PMCID: PMC2820240
NIHMSID: NIHMS174679
چکیده
تغییرات ناشی از کوکائین در بیان ژن موجب تغییر در مورفولوژی و رفتار عضلانی می شود که ممکن است وابستگی کوکائین را تحت تأثیر قرار دهد. ما یک نقش اساسی برای دی دی اتیلسیون لیسین 3 هیستون (H9K3) و لیزین دی متیل ترانسفراز G9a در پلاستیک ساختاری و رفتار ناشی از کوکائین شناسایی کردیم. تجویز مکمل کاکائو در سطح nucleum accumbens باعث کاهش سطح هورمون H9K3 شد. Tکاهش آن در متیلاسیون هیستون، از طریق سرکوب G9a در این ناحیه مغزی، که توسط فاکتور رونویسی فاکتور ΔFosB ناشی از کوکائین تنظیم شده بود، میانجی گری شد. با استفاده از mutagenesis شرطی و انتقال ویروسی توسط ژن، ما دریافتیم که کاهش غلظت G9a باعث افزایش پلاستیک دندریتیک ستون فقرات هسته accumbens نورون و افزایش ترجیح کوکائین، در نتیجه ایجاد نقش مهمی برای متصل شدن هیستون در اقدامات دراز مدت کوکائین.
معرفی
قرار گرفتن در معرض کوکائین تکرار شده با تغییرات پایدار در بیان ژن و تغییر مورفولوژی نورون در هسته accumbens (NAc)، یکی از مولفه های اصلی مغز پاداش مغناطیسی (1-2). تغییرات کروماتین در تغییرات رونویسی غیرمعمول در این منطقه مغزی مهم است که ممکن است جنبه های اعتیاد کوکائین را تحت تأثیر قرار دهد (3-9) تنظیم کوکائین ساختار کروماتین در NAc بخشی از تغییرات ناشی از کوکائین بوسیله دستگاه های آنزیمی کروماتین است که منجر به تغییر در استیلاسیون و فسفوریلاسیون هیستون می شود (4, 7-9)؛ با این حال، نقش آنزیم های کنترل متيل شدن هيستون هنوز مورد بررسی قرار نگرفته است.
تجزیه و تحلیل پروموتور اخیر با استفاده از کروماتین با استفاده از کروماتین ايمن سازي همراه با میکرواراسيون (Chip-Chip)، الگوهای متفاوتی از متیلاسیون H3 لیزین 9 (H3K9) و 27 (H3K27) سرکوبگر در پروتئین های ژنی خاص در ناحیه زیر را تحت درمان با تکرار کوکائین (6) بنابراین ما تعداد زیادی از متیل ترانسفرازهای لیزین (KMTs) و demethylases (KDM ها) که برای کنترل H3K9 یا H3K27 متیلاسیون (شکل 1A). تنها دو آنزیم، G9a و GLP، تنظیم زمان ماندگاری رونویسی 24 را پس از تجویز مکرر مکمل کوکائین نشان دادند، در حالی که بیان هر دو ژن به طور قابل توجهی کاهش یافته بود. از آنجایی که G9a و GLP به طور خاص dimethylation از H3K9 (H3K9me2) کاتالیز می کنند، میزان پایین آمدن آنها توسط کوکائین با کاهش سطح جهانی H3K9me2 که در این نقطه زمان مشاهده می شود (شکل 1B) در مقابل، سطح متیلاسیون H3K27 هتروکروماتیک جهانی با قرار گرفتن در معرض مکرر کوکائین (شکل S1 در حمایت از مطالب آنلاین) با توجه به سطح بالایی از فعالیت کاتالیزوری هر دو در شرایط in vitro و در داخل بدن (10)، ما برای بررسی بیشتر اهمیت کارکرد سرکوب G9a بعد از قرار گرفتن در معرض مکرر کوکائین در NAc قرار گرفتیم. سطوح پروتئین G9a، مانند سطح mRNA آن، به طور قابل توجهی باعث کاهش 24 ساعت پس از تجویز مکرر کوکائین (شکل S2) اگر چه بیان MRNA G9a توسط 35٪ در NAc کاهش یافته است، تجزیه و تحلیل ایمونوهیستوشیمی تجزیه و تحلیل نسبت 15٪ کمتر در سطح پروتئین G9a را نشان داد، مطابق با کاهش 21٪ مشاهده شده در H3K9me2 پس از تجویز مکمل کاکائینشکل 1B) بیان ژن G9a mRNA در این ناحیه مغز توسط 20٪ پایین بود و پس از تجویز مکرر کوکائین (شکل S3).
