DeltaFosB en The Nucleus Accumbens es fundamental para reforzar los efectos de la recompensa sexual. (2010)

COMENTARIOS: Delta FosB es un marcador de todas las adicciones, tanto conductuales como químicas. A medida que esta molécula aumenta en el circuito de recompensa, también lo hacen los comportamientos adictivos. Es una de las moléculas involucradas en los cambios neuroplásticos. Este experimento muestra que aumenta con la experiencia sexual, de manera similar a como lo hace con las adicciones a las drogas. En el experimento, emplearon ingeniería genética para aumentar sus niveles más allá de lo "normal". Esto resultó en una mayor facilitación de la actividad sexual. Creemos que esto sucede con la adicción a la pornografía.


Estudio completo

Lanzadores KK, Frohmader KS, Vialou V, Mouzon E, Nestler EJ, Lehman MN, Coolen LM.

Genes Brain Behav. 2010 Oct; 9 (7): 831-40 doi: 10.1111 / j.1601-183X.2010.00621.x. Epub 2010 Ago 16.

Departamento de Anatomía y Biología Celular, Escuela de Medicina y Odontología Schulich, Universidad de Western Ontario, London, Ontario, Canadá.

RESUMEN

El comportamiento sexual en ratas macho es gratificante y reforzante. Sin embargo, poco se sabe acerca de los mecanismos celulares y moleculares específicos que median la recompensa sexual o los efectos de refuerzo de la recompensa en la expresión posterior de la conducta sexual. Este estudio pone a prueba la hipótesis de que ΔFosB, la forma truncada de FosB expresada de manera estable, desempeña un papel fundamental en el refuerzo del comportamiento sexual y la facilitación de la motivación y el rendimiento sexual inducida por la experiencia.

Se demostró que la experiencia sexual causa una acumulación de BFosB en varias regiones del cerebro límbico, incluido el núcleo accumbens (NAc), la corteza prefrontal medial, el área tegmental ventral y el putamen caudado, pero no el núcleo preóptico medial.

A continuación, se midió la inducción de c-Fos, un objetivo descendente (reprimido) de ΔFosB, en animales con experiencia sexual e ingenuos. El número de células inmunorreactivas para c-Fos inducidas por el apareamiento disminuyó significativamente en animales con experiencia sexual en comparación con los controles sexualmente ingenuos.

Finalmente, los niveles de ΔFosB y su actividad en la NAc se manipularon mediante la transferencia de genes mediada por virus para estudiar su papel potencial en la mediación de la experiencia sexual y la facilitación del rendimiento sexual inducida por la experiencia. Los animales con sobreexpresión de ΔFosB mostraron una mayor facilitación del rendimiento sexual con experiencia sexual en relación con los controles. En contraste, la expresión de ΔJunD, un socio de unión negativo dominante de ΔFosB, atenuó la facilitación del rendimiento sexual inducida por la experiencia sexual y retrasó el mantenimiento a largo plazo de la facilitación en comparación con la proteína de fluorescencia verde y los grupos que sobreexpresan ΔFosB.

Juntos, estos hallazgos apoyan un papel crítico para la expresión de ΔFosB en la NAc por los efectos de refuerzo del comportamiento sexual y la facilitación del desempeño sexual inducida por la experiencia sexual.

INTRODUCCIÓN

El comportamiento sexual es altamente gratificante y reforzante para los roedores machos (Coolen et al. 2004; Pfaus et al. 2001). Además, la experiencia sexual altera el comportamiento sexual posterior y la recompensa (Tenk et al. 2009). Con la experiencia de apareamiento repetida, el comportamiento sexual se facilita o se “refuerza”, evidenciado por la disminución de las latencias para iniciar el apareamiento y la facilitación del desempeño sexual (Balfour et al. 2004; Pfaus et al. 2001). Sin embargo, los mecanismos celulares y moleculares subyacentes de la recompensa y el refuerzo sexual son poco conocidos. Se ha demostrado que el comportamiento sexual y las señales condicionadas que predicen el apareamiento inducen transitoriamente la expresión del gen c-fos inmediato y temprano en el sistema mesolímbico de ratas macho (Balfour et al. 2004; Pfaus et al. 2001). Además, recientemente se demostró que la experiencia sexual induce neuroplasticidad de larga duración en el sistema mesolímbico de rata macho (Frohmader et al. 2009; Lanzadores et al. 2010). Además, en ratas macho, se ha demostrado que la experiencia sexual induce ΔFosB, una Miembro de la familia Fos, en el núcleo accumbens (NAc) (Wallace et al. 2008). ΔFosB, una variante de empalme truncada de FosB, es un miembro único de la familia Fos debido a su mayor estabilidad (Carle et al. 2007; Ulery-Reynolds et al. 2008; Ulery et al. 2006) y desempeña un papel en la mejora de la motivación y la recompensa por las drogas de abuso y la plasticidad neuronal a largo plazo que media la adicción (Nestler et al. 2001). ΔFosB forma un complejo de factor de transcripción heteromérico (proteína activadora-1 (AP-1)) con proteínas Jun, preferiblemente JunD (Chen et al. 1995; Hiroi et al. 1998). A través de la sobreexpresión inducible de ΔFosB, restringido principalmente al estriado utilizando ratones bi-transgénicos, se produce un fenotipo de comportamiento similar al de un adicto a un fármaco a pesar de una ausencia de exposición previa al fármaco. (McClung et al. 2004). Este fenotipo de comportamiento incluye una respuesta locomotora sensibilizada a la cocaína (Kelz et al. 1999), mayor preferencia por la cocaína (Kelz et al. 1999) y morfina (Zachariou et al. 2006), y aumento de la autoadministración de cocaína (Colby et al. 2003).

