allikas
Raku- ja molekulaarfarmakoloogia rühm, Murcia ülikooli meditsiinikooli farmakoloogia osakond, Hispaania.
Abstraktne
Kuritarvitavate ainete krooniline tarvitamine muudab sügavalt stressile reageerivat süsteemi. Korduv kokkupuude morfiiniga viib transkriptsioonifaktori ΔFosB akumuleerumiseni, eriti ajupiirkondades, mis on seotud tasu ja stressiga. ΔFosB püsiv mõju sihtgeenidele võib mängida olulist rolli narkootikumide poolt esilekutsutud plastilisuses. Hiljutised tõendid viitavad sellele, et stressiga seotud hormoonid (nt glükokortikoidid, GC) võivad aju stressisüsteemis esile kutsuda kohandusi, mis tõenäoliselt hõlmavad geeniekspressiooni ja transkriptsioonifaktorite muutusi. Selles uuringus uuriti GC rolli FosB / ΔFosB reguleerimisel nii hüpotalamuse kui ka ekstrahüpotalamuse aju stressisüsteemides morfiinisõltuvuse ajal. Selleks mõõdeti FosB/ΔFosB ekspressiooni kontroll- (võltsoperatsiooniga) ja adrenalektoomiaga (ADX) rottidel, kes muudeti opiaatidest sõltuvaks pärast kümnepäevast morfiiniravi. Näidisopereeritud rottidel indutseeriti FosB/ΔFosB pärast kroonilist morfiini manustamist kõigis uuritud aju stressipiirkondades: nucleus accumbens (shell) (NAc), stria terminalis'e voodituum (BNST), tsentraalne mandelkeha (CeA), hüpotalamuse paraventrikulaarne tuum (PVN) (NTS-A(2)). Adrenalektoomia nõrgendas FosB / ΔFosB suurenenud tootmist, mida täheldati pärast kroonilist morfiiniga kokkupuudet NAc-s, CeA-s ja NTS-is. Lisaks vähendas ADX FosB / ΔFosB ekspressiooni BNST, PVN ja CeA CRH-positiivsetes neuronites. Sarnased tulemused saadi NTS-A(2) TH-positiivsete neuronite ja NAc prodünorfiin-positiivsete neuronite puhul. Need andmed viitavad sellele, et neuroadaptatsiooni (hinnanguliselt FosB / ΔFosB akumuleerumisena) opiaatidega stressiga seotud ajupiirkondades moduleerib GC, toetades tõendeid aju stressihormoonide ja sõltuvuse vahelise seose kohta.
Sissejuhatus
Opiaatravimid, nagu morfiin, on tõhusad valuvaigistid, mida kasutatakse paljude ägeda ja kroonilise valu vormide raviks. Kuid tõsised kõrvalmõjud, nagu tolerantsus ja võõrutus, soodustavad opiaatide sõltuvust ja piiravad nende kasutamist. Lisaks on viimastel aastatel suurenenud opiaatide (heroiin, morfiin) mittemeditsiiniline kasutamine. Üha rohkem tõendeid viitab erinevatele geeniregulatsiooni mehhanismidele (sealhulgas epigeneetilised, molekulaarsed, rakulised ja ahela tasemel mõjud) muutustes, mida kuritarvitamise ravimid ajus esile kutsuvad, mis näitab sõltuvusravi potentsiaalset terapeutilist strateegiat. [1]-[4].
Uimastite kuritarvitamise valdkonna keskne küsimus on olnud valkude tuvastamine, mis vahendavad nende ravimite üleminekut ägedalt pikaajalisele toimele. Sõltuvuse uurimise vastu pakub erilist huvi transkriptsioonifaktorite perekond Fos. Sellesse perekonda kuuluvad c-Fos, Fra-1 ja Fra-2, FosB ja ΔFosB, täispika FosB kärbitud splaissvariant [5]Erinevalt teistest Fos-perekonna liikmetest indutseeritakse ΔFosB ajus pärast ägedat ravimi manustamist tagasihoidlikult, kuid oma ebatavaliselt pika poolväärtusaja tõttu püsib see nädalaid, isegi kuid pärast ravimi tarvitamise lõpetamist. Selle tulemusena ΔFosB tasemed kuhjuvad järk-järgult korduva ravimi manustamise korral [6], [7], mis viitab sellele, et ΔFosB võib kujutada endast mehhanismi, mille abil kuritarvitavad ravimid põhjustavad püsivaid muutusi geeniekspressiooni mustris kaua pärast ravimi ärajätmist. [8].
On teatatud, et korduv kokkupuude kokaiini, amfetamiini, kannabinoidide või morfiiniga põhjustab ΔFosB suurenemist ajupiirkondades, mis on seotud ravimite positiivse tugevdava toimega, nagu nucleus accumbens (NAc), prefrontaalne ajukoor ja dorsaalne juttkeha. Seda suurenemist peetakse neuroadaptatsiooniks, mis põhjustab suurenenud tundlikkust kuritarvitavate ravimite suhtes ja haavatavust sõltuvusele iseloomuliku käitumise kujunemisel. [9]-[13]. Oleme hiljuti näidanud, et thFosB/ΔFosB taseme tõus pärast kroonilist morfiini manustamist ei piirdu ainult premeerimissüsteemiga, vaid toimub ka aju stressisüsteemis (mida on seostatud ravimite negatiivse tugevdava toimega), samuti üksildase trakti tuumas-A2 noradrenergiliste rakkude rühm (NTS-A2, peamine noradrenergiline süsteem, mis innerveerib stressi neuroahelaid) [14]. Kooskõlas nende leidudega indutseerivad mitmed kroonilise stressi vormid ka ΔFosB NAc-s ja teistes ajupiirkondades [15], [16].
