allikas
Nathan Kline Instituut, Orangeburg, New York, 10962, USA. [meiliga kaitstud]
Abstraktne
Lapsed ja noorukid puutuvad üha enam kokku psühhostimulantidega, nii ebaseaduslikult kui ka tavaliste neuropsühhiaatriliste seisundite ravis, nagu tähelepanupuudulikkuse häire hüperaktiivsusega ja ilma. Hoolimata psühhomotoorsete stimulantide laialdasest kasutamisest nooremates vanuserühmades, on vähe teada kroonilise molekulaarse neuroadaptive vastuse kohta nendele ainetele ebaküpses ajus. Siin näitame, et pärast psühhostimulantide kroonilist manustamist kokaiin ja Amfetamiini, transkriptsioonifaktor DeltaFosB on kõrgenenud periadolescent hiired kuid mitte võõrutamise või täiskasvanu puhul hiired. Induktsioon DeltaFosB esineb ka eranditult periadolescent hiired pärast Amfetamiini manustamist. Need tulemused näitavad, et kriitilise molekuli nooruki ajus on ainulaadne plastsus, mis reguleerib psühhostimulantide toimet ja viitab sellele, et need neuroadaptive muutused võivad olla kaasatud vahendajaks tõhustatud sõltuvustendentsid noorukieas võrreldes täiskasvanuga.
Sissejuhatus
Psühhostimulaatoreid kasutatakse tavapäraste lastehaiguste, näiteks tähelepanupuudulikkuse hüperaktiivsuse häire raviks. Lisaks on noorukite seas stimulantide, sealhulgas amfetamiini ja kokaiini kuritarvitamine, vanus, mil on tõendeid täiskasvanutega seotud suurenenud sõltuvustendentside kohta (Estroff jt, 1989; Myers ja Anderson, 1991). Vaatamata andmetele, mis viitavad arengule reguleeritud käitumisele avalduvatele mõjudele, on vähe teada molekulide neuroadaptive vastustest ebaküpsetes ajus, mis esinevad nende ainete manustamise ajal. Kokaiin ja amfetamiin võivad dopamiini D stimuleerimise kaudu mõjutada pikaajalisi muutusi1retseptorid ja transkriptsioonifaktorite, kaasa arvatud ΔFosB, taseme tõus dorsaalses striatumis (st caudate putamen) ja ventral striatumis (st.Chen et al., 1997). ΔFosB taseme suurenemine, võib-olla valguproduktide stabiliseerimise kaudu, kestab mitu nädalat pärast kroonilist kokkupuudet kokaiiniga või amfetamiiniga ja seda reguleerib vähemalt osaliselt dopamiini signaaliülekande rada (Chen et al., 1997; Nestler jt, 2001).
Noorte loomade keskne dopamiinergiline süsteem on tavapärase arengu käigus kriitiliste molekulide muutuvate tasemete, sealhulgas Dopamiini D muutumise tõttu väga muutuv.1retseptor DARPP-32 (dopamiini ja cAMP reguleeritud fosfoproteiin; Mr 32 kDa) ja cAMP (Ehrlich et al., 1990;Teicher et al., 1993; Perrone-Capano jt, 1996; Tarazi et al., 1999;Andersen, 2002). Seetõttu võib selle perioodi jooksul eksponeerida psühhostimulante, mis suurendavad dopamiinergilist neurotransmissiooni, kvantitatiivselt ja / või kvalitatiivselt erinevaid molekulaarseid vastuseid, kaasa arvatud muutused AFosB ekspressioonis. Et testida hüpoteesi, et psühhostimulantide kroonilise ekspositsiooni ajal esineb vanusest sõltuvaid neuroadaptive vastuseid, analüüsiti järjestikustes katsetes kolme rühma hiiri: täiskasvanud (60 d vanad süstide alguses), periadoolne (33 d vana süstide alguses), ja võõrutamise järgselt (24 d vana süstimise alguses). See on esimene otsene võrdlemine molekulaarse neuroadaptive vastusega kroonilisele psühhostimulantide ekspositsioonile nendes kolmes vanuserühmas. Leidsime, et pärast identseid ravi paradigme näitavad periadolescent hiired paremat ΔFosB ülesreguleerimist vastuseks nii kokaiinile kui ka amfetamiinile.