Al igual que con la recompensa de drogas, ΔFosB está regulado al alza por comportamientos gratificantes naturales y media la expresión de estos comportamientos. La sobreexpresión de ΔFosB en la NAc utilizando modelos de roedores aumenta el funcionamiento voluntario de la rueda (Werme et al. 2002), respuesta instrumental para la comida (Olausson et al. 2006), ingesta de sacarosa (Wallace et al. 2008), y facilita masculino (Wallace et al. 2008) y femenino (Bradley et al. 2005) comportamiento sexual Por lo tanto, ΔFosB puede participar en la mediación de los efectos de experiencias gratificantes naturales. TEl estudio actual expande estudios previos al investigar específicamente el papel de ΔFosB en la NAc en los resultados a largo plazo de la experiencia sexual en el comportamiento de apareamiento posterior y la activación neural en el sistema mesolímbico.

  • Primero, se estableció qué regiones del cerebro implicadas en los circuitos de recompensa y el comportamiento sexual expresan ΔFosB inducida por la experiencia sexual.
  • A continuación, el efecto de ΔFosB inducido por la experiencia sexual en la expresión inducida por el apareamiento de c-Fos, un objetivo corriente abajo reprimido por ΔFosB (Renthal et al. 2008), fue investigado.
  • Finalmente, el efecto de la manipulación de la actividad de ΔFosB en la NAc (sobreexpresión de los genes y expresión de una pareja de unión negativa dominante) sobre el comportamiento sexual y la facilitación de la motivación y el rendimiento sexual inducida por la experiencia se determinó mediante la tecnología de administración de vectores virales.

FORMAS DE PAGO

Animales

Se obtuvieron ratas Sprague Dawley macho adultas (gramos 200-225) de Charles River Laboratories (Senneville, QC, Canadá). Los animales se alojaron en jaulas de plexiglás con un tubo de túnel en parejas del mismo sexo a lo largo de los experimentos. La habitación de la colonia se reguló por temperatura y se mantuvo en un ciclo de luz oscura de 12 / 12 con comida y agua disponibles ad libitum Excepto durante las pruebas de comportamiento. Las hembras de estímulo (210 – 220 gramos) para las sesiones de apareamiento recibieron un implante subcutáneo que contenía 5% de benzoato de estradiol y 95% de colesterol luego de una ovariectomía bilateral bajo anestesia profunda (0.35g ketamine / 0.052g Xylazine). La inducción sexual se indujo mediante la administración de 500 µg de progesterona en 0.1 mL de aceite de sésamo aproximadamente 4 horas antes de la prueba. Todos los procedimientos fueron aprobados por los Comités de cuidado y uso de animales de la Universidad de Western Ontario y se ajustaron a las pautas de CCAC que involucran animales vertebrados en la investigación.

Comportamiento sexual

Las sesiones de apareamiento ocurrieron durante la fase oscura temprana (entre 2 y 6 horas después del inicio del período oscuro) con iluminación roja tenue. Antes del inicio del experimento, los animales se dividieron aleatoriamente en grupos. Durante las sesiones de apareamiento, a las ratas macho se les permitió copular la eyaculación o la hora 1, y se registraron los parámetros para el comportamiento sexual, que incluyen: latencia de la montura (ML; tiempo desde la introducción de la hembra hasta la primera montura), latencia de intromisión (IL; tiempo de la introducción de la hembra hasta la primera montura con penetración vaginal), latencia de eyaculación (EL; tiempo desde la primera intromisión hasta la eyaculación), intervalo posterior a la eyaculación (PEI; tiempo desde la eyaculación hasta la primera intromisión subsiguiente), número de monturas (M; empuje pélvico sin vaginal) penetración), número de intromisiones (IM; montura incluida la penetración vaginal) y eficacia de la cópula (CE = IM / (M + IM)) (Agmo 1997). Los números de monturas e intromisiones no se incluyeron en el análisis para los animales que no mostraron eyaculación. Las latencias de montaje e intromisión son parámetros indicativos de motivación sexual, mientras que la latencia de la eyaculación, el número de montajes y la eficiencia de la cópula reflejan el rendimiento sexual (Casco 2002).

Experimento 1: Expresión de ΔFosB

A ratas macho sexualmente ingenuas se les permitió aparearse en jaulas de prueba limpias (60 × 45 × 50 cm) para 5 consecutivas, sesiones diarias de apareamiento o permaneció sexualmente ingenuo. Tabla complementaria 1 describe el paradigma de comportamiento para grupos experimentales: ingenuo sin sexo (NNS; n = 5), sexo ingenuo (NS; n = 5), no experimentó sexo (ENS; n = 5) y sexo experimentado (ES; n = 4). Los animales NS y ES se sacrificaron 1 hora después de la eyaculación en el último día de apareamiento para investigar la expresión de c-Fos inducida por el apareamiento. Los animales NNS se sacrificaron simultáneamente con los animales ENS 24 horas después de la sesión de apareamiento final para examinar el ΔFosB inducido por la experiencia sexual. Los grupos con experiencia sexual se combinaron para el comportamiento sexual antes de las pruebas posteriores. No se detectaron diferencias significativas entre los grupos para ninguna medida de comportamiento dentro de la sesión de apareamiento apropiada y ambos grupos experimentados mostraron una facilitación del comportamiento sexual inducida por la experiencia sexual (Tabla complementaria 2). Los controles incluyeron machos sexualmente ingenuos manejados simultáneamente con animales de apareamiento que aseguran la exposición a los olores y las vocalizaciones femeninas sin contacto directo con las hembras.