Sõltuvus on keeruline häire, kuna selle neuroloogilise häire tekkele ja säilimisele aitavad kaasa paljud tegurid. Üks tegur on stress, mis on olnud seotud uimastisõltuvuse teatud aspektidega [17]-[21]. Nii hüpotalamuse-hüpofüüsi-neerupealise (HPA, esmane endokriinse stressirada) telg kui ka ekstrahüpotalamuse stressisüsteem (mis hõlmab laiendatud amügdalat ja NTS-A2) on reguleerimata sõltuvuspotentsiaaliga ravimite kroonilise manustamisega [14], [22]. Lisaks on HPA telje reaktsioon sarnane nii pärast stressi tekitavaid stiimuleid kui ka ägedat kokkupuudet kuritarvitavate ravimitega [23], [24], suurenenud kortikotropiini vabastava hormooni (CRH), adrenokortikotroopse hormooni (ACTH) ja glükokortikoidide (GC) vabanemisega. Ttema reaktsioon hõlbustab kohanemist ägedate keskkonnamuutustega, kuid võib põhjustada ka käitumispatoloogiaid krooniliste stressitingimuste korral, nagu sõltuvus ja depressioon [25]Uuringutes pole veel uuritud GC ja morfiinisõltuvusest tingitud FosB/ΔFosB indutseerimise vahelist seost aju stressisüsteemis. Seetõttu hindasime GC mõju FosB/ΔFosB ekspressioonile pärast morfiini pidevat manustamist aju stressiga seotud piirkondades. Sellele küsimusele vastamiseks uurisime kõigepealt kahepoolse adrenalektoomia (ADX) mõju FosB/ΔFosB immunoreaktiivsusele (IR) morfiinisõltuvate rottide stressisüsteemi peamistes tuumades.
Aju stressisüsteemi aktiivsust vahendavad mitmed neurotransmitterid/neuromodulaatorid. CRH on peamine stressisüsteemi aktiivsust reguleeriv neuropeptiid ning on oletatud, et see aitab kaasa nii olemasolevale sõltuvust tekitavale narkootikumide tarvitamise vastuvõtlikkusele kui ka hilisemale retsidiivide tekkele. [26]. MaLisaks toetab NTS-A olulisust rohke töö2 aju stressisüsteemi innerveerimine uimastisõltuvuses ja noradrenaliini (NA) keskset rolli neurotransmitterina, mis moduleerib seda neuroahelat [27]. Lõpuks näitavad olulised tõendid, et dünorfiini ekspressioon aktiveerub juttkehas ja amügdalas ägeda ja kroonilise ravimi manustamise ajal. [28]. Arvestades neid fakte, oli selle uuringu järgmine eesmärk tuvastada GC roll FosB / ΔFosB ekspressioonil aju stressisüsteemi spetsiifilistes populatsioonides morfiinist sõltuvuse ajal.
Tulemused
Adrenalektoomia mõju kehakaalu tõusule ja plasma ACTH ja kortikosterooni kontsentratsioonile morfiinist sõltuvatel rottidel
Enne immuuntuvastustestide läbiviimist hindasime kroonilise morfiiniravi efektiivsust. Selleks registreeriti loomade kaal graanulite implanteerimise päeval ja surmamise päeval (10. päev). Kahesuunaline ANOVA näitas adrenalektoomia puhul olulisi peamisi mõjusid kehakaalu tõusule [F(1,47)
=13.24, lk=0.0007), morfiinitöötlus [F(1,47)=281.05, lk<0.0001] ning ADX-i ja morfiinravi vaheline koostoime [F(1,47)=4.13, lk=0.0479]. Kooskõlas varasemate leidudega [29], [30], post hoc Analüüs näitas, et nii platseebo- kui ka morfiinist sõltuvaks muutunud ADX-rühmadel oli oluliselt (p<0.001) väiksem kaalutõus (−13.75±5.0 g, n=12; 3.84±2.45 g, n=13) kui see, mida täheldati võlts- ja ADX-loomadel, kes said platseebot pelleteid (44.58 ± 1.7 g, n=12; 49.57±2.4 g, n=12), mida on seostatud nende loomade vähenenud toidutarbimisega [29].
Adrenalektoomia efektiivsuse kontrollimiseks mõõdeti hormoonide kontsentratsiooni plasmas. Kahesuunaline ANOVA, mis uuris adrenalektoomia ja morfiini mõju ACTH ja kortikosterooni plasmakontsentratsioonile, näitas adrenalektoomia olulisi peamisi mõjusid [ACTH: F(1,18)=68.12, lk<0.0001; kortikosteroon: F(1,45)=10.42, lk=0.0023). Nagu oodatud, Newmani oma post hoc test näitas (Joonis S1) et platseeborühmas (n=6)- ja morfiin (n=4)-ADX rottidel oli ACTH plasmakontsentratsioon kõrgem (lk<0.001) võrreldes fiktiivselt opereeritud loomadega kahe hinnatud ravi puhul (platseebo, n=6; ja morfiin, n=6). ADX-platseebo vahel ei täheldatud kortikosterooni plasmakontsentratsioonis muutusi (n=14) ja ADX-morfiin (n=13) töödeldud rottidel. Kortikosterooni kontsentratsioon ADX-morfiiniga töödeldud rottidel oli oluliselt (p<0.01) madalam kui näidismorfiini puhul (n=10) ravitud rotid. Võltsmorfiini rühmas ei täheldatud olulisi muutusi võrreldes fiktiivse platseeboga (n=12).
