PLoS One. 2013 Nov 25, 8 (11): e81245. doi: 10.1371 / journal.pone.0081245.
Nishijima T, Kawakami M, Kita I.
allikas
Käitumisfüsioloogia labor, Humanitaarteaduste magistrikool, Tokyo Metropolitan University, Tokyo, Jaapan.
Abstraktne
Kehaline treening parandab hipokampuse funktsiooni mitmeid aspekte. Kooskõlas arusaamaga, et neuronaalne aktiivsus on neuronaalsete funktsioonide edendamisel võtmetähtsusega, on varasem kirjandus järjekindlalt näidanud, et treeningu ägedad hajumised tekitavad neurokontrolli hippokampuses. Korduvad aktiveerivad stiimulid põhjustavad transkriptsioonifaktori ΔFosB akumulatsiooni, mis vahendab pikaajalist närvilisust..
Selles uuringus testisime hüpoteesi, et pikaajaline vabatahtlik rattajõud indutseerib ΔFosB ekspressiooni hipokampuses ja uuris kõiki võimalikke piirkonna-spetsiifilisi toimeid hipokampuse alamväljades piki dorso-ventralit. Isased C57BL / 6 hiired hoiti 4 nädalat jooksva rattaga või ilma. Pikaajaline ratta jooksmine suurendas märkimisväärselt FosB / ΔFosB immunoreaktiivsust kõigis mõõdetud hipokampuse piirkondades (st DG, CA1 ja CA3 nii dorsaalse kui ka ventraalse hipokampuse alamväljades). Tulemused kinnitasid, et ratta jooksmine kutsus esile FosB / ΔFosB immunoreaktiivsuse regioonispetsiifilist ekspressiooni ajukoores, mis viitab sellele, et FosB / ΔFosB ühtne kasv hippokampuses ei ole töötamise mittespetsiifiline tagajärg. Western bloti andmed näitasid, et suurenenud hipokampuse FosB / AFosB immunoreaktiivsus oli tingitud peamiselt suurenenud ΔFosB-st. Need tulemused viitavad sellele, et pikaajaline füüsiline koormus on potentne AFosB induktsiooni kogu hippokampuses, mis selgitab, miks harjutus võib parandada nii selja kui ka vatsakese hüpokampuse sõltuvaid funktsioone. Huvitaval kombel leidsime, et FosB / ΔFosB ekspressioon DG-is korreleerus positiivselt doubletsortiini-immunoreaktiivsete (st ebaküpsete) neuronite arvuga.
Kuigi mehhanismid, millega ΔFosB vahendab treeningu poolt indutseeritud neurogeneesi, on endiselt ebakindlad, viitavad need andmed sellele, et treeningu poolt indutseeritud neurogenees on vähemalt aktiivsusest sõltuv. Kokkuvõttes näitavad meie praegused tulemused, et ΔFosB on uus molekulaarne sihtmärk, mis on seotud treeningu poolt indutseeritud hipokampuse plastilisuse reguleerimisega.
Sissejuhatus
Harjutus annab närilistel hüpokampuse molekulaarsetele, struktuurilistele ja funktsionaalsetele aspektidele erinevaid eeliseid [1,2] millest mõned olid toetatud inimeste uuringutega [3,4]. Hippokampuse plastiilsuse harjutustest tingitud muutuste aluseks olevaid mehhanisme ei mõisteta siiski piisavalt. Varasem kirjandus on järjekindlalt näidanud, et harjutused tekitavad närilistel hippokampuse neuronaalse aktivatsiooni. Immunohistokeemilised uuringud, mis kasutavad c-Fos-i, mis on mööduva neuronaalse aktiveerimise marker, on näidanud, et nii sunnitud kui ka vabatahtlik suurenenud c-Fos-i ekspressioon närilise hirokampuse (DG), CA1 ja CA3 alamandmetes [5-7]. Lisaks on eelmine uuring, milles kasutati laser-Doppleri voolumõõtmist (LDF), näidanud, et kerge jooksurada suurendab piirkondlikku aju verevoolu (rCBF), mis on neuronaalse aktivatsiooni alternatiivne marker, rottide CA1i alamväljal.8]. Immunohistokeemilised uuringud võimaldavad pärast treeningu lõppu üksikasjalikud regioonispetsiifilised analüüsid, samas kui LDF võimaldab treeningu ajal lokaliseeritavas piirkonnas reaalajas jälgida rCBF-i. Hoolimata iga uuringu eelistest ja piirangutest näitasid need uuringud sarnaselt ka ägedaid harjutusi hippokampuse neuronaalsele aktiivsusele. Need tulemused viitavad mehhanismile, mille kohaselt pikaajaline regulaarne treening soodustab hipokampuse plastilisust, käivitades korduvalt neuronaalse aktiveerimise [9].