Para el sacrificio, los animales se anestesiaron profundamente con pentobarbital sódico (270mg / kg; ip) y se perfundieron intracardialmente con 50 mL de 0.9% de solución salina, seguido de 500 mL de 4% de paraformaldehyde en 0.1 Mosphate Mferate (PB). Los cerebros se retiraron y se fijaron posteriormente para 1 h a temperatura ambiente en el mismo fijador, luego se sumergieron en 20% de sacarosa y 0.01% de azida de sodio en 0.1 M PB y se almacenaron a 4 ° C. Las secciones coronales (35 µm) se cortaron con un microtomo de congelación (H400R, Micron, Alemania), se recogieron en cuatro series paralelas en solución crioprotectora (30% de sacarosa y 30% de etilenglicol en 0.1 M PB) y se almacenaron a −20 ° C. Las secciones de flotación libre se lavaron extensivamente con solución salina tamponada con fosfato 0.1 M (PBS; pH 7.3-7.4) entre las incubaciones. Las secciones fueron expuestas a 1% H2O2 para 10 mín. a temperatura ambiente para destruir las peroxidasas endógenas, luego bloqueadas en la solución de incubación PBS +, que es PBS que contiene 0.1% de albúmina de suero bovino (artículo del catálogo 005-000-121; Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) y 0.4% Triton X -100 (artículo de catálogo BP151-500; Sigma-Aldrich) para 1 h. Las secciones se incubaron durante la noche a 4 ° C en un anticuerpo policlonal de conejo pan-FosB (1: 5K; sc-48 Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE. UU.). El anticuerpo pan-FosB se generó contra una región interna compartida por FosB y ΔFosB. Las células ΔFosB-IR fueron específicamente positivas a ΔFosB porque en el momento posterior al estímulo (24 horas) todos los FosB detectables inducidos por estímulos se degradan (Perrotti et al. 2004; Perrotti et al. 2008). Además, en este experimento, los animales que se aparearon en el último día (NS, ES) se sacrificaron 1 h después del apareamiento, por lo tanto antes de la expresión de FosB. El análisis de transferencia Western confirmó la detección de ΔFosB en aproximadamente 37 kD. Después de la incubación del anticuerpo primario, las secciones se incubaron para 1 h en IgG anti-conejo de cabra conjugado con biotina (1: 500 en PBS +; Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE. UU.) Y luego en 1 h en la peroxidasa avidina-biotina-hosteradish (ABC elite ; 1: 1K en PBS; Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE. UU.). Después de esta incubación, las secciones se procesaron de una de las siguientes maneras:

1. Etiquetado único de peroxidasa

Se usaron secciones de animales NNS y ENS para un análisis cerebral de la acumulación de osFosB inducida por la experiencia sexual. Después de la incubación ABC, se visualizó el complejo de peroxidasa después del tratamiento durante 10 minutos a una solución de cromógeno que contenía 0.02% de tetrahidrocloruro de diaminobencidina 3,3 (DAB; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) mejorado con 0.02% níquel sulfato en 0.1 MMP con Peróxido de hidrógeno (0.015%). Las secciones se lavaron a fondo en 0.1 M PB para terminar la reacción y se montaron en portaobjetos de vidrio Superfrost plus codificados (Fisher, Pittsburgh, PA, EE. UU.) Con 0.3% de gelatina en ddH20. Después de la deshidratación, todos los portaobjetos se cubrieron con DPX (ftalato de xileno dibutilo).

2. Doble inmunofluorescencia

Se usaron secciones de los cuatro grupos experimentales que contenían NAc y mPFC para el análisis de ΔFosB y c-Fos. Después de la incubación ABC, las secciones se incubaron durante 10 min con tiramida biotinilada (BT; 1: 250 en PBS + 0.003% H2O2 Tyramid Signal Amplification Kit, NEN Life Sciences, Boston, MA) y para 30 min con estrepavidina conjugada con Alexa 488 (1: 100; Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA). Luego, las secciones se incubaron durante la noche con un anticuerpo policlonal de conejo que reconocía específicamente c-Fos (1: 150; sc-52; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), seguido de una incubación mínima de 30 con anticuerpo secundario conjugado con Cy3 de cabra anti-conejo (1: 200; Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA, EE. UU.). Después de la tinción, las secciones se lavaron a fondo en 0.1 M PB, se montaron en portaobjetos de vidrio codificado con 0.3% de gelatina en ddH20 y cubierta con un medio de montaje acuoso (Gelvatol) que contiene el agente anti-desvanecimiento 1,4-diazabiciclo (2,2) octano (DABCO; 50 mg / ml, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Los controles inmunohistoquímicos incluyeron la omisión de uno o ambos anticuerpos primarios, lo que resultó en la ausencia de marcaje en la longitud de onda apropiada.

Análisis de Datos

Análisis cerebral de ΔFosB

Dos experimentadores cegados al tratamiento realizaron la exploración de todo el cerebro en diapositivas codificadas. Las células ΔFosB-inmunoreactivas (-IR) en todo el cerebro se analizaron de manera semicuantitativa utilizando una escala para representar el número de células ΔFosB positivas como se describe en Tabla 1. Además, según los hallazgos semicuantitativos, se contaron los números de células ΔFosB-IR utilizando áreas estándar de análisis en áreas cerebrales implicadas en la recompensa y el comportamiento sexual utilizando un tubo de extracción de lúcida de cámara conectado a un microscopio Leica DMRD (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar , Alemania): NAc (núcleo (C) y concha (S); 400 × 600µm) analizado en tres niveles rostral-caudal (Balfour et al. 2004); área tegmental ventral (VTA; 1000 × 800µm) analizada en tres niveles rostral-caudal (Balfour et al. 2004) y la cola VTA (Perrotti et al. 2005); corteza prefrontal (área cingulada anterior (ACA); corteza prelímbica (PL); corteza infralímbica (IL); 600 × 800µm cada una); putamen caudado (CP; 800 × 800µm); y núcleo preóptico medial (MPN; 400 × 600 µm) (Figuras suplementarias 1 – 3). Se contabilizaron dos secciones por subregión y se promediaron por animal para el cálculo de la media del grupo. Se compararon los promedios de los grupos ΔFosB-IR sexualmente ingenuos y experimentados para cada subregión utilizando pruebas t no pareadas.