Adrenalektoomia nõrgestab morfiinisõltuvusest tingitud FosB/ΔFosB-d erinevalt aju stressisüsteemi alampiirkondades
Kontrollloomadel (platseebo-implanteeritud rotid) tuvastati kõigis stressiga seotud ajusüsteemi piirkondades FosB/ΔFosB-IR nõrk konstitutiivne ekspressioon. Krooniline morfiinravi põhjustas FosB / ΔFosB ilmnemise kõigis uuritud ajupiirkondades. NAc(shell) puhul näitas kahesuunaline ANOVA adrenalektoomia olulisi peamisi mõjusid [F(1,16)=6.44, lk=0.0220] ja krooniline morfiinravi [F(1,16)=19.98, lk=0.0004]. Newman-Keulsi post hoc test näitas (Joonis 2A–E), et morfiiniga töödeldud rottidel suurenes FosB/ΔFosB ekspressioon märkimisväärselt (p<0.01). Morfiinist sõltuvatel ADX rottidel vähenes FosB/ΔFosB valgu ekspressioon NAc-s oluliselt (p<0.05). BNST kahesuunaline ANOVA näitas kroonilise morfiinravi olulist peamist mõju [F(1,16)=48.92, lk<0.0001]. Post hoc analüüs näitas tõusu (lk<0.001) FosB/ΔFosB-s nii vale- kui ka ADX-morfiinist sõltuvatel loomadel, mis näitab, et FosB/ΔFosB reguleerimine oli seotud kroonilise morfiini ekspositsiooniga, sõltumata GC kontsentratsioonist (Joonis 2F–J). Kahesuunaline ANOVA FosB/ΔFosB kohta CeA-s näitas adrenalektoomia olulist mõju [F(1,15)].=20.51, lk=0.0004] ja eeltöötlus morfiiniga [F(1,15)=27.52, lk<0.0001]. Post hoc test näitas FosB/ΔFosB taseme olulist suurenemist (p<0.01) platseeboga platseeboga võrreldes platseeboga ravitud rottidel, mis oli ADX morfiinist sõltuvas rühmas nõrgenenud (p<0.01) (Joonis 2K–OLisaks näitasid ADX platseebograanulitega rotid madalamaid FosB/ΔFosB tasemeid (p<0.01) kui platseeborühmas, keda raviti kontrollrühmas.
Kahesuunaline ANOVA, mis uuris adrenalektoomia ja morfiini mõju FosB/ΔFosB ekspressioonile PVN-is (parvotsellulaarne alajaotus), näitas morfiinravi olulist mõju [F(1,16)].=16.31, lk<0.0001]. Post hoc analüüs näitas olulist (Joonis 3A–E) suurendamine (lk<0.05) FosB/ΔFosB-IR-is nii võlts- kui ka ADX-morfiiniga töödeldud rottide PVN-s. NTS-A-s2 katehhoolaminergiliste rakkude rühmas näitas kahesuunaline ANOVA morfiiniravi peamist mõju [F(1,11)]=76.33, lk<0.0001]. Post hoc analüüs näitas olulist (Joonis 3F–J) FosB/ΔFosB-IR suurenemine morfiiniga võltsitud rottidel võrreldes fiktiivse platseeborühmaga (p<0.001), mis oli ADX morfiinist sõltuvas rühmas nõrgenenud (p<0.05).
Krooniline morfiini ekspositsioon indutseerib FosB/ΔFosB ekspressiooni CRH neuronites PVN-is, BNST-s ja CeA-s. Glükokortikoidide mõju.
Kahesuunaline ANOVA FosB/ΔFosB-positiivsete/CRH-positiivsete neuronite jaoks BNST-s näitas adrenalektoomia peamist mõju [F(1,20)=64.43, lk<0.0001] ning oluline koostoime adrenalektoomia ja morfiinravi vahel [F(1,20)=6.80, lk=0.0169]. PVN-s näitas kahesuunaline ANOVA adrenalektoomia olulist peamist mõju [F(1,19)=11.35, lk=0.0032]. Kahesuunaline ANOVA FosB/ΔFosB-positiivsete/CRH-positiivsete neuronite jaoks CeA-s näitas adrenalektoomia olulist peamist mõju [F(1,20)=106.85, lk<0.0001], morfiinravi [F(1,20)=7.33, lk=0.0136] ning märkimisväärne koostoime adrenalektoomia ja ravimite eelravi vahel [F(1,20)=7.07, lk=0.0151]. Arvud 4, , 5,5, ,66 näitavad BNST, PVN ja CeA lõikude representatiivseid kujutisi platseebo- või ADX-kontrollrottidelt ja morfiinisõltuvatelt rottidelt. Post hoc analüüs näitas, et märkimisväärne arv FosB/ΔFosB-positiivseid neuroneid ekspresseerivad BNST-s CRH-d (p<0.01; Joonis 4E), PVN (lk<0.05; Joonis 6E) ja CeA (p<0.01; Joonis 6E) platseebo-morfiini saanud rottidel võrreldes platseebo-platseebo rühmaga. Lisaks oli ADX platseebo-granuleeritud rottidel ja morfiinisõltuvatel rottidel CRH-d koekspresseerivate FosB/ΔFosB-positiivsete neuronite arv kolmes tuumas oluliselt madalam võrreldes vastava raviga platseebo-loomadel, nagu on näidatud joonisel Arvud 4, , 5,5, ,66 (BNST: lk<0.01 vs võlts pluss platseebo; lk<0.001 vs võlts pluss morfiin; PVN: lk<0.05 vs võlts pluss platseebo; lk<0.001 vs võlts pluss morfiin; CeA: lk<0.001 vs. platseebo pluss platseebo ja vs. platseebo pluss morfiin).