Transkriptsioonifaktorit ΔFosB, mis on täispika FosB kärbitud splaiss-isovorm, indutseerivad erinevat tüüpi korduvad stiimulid spetsiifilistes aju piirkondades, kus see järk-järgult akumuleerub selle ainulaadse stabiilsuse (nädala poolväärtusaja) tõttu [10-12]. Kasvav hulk tõendeid näitab, et ΔFosB suurenenud tase vahendab pikaajalise neuronaalse ja käitumusliku plastilisuse, mis on seotud konkreetsete stiimulitega [11,13]. Näiteks kuritarvitatavate ravimite, näiteks kokaiini ja morfiini, krooniline manustamine suurendab tavaliselt AFosB ekspressiooni tuumasõlmedes, mis on üks molekulaarsetest mehhanismidest nende ravimite suurenenud tundlikkuse suhtes. [11,14,15]. Ssarnaselt teiste tasu stiimulitega, kaasa arvatud kõrge rasvasisaldusega dieet ja seksuaalne kogemus [16,17], lvabatahtlik rattajooks suurendas ka FosB / ΔFosB immuunreaktiivsust rottide tuumas, mis viitab sellele, et vabatahtlik jooksmine on närilistele loomulik tasu [18,19]. Kuid meie teadmiste kohaselt ei ole üheski kirjanduses uuritud, kas korduv kokkupuude füüsilise koormusega põhjustab ΔFosB ekspressiooni hipokampuses. Kuna harjutus käivitab hippokampuses neuronaalse aktiveerimise, siis me oletame, et pikaajaline vabatahtlik rataste liikumine põhjustaks ka ΔFosB ekspressiooni hipokampuses. Kuigi täpsed mehhanismid, mille abil ΔFosB reguleerib hipokampuse plastilisust, on endiselt ebakindlad, on uuringud näidanud, et hiirtel, kellel puudub fosB geenil on nõrgestatud hipokampuse neurogenees ja suurenenud depressioonisarnane käitumine [20,21]. IOn teada, et treening tugevdab neurogeneesi ja omab antidepressantide omadusi [22-25]. If meie hüpotees on õige, ΔFosB oleks uus potentsiaalne molekulaarne sihtmärk, mis vahendab harjutuse poolt põhjustatud hipokampuse plastilisust.
Hippokampusel on anatoomiline ja funktsionaalne gradient piki selle piki- (dorso-ventral) telge [26]. Dorsaalne hippokampus mängib ruumilise õppimise ja mälu puhul võtmerolli [27,28], samas kui ventraalne hippokampus on eelistatavalt seotud emotsionaalse käitumise reguleerimisega [29,30]. Lisaks on uuringud näidanud, et füsioloogilised stiimulid indutseerivad erinevaid c-Fos ekspressiooni mustrid hipokampuse dorsaalsetes ja ventraalsetes osades [31-33]. Kuna treening parandab nii dorsaalset [34-37] ja vatsakese hipokampuse sõltuvad funktsioonid [24,25,38] on oluline uurida, kas pikaajaline vabatahtlik töötamine põhjustab ΔFosB piirkonna spetsiifilist ekspressiooni hipokampuses.
Selle uuringu peamine hüpotees oli see, et pikaajaline vabatahtlik rataste liikumine indutseeriks AFosB ekspressiooni hiire hipokampuses. Seda hüpoteesi uuriti FosB / ΔFosB immunohistokeemiaga dorsaalses ja ventralises hipokampuse alamvaldkonnas, DG, CA1 ja CA3, pöörates erilist tähelepanu piirkonna spetsiifilise induktsiooni tuvastamisele. Tulemused kinnitati western blot-meetodil, mida kasutati ühendi isovormi tuvastamiseks fosB hüpokampuses indutseeritud geeniproduktid. Samuti uurisime regioonispetsiifilise FosB / ΔFosB induktsiooni koort, et välistada võimalust, et pikaajaline harjutus ei suurendanud aju FosB / ΔFosB immunoreaktiivsust. Lõpuks uuriti FosB / AFosB ekspressiooni ja neurogeneesi vahelist korrelatiivset seost esimese sammuna harjutuse poolt indutseeritud FosB induktsiooni funktsionaalsete tagajärgede otsimisel hipokampuse plastilisuse reguleerimisel.
Materjalid ja meetodid
1: Loomad ja eetika avaldus
Kakskümmend isast C57BL / 6 hiirt (8 nädala vanused) osteti kaubanduslikust kasvatajast (SLC, Shizuoka, Jaapan). Kümme hiirt kasutati katse 1 jaoks ja teine kümme katse 2 jaoks. Hiired hoiti kontrollitud temperatuuritingimustes (22-24 ° C) ja valguses (12 / 12-h valguse / pimeduse tsükkel, valgustus 0500is) ja neile pakuti toitu ja vett ad libitum. Kõik katsemenetlused kiitis heaks Tokyo Metropolitan University loomkatsete eetikakomitee.
Igas katses määrati hiirtele saabumisel juhuslikult kas kontrollrühm (kontroll, n = 5) või jooksev rühm (Runner, n = 5). Esimese nädala jooksul paigutati kõik hiired esialgsetesse aklimatiseerimistesse standardsetes plastkastides rühmades (5 hiired / puur). Seejärel viidi Runner hiired üle rattaga, mis oli varustatud jooksva rattaga (ENV-046, Med Associate Inc., Georgia, VT, USA). Kuna on teada, et sotsiaalne isolatsioon pärsib hipokampuses treeningut põhjustatud neurogeneesi [39], Paigutati Runner hiired rühmana (5 hiired / puur) täiendavate 4 nädalate jooksul. Ratta pöörete arv registreeriti igal hommikul ja kehakaalu (g) mõõdeti iga nädal.
