Psiquiatría Front. 2018; 9: 81.
Publicado en línea 2018 Mar 12. doi 10.3389 / fpsyt.2018.00081
PMCID: PMC5858605
PMID: 29593587
Minho Lee,1,† Hyeyoung cho,2,3,† Seung Hyun Jung,2,4 Seon-Hee Yim,2 Sung-Min Cho,2,3 Ji-Won Chun,5 Soo-Hyun Paik,5 Parque yae eun,6,7 Dong Huey Cheon,7,8 Ji eun lee,7 Jung-Seok Choi,9 Dai-Jin Kim,5,* y Yeun-Jun Chung1,2,3,*
Resumen
Antecedentes
El uso adictivo de Internet y los juegos en línea es un trastorno psiquiátrico potencial denominado trastorno de los juegos en Internet (IGD). Se han informado perfiles de expresión de microARN alterados (miARN) en la sangre y el tejido cerebral de pacientes con ciertos trastornos psiquiátricos y se han sugerido como biomarcadores. Sin embargo, no ha habido informes sobre los perfiles de miRNA en sangre en la IGD.
Métodos
Para descubrir los miARN asociados con IGD, analizamos los perfiles de expresión de miARN de muestras 51 (controles 25 IGD y 26) utilizando la matriz de miARN de baja densidad TaqMan. Para la validación, realizamos la PCR cuantitativa de transcripción inversa con muestras independientes de 36 (controles 20 IGD y 16).
Resultados
A través del descubrimiento y la validación independiente, identificamos tres miRNAs (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-652-3p) que estaban significativamente desregulados en el grupo IGD. Los individuos con las tres alteraciones de miARN tenían un riesgo mucho mayor de IGD que aquellos sin alteración [odds ratio (OR) 22, 95% CI 2.29 – 211.11], y las RUP aumentaron de forma dependiente con el número de miRNA alterados. Los genes diana predichos de los tres miRNAs se asociaron con las vías neurales. Exploramos la expresión de la proteína de los tres genes diana en sentido descendente mediante Western blot y confirmamos que la expresión de GABRB2 y DPYSL2 fue significativamente mayor en el grupo con IGD.
Conclusión
Observamos que las expresiones de hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p y hsa-miR-652-3p estaban reguladas a la baja en los pacientes con IGD. Nuestros resultados serán útiles para comprender la fisiopatología de la DID.
Introducción
El uso adictivo de Internet y los juegos basados en Internet no es solo un fenómeno social en países con una amplia infraestructura de acceso a Internet, sino un posible trastorno psiquiátrico denominado trastorno de juegos de Internet (IGD) (1–3). Según los informes epidemiológicos, las tasas de prevalencia de IGD en adolescentes varían entre los países, desde 0.8 hasta 26.7% (4). En particular, los estudios muestran tasas de prevalencia superiores al 10% en adolescentes en muchos países asiáticos como Corea del Sur, China, Taiwán, Hong Kong y Singapur (4). La IGD está asociada con un deterioro en la cognición, las relaciones psicosociales y la vida diaria; por ejemplo, la disminución del rendimiento académico u ocupacional (4–7). IGD se incluye ahora en la Sección III (Condiciones para estudio adicional) de la quinta revisión del Manual diagnóstico y estadístico de trastornos mentales (DSM-V) (8). Sin embargo, a pesar de su importancia clínico-social, poco se sabe sobre el mecanismo genético molecular detrás de la IGD.
Recientes estudios de gemelos a gran escala han sugerido un fondo genético para la IGD (9, 10). Vink et al. investigó las diferencias individuales en el uso compulsivo de Internet con gemelos adolescentes monocigóticos y dicigóticos 5,247 en el Registro Gemelo de los Países Bajos e informó que el 48% de las diferencias se explicaron por factores genéticos (9). Li et al. observaron parejas 825 de gemelos adolescentes chinos e informaron que los factores genéticos explicaron 58 – 66% de las diferencias (10). En consecuencia, los polimorfismos de los genes implicados en la neurotransmisión, la cognición y la atención, como el gen D2 receptor de dopamina (DRD2), gen de catecolamina-O-metiltransferasa (COMT), gen transportador de serotonina (5HTTLPR), y el receptor colinérgico nicotínico alfa 4 gen (CHRNA4) han sido reportados como significativamente asociados con la adicción a Internet (11–13). Recientemente, Kim et al. Variantes seleccionadas de más de 100 genes candidatos relacionados con la producción, la acción y el metabolismo de los neurotransmisores mediante el análisis de secuenciación de la próxima generación e informaron que rs2229910 de NTRK3 El gen está asociado con IGD (14).