Tabla 1     

Resumen de la expresión de ΔFosB en animales sexualmente ingenuos y experimentados
Análisis de ΔFosB y c-fos

Las imágenes se capturaron utilizando una cámara CCD enfriada (Microfire, Optronics) conectada a un microscopio Leica (DM5000B, Leica Microsystems; Wetzlar, Alemania) y el software Neurolucida (MicroBrightfield Inc.) con ajustes de cámara fijos para todas las materias (utilizando los objetivos 10x). Número de células que expresan c-Fos-IR o ΔFosB-IR en áreas estándar de análisis en el núcleo y la cubierta de NAc (400 x 600µm cada una; Figura suplementaria 1) y ACA de mPFC (600 × 800µm; Figura suplementaria 3) fueron contados manualmente por un observador cegado a los grupos experimentales, en secciones 2 por animal utilizando el software Neurolucida (MBF Bioscience, Williston, VT) y promediados por animal. Los promedios grupales de células c-Fos o ΔFosB se compararon utilizando ANOVA de dos vías (Factores: experiencia sexual y actividad sexual) y Fisher LSD para comparaciones post hoc a un nivel significativo de 0.05.

Experimento 2: manipFosB expresión de manipulación

Transferencia génica mediada por vectores virales

Las ratas Sprague Dawley macho sexualmente ingenuas se dividieron aleatoriamente en grupos antes de la cirugía estereotáxica. Todos los animales recibieron microinyecciones bilaterales de vectores virales adenoasociados recombinantes (rAAV) que codifican GFP (control; n = 12), ΔFosB de tipo salvaje (n = 11) o una pareja de unión dominante-negativa de ΔFosB denominada ΔJunD (n = 9) en la NAc. ΔJunD disminuye la transcripción mediada por ΔFosB mediante la heterodimerización competitiva con ΔFosB antes de unirse a la región AP-1 dentro de los promotores de genes (Winstanley et al. 2007). El título del virus se determinó por qPCR y se evaluó in vivo antes del inicio del estudio. El título era 1 – 2 × 1011 Partículas infecciosas por ml. Los vectores rAAV se inyectaron en un volumen de 1.5 µL / lado durante 7 minutos (coordenadas: AP + 1.5, ML +/− 1.2 de Bregma; DV −7.6 de la superficie del cráneo según Paxinos y Watson, 1998) utilizando una jeringa Hamilton (5µL) Harvard Apparatus, Holliston, MA, EE. UU.). Los vectores no producen una toxicidad mayor que las infusiones de control solas (Winstanley et al, 2007; Para detalles de la preparación de AAV, vea Hommel et al., 2003). Los experimentos de comportamiento comenzaron 3 semanas después de las inyecciones de vectores, lo que permitió una infección viral óptima y estable (Wallace et al. 2008). La expresión del transgén en las especies murinas alcanza su punto máximo en los días 10 y permanece elevada durante al menos 6 meses (Winstanley et al. 2007). Al final del experimento, los animales se perfundieron transcardialmente y las secciones NAc se sometieron a un tratamiento inmunológico para GFP (1: 20K; anticuerpo anti-GFP de conejo; Sondas moleculares) utilizando una reacción ABC-peroxidasa-DAB (como se describió anteriormente) histológicamente. verificar los sitios de inyección utilizando GFP como marcador (Figura suplementaria 4). Los vectores osFosB y ΔJunD también contienen un segmento que expresa GFP separado por un sitio de entrada ribosomal interno, lo que permite la verificación del sitio de inyección por visualización de GFP en todos los animales. Solo los animales con sitios de inyección y propagación de virus restringidos a la NAc se incluyeron en los análisis estadísticos. La propagación del virus se limitó generalmente a una porción de la NAc y no se extendió rostral-caudal en todo el núcleo. Por otra parte, la propagación del virus apareció mayoritariamente restringida a shell o núcleo. Sin embargo, la variación de los sitios de inyección y la propagación dentro de la NAc no influyó en los efectos sobre el comportamiento. Finalmente, las inyecciones de GFP no afectaron el comportamiento sexual o la facilitación de la conducta sexual inducida por la experiencia en comparación con animales no quirúrgicos de estudios previos (Balfour et al. 2004).

Comportamiento sexual

Tres semanas después de la administración del vector viral, los animales se aparearon a una eyaculación (o por 1 hora) para 4 consecutivas, sesiones de apareamiento diarias para ganar experiencia sexual (sesiones de experiencia) y se probaron posteriormente para la expresión a largo plazo de la experiencia inducida facilitación del comportamiento sexual 1 y semanas 2 (sesiones de prueba 1 y 2) después de la sesión de experiencia final. Los parámetros de comportamiento sexual se registraron durante todas las sesiones de apareamiento como se describió anteriormente. Las diferencias estadísticas para todos los parámetros durante cada sesión de apareamiento se compararon dentro y entre los grupos utilizando ANOVA de medidas repetidas de dos vías (Factores: tratamiento y sesión de apareamiento) o ANOVA de una vía (latencia de la eyaculación, número de monturas e intromisiones; Factor: tratamiento o apareamiento sesión) seguido de las pruebas Fisher LSD o Newman-Keuls para comparaciones post hoc en un nivel de significancia de 0.05. Específicamente, los efectos facilitadores de la experiencia sexual en los parámetros de apareamiento se compararon entre la sesión de experiencia 1 (naïve) y las sesiones de experiencia 2, 3 o 4, así como entre grupos experimentales dentro de cada sesión de experiencia. Además, para analizar los efectos del tratamiento (vector) en la facilitación a largo plazo del comportamiento sexual, se compararon los parámetros de apareamiento entre la sesión de experiencia 4 y la sesión de prueba 1 y 2 dentro de cada grupo de tratamiento, y se compararon entre los grupos experimentales dentro de cada sesión de prueba.