2: katse 1. FosB / AFosB ekspressiooni ja hipokampuse neurogeneesi immunohistokeemiline uurimine
2.1: perfusioon ja kudede töötlemine
Hommikul (0900 – 1100) pärast jooksva perioodi viimast päeva anesteseeriti hiired pentobarbitaalnaatriumiga ja perfuseeriti transkardiaalselt külma soolalahusega. Aju eemaldati kiiresti ja fikseeriti 4% paraformaldehüüdis 0.1 M fosfaatpuhverdatud soolalahuses (PBS, pH 7.4) üle öö. Seejärel aju külmutati 30% sahharoosiga PBS-is ja külmutati kuni edasise töötlemiseni. Poolkera koronaalsed ajuosad (40 μm) saadi külmutava mikrotomi abil ja koguti PBS-sse 0.01% naatriumasiidiga.
2.2: Immunohistokeemia
FosB / AFosB immunovärvimiseks valiti juhuslikult üks-kuus seeria sektsioone. Doublekortiini (DCX) märgistamiseks kasutati külgnevat seeriat, mis on neurogeneesi hindamiseks valideeritud ebaküpsete markerite marker [40,41]. Pärast endogeense peroksidaasi aktiivsuse kustutamist 1% H-ga2O2 PBS-is inkubeeriti vabalt ujuvaid sektsioone 10 h jaoks PBS-is 2-i normaalset hobuseseerumit sisaldava blokeeriva lahusega. Pärast loputamist PBS-s inkubeeriti sektsioone küüliku polüklonaalse pan-FosB antikehaga (1: 1000, sc-48, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), mis oli lahjendatud PBS-iga, kasutades 0.5% Triton X-100 ja 0.5% BSA (PBST) -BSA) 24 h juures 4 ° C juures. Teist sektsioonide seeriat inkubeeriti kitse polüklonaalse DCX-vastase antikehaga (1: 500, sc-8066, Santa Cruz) PBST-BSA-s 48 h juures 4 ° C juures. Jaotisi inkubeeriti täiendavalt sobiva biotinüülitud sekundaarse antikehaga (anti-küüliku IgG, 1: 1000, AP182B; kitse IgG, 1: 1000, AP180B, mõlemad antikehad EMD Millipore'st, Billerica, MA, USA) PBST-BSA-s 2 h toatemperatuuril. Seejärel töödeldi sektsioone avidiin-biotiin-peroksidaasi kompleksiga (Vectastain ABC peroksidaasi komplekt, Vector Laboratories Inc, Burlingame, CA, USA) 90 min jaoks, järgides tootja juhiseid. Lõpuks visualiseeriti antigeenid 0.02% 3,3-diaminobensidiiniga (DAB) 0.1 M Tris-HCl (pH 7.6), mis sisaldas 0.01% H2O2. FosB / AFosB immunovärvimise korral intensiivistati reaktsiooni nikkelammooniumsulfaadiga. DCX värvimise jaoks värviti raku tuumad Nissl värvimisega. Sektsioonid paigaldati želatiiniga kaetud slaididele ja katted olid paigutatud.
2.3: FosB / ΔFosB immunoreaktiivsuse kvantifitseerimine, kasutades kujutise läviväärtust
Selles uuringus kasutatud pan-FosB antikeha tõstatati FosB ja ΔFosB N-terminaalse piirkonna vahel jagatud sisemise piirkonna vastu, nii et see ei saa kahe isovormi vahel eristada. Seetõttu kirjeldati immunosoonitud struktuure kui FosB / AFosB immunoreaktiivseid (FosB / ΔFosB-ir) tuumasid. Objektiivse pime kvantifitseerimise jaoks kodeeriti slaidid enne analüüsi. Hiire aju atlas [42] kasutati järgmiste huvipakkuvate piirkondade (ROI) asukoha kindlaksmääramiseks: DG (3 lõigud) graanulrakkude kiht (GCL), CA1i (3 lõigud) püramiidrakkude kiht ja CA3 (2 – 3 sektsioonid) dorsal-hipokampuses (suletud -2.2 mm kaugusele bregmist); DG (2 lõigud), CA1 (2 sektsioonid) ja CA3 (2 sektsioonid) vatsakese hipokampuses (suletud -3.4 mm kaugusel bregmist) (Joonis 4, vasakul). Kaudsed sektsioonid sisaldavad nii hipokampuse dorsaalseid kui ka vatsakujulisi osi, kuid ventraalne osa oli suunatud. DG-s analüüsiti eraldi suprapüramidaalseid (DGsp) ja infrapüramidaalseid (DGip) labasid. Moorkarkass (2 – 3 sektsioonid, suletud -0.6 mm kaugusele bregmast), somatosensoorne tünnikoor (2 – 3 sektsioonid, suletud -0.6 mm kaugusele bregmist), visuaalne ajukoort (3 lõigud, suletud -2.9 mm kaugusele) analüüsiti ka kuuldekooret (3 lõigud, mis on suletud -2.9 mm kaugusele bregmast) ja lõhnaaeg (3 sektsioonid, mis on suletud + 4.3 mm kaugusele bregmist).Joonis 6, vasakul).