Además de los factores genéticos, también es bien sabido que los fenotipos neuroconductuales están controlados epigenéticamente por ARN no codificantes, incluidos los microARN (miARN) (15, 16). Los miARN son pequeñas moléculas de ARN monocatenarias no codificantes (aproximadamente de nucleótidos 20-23 de longitud), que regulan negativamente la expresión de genes codificantes de proteínas al degradar los ARNm y desempeñan un papel crítico en el proceso patofisiológico de diversas enfermedades (17). Las líneas de evidencia han demostrado que los miRNAs son abundantes en el sistema nervioso central humano (SNC) y actúan para afinar los niveles de expresión de sus genes objetivo, que están involucrados en el desarrollo y la maduración del sistema del SNC (15). De hecho, estudios recientes han revelado que los perfiles de expresión de miRNA están alterados en el tejido cerebral de pacientes con trastornos psiquiátricos, lo que sugiere que sus perfiles de expresión podrían ser biomarcadores para trastornos psiquiátricos (15, 16, 18). Por ejemplo, a través del análisis postmortem, López et al. informaron que la expresión de miR-1202, que regula la expresión del gen metabotrópico del receptor de glutamato-4 y predice la respuesta al antidepresivo, estaba regulada a la baja en los tejidos de la corteza prefrontal de pacientes con trastorno de depresión mayor (19). En términos de detección de biomarcadores, este enfoque tiene una clara limitación porque es imposible realizar una biopsia de tejido del SNC para la detección. Dado que los miRNAs pueden detectarse en la sangre (plasma o suero), los miRNA circulantes tienen una ventaja definitiva como biomarcadores no invasivos en los trastornos neuropsiquiátricos. Sin embargo, hasta la fecha, no se han realizado estudios sobre la circulación de perfiles de miRNA en IGD. Una mejor comprensión de los perfiles de expresión de miRNA circulantes podría ayudar a aclarar el mecanismo de desarrollo de la IGD y facilitar la traducción clínica.
En este estudio, el objetivo fue identificar los marcadores de miARN asociados a la IGD mediante la observación de los miARN plasmáticos expresados diferencialmente entre los grupos de control y la IGD y exploramos sus implicaciones biológicas.
Materiales y Métodos
Sujetos de estudio
Encuestamos a adolescentes 3,166 (años 12 – 18 de edad) utilizando DSM-V IGD scoring. Entre ellos, 251 (hombres 168 y mujeres 83) fueron diagnosticados como IGD según los criterios del DSM-V (8). Un total de individuos 91 (49 IGD y controles 42) proporcionaron el consentimiento informado para este estudio. Entre ellos, cuatro individuos fueron excluidos según los criterios de exclusión. Finalmente, los individuos de 87 (sujetos con 45 IGD y individuos de control sanos de 42) se inscribieron para este estudio. Entre ellos, los participantes de 51 (pacientes con 25 IGD y controles de 26) fueron reclutados como el conjunto de descubrimiento de 2014 a 2016. Los otros participantes de 36 (pacientes con 20 IGD y controles de 16) se reclutaron como el conjunto de validación independiente de 2016. Todos los participantes eran individuos coreanos, inscritos en el Hospital St. Mary's de Seúl (Seúl, Corea del Sur) y en el Hospital Boramae de la Universidad Nacional de Seúl (Seúl, Corea del Sur). Todos los participantes se sometieron a una entrevista estructurada por un psiquiatra basada en el Programa para niños coreanos para los trastornos afectivos y la esquizofrenia (K-SADS-PL) (20). Todos los participantes completaron las subpruebas de Vocabulario y Diseño de Bloques de la Escala de Inteligencia Coreana-Wechsler para Niños, edición 4 (K-WISC-IV) (21). La impulsividad se evaluó mediante la Escala de impulsividad de Barratt (BIS) (22). Las escalas del Sistema de inhibición del comportamiento (BInS) y del Sistema de activación del comportamiento (BAS) se midieron para evaluar la dimensión de la personalidad (23). Los criterios de exclusión incluyeron trastornos médicos mayores pasados o actuales (por ejemplo, diabetes mellitus), trastornos neurológicos (por ejemplo, trastornos convulsivos, lesiones en la cabeza), trastornos psiquiátricos (por ejemplo, trastorno depresivo mayor, trastornos de ansiedad), retraso mental o cualquier abuso de sustancias (por ejemplo, , tabaco, cannabis, alcohol). Las características generales de los sujetos de estudio se resumen en la Tabla Table1.1. Este estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional del Colegio Médico de la Universidad Católica de Corea (MC16SISI0120). Todos los participantes y sus padres dieron su consentimiento informado por escrito.
Tabla 1
Características generales de los sujetos de estudio.