RESULTADOS

La experiencia sexual causa la acumulación de BFosB.

Inicialmente, se llevó a cabo una investigación semicuantitativa de la acumulación de BFosB en todo el cerebro en varones con experiencia sexual en comparación con controles sexualmente ingenuos. Un resumen de los resultados generales se proporciona en Tabla 1. Se amplió el análisis de ΔFosB-IR mediante la determinación de los números de células ΔFosB-IR en varias regiones cerebrales asociadas con el límbico utilizando áreas estándar de análisis. Figura 1 muestra imágenes representativas de DAB-Ni que tiñe la NAc de animales sexualmente ingenuos y experimentados. Se encontró un aumento significativo de ΔFosB en subregiones mPFC (Figura 2A), Núcleo y carcasa NAc (2B), putamen caudado (2B) y VTA (2C). En NAc, existían diferencias significativas en todos los niveles rostral-caudal en el núcleo y la carcasa de NAc, y los datos se muestran en Figura 2 Es el promedio sobre todos los niveles de rostro-caudal. En contraste, no hubo un aumento significativo en ΔFosB-IR en el núcleo preóptico medial hipotalámico (NNS: Avg 1.8 +/− 0.26; ENS: Avg 6.0 +/− 1.86).

Figura 1    

 

Imágenes representativas que muestran las células ΔFosB-IR (negras) en los grupos NAc de grupos sin sexo (A) sin experiencia y grupos sin sexo (B). aco: comisura anterior La barra de escala indica 100 µm.
Figura 2      

Número de células ΔFosB-IR en: A. infralímbicas (IL), prelímbicas (PL) y córtex cingulado anterior (ACA) subregiones de la corteza prefrontal medial; B. Núcleo accumbens núcleo y cáscara, y putamen caudado (CP); C. Rostral, medio, caudal y cola. ...

La experiencia sexual atenúa el c-Fos inducido por el apareamiento.

El efecto de la experiencia sexual en los niveles de BFosB en el NAc se confirmó utilizando técnicas de tinción de fluorescencia. Además, se analizaron los efectos de la experiencia sexual en la expresión de c-Fos. Figura 3 muestra imágenes representativas de IRFosB- (verde) y c-Fos (rojo) -IR células en todos los grupos experimentales (A, NNS; B, NS; C, ENS; D, ES). La experiencia sexual aumentó significativamente la expresión de ΔFosB en el núcleo de NAc (Figura 4A: F1,15 = 12.0; p = 0.003) y shell (Figura 4C: F1,15 = 9.3; p = 0.008). Por el contrario, el acoplamiento 1 hora antes de la perfusión, no tuvo un efecto en la expresión de ΔFosB (Figura 4A, C) y no se detectó interacción entre la experiencia sexual y el apareamiento inmediatamente antes de la perfusión. Hubo un efecto general de apareamiento antes de la perfusión en la expresión de c-Fos tanto en el núcleo NAc (Figura 4B: F1,15 = 27.4; p <0.001) y caparazón (Figura 4D: F1,15 = 39.4; p <0.001). Además, se detectó un efecto general de la experiencia sexual en el núcleo NAc (Figura 4B: F1,15 = 6.1; p = 0.026) y shell (Figura 4D: F1,15 = 1.7; p = 0.211) y se detectó una interacción entre la experiencia sexual y el apareamiento antes de la perfusión en el núcleo de NAc (F1,15 = 6.5; p = 0.022), con una tendencia en la cáscara (F1,15 = 1.7; p = 0.211; F1,15 = 3.4; p = 0.084). Los análisis post hoc demostraron la expresión de c-Fos inducida por el apareamiento en el núcleo y la concha de los machos sexualmente ingenuos (Figura 4B, D). Sin embargo, en varones con experiencia sexual, c-Fos no aumentó significativamente en el núcleo de NAc (Figura 4B) y significativamente atenuado en la concha (Figura 4D). Por lo tanto, la experiencia sexual causó una reducción de la expresión de c-Fos inducida por el apareamiento. Los valores de p para comparaciones por pares específicos se encuentran en las leyendas de las figuras.

Figura 3      

Imágenes representativas que muestran ΔFosB (verde) y c-Fos (rojo) en NAc para cada grupo experimental. Barra de escala indica 100 µm.
Figura 4      

ExperienceFosB inducida por la experiencia sexual y c-Fos inducida por el apareamiento. Números de osFosB (Core, A; Shell, C; ACA, E) o c-Fos (Core, B; Shell, D; ACA, F) células inmunorreactivas para cada grupo: NNS (n = 5), NS (n = 5), ENS (n = 5) o ES (n = 4). Los datos son expresados ...