BNST tasemel näitas CRH-positiivsete neuronite arvu kahesuunaline ANOVA, et ADX-il oli peamine mõju [F(1,20)=103.92, p<0.0001], samuti krooniline morfiin [F(1,20)=4.35, p<0.05]. Nagu näidatud Tabel 1, Newman-Keuls post hoc test näitas, et ADX platseebo- ja morfiinigraanulitega rottidel oli vähem CRH neuroneid (p<0.001) kui platseebo- või morfiinisõltuvatel rühmadel. PVN-i juures näitas kahesuunaline ANOVA adrenalektoomia olulist mõju [F(1,19)].=11.35, lk=0.0032]. Kahesuunaline ANOVA kogu CRH neuronite kohta CeA tasemel näitas ADX märkimisväärset mõju [F(1,20)=240.09, p<0.0001] ja peamine koostoime ADX-i ja kroonilise morfiini vahel [F(1,20)=4.49, lk=0.0467]. Tabel 1 kujutab, et ADX platseebo või morfiiniga ravitud rottide CRH neuronite arv CeA-s vähenes oluliselt. Tabel 1 näitab ka, et krooniline morfiini ekspositsioon kutsub esile CRH-positiivsete neuronite arvu suurenemise (p<0.05) BNST ja CeA tasemel.
Adrenalektoomia mõju FosB/ΔFosB-le DYN-positiivsetes neuronites NAc(Shell)-s
Me ei täheldanud olulisi muutusi pro-DYN-positiivsete rakkude arvus, mis ekspresseerivad FosB / ΔFosB NAc-s (kestas) pärast kroonilist morfiiniga kokkupuudet (Joon. 7) platseeborühma kohta. Kahesuunaline ANOVA FosB/ΔFosB-positiivsete/pro-DYN-positiivsete neuronite jaoks NAc(kestas) näitas ADX-i peamist mõju [F(1,19)=10.11, lk=0.0049]. Nagu näidatud Joonis 7Coli ADX morfiinist sõltuvatel rottidel pro-DYN-i koekspresseerivate FosB/ΔFosB-positiivsete neuronite arv oluliselt (p<0.05) madalam võrreldes vastava raviga platseebo-loomadel. Nagu on näidatud joonisel Tabel 1, ADX ei indutseerinud NAc(kesta) kogu pro-DYN-rakkudes muutusi.
Adrenalektoomia inhibeerib morfiinist sõltuvusest põhjustatud FosB/ΔFosB NTS-A TH-positiivseteks neuroniteks2 Noradrenergiliste rakkude rühm
Kahesuunaline ANOVA FosB/ΔFosB-positiivsete/TH-positiivsete neuronite jaoks NTS-A-s2 näitas ADX-i peamist mõju [F(1,15)=64.86, lk<0.0001], morfiinravi [F(1,15)=29.62, lk<0.0001] ning oluline koostoime adrenalektoomia ja morfiinravi vahel [F(1,15)=19.24, lk=0.0005]. Newman-Keuls post hoc test näitab, et märkimisväärne arv FosB/ΔFosB-positiivseid neuroneid koekspresseerivad TH-d NTS-is (p<0.001; Joonis 7F) näidismorfiinrottidel. Lisaks oli TH-d koosekspresseerivate FosB/ΔFosB-positiivsete neuronite arv ADX morfiinist sõltuvatel rottidel oluliselt väiksem (p<0.001) võrreldes vastava raviga platseebo-loomadel, nagu on näidatud joonisel Joonis 7F. Teisest küljest, nagu näidatud Tabel 1ADX ei indutseerinud NTS-is TH-positiivsete neuronite koguarvus muutusi.
Arutelu
Praegused tulemused näitasid esmakordselt, et aju GC signaalimine moduleeris kroonilise morfiini manustamise indutseeritud FosB/ΔFosB ekspressiooni aju stressisüsteemis piirkonnaspetsiifilisel viisil.
Ühinevad tõendid näitavad, et stress suurendab sõltuvust tekitava käitumise riski [18]. Püsivad stressi tekitavad stiimulid muudavad sünteesi, ekspressiooni ja signaaliülekannet stressiga seotud radadel (nt CRH, GC, NA jne). Lisaks mõjutavad kuritarvitamise ravimid stressiradasid, mille tulemuseks on geeniekspressiooni muutumine, mis annab signaali mõju tasu ja stressiga seotud molekulidele. [31]. Stressil ja kuritarvitatud ravimitel on ühine võime vallandada kesknärvisüsteemis neuronite aktivatsiooni kattuvaid mustreid, mille tulemuseks on vahetu geeniekspressiooni aktiveerimine.
Laialdaselt on kirjeldatud, et sõltuvust tekitavad ained ja kroonilised stressi tekitavad stiimulid suurendavad transkriptsioonifaktori ΔFosB ekspressiooni peamistes tuumades, mis on seotud nende positiivse tugevdava toimega. [12], [13], [32], [33]ja on tehtud ettepanek, et ΔFosB püsiv mõju sihtgeenidele võib mängida olulist rolli sõltuvust iseloomustavate kohanduste väljatöötamisel. [9], [34]Siiski on vähe teada nii ΔFosB ekspressioonist aju stressisüsteemis pärast kuritarvitatavate ravimite kroonilist manustamist kui ka morfiini poolt esile kutsutud ΔFosB akumuleerumise molekulaarsetest mehhanismidest stressiga seotud piirkondades.
Käesolevas uuringus uurisime GC seotust morfiini poolt indutseeritud FosB/ΔFosB ekspressiooniga hormonaalses stressisüsteemis (HPA teljel), mida kontrollib CRH PVN-is, aga ka ekstrahüpotalamuse stressisüsteemides (mis hõlmavad pikendatud amügdalat; [35]), mida vahendavad CRH ja teised stressiga seotud süsteemid (sh NA ja dünorfiin; [19]).