Descubrimiento de moléculas | Validación | Conjunto | |||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Control | IGD | P-valor | Control | IGD | P-valor | Control | IGD | P-valor | |
N | 26 | 25 | 16 | 20 | 42 | 45 | |||
Años de edad) | |||||||||
Mediana (min – max) | 13 (12 – 17) | 13 (12 – 15) | 0.759 | 15 (13 – 18) | 14.5 (12 – 18) | 0.628 | 14 (12 – 18) | 14 (12 – 18) | 0.509 |
Horas semanales de juego en internet (h) | |||||||||
Mediana (min – max) | 5.25 (2 – 17) | 18 (6 – 46) | 1.27E − 6a | 5.5 (2 – 23) | 8 (1 – 112) | 0.374 | 5.5 (2 – 23) | 14 (1 – 112) | 1.63E − 5a |
Ingreso mensual del hogar (millones de KRW) | |||||||||
Mediana (min – max) | 5 (1 – 9) | 3 (1 – 9) | 0.588 | 4 (4 – 4) | 2 (2 – 2) | 1.000 | 5 (1 – 9) | 3 (1 – 9) | 0.460 |
Educación (años) | |||||||||
Mediana (min – max) | 8 (7 – 9) | 8 (7 – 9) | 0.584 | 12 (12 – 12) | 6 (6 – 13) | 0.305 | 8 (7 – 12) | 8 (6 – 13) | 0.269 |
K-WISC: diseño de bloques | |||||||||
Mediana (min – max) | 10.5 (4 – 17) | 10 (4 – 16) | 0.544 | 10 (3 – 16) | 12.5 (4 – 15) | 0.125 | 10 (3 – 17) | 11 (4 – 16) | 0.598 |
K-WISC: vocabulario | |||||||||
Mediana (min – max) | 9 (5 – 17) | 7 (5 – 13) | 0.174 | 9.5 (8 – 15) | 11.5 (5 – 15) | 0.595 | 9 (5 – 17) | 9 (5 – 15) | 0.527 |
KS | |||||||||
Mediana (min – max) | 24 (17 – 36) | 37 (22 – 51) | 3.81E − 6a | 29 (17 – 34) | 59 (22 – 108) | 1.2E − 5a | 25 (17 – 36) | 40 (22 – 108) | 2.05E − 10a |
BIS | |||||||||
Mediana (min – max) | 63 (35 – 75) | 67.5 (45 – 81) | 0.080 | 61 (45 – 79) | 63 (32 – 82) | 0.835 | 62 (35 – 79) | 65 (32 – 82) | 0.240 |
BAS | |||||||||
Mediana (min – max) | 31 (15 – 40) | 31 (13 – 51) | 0.558 | 36.5 (22 – 48) | 34 (27 – 52) | 1.000 | 32 (15 – 48) | 34 (13 – 52) | 0.637 |
BINS | |||||||||
Mediana (min – max) | 18 (10 – 26) | 17.5 (13 – 27) | 0.642 | 18.5 (12 – 25) | 20 (13 – 21) | 0.138 | 18 (10 – 26) | 19 (13 – 27) | 0.302 |
IGD, pacientes con trastornos de los juegos de Internet; KS, Escala de indiferencia de la adicción a Internet de Corea; BIS, Barratt Impulsivity Scale; BAS, Sistema de Activación de Comportamiento; BInS, sistema de inhibición del comportamiento; KRW, Won coreano.
aP <0.05 (prueba de Mann-Whitney-Wilcoxon).
Experimentos con la matriz de miARN de baja densidad TaqMan (TLDA)
Se extrajo sangre periférica de cada participante y se transfirió al laboratorio dentro de 4 h para minimizar la lisis de las células sanguíneas. La muestra se centrifugó a 3,000 rpm durante 10 min a temperatura ambiente. Luego, se recogió el sobrenadante (capa de plasma) sin contaminar las células sanguíneas. Los miRNA circulantes se extrajeron utilizando el kit de purificación ABC miRNA TaqMan (Panel A humano; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) De acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, se mezclaron 50 µL de muestra de plasma y 100 µL de tampón ABC. Después de la hibridación con perlas magnéticas anti-miRNA específicas de diana, los miRNAs circulantes limitados se eluyeron de las perlas con 100 µL de tampón de elución. En la fase de descubrimiento, se examinaron los miRNAs 381 de muestras de plasma 51 (25 IGDs y controles 26) utilizando el kit de purificación ABC de miRNA TaqMan (Panel A humano; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) Según las instrucciones del fabricante. Se realizaron reacciones de transcripción inversa y preamplificación de Megaplex para aumentar la cantidad de ADNc para el análisis de expresión de miARN utilizando los MegaplexPreAmp Primers Human Pool A y TaqManPreAmp Master Mix (Thermo Fisher Scientific). El panel TLDA A v2.0 (Thermo Fisher Scientific) se ejecutó en el sistema de PCR en tiempo real ViiA7 (Thermo Fisher Scientific) para evaluar la expresión de los miRNAs. Los datos sin procesar se procesaron utilizando el software ExpressionSuite v1.0.4 (Thermo Fisher Scientific) para determinar los valores de Ct para cada miRNA.
