la complejidad dendrítica (Figura 2B). El análisis ANOVA de medidas repetidas de dos vías de los datos del gráfico de Sholl reveló efectos principales significativos del tratamiento [F(1,738)=30.59, p <0.0001] y radio [F(245, 738)=289.6, p <0.0001] (Figura 2B), confirmando una pérdida de dendritas que está de acuerdo con la pérdida de sinapsis medida en estudios de matriz (Figura 1C). El análisis de las dendritas basilares de segundo y tercer orden reveló un aumento significativo en las espinas dendríticas después de 7 días de abstinencia de cocaína [t (6)=−3.12, p <0.05] (Figura 2D). Más específicamente, la abstinencia de la exposición a la cocaína aumentó el número de subtipo de columna delgada, mientras que no tuvo un efecto significativo en otros subtipos de columna vertebral (Figura 2E), según lo revelado por ANOVA de medidas repetidas de dos vías con los principales efectos del tratamiento [F(1,30)=11.9, p=0.0017], subtipo de columna vertebral [F(4,30)=57.7, p <0.0001], y una interacción significativa tratamiento x subtipo de columna [F(1, 4, 30)=8.8, p <0.0001].
Discusión
En el presente estudio, demostramos que hay pronunciados cambios estructurales y sinápticos en la capa V de PFC después de 7 días de abstinencia forzada de autoadministración de cocaína. Específicamente, hay una disminución significativa en la ramificación dendrítica de las neuronas piramidales y una pérdida general en la densidad de sinapsis, medida por la disminución de la densidad de los boutons presinápticos totales marcados con sinaptofisina. A pesar de la pérdida de densidad presináptica, las dendritas basales de las neuronas piramidales de la capa V experimentaron un aumento en la densidad de la columna dendrítica, particularmente de espinas plásticas delgadas. Como no detectamos cambios significativos en la densidad de PSD95, se puede especular que las disminuciones en los terminales presinápticos, pero el aumento en la densidad de la columna vertebral puede deberse a un aumento en el número de boutons multi-sinápticos. Además, también vale la pena señalar que observamos una tendencia hacia el aumento de las sinapsis inhibitorias en el PFC. Dado que las espinas delgadas están involucradas en la plasticidad [ 29 ], el aumento de estas espinas podría representar una plasticidad compensatoria para mantener entradas sinápticas en estas neuronas denervadas que han perdido ramas dendríticas.
Estudios previos demostraron que la cocaína aumenta la arborización dendrítica y la densidad de la columna vertebral en la NAc [ 2 ]–[ 4 ]. Recientemente, Dumitriu et al., 2012 [ 30 ] demostró que la cocaína altera dinámicamente las espinas proximales en el núcleo y la capa de NAc. Específicamente, en la cáscara, la extracción de la cocaína aumentó las espinas delgadas, mientras que disminuyó la densidad de la cabeza de la seta en la capa de NAc [ 30 ]. A diferencia de los estudios de la NAc, solo hay unos pocos estudios que han examinado los efectos de la cocaína sobre la morfología neuronal en la PFC [ 6 ], [ 31 ]. Nuestros datos son consistentes con un estudio reciente que demuestra que la cocaína induce un aumento en la densidad de la columna vertebral en el PFC [ 31 ]. En particular, los ratones que tuvieron un mayor aumento en las espinas persistentes y estables, es decir, las espinas presentan días 3 posteriores a la retirada, en las dendritas apicales mostraron puntuaciones más altas de preferencia de lugar condicionadas por la cocaína e hiperactividad inducida por la cocaína [ 31 ]. Un estudio previo en ratas PFC de las neuronas de la capa II-III informó valores de aproximadamente 3 de espinas por µm de dendrita en dendritas tanto apicales como basales, un nivel sorprendentemente denso de espinas que era modificable por el estrés [ 32 ]. Nuestros valores en ratas de control de sp2 espinas / 10 µm de segmentos dendríticos son menores, lo que puede deberse a la diferente población neuronal analizada (dendritas basales de la capa V) oa la diferencia en la técnica de imagen. En el presente estudio utilizamos el método de tinción rápida de Golgi de una sola sección, mientras que Radley y sus colegas utilizaron inyecciones iontoforéticas de colorante amarillo de Lucifer combinadas con imágenes confocales. [ 32 ] Visualizar morfología neuronal y dendrítica. Además, nuestros hallazgos también resaltan la importancia de la duración de la abstinencia de la autoadministración de cocaína que conduce a cambios estructurales en el cerebro. Un informe publicado anteriormente demostró un aumento en la arborización dendrítica después del retiro a largo plazo (24-25 días) de la cocaína en ratas hembras [ 6 ], en contraste con nuestra disminución observada después de 7 días de abstinencia forzada en ratas macho. A pesar de estas diferencias metodológicas y diferencias en los datos de ramificación, en ambos estudios se observó un aumento en el número de espinas, lo que confirma la reorganización del circuito a gran escala durante la abstinencia de la cocaína. Los estudios futuros dilucidarán el curso temporal de estos eventos para determinar si estos cambios estructurales son transitorios o duraderos.