Hiljuti näitasime, et krooniline morfiini manustamine seitsme päeva jooksul suurendas FosB / ΔFosB ekspressiooni laiendatud amügdalas, PVN-s ja NTS-A-s2 [14]. Kooskõlas nende andmetega näitavad praegused tulemused, et krooniline morfiini manustamine kutsus esile FosB/ΔFosB suurenemise CeA-s, BNST-s ja NAc-s (kest), aga ka PVN-s ja NTS-A-s.2. Laienenud amygdalat on seostatud ravimitasuga. Tegelikult aktiveerivad kõik peamised kuritarvitavad ravimid dopamiinergilise ülekande VTA-st NAc-le (kestale) ja CeA-le. On näidatud, et see aktiveerimine ja sellest tulenev kuritarvitavate ainete positiivne tugevdav mõju on seotud VTA-s asuvate GR-i GC-meetmetega. [28]. Seda hüpoteesi toetades näitavad meie tulemused, et FosB / ΔFosB-IR NAc (kestas) ja CeA-s oli ADX loomadel nõrgenenud, mis võib viidata AP-1 transkriptsioonifaktorite ja GR vahelisele ristkõnele morfiinisõltuvuse ajal. [36]Vastupidiselt ADX-i täheldatud mõjule FosB ekspressioonile NAc-s ja CeA-s näitavad praegused tulemused, et krooniline morfiin suurendas Fos/ΔFosB ekspressiooni PVN-is ja BNST-s GC-sõltumatul viisil.
Mitmed aju stressisüsteemi neurotransmitterid, nagu CRH, NA ja DYN, on seotud sõltuvusprotsessile iseloomulike aversiivsete seisunditega. [35], [37]-[39]. Praegused leiud näitasid, et krooniline morfiini ekspositsioon kutsus esile Fos / ΔFosB ekspressiooni olulise suurenemise CRH-d sisaldavates neuronites BNST-s, CeA-s ja PVN-s. Transkriptsioonifaktorite perekond Fos võib toimida tsüklilise AMP-vastuse elemendi (CRE) saitidel [40]. Märkimisväärsed tõendid näitavad, et ΔFosB võib toimida kas transkriptsiooni repressorina või aktivaatorina [40], [41]. Garvestades, et CRH geeni promootorjärjestuses on CRE motiiv, võib teha ettepaneku, et FosB/ΔFosB akumuleerumine CRH neuronites võib vahendada morfiinist põhjustatud muutusi CRH tasemetes, nagu on teatatud kokaiini mõjude kohta. [42], eriti CeA-s ja BNST-s, kus esimest korda teatasime CRH-positiivsete neuronite arvu suurenemisest morfiinisõltuvuse ajal. Seda hüpoteesi toetades on CeA-s kirjeldatud CRH mRNA taseme tõusu pärast morfiini kroonilist manustamist. [43]Siiski ei muutunud CRH-positiivsete neuronite arv PVN-is pärast kroonilist morfiinravi. Need tulemused on kooskõlas varasemate leidudega, mis näitavad, et krooniline morfiiniga kokkupuude ei põhjusta muutusi PVN CRH hnRNA-s. [44]. Kuna PVN CRH ekspressiooni reguleerib GC alla [45]ning arvestades seda praegust tööd ja muud [29], [44] näitas, et krooniline opiaatide kokkupuude ei muutnud kortikosterooni vabanemist, tundub loogiline, et krooniline morfiini manustamine ei muutnud CRH-rakkude arvu.
Kortikosterooni perifeerne manustamine suurendab CRH mRNA ekspressiooni CeA-s ja BNST-s [46], [47]. Lisaks vähendas ADX CRH ekspressiooni CeA-s [48], [49]. Sellest lähtuvalt oleme täheldanud, et CRH neuronite arvu suurenemine BNST-s ja CeA-s morfiinisõltuvuse ajal kaotati pärast adrenalektoomiat. Arvestades, et Fos / ΔFosB suurenemine CRH neuronites morfiinist sõltuvuse ajal nõrgenes ADX loomadel, võib soovitada Fos / ΔFosB rolli CRH ekspressiooni reguleerimisel GC poolt laiendatud amygdalas. Teisest küljest on hästi teada, et GC reguleerib negatiivselt CRH geeni ekspressiooni PVN-s [45]. Kokkuleppel näitasid praegused andmed selgelt, et adrenalektoomia kaotas Fos / ΔFosB-IR suurenemise CRH-d sisaldavates neuronites selle tuuma morfiini sõltuvuse ajal.
Selles uuringus näitasid immunokeemilised andmed, et krooniline morfiinravi suurendas oluliselt Fos / ΔFosB värvumist NTS-A-s2, mis pärast ADX-i vähenes. Kui uurisime spetsiifilisi närvipopulatsioone, mis ekspresseerisid FosB/ΔFosB-d, leidsime Fos/ΔFosB-IR tugeva suurenemise TH-positiivsetes (katehhoolamiini sünteesi kiirust piirav ensüüm) neuronites. On näidatud, et NA mängib peamist rolli sõltuvuses. [50]. Varasemas töös kutsus krooniline kokkupuude morfiiniga esile TH taseme tõusu NTS-A-s2 [14], [29]On teada, et TH geenil on promootoris AP-1 sait. [51]. Meie tulemused võivad viidata sellele, et FosB / ΔFosB on seotud opiaatide poolt indutseeritud TH taseme tõusuga NTS-A-s2. Ajutüve noradrenergiliste rakkude rühm ekspresseerib kõrgel tasemel GC retseptoreid (GR). On näidatud, et GC-l on noradrenergilises neurotransmissioonis lubav roll [29], [30], [52]. Seega mõjutas GR antagonistide manustamine NA aktiivsuse mitmeid aspekte, sealhulgas TH aktivatsiooni ja neuronaalset aktiivsust [30]. Praegused tulemused näitasid, et pärast ADX-i vähenes NTS-A-s FosB / ΔFosB ekspresseerivate TH-positiivsete rakkude arv.2Võttes arvesse, et adrenalektoomia blokeeris TH-valgu taseme tõusu NTS-A-s.2 morfiinisõltuvuse ajal [29]ja et TH geeni promootoris on kirjeldatud GRE/AP-1 saiti [53], võivad meie andmed osutada ΔFosB-le kui vahendajale GC mõjus noradrenergilisele aktiivsusele NTS-A-s.2 opiaadisõltuvuse ajal.