Análisis de datos para TLDA
Primero medimos los ciclos de umbral (valor Ct) de cada miARN. Los miARN con un valor de Ct> 35 se consideraron indetectables y se excluyeron del análisis posterior. Todos los valores de Ct se normalizaron al valor de Ct de miR-374b (valor ΔCt), uno de los miARN expresados de forma más estable que circulan en el plasma humano (24). Se calculó una relación de cambio del valor log2 (valor de ΔΔCt) de la expresión utilizando los valores medios de las muestras de control como calibrador en el paquete HTqPCR en Bioconductor (25). La cuantificación relativa (RQ) de cada objetivo de miRNA se definió como 2−ΔΔCt. Para la prueba hipotética de la diferencia en la expresión entre dos grupos, aplicamos el análisis de variables sustitutas (SVA) para capturar las heterogeneidades, como los efectos de los lotes en los experimentos que utilizan sva paquete en bioconductor (26). miRNAs con un P-Se consideró que un valor <0.05 era significativamente diferente entre dos grupos.
Análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes
Para el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes, utilizamos ToppFun en ToppGene Suite (27) para inferir la ontología génica enriquecida (GO) (28) términos, vías y términos de enfermedad. Como entrada para este enfoque, utilizamos los genes diana predichos de 1,230 de los miRNA candidatos. Se usó el análisis de rutas para encontrar rutas significativas de los genes diana pronosticados de acuerdo con KEGG, BioCarta, Reactome, GeneMAPP y MSigDB en las rutas ToppGene. La importancia de los términos de enriquecimiento funcional se determinó en base al ajuste de Bonferroni P-valor.
Validación y replicación cuantitativa de la transcripción inversa (qRT-PCR)
Para validar los miRNAs de 10 que se expresaron diferencialmente en la etapa de descubrimiento, se realizó qRT-PCR utilizando el ensayo de microARN TaqMan (miR-15b-5p, #000390; miR-26b-5p, #000407p, miR-29b-3pc 000413; miR-125b-5p, #000449; miR-200c-3p, #002300; miR-337-5p, #XNUMGNUITES DE NÚMEROS; -002156p, #411; y miR-5-001610p, #423) y el sistema ViiA5 (Life Technologies) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Diez nanogramos de ARN total se convirtieron en ADNc de primera cadena con cebadores específicos de miARN utilizando el kit de transcripción inversa de microARN de TaqMan (#002340, Life Technologies), seguido de una PCR en tiempo real con las sondas de TaqMan. El RQ de cada miRNA se definió como 483−ΔCt, donde ΔCt es la diferencia en los ciclos de umbral para la muestra en cuestión, normalizada contra el miRNA endógeno (miR-374b-5p, #001319). Todas las reacciones de PCR se llevaron a cabo por triplicado, y sus valores de Ct se promediaron. Calculamos una relación de cambio de veces log2 (ΔΔCt) de cada miRNA de la misma manera que en el análisis basado en matrices. Se realizó una prueba no paramétrica de Mann-Whitney-Wilcoxon para probar las diferencias en los niveles de expresión de los miRNAs en dos grupos con un umbral P-valor de 0.05.
Análisis de Western Blot
Cada muestra de suero se agotó por primera vez de las principales proteínas de alta abundancia de 14 (albúmina, inmunoglobulina G, inmunoglobulina A, serotransferrina, haptoglobina, antitripsina alfa-1, fibrinógeno, macroglobulina alfa-2, glicoproteína ácida alfa-1, yacopina) , apolipoproteína A-II, complemento C3 y transtiretina) utilizando la columna MARS-14 (4.6 × 50 mm, Agilent Technology, Santa Clara, CA, EE. UU.) antes del análisis de transferencia Western. La fracción no unida obtenida de la columna MARS-14 se concentró utilizando un filtro centrífugo Amicon Ultracel-3 (corte de 3 kDa), y luego se determinó la concentración de proteína utilizando el método del ácido bicinconínico. Las mismas cantidades (de 10 a 30 µg) de control y muestras de suero IGD se separaron en un gel prefabricado 4-20% Mini-PROTEAN TGX (Bio-Rad, CA, EE. UU.) Y se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno. A continuación, la membrana se bloqueó en TBS-T (190 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl, pH 7.5 y 0.05% Tween 20) con 5% de leche en polvo no grasa a temperatura ambiente durante 30 mín. Las membranas luego se incubaron con anticuerpos primarios contra DPYSL2 (1: 500, Novus Biologicals, Littleton, CO, EE. UU.), GABRB2 (1: 1000, Abcam, Cambridge, MA, EE. UU.) Y CNR1 (1: 100: Santa Bromix , Inc., Santa Cruz, CA, EE. UU.), DUSP4 (1: 500, MybioSource, San Diego, CA, EE. UU.) Y PI15 (1: 500, MybioSource, San Diego, CA, EE. UU.) En TBS-T con 5 % de leche en polvo sin grasa a 4 ° C durante la noche, y luego con los anticuerpos secundarios apropiados, ya sea anti-ratón bovino (1: 1,000, Santa Cruz Biotechnology) o anti-conejo de cabra (1: 1,000, Cell Signaling, Beverly, MA, EE. UU. ) conjugado con peroxidasa de rábano picante a temperatura ambiente para 1 h. La detección de señales se realizó mediante quimioluminiscencia con reactivo ECL (GE healthcare, Piscataway, NJ, EE. UU.). Cuantificamos los resultados de Western Blot utilizando el software de análisis TotalLab 1D (Dinámica no lineal, Newcastle upon Tyne, Reino Unido). Luego, el valor de la relación de densitometría se calculó dividiendo el valor de densitometría de cada muestra como se describe en otro lugar (29). Como control para la normalización, se utilizó una muestra de suero agrupada de 46 IGD y muestras de control para cada experimento. La significación estadística se determinó mediante una prueba no paramétrica de Mann-Whitney-Wilcoxon con un umbral P-valor de 0.05.