MATERJALID JA MEETODID
Loomad ja ravimite manustamine. Isased CD-1 hiired (Charles River Laboratories, Kingston, NY) paigutati 12 hr valguse / pimeduse tsüklisse (6: 00 AM kuni 6: 00 PM) koos ad libitumjuurdepääs toidule ja veele. Loomadel lasti enne süstimiste alustamist loomaruumi mahutada vähemalt 10 d. Loomi käsitlesid kaks uurijat, kes viisid kõik süstid samasse ruumi, kus loomad olid paigutatud. Kõik loomad võõrutati 21 d vanuses. Süstid algasid 24-i (võõrutamise järgselt), 33-i (periadolescent) või 60-i (täiskasvanu) korral. 20: 5 ja 4 vahelises 00-i vahel manustati loomadele 5 mg / kg kokaiini (Sigma, St. Louis, MO), 00 mg / kg amfetamiini (Sigma) või samaväärset soolalahust intraperitoneaalselt. Loomad surmati pärast lühikest kokkupuudet CO-ga2 10is: 00 AM pärast viimast süstimist. Ajusid eemaldati otsekohe koljust ja caudate putamen ja tuumad accumbens lõigati kiiresti jääle. Kõik dissektsioonid viidi läbi koronaalsete aju viiludega ühe uurija poolt ja valguekstraktid valmistati värskest koest ilma külmutamata. Kõik loomade protseduurid kiideti heaks loomade hooldamise ja kasutamise komitees ning need olid kooskõlas riiklike tervishoiuinstituutidega Laborite loomade hooldamise ja kasutamise juhend.
Western blot analüüs. Western blot analüüside jaoks laaditi igast proovist 40% SDS-polüakrüülamiidgeeli igasse riba pärast valgu kontsentratsioonide mõõtmist BCA testiga (Pierce, 20 μg caudate putamen ja 10 μg tuuma accumbens'i jaoks). Rockford, IL). Võrdse valgu koormust kontrolliti ka kogu valgu visualiseerimisega Ponceau Red'i poolt pärast ülekandmist nitrotselluloosile ja / või anti-aktiini antikehaga (1: 500; Sigma). Fos-seotud antigeeni (FRA) antiseerumit, mis tunneb ära FosB isovorme, pakkusid heldelt Dr. M. Iadarola (riiklik tervishoiuinstituut, Bethesda, MD) ja kasutati 1i kontsentratsioonis: 4000. Varasemad uuringud (Chen et al., 1997; Hiroi jt, 1997), sealhulgas FRA antiseerumi preadsorptsioon M-peptiidi immunogeeniga, näitas selle antiseerumi spetsiifilisust. DNPX-32 5a monoklonaalset antikeha, mida kasutati 1: 10,000-is, pakkusid drs. Hugh Hemmings ja Paul Greengard (Rockefelleri ülikool, New York, NY). Dopamiini transporteri (DAT) antikeha oli alates Chemicon (Temecula, CA). Blotid reageerisid NEN-DuPont (Boston, MA) kemoluminestsentssüsteemiga ja eksponeeriti filmiga. ΔFosB immunoreaktiivsuse densitomeetrilised väärtused saadi kasutades ScanAnalysis for Apple (Biosoft, Ferguson, MO). Statistiline olulisus määrati ühesuunalise ANOVA abil, millele järgnes post hoc Tukey mitmekordne võrdlustest või paaristamata kahe sabaga õpilase test t katse, nagu on näidatud joonistel. Ravimikäsitluskatsete puhul viidi iga vanuserühma analüüs läbi eraldi blotiga ja seetõttu määrati iga soolalahus suvaliselt 100% väärtuseks vanuserühmade võrdlemiseks. Ontogeensete uuringute jaoks analüüsiti kõigi vanuserühmade proove koos ühe blotiga.
TULEMUSED
ΔFosB indutseerimine pärast kokaiini ja amfetamiini esinemist ainult periadolescent hiirte tuumas.
ΔFosB ekspressiooni mõõdeti võõrutusjärgse, periadoolse ja täiskasvanud hiirte tuumas accumbensis ja caudate putamenis pärast amfetamiini või kokaiini manustamist. Tuumad accumbens on aju piirkond, mis arvatakse olevat kõige olulisem psühhostimulantide rahuldava mõju vahendamisel. AFosB immunoreaktiivsus (7 kDa) indutseeriti selektiivselt periadoolsete loomade tuumaklundides pärast amfetamiini kroonilist manustamist (joonis fig. 1 A) või kokaiin (joon. 1 B). Vastupidiselt sellele ei olnud ΔFosB (35 kDa) tasemed võõrutusjärgsete või täiskasvanud loomade tuumaklundides oluliselt muutunud (joonis fig.1 A,B). Caudate putamenis suurenesid AFosB tasemed (35 kDa) ka pärast kroonilist amfetamiini manustamist ainult periadoolsetel loomadel (joonis fig.2 A). Kõigil kolmel vanuserühmas täheldati pärast kroonilise kokaiini manustamist udifaadi (35 kDa) ekspressiooni märkimisväärset suurenemist caudate putamenis.2 B). Induktsiooni suurus oli siiski suurim periadoolsetel loomadel, eriti võrreldes võõrsilindritega (joonis fig. 2 B). Teised FRA ja Fos isovormid olid kõigis vanuserühmades muutmata (andmeid ei ole näidatud).