Iga ROI digitaalsed pildid (2070 × 1548 pikslid) võeti optilise mikroskoobi (BX-51, Olympus, Tokyo, Jaapan) abil, mis oli varustatud CCD-kaameraga (DP-73, Olympus) ja pilditarkvara (cellSens, Olympus). objektiivläätse suurendus oli 10 × hippokampuse ROI-de korral ja 4 × kortikaalsete ROI-de korral. Mõõduka kuni tugeva FosB / ΔFosB immunoreaktiivsuse tuvastamiseks (Joonis 1D – G), kasutades eelnevalt mitut sektsiooni, optimeeriti nii hipokampuse kui ka kortikaalsete ROI-de jaoks nii pildi omandamise seaded (valguse intensiivsus, väljalülitumise suurus, säriaeg ja valge tasakaal) kui ka iga RGB komponendi lävitasemed. Järgnev analüüs viidi läbi optimeeritud tingimustes (1). ROI-d valiti ebaregulaarse kujuga polügooniga (Joonis 1A, B) (2). Pilt oli läviväärtus, mis muutis FosB / ΔFosB-ir tuumad punaseks värviks (Joonis 1C-G) (3). Seejärel arvutati% ROI automaatselt järgmiselt:% ROI = (konverteeritud ala (punane) / kogu ROI piirkond) × 100.
Selle läviväärtuse analüüsi valideerimiseks valiti 20i piirkonnad juhuslikult erinevatest aju piirkondadest, millel on erinevad piirkonna suurused. Lisaks kujutise läviväärtuse kvantifitseerimisele arvati FosB / ΔFosB-ir tuumade arv valitud piirkondades käsitsi ja FosB / ΔFosB-ir tuumade tihedus saadi FosB / ΔFosB-ir tuumade arvu jagamisel mõõdetud pindala (mm2).
2.4: DCX-ir ebaküpsete neuronite kvantifitseerimine dentate gyrus'es
DCX-ir ebaküpsed neuronid Runner hiirte hiirtel olid rikkalikud ja kattuvad, mistõttu oli keeruline DCX-ir-soma diskreetse arvu optiliselt mikroskoobi abil arvutada. Kuid eelmises uuringus näitas Sholli analüüs morfoloogiliseks hindamiseks, et iga DCX-ir neuronil on keskmiselt üks dendriit, mõõdetuna soma 40 μm piires.43]. Seetõttu töötati välja järgmine algne analüüs, et võimaldada DCX-ir neuronite piirkonna-spetsiifilist kvantifitseerimist.
- (1) GCL-i kujutist projitseeriti arvutiekraanile, kasutades pilditarkvara ja 40 × objektiivi (2). Live-kujutisel tõmmati GCL-i keskel sirge segment (150 ± 0.1 μm) (Joonis 2) (3). Fookuskauguse muutmisel loendati, kui palju rida segment läbis DCX-ir dendriide (4). ROI (dorsal DGsp, dDGsp; dorsal DGip, dDGip; ventral DGsp, vDGsp; ventral DGip, vDGip) vastasid piirkondadele, kus analüüsiti FosB / AFosB immunoreaktiivsust (5). Igas ROI-s tõmmati 2-3 liinilõigud sektsiooni kohta ja ristumiste arv keskmistati 2 – 3-osade kaupa hiire kohta. Kuna GCL-i paksus on ligikaudu 60 – 80 μm, peaks ristumiste arv kajastama piiratud piirkonnas analüüsitud DCX-ir neuronite arvu.
DCX-ir ebaküpsete neuronite representatiivne kujutis ja joonesegment (150 ± 0.1 μm), mis on ette nähtud DCX-ir dendritidega ristumiste arvu arvutamiseks.
3. Eksperiment 2. FosB / ΔFosB isovormi identifitseerimine, mis on põhjustatud ratta liikumisest
3.1: perfusioon ja kudede töötlemine
Täiendavat hiirte kohort töödeldi nagu ülalpool katses 1. Pärast 4i nädalat kestnud interventsiooni nädalat perfundeeriti hiiri sügavalt anesteesias külma soolalahusega. Hippokampus lõigati kiiresti välja ja külmutati vedela lämmastikuga ning säilitati -80 ° C juures. Iga hiire hippokampi homogeniseeriti RIPA puhvris (150 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl pH 7.6, 1% NP-40, 1% naatriumdoksüoksüolaat, 0.1% SDS, # 8990, Thermo Scientific, IL, USA), mis sisaldasid proteaasi inhibiitorid (cOmplete Mini, Roche, Manheim, Saksamaa). Lüsaadid tsentrifuugiti 15 min juures 5000 rpm juures 4 ° C juures ja supernatandid koguti. Valgu kontsentratsioonid mõõdeti BCA Protein Assay komplektiga (#23227, Thermo Scientific, IL, USA).
3.2: Western blotting
Võrdsed valgu kogused (30 μg / sõidurada) olid elektroforeesitud 10% polüakrüülamiidi geelil, seejärel kantud PVDF membraanile (Immun-Blot, 0.2 μm, Bio-Rad, MD, USA). Mittespetsiifiline seondumine blokeeriti 1 h membraani eelinkubeerimisel TBST-s (0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.1% Tween-20), mis sisaldas 3% BSA-d. Membraani inkubeeriti ülalpool immunohistokeemias kasutatava pan-FosB antikehaga (1: 1000), lahustati TBST-s, mis sisaldas 3% BSA-d. Pärast TBST-ga pesemist inkubeeriti membraani HRP-konjugeeritud küüliku vastase IgG antikehaga (1: 5000 TBST-s, NA934, GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) toatemperatuuril 1 h. Pärast TBST-ga pesemist visualiseeriti valguribad inkubeerimise teel Enhanced Chemiluminescence'ga (Western Lightning Plus-ECL, PerkinElmer, MA, USA) ja pildistati Image Quant LAS 4000 mini abil (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK). Seejärel laaditi membraan uuesti glütseraldehüüd-3-fosfaatdehüdrogenaasi (GAPDH) antikehaga (#2275, 1: 5000 TBS-T-s, Trevigen, MD, USA). Valgu ribade optiline tihedus kvantifitseeriti kasutades Image-J ja normaliseeriti GAPDH tasemeni.