Resultados
Características de los sujetos de estudio
Las características demográficas y clínicas de los sujetos del estudio se muestran en la Tabla Table1.1. Cuando comparamos la IGD y los grupos de control de acuerdo con la Escala de adicción a la adicción a Internet de Corea (K-Escala) como se describe en otra parte (20, 30), el grupo IGD mostró un valor mediano de la Escala K significativamente mayor que el grupo control (37 vs. 24, P = 3.81 × 10-6) (Mesa (Table1) .1). El tiempo medio semanal empleado en juegos de Internet en el grupo IGD fue significativamente más largo que el de los controles (18 vs. 5.25 h, P = 1.27 × 10-6). Si bien no hubo diferencias significativas entre los dos grupos en edad, ingresos mensuales del hogar, duración de la educación, diseño de bloques y resultados de subprueba de vocabulario de K-WISC, BIS, BInS y BAS.
MiRNAs expresados diferencialmente entre IGD y controles
Para descubrir los miRNAs asociados con IGD, adoptamos un enfoque de dos pasos (descubrimiento y validación independiente). El diseño del estudio y la estrategia general se ilustran en la Figura S1 en Material complementario. En la etapa de descubrimiento, analizamos los perfiles de expresión de miARN de muestras de 51 (25 IGD y controles de 26) utilizando la matriz de miARN que contiene miARN de 384. Se encontró que los niveles de expresión de los miRNAs de 10 eran significativamente diferentes entre los grupos de control e IGD (Tabla (Table2) .2). Los niveles de expresión relativos de estos miRNAs 10 se muestran en la Figura Figura1.1. Entre ellos, dos (hsa-miR-423-5p y hsa-miR-483-5p) estaban regulados al alza y ocho (hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miN-RNXXX) hsa-miR-29b-3p, hsa-miR-125c-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-337-5p, y hsa-miR-411-5p) fueron descargados
Tabla 2
MicroRNAs expresados diferencialmente (miRNAs) y cambios en el pliegue.
miRNA | Descubrimiento de moléculas | Validación | Conjunto | |||
---|---|---|---|---|---|---|
P-valor | Doble cambio | P-valor | Doble cambio | P-valor | Doble cambio | |
hsa-miR-15b-5p | 0.033 | 0.829 | 0.694 | 1.119 | 0.381 | 0.947 |
hsa-miR-26b-5pa | 0.008 | 0.871 | 0.049 | 0.841 | 0.013 | 0.857 |
hsa-miR-29b-3p | 0.005 | 0.400 | 0.560 | 1.187 | 0.089 | 0.647 |
hsa-miR-125b-5p | 0.021 | 0.582 | 0.290 | 0.950 | 0.069 | 0.723 |
hsa-miR-200c-3pa | 0.011 | 0.336 | 0.003 | 0.542 | 2.93 × 10-5 | 0.415 |
hsa-miR-337c-5p | 0.009 | 0.385 | 0.582 | 0.872 | 0.020 | 0.553 |
hsa-miR-411-5p | 0.004 | 0.322 | 0.336 | 1.282 | 0.158 | 0.595 |
hsa-miR-423-5p | 0.026 | 1.387 | 0.189 | 0.955 | 0.518 | 1.175 |
hsa-miR-483-5p | 0.018 | 1.861 | 0.765 | 1.413 | 0.211 | 1.647 |
hsa-miR-652-3pa | 0.019 | 0.715 | 0.049 | 0.877 | 0.011 | 0.782 |
aLos miRNAs se alteraron significativamente tanto en el descubrimiento como en la validación de forma consistente..