DYN on oletatud ΔFosB võimaliku sihtgeenina [54], [55]. Meie tulemused näitavad, et krooniline kokkupuude morfiiniga ei muutnud märkimisväärselt FosB/ΔFosB ekspressiooni pro-DYN-i ekspresseerivates neuronites NAc(kestas). DYN ekspressiooni ΔFosB regulatsiooni osas Zachariou jt. [33] teatasid DYN mRNA taseme väikesest, kuid olulisest langusest ΔFosB üleekspresseerivate hiirte NAc-s, oletades seega, et see transkriptsioonifaktor pärsib DYN ekspressiooni. Meie andmete põhjal ei saa järeldada, et krooniline morfiin muudab DYN ekspressiooni FosB/ΔFosB aktiivsuse kaudu, arvestades, et meie tulemused on saadud valgu tasemel.
On oletatud, et DYN/kappa opioidsüsteem näib kutsuvat esile depressiivseid seisundeid, mis hõlmavad vastumeelsuse elemente. See aversiivne reaktsioon võib hõlmata vastastikuseid koostoimeid NAc, DA ja ekstrahüpotalamuse CRH süsteemiga [35]. Siiski on vähe teada DYN-i ekspressiooni võimalikust GC-regulatsioonist NAc-s. On tehtud ettepanek, et ΔFosB NAc-s suurendab osaliselt DYN-i ekspressiooni mahasurumise kaudu tundlikkust morfiini ja kokaiini rahuldust pakkuvate mõjude suhtes ning suurendab vastupidavust stressile. [9], [33]. Meie andmed toetavad GC rolli mesokortikolimbilise DA-süsteemi vahendatud morfiini positiivsete tugevdavate mõjude reguleerimisel, arvestades, et FosB / ΔFosB / pro-DYN-positiivsete neuronite arv väheneb ADX-rottide NAc-s. Neid mõjusid võib vahendada otse GR, mis esineb kogu mesolimbilises tasustamise rajas, või kaudselt CeA-st ja/või BNST-st tulenevate CRH projektsioonide kaudu VTA-le ja NAc-le, mis on ADX-rottide morfiinisõltuvuse ajal alaaktiveeritud.
Kokkuvõttes annab see uuring tõendeid selle kohta, et GC-l on kriitilise tähtsusega roll FosB/ΔFosB akumuleerumisel aju stressisüsteemides pärast kroonilist morfiiniga kokkupuudet, mis võib põhjustada püsivaid muutusi geeniekspressiooni mustris stressiga seotud piirkondades. Käesolevad leiud näitavad ka, et FosB/ΔFosB võib opioidisõltuvuse ajal kaasa aidata GC-sõltuvatele muutustele aju stressisüsteemi plastilisuses. Täiendavad uuringud on vajalikud selleks, et määrata kindlaks intratsellulaarsed mehhanismid, mille abil kroonilised opiaadid indutseerivad FosB / ΔFosB valitud stressiga seotud piirkondades, samuti mehhanism, mis vastutab morfiini poolt indutseeritud FosB / ΔFosB ekspressiooni pärssimise eest GC poolt.
Meetodid
materjalid
Kortikosteroon ja kolesterool osteti firmalt Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Kortikosterooni pelletid valmistas dr Márton Vajna (Semmelweisi Ülikooli Farmaatsiaülikooli Apteegiadministratsiooni Osakond, Budapest, Ungari). Morfiinialuse (Alcaliber Laboratories, Madrid, Hispaania) või laktoosi (kontroll) pelletid valmistati farmaatsia ja farmatseutilise tehnoloogia osakonnas (Granada Farmaatsiakool, Hispaania). Pentobarbitaal osteti firmalt Hospira (Hoofddorp, Holland). Ketamiinkloriid ja ksülasiin osteti vastavalt firmadelt Labs. Merial (Lyon, Prantsusmaa) ja Labs. Calier (Barcelona, Hispaania).
Loomad
Isased Sprague-Dawley rotid (katse alguses 220–240 g; Harlan, Barcelona, Hispaania) paigutati paarikaupa puuridesse (pikkus 45 cm; laius 24 cm; kõrgus 20 cm) saabumisel kontrollitud temperatuuriga (22±2°C) ja õhuniiskusega (50±10%) ruumi, kus oli vaba juurdepääs veele ja toidule (Harlan Teklad standardne näriliste toit; Harlan Interfauna Ibérica, Barcelona, Hispaania). Loomi harjutati standardse 12-tunnise valguse-pimeduse tsükliga (tuled sisse lülitatud: 08:00–20:00) 7 päeva enne katsete algust. Kõik kirurgilised ja eksperimentaalsed protseduurid viidi läbi vastavalt Euroopa Ühenduste Nõukogu 24. novembri 1986. aasta direktiivile (86/609/EMÜ) ning need olid heaks kiidetud kohalike loomkatsete komiteede poolt (REGA ES300305440012). Uuringu kiitsid heaks Murcia ülikooli bioeetikakomitee (RD 1201/2005) ja Ministerio de Ciencia y Tecnología (SAF/FEDER 2009-07178), Hispaania.