El efecto de la experiencia sexual en los niveles de c-Fos inducidos por el apareamiento no se limitó a la NAc. Se observó una atenuación similar de la expresión de c-Fos en el ACA en animales con experiencia sexual en comparación con los controles sexualmente ingenuos. La experiencia sexual tuvo un efecto significativo en la expresión de ΔFosB en la ACA (Figura 4E: F1,15 = 154.2; p <0.001). El apareamiento antes de la perfusión no tuvo efecto sobre la expresión de ΔFosB (Figura 4C) pero aumentó significativamente los c-fos (Figura 4F: F1,15 = 203.4; p <0.001) en el ACA. Además, la expresión de c-Fos inducida por el apareamiento en el ACA disminuyó significativamente por la experiencia sexual (Figura 4F: F1,15 = 15.8; p = 0.001). Se detectó una interacción bidireccional entre la experiencia sexual y el apareamiento antes de la perfusión para la expresión de c-Fos (Figura 4F: F1,15 = 15.1; p <0.001). Los valores P para comparaciones específicas por pares se encuentran en las leyendas de las figuras. Finalmente, no hubo una reducción significativa en la expresión de c-Fos inducida por apareamiento en el núcleo preóptico medial (NS: Promedio 63.5 +/− 4.0; ES: Promedio 41.4 +/− 10.09), un área donde la experiencia de apareamiento no causó una aumento en la expresión de ΔFosB, lo que indica que la expresión de c-Fos inducida por el apareamiento no se vio afectada en todas las áreas del cerebro.

ΔFosB en la NAc media el refuerzo del comportamiento sexual

Para explorar un posible mecanismo molecular para reforzar el comportamiento sexual, como lo demuestra la facilitación de la conducta sexual inducida por la experiencia, se determinaron los efectos de la manipulación local de los niveles de ΔFosB y su actividad transcripcional. La experiencia sexual durante las cuatro sesiones de experiencia consecutivas tuvo un efecto significativo en la latencia de montura (Figura 5A: F1,23 = 13.8; p = 0.001), latencia de intromisión (Figura 5B: F1,23 = 18.1; p <0.001) y latencia de eyaculación (Figura 5C: GFP, F11,45 = 3.8; p = 0.006). Los animales de control GFP mostraron la facilitación del comportamiento sexual esperada por la experiencia esperada y mostraron latencias significativamente más bajas al primer montaje, primera intromisión y eyaculación durante la sesión de experiencia 4 en comparación con la sesión de experiencia 1 (Figura 5A – C; ver la leyenda de la figura para valores de p). Esta facilitación del comportamiento sexual inducida por la experiencia también se observó en el grupo ΔFosB para latencias de montaje e intromisión, pero no se detectó una diferencia significativa en la latencia de la eyaculación (Figura 5A – C). En contraste, los animales unJunD mostraron una facilitación atrofiada; aunque las latencias para montajes, intromisiones y eyaculaciones disminuyeron con las sesiones de apareamiento repetidas, ninguno de estos parámetros alcanzó significación estadística cuando se comparó entre sesiones de experiencia 1 y 4 (Figura 5A – C). Las comparaciones entre grupos para cada sesión de experiencia muestran que ΔJunD tenía latencias significativamente más largas para montar, intromitir y eyacular durante las sesiones de experiencia en comparación con ΔFosB y GFP (Figura 5A – C). Además, tanto la experiencia sexual como el tratamiento tuvieron efectos significativos en la eficiencia de la cópula (Figura 5F: experiencia sexual, f1,12 = 22.5; p <0.001; tratamiento, F1,12 = 3.3; p = 0.049). MalesLos machos de FosB han aumentado la eficacia de la copulación durante la sesión de experiencia 4 en comparación con la sesión de experiencia 1 (Figura 5F). Además, los animales ΔFosB tuvieron significativamente menos montajes antes de la eyaculación durante la sesión de experiencia del día 4, en comparación con la sesión de experiencia 1 (Figura 5D: F10,43 = 4.1; p = 0.004), y que los machos ΔJunD tenían significativamente más montajes que preceden a la eyaculación, por lo que disminuyeron significativamente la eficiencia de la copulación, que cualquiera de los otros dos grupos (Figura 5D y F). Por lo tanto, los animales GFP y ΔFosB mostraron una facilitación inducida por la experiencia del inicio del comportamiento sexual y el rendimiento sexual, mientras que los animales ΔJunD no lo hicieron.

Figura 5      

Comportamiento sexual de animales GFP (n = 12), ΔFosB (n = 11) y ΔJunD (n = 9): latencia de la montura (A), latencia de la intromisión (B), latencia de la eyaculación (C), número de monturas (D), número de intromisiones (E) y eficiencia de la cópula (F). Los datos son expresados ...

Para probar la hipótesis de que la expresión de ΔFosB es crítica para la expresión a largo plazo de la facilitación de la conducta sexual inducida por la experiencia, los animales se probaron la semana 1 (sesión de prueba 1) y las semanas 2 (sesión de prueba 2) después de la sesión de experiencia final. De hecho, el comportamiento sexual facilitado se mantuvo en los grupos GFP y ΔFosB, ya que ninguno de los parámetros de comportamiento difirió entre las sesiones de prueba 1 o 2 y la sesión de experiencia final 4, dentro de los grupos GFP y ΔFosB (Figura 5A – C; excepto por la latencia de la eyaculación y la eficiencia de la cópula en la sesión de prueba 1 para animales ΔFosB). Se detectaron diferencias significativas entre los animales ΔJunD y los grupos GFP o ΔFosB en ambas sesiones de prueba para todos los parámetros de comportamiento sexual (Figura 5A – F). No se detectaron diferencias entre o dentro de los grupos cuando se compararon números de intromisiones, PEI o porcentajes de animales que eyacularon (100% de machos en todos los grupos eyaculados durante las últimas cuatro sesiones de apareamiento).