qRT-PCR Validación de los miRNAs candidatos
Para validar los miRNAs candidatos de 10, realizamos qRT-PCR con un conjunto de validación independiente (controles IGD de 20 y controles 16) (Tabla S1 en Material complementario). Tres de estos miRNAs (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p, y hsa-miR-652-3p) se regularon significativamente en el grupo IGD del conjunto de validación (Tabla (Table2) .2). Otros tres miRNAs (hsa-miR-337c-5p, hsa-miR-125b, y hsa-miR-423-5p) también fueron regulados a la baja en el grupo IGD pero no significativamente. Quedan cuatro miRNAs (hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-29b-3p, hsa-miR-411-5p, y hsa-miR-423-5p) se expresaron de manera opuesta en el conjunto de validación. Cuando combinamos los conjuntos de descubrimiento y validación (un total de sujetos 45 IGD y controles 42), los tres miRNAs validados fueron consistentemente significativos (Tabla (Table2) .2). La información detallada, las ubicaciones cromosómicas, las secuencias maduras y los niveles de expresión en el SNC de estos tres miARN están disponibles en la Tabla S2 en Material complementario.
Efecto sinérgico de la alteración simultánea de los tres miRNAs en el riesgo de IGD
Para evaluar el efecto combinado de los tres miRNAs, observamos los odds ratios (OR) de los cuatro subgrupos (con alteraciones de los miRNA de 0, 1, 2 o 3). La alteración de miRNA se definió por el valor RQ como se describe en la Sección “Materiales y Métodos. ”Debido a que los tres marcadores de miARN estaban regulados a la baja en el grupo IGD, un miARN cuyo valor de RQ estaba por debajo de uno se desafió como uno alterado. La información detallada del valor RQ de cada sujeto del estudio para los tres miRNAs está disponible en la Tabla S3 en Material complementario. Para cada subgrupo, las probabilidades se calcularon como la relación entre el número de controles y la de las IGD, luego cada OR se calculó dividiendo las probabilidades de cada subgrupo por las probabilidades del subgrupo sin ninguna alteración de miARN. Los individuos con tres alteraciones de miARN mostraron un riesgo 22 veces mayor que aquellos sin ninguna alteración de miARN (O 22, 95% CI 2.29 – 211.11). Los RUP mostraron una tendencia creciente con el número de miARN alterados de 0 a 3 (r2 = 0.996) (Figura (Figura 22).
GO y análisis de la ruta de los genes diana de los miRNA candidatos
Para comprender mejor las funciones de los tres marcadores de miARN regulados a la baja en el grupo IGD, se predijeron sus genes diana utilizando la base de datos miRWalk 2.0 (31). Un total de genes 1,230 se predijeron consistentemente como objetivos descendentes mediante cuatro algoritmos (miRWalk, miRanda, RNA22 y Targetscan) usando la base de datos miRWalk (32–34) (Tabla S4 en Material Complementario). El análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes utilizando ToppFun en ToppGene Suite mostró que los genes diana de esos miRNAs se asociaron significativamente con vías de desarrollo neuronal como "Guía de axones" y términos de GO como "neurogénesis" (Tabla S5 en Material complementario).
Expresión de los genes objetivo predichos
Entre los genes diana descendentes de los tres miRNAs, 140 se predijo simultáneamente para dos o más miRNAs (Tabla S4 en Material suplementario). Para explorar si los niveles de expresión de proteínas de los genes diana posteriores son diferentes entre los grupos de control e IGD, seleccionamos los genes 2 (DUSP4 y PI15), que se pronostican como objetivos descendentes de todos los miRNAs 3 y genes 3 adicionales (GABRB2, DPYSL2y CNR1) de los pronosticados para los miRNA de 2 y realizó un análisis de transferencia de western con las muestras de plasma de los controles IGN de 28 y controles de 28 disponibles para el experimento. Comparamos las expresiones de los cinco objetivos entre el IGD y los grupos de control al medir la intensidad de la banda y el área como se describe en otro lugar (29). Entre ellos, los niveles de expresión de DPYSL2 (28 IGDs y controles 28, P = 0.0037) y GABBR2 (27 IGD y 28 controles, P = 0.0052) fueron significativamente mayores en el grupo IGD (Figura (Figura 3) .3). Sin embargo, no pudimos observar expresiones diferenciales de CNR1 (P = 0.0853), DUSP4 (P = 0.5443) y PI15 (P = 0.6346).