Adrenalektoomia
Rottidel tehti kahepoolselt adrenalektoomia ja siirdati kortikosterooni pellet, et tagada madal, kuid stabiilne GC tase [29]. Rottidele tehti kahepoolselt adrenalektoomia (ADX) dorsaalse lähenemise teel 90 mg/kg ketamiinkloorhüdraadi ja 8 mg/kg ksülasiini (ip) anesteesia all ning neile implanteeriti operatsiooni ajal subkutaanselt (sc) aeglaselt vabastavad kortikosterooni graanulid. Steroidigraanulite koostis (25 mg kortikosterooni pluss 75 mg kolesterooli) valiti selliselt, et tagada stabiilne kortikosterooni kontsentratsioon, mis vastab ööpäevasele madalaimale tasemele kuni 20 päeva pärast implanteerimist. [56]. Kortikosterooni asendusravi saanud ADX rotid (ADX pluss kortikosteroon) ei suurenda plasma kortikosterooni taset, mis on põhjustatud väljakutsest [56]Pärast operatsiooni oli ADX pluss kortikosterooni saanud rottidel vaba valik juua isotoonilist soolalahust (0.9% NaCl), et asendada adrenalektoomia tõttu aldosterooni kaotuse tagajärjel tekkinud naatriumivaegust. Kontrollrottidele tehti sama kirurgiline protseduur (spittel) ilma neerupealiste eemaldamiseta. Shake- ja ADX pluss kortikosterooni saanud rottidel lasti operatsioonist 5 päeva taastuda enne morfiinisõltuvuse protseduuri. Edukat kahepoolset adrenalektoomiat kinnitati kortikosterooni ja AKTH plasmakontsentratsioonide ning ADX loomade lahkamise teel.
Narkootikumide ravi ja eksperimentaalne protseduur
Viis päeva pärast operatsiooni implanteeriti rottidele kerge eeteranesteesia all naha alla kaks 75 mg morfiinipelletit. Kontrollrühma rottidele manustati laktoosi sisaldavaid platseebopelleteid. On näidatud, et see protseduur tekitab püsiva morfiini kontsentratsiooni plasmas alates mõnest tunnist pärast pelletite implanteerimist ja täieliku võõrutussündroomi pärast opioidantagonistide ägedat süstimist. [57]. Sõltuvus morfiinist saavutatakse 24 tundi pärast graanulite implanteerimist ja püsib konstantsena 15 päeva [58]. Kümme päeva pärast morfiini- või platseebograanulite implanteerimist rotid surmati. HPA telje aktiivsuse (kortikosterooni ja ACTH plasmakontsentratsioon), FosB/ΔFosB ekspressiooni, CRH ekspressiooni, DYN ekspressiooni, TH ekspressiooni ja FosB/ΔFosB ekspressiooni CRH-, DYN- ja TH-positiivsetesse neuronitesse uuritud neli katsetingimust olid: (i) võlts-platseebo; (ii) valemorfiin; (iii) ADX-platseebo; (iv) ADX-morfiin. Rottide kehakaalu tõusu kontrolliti ravi ajal, et tagada morfiini õige vabanemine graanulitest, sest on teada, et pikaajaline morfiinravi kutsub esile kehamassi tõusu vähenemise, mis on tingitud väiksemast kaloraažist. [29].
Aju perfusioon ja lõikamine
Rotid anesteseeriti sügavalt pentobarbitaali üledoosiga (100 mg/kg ip) ja perfuseeriti transkardiaalselt soolalahusega, millele järgnes paraformaldehüüdi sisaldav fiksaator (4% paraformaldehüüdi 0.1 M boraatpuhvris, pH 9.5). Pärast perfuseeritud ajude eemaldamist fikseeriti need 3 tundi samas fiksaatoris ja hoiti temperatuuril 4 °C PBS-is, mis sisaldas 10% sahharoosi, kuni koronaalsed lõigud (paksus 30 µm) lõigati rostrokaudaalselt külmutusmikrotoomil (Leica, Nussloch, Saksamaa). Paxinose ja Watsoni atlas (2007) [59] kasutati rottide erinevate ajupiirkondade tuvastamiseks: NAc (shell), BNST, PVN, CeA ja NTS-A2 (Joonis 1). Sektsioonid kaitsti külma eest ja neid hoiti kuni kasutamiseni temperatuuril –20 °C.
FosB / ΔFosB immunohistokeemia
Sektsioone töödeldi immunohistokeemia jaoks, nagu on kirjeldanud Núñez et al [29]. Lühidalt, pärast blokeerimist 0.3% H-ga2O2 ja 2% normaalset kitseseerumi (Sigma, USA) koelõike inkubeeriti primaarses anti-FosB/ΔFosB antiseerumis (küüliku polüklonaalne, #sc-48, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA; 1![[suhe]](http://www.ncbi.nlm.nih.gov/corehtml/pmc/pmcents/x2236.gif)
1000). Selles uuringus kasutatud esmane antikeha ei tee vahet FosB ja selle stabiilse splaissingu variandi ΔFosB vahel. On näidatud, et korduv kokkupuude FosB-d indutseerivate stiimulitega desensibiliseerib ägeda FosB indutseeritavuse [15], [40], [60]. Seetõttu võib FosB / ΔFosB värvimise erinevusi morfiiniga eeltöödeldud ja eeltöödeldud rottidel tõlgendada nii, et need peegeldavad peamiselt erinevusi ΔFosB akumulatsioonis. Antigeenid visualiseeriti tavapärase avidiin-biotiin-immunoperoksidaasi protokolliga (Vectastain ABC Elite Kit; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). 3,3'-diaminobensidiintetrahüdrokloriidi (DAB; Sigma, USA) reaktsiooni intensiivistati nikkel-ammooniumsulfaadiga. Sektsioonid paigaldati kroom-maarjas želatiiniga kaetud alusklaasidele, kuivatati ja kaeti katteklaasiga.
FosB/ΔFosB-immunoreaktiivsete tuumade ja CRH-, TH- ja DYN-positiivsete neuronite topeltmärgistamine immunohistokeemia
FosB / ΔFosB-TH topeltmärgistamiseks töödeldi iga ravirühma iga roti koelõike FosB / ΔFosB immunoreaktiivsuse suhtes, kasutades DAB nikli intensiivistamist, ja seejärel tuvastati TH, kasutades ainult DAB kromogeeni. FosB / ΔFosB immunovärvimine viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud. Pärast FosB/ΔFosB värvimist loputati sektsioone PBS-is, töödeldi 2% normaalse kitse seerumiga ja inkubeeriti seejärel üleöö küüliku polüklonaalse TH-vastase antikehaga (AB152, Chemicon, USA; 16000) toatemperatuuril. Järgiti samu ülalkirjeldatud immunohistokeemia protseduure. TH-antikeha-peroksidaasi kompleks töötati välja DAB-s. Sektsioonid paigaldati kroom-alumiiniumželatiiniga kaetud alusklaasidele ja kaeti katteklaas.