4: statistiline analüüs
Hiire kehakaalu muutusi analüüsiti kahesuunaliste korduvate mõõtmistega ANOVA (grupp × aeg). Rühmade vaheliste statistiliste erinevuste määramiseks kasutati paaritu t-testi (Control vs. Runner). Pearsoni korrelatsioonianalüüsi kasutati FosB / ΔFosB immunoreaktiivsuse analüüsi (käsitsi loendamine vs kujutise läviväärtus) valideerimiseks ja uurimaks seost FosB / ΔFosB ekspressiooni taseme ja DCX ristumiste arvu vahel peadirektoraadis. Andmed esitati kui keskmine ± SEM. Statistilise olulisuse künnis määrati P <0.05.
Tulemused
1: kehamass ja sõiduteekond katsetes 1 ja 2
Eksperimendid 1 ja 2 nii kontroll- kui ka jooksja hiirte kehakaalu muutused ühendatakse ja näidatakse Joonis 3. Kahesuunaline korduvmõõtmine ANOVA näitas olulist koostoimet (rühm × aeg, F(4, 72) = 13.6, P <0.001) ja rühma peamine mõju F(1, 18) = 6.07, P <0.05), mis näitab oluliselt madalamat kehakaalu Runner hiirtel. Jooksudistants puuri kohta on näidatud Tabel 1. Kuigi iga hiire täpne sõiduteekond oli ebakindel, kuna hiired paigutati kokku, kinnitas regulaarne vaatlus, et kõik hiired kasutasid sageli rattaid. Eksperimendi 2 jooksjad hiired jooksid kauem kui eksperimendis 1, kuid keskmine katse pikkus (m / päev / puur) oli igas katses järjepidev.
2: FosB / ΔFosB immunoreaktiivsuse kvantifitseerimise valideerimine, kasutades kujutise läviväärtust
FosB / ΔFosB-ir ala, mis saadi kujutise läviväärtusega, ja FosB / ΔFosB-ir tuumade tiheduse vahel, mis saadi käsitsi loendamisega (r = 0.941, P <00001, Joonis 4).
3: FosB / AFosB immunoreaktiivsus hipokampuses
FosB / ΔFosB immuunvärvimise representatiivsed kujutised dorsaalses ja vatsakujulises hipokampuse alamväljas näidati Joonis 5. Kõigis analüüsitud ROI-des on FosB / ΔFosB immunoreaktiivsus Runner hiirtel (Joonis 5paremal) oli kvalitatiivselt kõrgem kui kontrollhiirtel (Joonis 5, Keskus). Runner hiirtel näitas kvantitatiivne analüüs FosB / ΔFosB-ir piirkonna märkimisväärset suurenemist nii seljaosas (DGsp: P <0.01; DGip: P <0.01; CA1: P <0.05; CA3: P <0.05) ja ventraalse hipokampuse alaväljad (DGsp: P <0.01; DGip: P <0.05; CA1: P <0.05; CA3: P <0.05; Joonis 6).
4: FosB / AFosB immunoreaktiivsus ajukoores
FosB / ΔFosB immuunvärvimise representatiivsed kujutised kortikaalsetes ROI-des on näidatud Joonis 7. Kvantitatiivne analüüs näitas piirkonna sõltuvaid muutusi FosB / ΔFosB immunoreaktiivsuses pikaajalise jooksuga (Joonis 8). Runner hiirtel oli FosB / ΔFosB-ir ala motoorses ajukoores märgatavalt kõrgem (P <0.05) ja somatosensoorset tünnikoort (P <0.05), kuid mitte visuaalses ajukoores (P = 0.662) või lõhnaaeg (P = 0.523). Kuulmiskoores tõusis FosB / ΔFosB-ir piirkond Runner hiirtele (P =
5: Neurogenees
DCX immuunvärvi esindavad kujutised on näidatud Joonis 9. Dorsaalses hipokampuses on DCX immunoreaktiivsus Runner hiirtel (Joonis 9paremal) oli kvalitatiivselt kõrgem kui kontrollhiirtel (Joonis 9, vasakul). Võrreldes dorsaalse hipokampusega, oli DCX immunoreaktiivsus vatsakese hipokampuses nõrgem nii kontroll- kui ka runner-hiirtel. Runner hiirtel oli ristumiste arv dDGsp-s oluliselt suurem (P <0.01) ja dDGip (P <0.01; Joonis 10). Ventraalses hipokampuses kalduti Runner hiirtel ristumiste arv suurenema, kuid gruppide vahel ei esinenud olulisi erinevusi (vDGsp, P = 0.101; vDGip, P = 0.257; Joonis 10).