Discusión
Se ha informado que los miRNAs están involucrados en el desarrollo neuronal (35, 36), y la expresión diferencial de los miRNAs del cerebro se observa en enfermedades psiquiátricas como la esquizofrenia (37). Por lo tanto, es plausible que los perfiles miRNA circulantes puedan ser biomarcadores útiles para IGD. Se han sugerido los miRNA circulantes como biomarcadores para diversos trastornos neuropsiquiátricos (38–40); sin embargo, los mecanismos moleculares detrás del desarrollo de la IGD son aún en gran parte desconocidos a pesar de su importancia clínica y social. Específicamente, no se han realizado estudios sobre miRNAs asociados con IGD. El objetivo de este estudio fue doble. Primero, intentamos descubrir los miRNAs de plasma asociados con la IGD. En segundo lugar, evaluamos la implicación biológica de los candidatos de miARN al explorar la expresión de proteínas y el GO de los genes diana posteriores. A través del rastreo genómico de los perfiles de expresión de miARN y la validación posterior de los candidatos, descubrimos que la expresión de tres miARN (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p, y hsa-miR-652-3p) fue significativamente más bajo en pacientes con IGD que los controles. Aunque los patrones de expresión de otros siete candidatos de miRNA no se replicaron en la validación, puede ser falso negativo debido al pequeño tamaño de la muestra en este estudio. Por lo que sabemos, este es el primer informe sobre la posibilidad de que los perfiles de expresión de miARN en sangre puedan ser biomarcadores útiles para la IGD. La combinación de los tres marcadores de miARN podría servir como una herramienta mínimamente invasiva para la identificación temprana de personas en riesgo de IGD.
Se ha informado que los miRNAs identificados en este estudio están involucrados en diversos trastornos neuropsiquiátricos. Se ha informado que la expresión de hsa-miR-200c en sangre está regulada a la baja en varios trastornos psiquiátricos, como la esquizofrenia (41) y episodios depresivos mayores (42). se informó que miR-200c se expresaba más altamente en fracciones sinápticas que en el cerebro anterior total (43) y también estar asociado con la muerte celular neuronal (44). Según estos informes anteriores, miR-200c está involucrado en el desarrollo neurológico y puede asociarse con trastornos neuropsiquiátricos si se perturba su expresión. Varios estudios han sugerido la asociación entre miR-652 y el riesgo de trastornos neuropsiquiátricos. Similar a nuestro enfoque, para identificar biomarcadores sanguíneos para la esquizofrenia, Lai et al. llevó a cabo un análisis de TLDA con pacientes con esquizofrenia y controles normales, y encontró que siete miRNAs, incluyendo hsa-miR-652, se expresaron de manera diferencial en pacientes con esquizofrenia (45). En el estudio posterior, diseñaron un modelo de predicción utilizando los datos de expresión de miARN y distinguieron con éxito la esquizofrenia del control normal (46). También se observó expresión alterada de hsa-miR-652 en alcohólicos (47). Se encontró que Hsa-miR-26b se activaba durante la diferenciación de las células neuronales (48). Perkins et al. informaron que hsa-miR-26b estaba regulado a la baja en la corteza prefrontal de los pacientes con esquizofrenia (49).
Aunque no hay evidencia directa que apoye la relación entre la expresión perturbada de estos miRNAs y la fisiopatología de la IGD, podemos inferir que la desregulación de estos miRNAs puede estar asociada con la fisiopatología de la IGD en base a varios informes anteriores sobre los genes posteriores que predijimos . Algunos de los genes posteriores de los tres miRNAs como GABRB2, CNR1, NRXN1y DPYSL2 Se reporta que están asociados con trastornos neuropsiquiátricos. El ácido gamma-aminobutírico (GABA) es un importante neurotransmisor inhibitorio en el SNC. La desregulación del receptor GABA está implicada en trastornos neuropsiquiátricos que incluyen adicción, ansiedad y depresión (50), que son también las principales características de IGD (8). Se informa que los polimorfismos genéticos en los genes del receptor GABA están asociados con la adicción al alcohol y la esquizofrenia (51, 52). La dihidropirimidinasa tipo 2 (DPYSL2) es un miembro de la familia de proteínas mediadoras de respuesta de colapsina, que desempeña un papel en el ensamblaje de microtúbulos, la señalización sináptica y la regulación del crecimiento axonal. En consecuencia, esta molécula ha sido sugerida como un biomarcador para trastornos psiquiátricos (53, 54). Polimorfismo en el DPYSL2 También se informó que el gen está asociado con el trastorno por consumo de alcohol (55). Informes anteriores y nuestros datos sugieren que la sobreexpresión de GABRB2 y DPYSL2, objetivos posteriores de los miRNAs regulados a la baja, tiene implicaciones para la patogenia de los trastornos neuropsiquiátricos, incluida la IGD. El receptor cannabinoide tipo 1 (CNR1) es un heterorreceptor presináptico que modula la liberación de neurotransmisores y las alteraciones en la señalización de los cannabinoides se asocian con varios trastornos neuropsiquiátricos (56). Polimorfismo genético de CNR1 Se sabe que el gen está asociado con la dependencia de sustancias en los caucásicos (57). En un modelo de rata, la activación del hipocampo ventral CNR1 altera el comportamiento social normal y la cognición (58). Se sabe que la alteración genética en la familia NRXN está involucrada en diversos trastornos neuropsiquiátricos, incluida la adicción (59).