DISCUSIÓN

El estudio actual demostró que la experiencia sexual causa una acumulación de ΔFosB en varias regiones cerebrales asociadas a las límbicas, que incluyen el núcleo y la carcasa de NAc, mPFC, VTA y el caudato putamen. Además, la experiencia sexual atenuó la expresión inducida por el apareamiento de c-Fos en la NAc y ACA. Finalmente, se demostró que ΔFosB en la NAc es fundamental para mediar en la facilitación del apareamiento durante la adquisición de la experiencia sexual y la expresión a largo plazo de la facilitación del comportamiento sexual inducida por la experiencia. Específicamente, la reducción de la transcripción mediada por ΔFosB atenuó la facilitación de la motivación y el rendimiento sexual inducida por la experiencia, mientras que la sobreexpresión de ΔFosB en la NAc provocó una mayor facilitación de la conducta sexual, en términos de mayor rendimiento sexual con menos experiencia. Juntos, los hallazgos actuales apoyan la hipótesis de que ΔFosB es un mediador molecular crítico para la plasticidad neuronal y conductual a largo plazo inducida por la experiencia sexual.

Los hallazgos actuales extienden estudios previos que muestran la experiencia sexual ΔFosB en la NAc en ratas macho (Wallace et al. 2008) y hámsters hembras (Coberturas et al. 2009). Wallace et al. (2008) mostró que rAAV-OverLa sobreexpresión de FosB en la NAc mejora el comportamiento sexual en animales sexualmente ingenuos durante la primera sesión de apareamiento, como lo evidencian las intromisiones a la eyaculación y los intervalos post-eyaculadores más cortos, pero no tuvo efecto en los machos con experiencia sexual (Wallace et al. 2008).

En contraste, el estudio actual no demostró efectos de la sobreexpresión de ΔFosB en hombres sexualmente ingenuos durante la primera prueba, sino durante y después de la adquisición de la experiencia sexual. Over Los sobreexpresores de FosB demostraron un mayor rendimiento sexual (mayor eficiencia de copulación) en comparación con los animales GFP.

Además, el estudio actual probó el papel de ΔFosB bloqueando la transcripción mediada por ΔFosB usando un vector viral que expresa expressJunD. La prevención del aumento inducido por la experiencia en la expresión de osFosB inhibió la facilitación inducida por la experiencia de la motivación sexual (aumento de la latencia de la montura y la intromisión), así como el rendimiento sexual (mayor latencia de la eyaculación y el número de monturas) y la subsiguiente expresión a largo plazo del comportamiento sexual facilitado.

Por lo tanto, estos datos son los primeros en indicar un papel obligatorio para ΔFosB en la adquisición de la facilitación del comportamiento sexual inducida por la experiencia. Además, estos datos muestran que ΔFosB también participa de manera crítica en la expresión a largo plazo del comportamiento facilitado inducido por la experiencia. Proponemos que esta expresión a largo plazo del comportamiento facilitado representa una forma de memoria para la recompensa natural, por lo tanto, ΔFosB en NAc es un mediador de la memoria de recompensa. La experiencia sexual también aumentó los niveles de BFosB en VTA y mPFC, áreas implicadas en la recompensa y la memoria (Balfour et al. 2004; Phillips et al. 2008). Se requieren estudios futuros para dilucidar un posible significado de la regulación positiva de BFosB en estas áreas para la memoria de recompensa.

La expresión de osFosB es altamente estable, por lo que tiene un gran potencial como mediador molecular de adaptaciones persistentes del cerebro después de perturbaciones crónicas (Nestler et al. 2001). Δ Se ha demostrado que el FosB aumenta gradualmente en la NAc con respecto a las múltiples inyecciones de cocaína y persiste durante varias semanas. (Hope et al. 1992; Hope et al. 1994). Estos cambios en la expresión NAc ΔFosB están asociados con la sensibilización y la adicción a la recompensa de drogas (Chao y Nestler 2004; McClung y Nestler 2003; McClung et al. 2004; Nestler 2004, 2005, 2008; Nestler et al. 2001; Zachariou et al. 2006). En contraste, el papel de ΔFosB en la mediación de la recompensa natural ha sido poco estudiado. Han surgido evidencias recientes que sugieren que la inducción de ΔFosB en la NAc está involucrada en la recompensa natural. LevelsLos niveles de FosB aumentan de manera similar en la NAc después de la ingesta de sacarosa y el funcionamiento de la rueda. La sobreexpresión de ΔFosB en el estriado utilizando ratones bitransgenicos o vectores virales en ratas provoca un aumento en la ingesta de sacarosa, Mayor motivación para la comida y mayor velocidad espontánea de la rueda. (Olausson et al. 2006; Wallace et al. 2008; Werme et al. 2002). Los datos actuales se suman sustancialmente a estos informes y respaldan aún más la idea de que osFosB es un mediador crítico para el refuerzo de recompensas y la memoria natural de recompensas.

ΔFosB puede mediar el refuerzo del comportamiento sexual inducido por la experiencia a través de la inducción de plasticidad en el sistema mesolímbico. De hecho, la experiencia sexual causa una serie de cambios duraderos en el sistema mesolímbico. (Bradley y Meisel 2001; Frohmader et al. 2009; Lanzadores et al. 2010). LaEn el nivel de comportamiento, se ha demostrado una respuesta locomotora sensibilizada a la anfetamina y una mayor recompensa de anfetamina en ratas macho con experiencia sexual (Lanzadores et al. 2010); También se ha observado una respuesta locomotora alterada a la anfetamina con hámsters hembra (Bradley y Meisel 2001). Además, se ha encontrado un aumento en el número de espinas dendríticas y la complejidad de los árboles dendríticos después de un período de abstinencia de la experiencia sexual en ratas macho (Lanzadores et al. 2010). El estudio actual sugiere que ΔFosB puede ser un mediador molecular específico de los resultados a largo plazo de la experiencia sexual. De acuerdo, recientemente se ha demostrado que FosB es importante para inducir cambios en la columna dendrítica en respuesta a la administración crónica de cocaína (Dietz et al. 2009; Laberinto et al. 2010).