6: FosB / ΔFosB ekspressiooni ja neurogeneesi vaheline korrelatsioon
FosB / ΔFosB-ir ala ja DCX ristmike arvu vahel tehti korrelatsioonianalüüs.Joonis 11). Kuna iga andmekogum (nt dorsaalne DGsp hiirtel) koosneb ainult 5-paaridest, teostati analüüs kõigepealt kõigi 40-paaridega. Huvitaval kombel oli FosB / ΔFosB-ir ala ja DCX ristmike arvu vahel märkimisväärne korrelatsioon (r = 0.885, P <0.0001). Lisaks tuvastati oluline seos ka selja peadirektoraadi korral (r = 0.762, P <0.05) ja ventraalne peadirektoraat (r = 0.816, P <0.01) analüüsiti eraldi.
7: FosB / ΔFosB isovormi identifitseerimine, mida põhjustab pikaajaline töötamine
Lõpuks identifitseeritakse. \ T fosB Hipokampuses indutseeritud geeniproduktid vastuseks pikaajalisele toimimisele, hippokampi hiirte täiendavast kohest viidi läbi western blottinguga, kasutades sama pan-FosB antikeha. 35 – 37 kDa mitu riba, mis esindavad ΔFosB modifitseeritud isovorme [44], olid Runner versus Control hiirtel oluliselt suurenenud (Joonis 12, P <0.01). Teiselt poolt ei olnud 48 kDa FosB isovormi kummaski rühmas võimalik tuvastada. Teine riba, mis on nõrgalt nähtav üle 25 kDa, esindab tõenäoliselt Δ2ΔFosB isovormi (27 kDa). Seal oli veel kaks riba, üle 50 kDa ja 37 kDa, mis olid tõenäoliselt mittespetsiifilise seondumise tõttu. Kvantifitseerituna ei leitud nendes mitte-FosB ribades erinevusi rühmade vahel (andmeid ei näidata).
Arutelu
Kokkuvõttes on käesolevas uuringus esmalt läbi viidud immunohistokeemiline analüüs 1i uurimiseks) kas pikaajaline vabatahtlik rattajõud indutseerib FosB / ΔFosB ekspressiooni hipokampuses; ja 2), kas regioonispetsiifiline reaktsioon eksisteerib piki selle dorso-ventral-telge.
Nelja nädala pikkune vabatahtlik rattajooks põhjustas FosB / AFosB immunoreaktiivsuse olulise suurenemise kõigis analüüsitud hippokampuse piirkondades (st nii hipokampuse dorsaalsete kui ka ventraalsete osade DG, CA1 ja CA3 alamväljad). Me kinnitasime, et 35 – 37kDa ΔFosB isovorm oli peamine fosB geeniprodukt akumuleerub vastuseks pikaajalisele käitumisele. Need tulemused toetavad selgelt hüpoteesi, et pikaajaline regulaarne treening on tugev hõõrdumine ΔFosB induktsioonile kogu hipokampuses ja et selle induktsioon võib olla uus molekulaarne mehhanism, mille abil mõjutatakse mitmesuguseid dorsaalseid ja / või ventralisi hipokampuse sõltuvaid funktsioone.
1: FosB / ΔFosB immunoreaktiivsuse kvantifitseerimise valideerimine ja piirangud, kasutades kujutise läviväärtust
Selles uuringus võeti FosB / ΔFosB immunoreaktiivsuse kvantitatiivseks määramiseks kasutusele pildilävivõtumeetod, mida laialdaselt kasutatakse immunohistokeemilistes uuringutes sihtrakkude arvu määramiseks ja rakkude morfoloogia hindamiseks.15,45,46]. FosB / ΔFosB immunoreaktiivsuse tasemete vahel, mis on kvantifitseeritud kujutise läviväärtuse ja käsitsi loendamisega, ilmnes märkimisväärne korrelatsioon (Joonis 4). Kuna tihedus ja kattuvus takistas FosB / ΔFosB-ir tuumade arvu ülitihedatel aladel lugemist, viitab demonstreeritud seos pildi lävistamismeetodi täpsusele ainult siis, kui FosB / ΔFosB-ir alad moodustavad <~ 40% kogu ROI-st piirkonnas. Seetõttu on vaja hoolikalt tõlgendada FosB / ΔFosB-ir alade puhul, mis on> 40% kogu ROI pindalast.
Eelkõige runner hiirte peadirektoraadis (Joonis 4), FosB / ΔFosB ekspressiooni indutseeris suuresti ratta jooksmine ja enamik FosB / ΔFosB-ir tuumadest kattusid. Nendes piirkondades põhjustab FosB / ΔFosB ekspressiooni suurenenud indutseerimine ekspressiooni taseme suuremat alahindamist, sõltumata kasutatud kvantifitseerimismeetodist (kujutise läviväärtus või käsitsi loendamine). Vaatamata alahindamise riskile on oluline märkida, et käesolev uuring tõestas edukalt FosB / ΔFosB-ir piirkonna märkimisväärset suurenemist runner hiirte peadirektoraadis. See viitab sellele, et metoodilised piirangud ei kahjusta meie tulemusi. Selle asemel suurendab potentsiaalne alahinnang selle tuvastamise usaldusväärsust, et pikaajaline FosB / ΔFosB immunoreaktiivsuse suurenemine hipokampuses.