ΔFosB immunoreaktiivsus tuuma accumbensis pärast kroonilist psühhostimulantide manustamist. CD-1 hiirtele süstiti üks kord päevas füsioloogilise lahuse, amfetamiini või kokaiiniga 7 d jaoks, mis algas päeval 24 (P24; võõrutamise järel), päev 33 (P33; periadolescent) või päeval 60 (Täiskasvanud). Pärast kroonilist amfetamiini näidatakse AFosB (35 kDa) immunoreaktiivsuse taset tuuma accumbensis.A) või kokaiin (B) manustamist. Tüüpilised soolalahuse immunoblotid (S), amfetamiin- (A) ja kokaiin (C) võõrutamise järel (P24), periadolescent (P33) ja täiskasvanud hiiri on näidatud ülemine paneel. Alumine paneel näidata keskmist ± SEM protsenti basaal ΔFosB ekspressioonist. n iga rühma väärtused on näidatud baarid. AFosB märkimisväärset suurenemist leiti ainult periadolescent hiirte tuumas. *p <0.05; **p <0.01 (õpilase oma t test; soolalahus vs ravim).
AFosB immunoreaktiivsus caudate putamenis pärast kroonilist psühhostimulantide manustamist. CD-1 hiirtele süstiti üks kord päevas füsioloogilise lahuse, amfetamiini või kokaiiniga 7 d jaoks, mis algas päeval 24 (P24; võõrutamise järel), päev 33 (P33; periadolescent) või päeval 60 (Täiskasvanud). ΔFosB (35 kDa) immunoreaktiivsuse tasemed caudate putamenis on näidatud pärast kroonilist amfetamiini (A) või kokaiin (B) manustamist. Tüüpilised soolalahuse immunoblotid (S), amfetamiin- (A) ja kokaiin (C) süstitud periadolescent hiired (P33) on näidatudülemine paneel. Alumine paneel näidata keskmist ± SEM protsenti basaal ΔFosB ekspressioonist. n iga rühma väärtused on näidatud baarid. Märkimisväärset amfetamiini poolt indutseeritud AFosB immunoreaktiivsuse suurenemist leiti ainult periadolescent hiirte caudate putamenis (A). Krooniline kokaiini manustamine suurendas ΔFosB-d kõigis kolmes vanuserühmas (B). *p <0.05; **p <0.01 (õpilase oma t test; soolalahus vs ravim).
DAT ja DARPP-32 tasemed ei muutu pärast kroonilist kokaiini või amfetamiini
Mitmed dopamiinergiliste ja / või dopaminotseptiivsete neuronite ekspresseeritud võtmemolekulid, sealhulgas DARPP-32, D1 dopamiiniretseptor ja DAT, aitavad kaasa ägedatele ja kroonilistele vastustele psühhostimulantidele (\ tMoratalla et al., 1996; Fienberg et al., 1998; Sora jt, 1998; Gainetdinov et al., 2001). DARPP-32, D andmed1 retseptori ja DAT null- ja DAT-null-hiirte vahel on nende taseme, dopamiinergilise aktiivsuse reguleerimise ja psühhostimulantide vastuste vahel keeruline seos. Tegelikult ei esine ΔFosB induktsiooni DARPP-32 null-hiirtel, kes saavad kroonilist kokaiini (Fienberg et al., 1998). Täiskasvanud hiirtel ei mõjuta 7 d kokkupuude 20 mg / kg kokaiiniga DARPP-32i kogusisaldust (Fienberg et al., 1998). DAT valgu reguleerimist ei ole eelnevalt teatatud psühhostimulantidele krooniliselt eksponeeritud hiirtel, kuigi teatavatel liikidel on teatatud muutustest radioligandi sidumisel dopamiini transporteriga (Letchworth jt, 2001). Siin mõõdeti DARPP-32i ja DAT valgu tasemeid, et teha kindlaks, kas nende valkude ekspressioon muutub pärast kroonilist psühhostimulantide manustamist hiirte igas vanuses. Meie tulemused näitavad, et pärast kokaiini või amfetamiini kroonilist manustamist üheski kolmes vanuserühmas ei esinenud DARPP-32 või DAT koguhulga olulisi muutusi kogu caudate putamenis või tuuma accumbensis. 1).