No está claro qué neurotransmisor corriente arriba es responsable de inducir ΔFosB en la NAc, pero se ha propuesto a DA como candidato (Nye et al. 1995). Prácticamente todas las drogas de abuso, incluidas la cocaína, la anfetamina, los opiáceos, los cannabinoides y el etanol, así como las recompensas naturales, aumentan el ΔFosB en la NAc (Perrotti et al. 2005; Wallace et al. 2008; Werme et al. 2002). Tanto las drogas de abuso como las recompensas naturales aumentan la concentración sináptica de DA en la NAc (Damsma et al. 1992; Hernández y Hoebel 1988a, b; Jenkins y Becker 2003). La inducción de osFosB por drogas de abuso se ha demostrado en las células que contienen el receptor de DA y el ΔFosB inducido por cocaína está bloqueado por un antagonista del receptor de D1 DAt (Nye et al. 1995). Por lo tanto, la liberación de DA tiene la hipótesis de que estimula la expresión de ΔFosB y, por lo tanto, media la neuroplasticidad relacionada con la recompensa. Respaldando la idea de que los niveles de BFosB son dependientes de la DA es el hallazgo de que las áreas del cerebro donde la experiencia sexual alteró los niveles de BFosB reciben una fuerte aportación dopaminérgica del VTA, incluida la corteza prefrontal medial y la amígdala basolateral.

Sin embargo, en contraste, ΔFosB no aumenta en el área preóptica medial a pesar de que esta área recibe aportes dopaminérgicos, aunque de fuentes hipotalámicas (Miller y Lonstein 2009). Se necesitan estudios futuros para probar si la expresión de ΔFosB inducida por el apareamiento y los efectos de la experiencia sexual en la motivación sexual y el rendimiento dependen de la acción de la DA. El papel de DA en la recompensa sexual en ratas macho actualmente no está completamente claro (Agmo y Berenfeld 1990; Pfaus 2009). Existe amplia evidencia de que el DA se libera en la NAc durante la exposición a una hembra o al apareamiento (Damsma et al. 1992) y las neuronas DA se activan durante el comportamiento sexual (Balfour et al. 2004). Sin embargo, las inyecciones sistémicas de antagonistas del receptor de DA no previenen la preferencia de lugar condicionada inducida por recompensa sexual (Agmo y Berenfeld 1990) y la hipótesis de que la DA es crítica para el refuerzo del emparejamiento inducido por la experiencia no está probada.

Tampoco está claro cuáles son los mediadores intermedios de los efectos de ΔFosB en el comportamiento sexual. Se ha demostrado que osFosB actúa como activador transcripcional y represor a través de un mecanismo dependiente de AP-1 (McClung y Nestler 2003; Peakman et al. 2003). Se han identificado numerosos genes diana, incluido el gen temprano inmediato c-fos (Hope et al. 1992; Hope et al. 1994; Morgan y Curran 1989; Renthal et al. 2008; Zhang et al. 2006), cdk5 (Bibb et al. 2001), dinorfina (Zachariou et al. 2006), sirtuin-1 (Renthal et al. 2009), Subunidades NFκB (Ang et al. 2001), LaLa subunidad GluR2 del receptor de glutamato AMPA (Kelz et al. 1999). Los resultados actuales demuestran que los niveles de c-Fos inducidos por el apareamiento se redujeron por la experiencia sexual en áreas del cerebro con un aumento de ΔFosB (NAc y ACA). La supresión de c-Fos parece depender del período desde la última pareja y las sesiones de apareamiento repetidas, como en estudios anteriores, tal disminución en c-Fos no se detectó en ratas macho examinadas 1 semana después de la sesión de apareamiento final (Balfour et al. 2004) o después de la experiencia sexual que consiste en una sola sesión de apareamiento (Lopez y Ettenberg 2002). Además, el hallazgo actual es consistente con la evidencia de que ΔFosB reprime el gen c-fos después de la exposición crónica a la anfetamina (Renthal et al. 2008). En línea con estos hallazgos, la inducción de varios ARNm de genes tempranos inmediatos (c-fos, fosB, c-jun, junB y zif268) se redujo después de las inyecciones repetidas de cocaína en comparación con las inyecciones agudas de drogas (Hope et al. 1992; Hope et al. 1994), y se suprimió el c-fos inducido por la anfetamina tras la retirada de la administración crónica de anfetamina (Jaber et al. 1995; Renthal et al. 2008). La relevancia funcional de la regulación a la baja de la expresión de c-Fos después del tratamiento crónico con medicamentos o la experiencia sexual sigue sin estar clara, y se ha sugerido que es un importante mecanismo homeostático para regular la sensibilidad de un animal a la exposición repetida a la recompensa (Renthal et al. 2008).

En conclusión, el estudio actual demuestra que ΔFosB en la NAc desempeña un papel integral en la memoria de recompensa sexual, apoyando la posibilidad de que ΔFosB sea importante para el refuerzo general de la recompensa y la memoria. Los hallazgos del estudio actual aclaran aún más nuestra comprensión de los mecanismos celulares y moleculares que median la recompensa y la motivación sexual, y se suman a un cuerpo de literatura que muestra que ΔFosB es un jugador importante en el desarrollo de la adicción, al demostrar un papel para ΔFosB en la recompensa natural reforzamiento.

Material suplementario

Supp Fig S1-S4 y Tabla S1-S2

Agradecimientos

Esta investigación fue apoyada por subvenciones de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud a LMC, Instituto Nacional de Salud Mental a EJN, y Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá a KKP y LMC.

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