2: ühtne ΔFosB induktsioon hippokampuses pikema aja jooksul
Hippokampusel on anatoomilised ja funktsionaalsed gradientid piki selle pikitelge [26], nii et käesolevas uuringus analüüsiti eraldi FosB / AFosB immunoreaktiivsust hipokampuse dorsaalses ja vatsakujulises osas. Andmed näitasid, et pikaajaline FosB / ΔFosB ekspressiooni suurendamine kõikides mõõdetud hipokampuse ROI-des. Selline FosB / ΔFosB immunoreaktiivsuse ühtne indutseerimine võib olla mittespetsiifiliselt põhjustatud pikaajaliste jooksvate süsteemse metabolismi muutustest. Siiski on oluline märkida, et ajukoores oli FosB / ΔFosB immunoreaktiivsuse piirkonnaspetsiifiline suurenemine. Seda tulemust toetavad hiljutised leiud, mis näitavad, et terav rööbastee jooksurada suurendab piirkondlikku aju verevoolu hipokampuses, kuid mitte lõhna-pirnis [8]. Lisaks Rhodes et al. (2003) näitas, et 7i päevad, mil vabatahtlik ratas jooksis indutseeritud c-Fos-i ekspressiooni hippokampuse (CA2 ei mõõdetud) ja sensoorses ajukoores, kuid mitte visuaalses ajukoores [47]. Kokkuvõttes näitavad need uuringud, et FosB / ΔFosB ekspressiooni ühtne induktsioon hipokampuses ei ole pikaajalise käitumise mittespetsiifiline tagajärg. Huvitav, Hawley et al. hiljuti teatas, et krooniline ettearvamatu stress suurendab FosB / ΔFosB ekspressiooni seljaosas, kuid mitte vatsakesta, roti hipokampuse peadirektoraadis [48]. Edasise uurimise korral annavad FosB / ΔFosB indutseerimise erinevad mustrid, nagu need, mis on esile kutsutud treeningu või stressi tõttu, jätkuvat arusaamist stiimulist sõltuvatest mõjudest hipokampusele.
Selles uuringus kasutatav primaarne pan-FosB antikeha on teada, et ta tunneb ära kõik FosB valkude isovormid. Western blottinganalüüsi põhjal leiti, et ainsad isovormid, mis pärast pikaajalist töötamist hippokampuses kasvasid, olid ΔFosB (35-37 kDa) modifitseeritud isovormid, ainukesed stabiilsed isovormid Fos perekonna valkude seas [11]. See leid on kooskõlas varasema tööga, milles kasutati pan-Fose antikeha, et näidata, et 35 – 37 kDa ΔFosB on domineeriv Fos perekonna valk, mis on esile kutsutud kroonilise stressi tõttu [44]. Seega peegeldab siin pikemas perspektiivis esilekutsutud hippokampuse FosB / ΔFosB immunoreaktiivsuse suurenemine tõenäoliselt ΔFosB taset.
Vähem on teada piirkonna spetsiifilistest harjutuse mõjudest hipokampuse molekulaarsetest ja struktuurilistest aspektidest. Kuid arvukad käitumuslikud uuringud näitavad, et nii dorsaalsete kui ka ventraalsete hipokampuse funktsioonide puhul on suured võimalused treeningutega seotud paranemiseks. Harjutus on näidanud, et see parandab ruumilist õppimist ja mälu [34-38] ning ruumiline ja kontekstuaalne töötlemine sõltub peamiselt dorsaalsest hipokampusest [27,28]. Seevastu treening on teadaolevalt ka anksiolüütiliste ja antidepressantide omaduste [24,25,38] ja neid emotsionaalseid vastuseid reguleerib valdavalt ventraalne hippokampus [29,30]. Selles uuringus täheldatud ΔFosB ühtlane indutseerimine pikaajalise kulgemisega näitab, et kogu hippokampuses toimus mingisugune neuroplastiline muutus. See selgitab, miks harjutamine võib mõjutada nii selja kui ka vatsakese hüpokampuse sõltuvaid funktsioone.
3: treeningu poolt indutseeritud neurogeneesi regioonispetsiifiline analüüs
Samuti on üha enam tähelepanu pööratud neurogeneesi funktsionaalsele dissotsiatsioonile selja ja vatsakese hipokampuse vahel [49]. Selles uuringus, kasutades ära DCX-ir ebaküpsete neuronite morfoloogilisi omadusi [43], loendasime DCX-ir dendritide ja GCL-i keskel tõmmatud joonte ristumiste arvu. See mõõtmine ei andnud peadirektoraadis DCX-ir neuronite koguarvu, kuid võimaldas FosB / ΔFosB ekspressiooniandmetega korrelatsioonianalüüsi läbiviimiseks vajalikku piirkonnapõhist kvantifitseerimist (vt allpool). Pärast pikaajalist töötlemist suurenesid DCX-ir neuronite arv oluliselt selja, kuid mitte kõhupiirkonna peadirektoraadis. See viitab sellele, et treening võib stimuleerida neurogeneesi dorsaalses suunas rohkem kui peadirektoraadi keskosa. Varasemad uuringud on siiski teatanud vastuolulistest tulemustest, mille puhul ratta jooksmine suurendas neurogeneesi nii selja kui ka vatsakese peadirektoraadis [50,51]. Käesolevas uuringus kaldus DCX-ir-ristumiste arv vatsakese peadirektoris jooksvalt suurenema, kuigi väike valimi suurus (5-hiired rühma kohta) võis piirata võimet tuvastada statistiliselt olulist erinevust rühmade vahel. Seetõttu on tõenäoline, et enneaegne on välistada võimalus, et vabatahtlik rattajooks võib stimuleerida ventraalset hipokampuse neurogeneesi. Täiendavad üksikasjalikud uuringud on vajalikud, et mõista treeningu poolt indutseeritud neurogeneesi regiooni-spetsiifilisust seoses selle mitmeastmelise protsessiga (rakkude proliferatsioon, diferentseerumine, migratsioon ja ellujäämine).