DARPP-32i ja DAT-i suhtelised densitomeetria väärtused amfetamiini ja kokaiiniga töödeldud P24, P33 ja täiskasvanud hiirtel võrreldes kontroll-soolalahustega, mis on meelevaldselt seatud 100% -ni
ΔFosB algtasemeid reguleeritakse arenguga
Uurisime ΔFosB ontogeensust, sest täiskasvanud hiirtel, kellel on striatumis geneetiliselt muundatud ΔFosB ekspressioon, on kõrgendatud käitumuslik vastus psühhostimulantidele (Kelz et al., 1999). Leidsime, et ΔFosB algtasemed olid noorematel loomadel oluliselt väiksemad kui täiskasvanutel nii caudate putamenis kui ka tuumakinnisuses (joonis fig.3 A). Dopamiini süsteemi funktsionaalsete markerite tasemed, sealhulgas DARPP-32 (Ehrlich et al., 1990), DAT (Perrone-Capano jt, 1996) ja dopamiini retseptorid (\ tTeicher et al., 1993; Tarazi et al., 1999) on ka arenguga reguleeritud. Varasemad aruanded CD-1 hiirte kohta näitasid, et striat DARPP-32 on postnataalsel päeval 28 (P28) (Ehrlich et al., 1990). Roti caudate putamen ja nucleus accumbens, D1P28-st kuni P40i (Teicher et al., 1993; Tarazi et al., 1999), kuid sarnaseid uuringuid ei ole hiirtel läbi viidud. Seevastu leidsime siin, et DAT valgu tasemed caudate putamenis ja tuuma accumbensides olid postnataalse päeva 24 ja täiskasvanueas püsivad (joonis fig. 3 B). Seega on suhtelised suhted D1 retseptorid, DAT, DARPP-32 ja ΔFosB erinevad vanuserühmade vahel, mis võib põhjustada erinevusi D1 retseptori aktiivsus, mis võib mõjutada ΔFosB induktsiooni astet.
ΔFosB ja DAT arengu väljendus. A, ΔFosB (35 – 37 kDa) immuunreaktiivsus naiivsete CD-1 hiirte caudate putamenis ja tuumaklundides vanuse funktsioonina. Tüüpilised immunoblotid on näidatud ülemine paneel.Alumine paneel näitavad kolme hiire rühma kohta ± SEM. *p <0.05, täiskasvanu versus P24; #p <0.05, täiskasvanu versus P36 (Tukey mitmekordne võrdlustest pärast ANOVA-d). B, DAT immunoreaktiivsuse densitomeetrilised väärtused caudate putamenis ja tuuma accumbensides naiivsete CD-1 hiirtega vanuse funktsioonina. DAT tasemed ei erinenud kolme vanuserühma vahel.
ARUTLUS
Psühhomotoorsete stimulantide käitumuslikud mõjud on sõltuvad vanusest. Sõltuvust tekitavad tendentsid on suurimad noorukieas, kui ebaseaduslike ainete kasutamine suureneb (Estroff jt, 1989; Myers ja Anderson, 1991). Tegelikult muutuvad nooremad lapsed psühhostimulantidega kokkupuutes sageli düspoorseteks, samas kui noorukitel ja täiskasvanutel on eufooria (Rapoport et al., 1980). Näriliste mudelite puhul näitavad mõned uuringud, et periadoolsetel loomadel on kõrgem algtaseme aktiivsus (Sõrm ja pidur, 1983) ja muutunud vastused psühhostimulantidele nooremate ja vanemate loomade suhtes. Seega näitavad nad vähem lokomotoorseid stimulatsioone ja uudsuse otsimist vastuseks ägeda väikese annuse manustamisele psühhostimulantide suhtes võõrutamise ja täiskasvanud loomade suhtes, kuid suurenenud hüperaktiivsus pärast suure annuse manustamist. Kroonilise manustamise korral on ülitundlikel rottidel tundlikuks muutumine kokaiini poolt põhjustatud liikumisega võrreldes täiskasvanutega, samas kui stereotüübi suhtes tundlikkus on madalam. Samuti on mikrodialüüsi andmed näidanud erinevusi periadoolsete ja täiskasvanud rottide vahel seoses amfetamiini poolt esilekutsutud dopamiini vabanemise sensibiliseerimisega (Laviola et al., 1995; Adriani et al., 1998; Adriani ja Laviola, 2000;Laviola et al., 2001). Siiski on olemas vastuolulised uuringud, mis puudutavad pikaajalist reaktiivsust kokaiini pärast metüülfenidaadi manustamist noorukitel (Brandon et al., 2001; Andersen et al., 2002). Need kaks viimast aruannet rõhutavad raskusi uuringute võrdlemisel, kui kasutatakse erinevaid eksperimentaalseid paradigme. Püüdlusi võrrelda nooremate loomadega käitumist käsitlevaid uuringuid segavad veelgi erinevad liigid ja tüved.