FosB/ΔFosB-CRH ja FosB/ΔFosB-pro-DYN topeltmärgistuse puhul oli protsess sama, mis eelnevalt FosB/ΔFosB-TH puhul kirjeldatud. DYN-i ekspresseerivate neuronite tuvastamiseks NAc-s rakendati antigeeni otsimise protseduuri, inkubeerides ajulõike tsitraatpuhvris (10 mM sidrunhape, 0.05% Tween 20, pH 6.0) temperatuuril 60 °C 20 minutit enne blokeerimisprotseduuri. Primaarse CRH-vastase küüliku antiseerumi pakkus lahkelt Wylie W. Vale (The Salk Institute, La Jolla, CA, USA) ja seda kasutati 1.500 lahjendust 72 tundi temperatuuril 4 °C. Pro-DYN primaarne antikeha osteti firmalt Neuromics (# GP10110, Neuromics, Edina, MN, USA) ja lahjendati 12000 (72 h, 4 °C).
Pildianalüüs
Pildid jäädvustati Leica mikroskoobi (DM 4000B; Leica) abil, mis oli ühendatud videokaameraga (DFC290, Leica). FosB/ΔFosB-positiivsete rakkude tuumad loendati arvuti abil pildianalüüsi süsteemi (QWIN, Leica) abil. NTS-A piirid2, BNST, CeA, NAc (shell) ja PVN parvotsellulaarne alajaotus ning registreeriti positiivsete profiilide arv. FosB / ΔFosB tuumaprofiilide arv huvipakkuvate rakurühmade piires loendati kahepoolselt iga roti neljas kuni viies osas ja keskmistati, et saada iga roti jaoks üks väärtus. Vaatlejate eelarvamuste vältimiseks kvantifitseeris pimestatud uurija kõik sektsioonid. Erinevate ajupiirkondade koguarvud on väljendatud keskmisena ± SEM.
TH-, CRH- ja DYN-positiivsete rakkude ning FosB/ΔFosB topeltvärvitud profiilide kvantifitseerimine
FosB / ΔFosB immunoreaktiivsuse positiivsed tuumad tuvastati sama ülalkirjeldatud tavapärase valgusmikroskoopia abil ja loendati 40-kordse suurendusega. FosB / ΔFosB-positiivsed CRH-, TH- või DYN-rakud tuvastati CRH-positiivse, TH-positiivse ja DYN-positiivse värvimise jaoks pruunide tsütosoolsete ladestustega rakkudena ja FosB / ΔFosB jaoks sinise / tumeda tuumaga. Võrdlusalana kasutamiseks kanti jäädvustatud kujutisele ruudukujuline väli (195 µm). Kahepoolselt täheldatud topeltmärgistatud neuronite arv loendati iga looma neljas kuni viies osas PVN-s, BNST ja CeA CRH neuronite jaoks, NTS TH neuronite jaoks ja NAc DYN neuronite puhul. Analüüsi kaasati ka ilma nähtava tuumata CRH-, TH- ja DYN-positiivsed rakud (FosB/ΔFosB-negatiivsed CRH-, TH- või DYN-rakud).
Radioimmunoanalüüs
Veri koguti jääga jahutatud tuubidesse, mis sisaldasid 5% EDTA-d ja seejärel tsentrifuugiti (500 g; 4 °C; 15 min). Plasma eraldati, jagati kaheks alikvoodiks ja säilitati temperatuuril –80 °C kuni kortikosterooni või ACTH määramiseni. Kortikosterooni ja ACTH plasmakontsentratsiooni kvantifitseeriti, kasutades rottide jaoks spetsiifilisi kortikosterooni ja ACTH antikehi ([125I]-CORT ja [125I]-ACTH RIA; MP Biomedicals, Orangeburg, NY, USA). Testi tundlikkus oli kortikosterooni puhul 7.7 ng/ml ja ACTH puhul 5.7 pg/ml.
Statistiline analüüs
Andmed on esitatud keskmisena ± SEM ja neid analüüsiti statistikapaketi GraphPad Prism (San Diego, CA, USA) abil. Andmeid analüüsiti kahesuunalise dispersioonanalüüsi (ANOVA) abil, kasutades sõltumatute muutujatena ravi (platseebo, morfiin) ja kirurgiat (võlts, ADX). Newman-Keuls post hoc testi kasutati üksikute rühmade võrdlemiseks. Erinevusi, mille väärtus oli <0.05, peeti oluliseks.
Tugiteave
Joonis S1
Adrenalektoomia (ADX) mõju plasma ACTH (A) ja kortikosterooni (B) kontsentratsioonile kontroll- ja morfiiniga ravitud loomadel. Kirurgiline ADX suurendas AKTH taset nii platseebo- kui ka morfiiniga ravitud rottidel, samas kui morfiiniga ravitud rottidel vähendas kortikosterooni kontsentratsiooni plasmas. Andmed näitavad plasma AKTH ja kortikosterooni taseme keskmist ± standardvea rottidel, keda oli eelnevalt ravitud platseebo või morfiiniga 10 päeva. ***p<0.001 versus valeplatseebo; ++p<0.01 + + +p<0.001 versus valemorfiin.
(TIF)
Tunnustused
Täname dr Márton Vajnat ja Anna Földest Semmelweisi ülikoolist (Budapest, Ungari) kortikosteroonigraanulite valmistamise eest.