4: treeningu poolt indutseeritud ΔFosB induktsiooni funktsionaalsed tagajärjed hipokampuse plastilisuse reguleerimiseks
Lõpuks uurisime hippokampuses treeningu poolt indutseeritud ΔFosB induktsiooni funktsionaalsete tagajärgede tuvastamise esimese sammuna FosB / ΔFosB immunoreaktiivsuse suhet DCX-iri ristumistega nii dorsaalses kui ka ventralises peadirektoraadis ning leiti märkimisväärne positiivne korrelatsioon need kaks muutujat. Kuigi täpsed mehhanismid, millega ΔFosB reguleerib treeningu poolt indutseeritud neurogeneesi, on endiselt ebakindlad, näitas hiljutine uuring, et fosB-null hiired, kellel puuduvad FosB, ΔFosB ja Δ2AFosB (kõik fosB esinesid basaalhippokampuse neurogeneesi puudujäägid, sealhulgas neuronaalsete eellasrakkude proliferatsiooni vähenemine, vastsündinute neuronite suurenenud ektoopiline migratsioon ja ebanormaalsed DG struktuurid [20]. Kuid neid muutusi ei täheldatud fosB(d / d) hiired, kellel puuduvad FosB, kuid mitte ΔFosB / Δ2AFosB. Huvitav, et fosB-null hiired, mõnede neurogeneesiga seotud geenide ekspressioon, kaasa arvatud Vgf (VGF närvi kasvufaktor indutseeritav) ja Gal (Galanini prepropeptiid) oli alla reguleeritud [20]. Kuna VGF ja GAL on sekretoorsed molekulid, on üks ettepanek, mis lubab tõdeda, et AFosB-d ekspresseerivad neuronid võivad reguleerida neurogeneesi autokriinse / parakriini aktiivsuse kaudu [20].
Lisaks tuleb märkida, et piirkond, kus ΔFosB indutseeritakse ruumilise kattumise tõttu piirkonnaga, kus neurogeenne aktiivsus on kõrge. See leid näitab, et treeningu poolt indutseeritud neurogenees on minimaalsest aktiivsusest sõltuv. Neuronaalne aktiveerimine on kesknärvisüsteemi funktsiooni säilitamise ja parandamise võti [9] mehhanismide kaudu, mis hõlmavad aju tuletatud neurotroofse teguri (BDNF) ekspressiooni ja vabanemist [52,53], seerumi insuliinisarnase kasvufaktori-1 (IGF-1) omastamine vere-aju barjääri kaudu [54,55], apoptoosi pärssimine [56] ja mitokondriaalse liikuvuse reguleerimine [57]. Seega näitab käesolev uuring, et pikaajaline harjutus vallandas korduva neuronaalse aktivatsiooni, mis ilmneb suurenenud AFosB ekspressioonis, mis aitab kaasa hüpokampuse plastilisuse suurendamisele, mis võib olla nende ülalkirjeldatud mitme mehhanismi kaudu.
Käesolevas uuringus hinnati ainult treeningu poolt põhjustatud neurogeneesi ja selle seost FosB / ΔFosB ekspressiooniga peadirektoraadis. FosB / AFosB immunoreaktiivsust indutseeriti ka CA1 ja CA3 alamväljades. Kuigi täiendavad uuringud on vajalikud, et saada paremini aru harjutuste poolt põhjustatud ΔFosB ekspressiooni funktsionaalsetest rollidest nendes alamväljades, pakub varasem kirjandus paljutõotavat võimalust. Guan et al. (2011) näitas, et tsükliin-sõltuva kinaasi 5 (Cdk5) spetsiifiline ablatsioon CA1i või CA3i püramiidi neuronites halvendas mälu konsolideerimist või taastumist [58]. Huvitav on see, et Cdk5 on ΔFosB [59] ja osaleb sünaptilise plastilisuse reguleerimises [60]. Seetõttu võib treeningu poolt indutseeritud AFosB ekspressioon olla seotud sünaptilise plastilisuse reguleerimisega Cdk5 aktiveerimise kaudu CA1 ja CA3 alamväljades.
Järeldus
Kuigi teadaolevalt kasutasid akuutsed harjutused hüpokampuses vahetu varajase geeniproteiini ekspressiooni, annab käesolev uuring esimesed tõendid selle kohta, et pikaajaline regulaarne treening indutseerib oluliselt FosB ekspressiooni kogu hipokampuses. Thon ühtne ΔFosB induktsioon toetab praegust arusaama, et harjutus on efektiivne mittefarmakoloogiline sekkumine, mis on võimeline parandama mitmeid hipokampuse funktsioone. Koos olulise korrelatsiooniga FosB / AFosB ekspressiooni ja neurogeneesi vahel on need andmed provokatiivsed ja näitavad vajadust täiendavate uuringute järele, mis määratlevad ΔFosB rolli harjutuse mõju vahendamisel hipokampuse funktsioonile, sealhulgas neurogeneesile.
Rahastamise aruanne
viited
;