Para examinar la implicación biológica de los tres candidatos de miARN de una manera más directa, exploramos la expresión de proteínas de sus genes diana posteriores. Debido a la disponibilidad limitada de muestras de plasma, de los candidatos comunes a 140 (pronosticados como downstream de 2 o más miRNAs), examinamos los objetivos de 5 (GABRB2, DPYSL2, CNR1, DUSP4, y PI15) mediante transferencia western y se confirmó esa expresión en el cuadro de GBB. y DPYSL2 fue significativamente mayor en el grupo IGD. Los informes anteriores y nuestros datos sugieren que la sobreexpresión de GABRB2 y DPYSL2, objetivos posteriores de los miRNAs regulados a la baja, puede tener implicaciones para la patogenia de los trastornos neuropsiquiátricos, incluida la IGD. Los resultados de GO y el análisis de la ruta de las vías de desarrollo neural también apoyan la implicación neurobiológica de los marcadores de miARN. Otro hallazgo interesante fue el efecto sinérgico de la alteración simultánea de los miRNAs. Los individuos con regulación negativa de todos los miRNAs 2 mostraron un riesgo 3 veces mayor que aquellos sin regulación negativa, y las RUP aumentaron de una manera dependiente de la dosis. Aunque el IC para estas tres alteraciones fue amplio debido al tamaño limitado de la muestra, la clara correlación positiva (r2 = 0.996) apoya el efecto sinérgico de los tres miARN.
Aunque descubrimos que los marcadores de miARN asociados con IGD y los individuos con las tres alteraciones de miARN tenían un riesgo 22 veces mayor que aquellos sin ninguna alteración de miARN, existen varias limitaciones en este estudio. Primero, el pequeño tamaño de la muestra aumentó la probabilidad de perder otros marcadores significativos de miARN. Segundo, dado que nuestros datos no fueron suficientes para aclarar si los perfiles de miRNA en plasma son causa o efecto, no podemos confirmar los roles biológicos de estos marcadores no invasivos en un entorno clínico. Otros perfiles de miARN y su análisis de genes en sentido descendente utilizando tejido cerebral humano del banco de tejido cerebral pueden dar una respuesta más directa. El análisis del tejido cerebral con un modelo animal de trastorno del juego también sería útil. Tercero, debido a la limitada disponibilidad de muestras de plasma, examinamos solo cinco moléculas candidatas posteriores. Explorar más objetivos descendentes con un conjunto de muestras más grande será útil para comprender mejor el mecanismo molecular de la IGD.
En resumen, a través de la detección en todo el genoma de los perfiles de expresión de miARN y la validación independiente, descubrimos tres miARN asociados a IGD (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p, y hsa-miR-652-3p). Se informa que muchos de sus genes posteriores están involucrados en diversos trastornos neuropsiquiátricos, y la validación experimental de la expresión alterada de estos genes posteriores respalda la implicación de los miRNA identificados en este estudio. Encontramos que los individuos con regulación negativa de los tres miRNA están en alto riesgo de IGD. Junto con los factores de riesgo clínicos o ambientales conocidos y los criterios de diagnóstico, nuestros hallazgos pueden facilitar la intervención temprana para ayudar a las personas con mayor riesgo de IGD.
Declaración de Ética
Este estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional del Colegio Médico de la Universidad Católica de Corea (MC16SISI0120). Todos los participantes y sus padres dieron su consentimiento informado por escrito.
Contribuciones de autor
ML y HC contribuyeron igualmente a este documento. ML, D-JK y Y-JC diseñaron el estudio. SJ, S-MC, YP, DC y JL realizaron experimentos y generación de datos. J-WC, S-HP, J-SC y D-JK recolectaron muestras de sangre e información clínica. ML, HC, S-HY y Y-JC analizaron los datos. ML, HC, S-HY y Y-JC describieron el manuscrito. Y-JC supervisó el proyecto.
Declaracion de conflicto de interes
Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pudiera interpretarse como un posible conflicto de intereses.
Notas a pie de página
Fondos. Este trabajo fue apoyado por una subvención del Programa de Investigación Cerebral a través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF), financiado por el Ministerio de Ciencia y TIC y Planificación Futura (NRF-2015M3C7A1064778).
Material suplementario
El Material complementario para este artículo se puede encontrar en línea en http://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpsyt.2018.00081/full#supplementary-material.
Referencias