Hiir on muutumas üha olulisemaks loommudeliks psühhostimulantide kasutamise ja kuritarvitamise uurimisel ning see on esimene süstemaatiline analüüs molekulaarsete neuroadaptive vastuste kohta kolmel erineval vanuserühmas hiirtel või mõnel muul üksikul liigil. Varasemad uuringud, millest saime oma raviparadigmid, on näidanud ΔFosB suurenemist metsikut tüüpi täiskasvanud rottide isoleeritud dorsaalses ja ventralises striatumis pärast kroonilist kokaiini ja amfetamiini manustamist (Hope et al., 1994; Nye et al., 1995; Turgeon jt, 1997), kuid ainult metsikut tüüpi täiskasvanud hiirte kombineeritud dorsaalses ja ventralises striatumis või isoleeritud dorsaalses striatumis pärast kroonilist kokaiini (Fienberg et al., 1998; Zachariou et al., 2001).
Nüüd demonstreerime psühhostimulandi poolt indutseeritud ΔFosB ruumilist ja kvantitatiivset erinevust võõrutusjärgses, periadoolses ja täiskasvanud hiirtes. Suurenenud reaktsiooni jälgimist periadoolsetel loomadel võrreldes täiskasvanutega ja pärast võõrutamist tugevdab asjaolu, et reaktsioon on kokaiini- ja amfetamiiniga ravitud hiirtel sarnane. Psühhostimulandid kokaiin ja amfetamiin suurendavad nii sünaptilist dopamiini kui ka serotoniini ja norepinefriini, kuid erinevad mehhanismid. Kokaiin seondub plasmalemma transporteritega dopamiini, serotoniini ja noradrenaliini jaoks ning inhibeerib nende tagasihaarde presünaptilistesse terminalidesse. Seevastu soodustab amfetamiin nende saatjate vabanemist. AFosB selektiivne indutseerimine ainult periadoolse vanuserühma tuumas accumensis pärast stimulantide manustamise 7 d ja suhteliselt kõrgendatud AFosB indutseerimine caudate putamenis võib olla neurobioloogiline esitus või eelnevalt täheldatud suurenenud kalduvus psühhostimulantide kuritarvitamiseks selles vallas. vanuserühm (Estroff jt, 1989; Myers ja Anderson, 1991) ja muud geeniekspressiooni pikaajalised muutused, mis erinevad vanuserühmade lõikes (Andersen et al., 2002). Peale selle võivad need erinevused olla sisuliselt reguleeritud arengumuutustega võtmemolekulide tasemetes, kaasa arvatud ΔFosB ise. ΔFosB algtaseme erinevuste võimalikud tagajärjed vanuserühmade vahel on analoogsed soovitatud erinevustega rottide tüvede vahel (Haile jt, 2001). Tegelikult eeldame, et inbred hiirte puhul leitakse sarnaseid tüveerinevusi. Samuti on võimalik, et erineva vanusega hiired näitavad erinevates molekulaarsetes kohandustes aju piirkondades peale tuumaklundi. Neid hüpoteese testitakse täiendava analüüsi abil, mis kasutab periadolescent hiiri geneetiliselt muundatud võtmemolekulide taseme muutuste ja samaaegsete käitumuslike vaatluste abil.
Allmärkused
- Saanud Aprill 8 2002.
- Saadud läbivaatamine August 6, 2002.
- Heaks kiidetud August 8, 2002.
-
Seda tööd toetasid riiklikud tervishoiuinstituudid / riiklikud neuroloogiliste häirete ja insultide toetamise instituudi NS41871 (MEE ja EMU) ning riikliku narkootikumide kuritarvitamise toetamise instituudi P30-DA13429 (EMU).
-
Kirjavahetus peaks olema adresseeritud dr Michelle E. Ehrlichile, Thomas Jeffersoni ülikoolile, Curtis 310ile, 1025 Walnut Streetile, Philadelphiale, PA 19107ile. E-post: [meiliga kaitstud].
- Copyright © 2002 Neuroteaduste Selts