Nuestros hallazgos indican que la abstinencia forzada de la autoadministración de cocaína induce cambios estructurales dinámicos y causa una reorganización sináptica en el PFC. Estos resultados pueden explicar la hipoactividad en el PFC que se produce como resultado de la exposición repetida a la cocaína. [ 8 ], [ 33 ]. Además, nuestros hallazgos apoyan estudios previos que demuestran la desactivación del PFC [ 7 ], [ 8 ], y aumento de GABA extracelular en el PFC medial durante la retirada de cocaína [ 34 ]. Así, los mecanismos que explican la hipoactividad de PFC luego de la exposición crónica a la cocaína [ 8 ], [ 10 ] puede incluir (1) un aumento en GABAergic, (2) reducción en glutamatérgica y / o (3) reducción en la entrada sináptica dopaminérgica al PFC. El presente estudio demuestra que la abstinencia de la cocaína reduce significativamente la densidad general de sinapsis, como lo indica una reducción en el número de puntos sinápticos positivos para sinaptofisina. Estos datos sugieren que hay una reducción en la capacidad de respuesta post-sináptica en el PFC, posiblemente mediado por la disminución de la entrada de glutamato o dopamina. De hecho, hay estudios que indican que la cocaína induce reducciones en el tono glutamatérgico [ 35 ], [ 36 ]. Sin embargo, utilizando el método de Golgi, observamos un aumento en el número de espinas dendríticas delgadas en las dendritas basales de las neuronas piramidales, lo que sugiere un aumento en la entrada de excitación en el PFC a las neuritas restantes. Estos datos aparentemente conflictivos pueden reflejar una pérdida general de sinapsis asociada con la gran pérdida de dendritas que observamos con una respuesta compensatoria, posiblemente mediada por un aumento de BDNF, como se muestra en nuestros hallazgos anteriores [ 20 ], para aumentar la densidad de las espinas dendríticas en las neuritas restantes.
En conjunto, nuestros hallazgos indican una reorganización dinámica en el PFC durante la abstinencia de la cocaína. Específicamente, hay una reducción significativa en la conectividad sináptica, la pérdida de la ramificación dendrítica y un aumento en el número de espinas delgadas en el PFC de rata después de 7 días de abstinencia forzada de drogas de la autoadministración de cocaína. Estos resultados pueden proporcionar la base estructural para la hipoactividad observada en el CPF de los consumidores crónicos de cocaína y tal vez explicar la pérdida del control cognitivo que se produce durante la adicción a la cocaína.
AGRADECIMIENTOS
Los autores desean agradecer a Gavin Sangrey por su ayuda en la preparación de las cápsulas incrustadas.
Declaración de financiación
Este trabajo fue apoyado por subvenciones NIDA DA22339 y DA033641 (RCP & GSV) y DA18678 (RCP). HDS fue apoyado por un premio K01 individual (DA030445). Los patrocinadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.
Referencias
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