برای تعیین اینکه آیا تغییرات در H3K9me2 euchromatic مربوط به تغییرات ژنوم در بیان ژن در NAc، ما برای تجزیه و تحلیل پروفایل های بیان شده ناشی از یک دوز چالش کوکائین در حیوانات با یا بدون سابقه قبلی قرار گرفتن در معرض کوکائین استفاده می شود (مشاهده مکمل لیست ژن ها در جداول S1-S3) حیوانات که کاکائین مکرر دریافت کرده اند به طور قابل توجهی افزایش بیان ژن 1 ساعت پس از یک چالش کوکائین در مقایسه با حیوانات حاد درمان شده (شکل 1C) این افزایش بیان ژن هنوز در پاسخ به یک چالش کوکائین پس از 1 هفته از خروج از کوکائین تکرار رخ داده است. مطابق با گزارش های قبلی، درصد کمی از ژن ها (~ 10٪) پاسخ های رونویسی غیر حساسیتی را پس از تجویز مکرر کوکائین نشان دادند (شکل 1C؛ دیدن جدول S1) (5) به طور مستقیم بررسی نقش غلظت G9a در بیان ژن افزایش یافته پس از کوکائین مکرر مشاهده شد، موش ها تزریق داخل in vitro ویروس هرپس سیمپلکس (HSV) بیان GFP یا G9a و درمان با سالین یا تکرار کوکائین برای تعیین اینکه آیا بیش از حد بیان G9a برای جلوگیری از افزایش بیان ژن مکرر کوکائین کافی بود. از مجموعه ای از ژن های انتخاب شده به طور تصادفی انتخاب شده توسط 12 که سطوح بالایی بیان بیان شده را زیر کوکائین تکراری نشان می دهند، مشاهده شد که G9a به طور قابل توجهی کاهش بیان 50٪ از این ژن هاجدول S4).
برای شناسایی رویدادهای رونویسی بالادستی که میان سرکوب بیان G9a ناشی از تکرار کوکائین متمرکز می شوند، ما نقش احتمالی برای ΔFosB، یک محصول اسپلیس بسیار پایدار ژن فوری اولیه را بررسی کردیم fosB. ΔFosB در NAc بعد از قرار گرفتن در معرض مکرر به کوکائین، جایی که با افزایش پاداش کوکائین (11) ΔFosB می تواند به عنوان یک فعالکننده رونویسی یا رپرسور بسته به نوع ژن هدف درگیر باشد (3, 5, 6, 12) با استفاده از NSE-TTA × tetOP-ΔFosB موش ها، که در آن بیان ΔFosB می تواند به صورت انتخابی در NAc و سینه پشتی از حیوانات بالغ (13) ما بررسی تاثیر بیان ΔFosB بر تنظیم کوکائین H3K9me2 و KMTs در NAc را مورد بررسی قرار دادیم. ΔFosB بیش از حد بیان کافی بود برای کاهش سطح هر دو H3K9me2 (شکل 1D) و بیان G9a (شکل 1E)، در نتیجه اثرات کوکائین مکرر را تقلید می کند. در مقابل، ΔFosB بیان ژن GLP را در این منطقه مغز کاهش نیافت و بر روی SUV39H1 و EZH2 تاثیری نداشت، و آنزیم های ترمیم کننده اصلی برای H3K9 و H3K27 (شکل S4) برای تایید این داده ها با استفاده از یک سیستم فوق فرانسوی ΔFosB، موش های بالغ وحشی دریافت تزریق دو جانبه در داخل NAc از ویروس های وابسته به آدنو (AAV) بیان GFP یا ΔFosB. بیان بیش از حد ویروس توسط ΔFosB باعث کاهش سطح بیان G9a در منطقه مغز (شکل 1E).
چنین تنظیمات مشخص و ویژه ای از G9a ما را به بررسی اینکه آیا تغییر بیان G9a به طور خاص در نورون NAc تنظیم پاسخ های رفتاری به کوکائین را موجب شده است. موشهای Wildtype تزریق داخل ویروس HSV را با استفاده از GFP یا G9a بیان کردند و سپس با استفاده از یک پارادایم ترجیحی مکان محرمانه کوکائین، که به طور غیرمستقیم از پاداش دارو استفاده می شود، مورد بررسی قرار گرفت. بیش از حد بیان ویروسی G9a در نورون NAc، پس از آزمایش رفتاری (شکل 2A) بیش از حد بیان G9a به طور قابل توجهی کاهش ترجیح کوکائین در مقایسه با حیوانات بیش از حد GFP (شکل 2B) و افزایش سطح H3K9me2 در NAc (شکل 2C) بیش از حد بیان جهش جهش کاتالیستی G9a (G9aH1093K) (14) بر ترجیح کوکائین تاثیر نمی گذارد (شکل 2B) و هیچ تاثیری در سطح H3K9me2 در این منطقه مغزی (شکل 2C).
برای مطالعه بیشتر نقش G9a در اثرات رفتاری کوکائین، و به طور خاص برای تقلید از سرکوب مکرر کوکائین از بیان G9a در NAc، بالغ G9afl / fl موش (14) دریافت تزریق داخل NAc از بردارهای AAV بیان کریک recombinase یا GFP به عنوان یک کنترل. AAV-Cre نابودی G9a در NAc، که ایمونوهیستوشیمی تایید شد (شکل S5)، اثرات کوکائین را به طور قابل توجهی در آزمایش های آماده سازی قرار داد و کاهش سطح H3K9me2 در NAcشکل 2D، E) بازدارنده دارویی تجاری G9a و GLP، BIX01294 (15-16) برای بررسی اینکه آیا مهار آنزیم به طور مشابه پاسخ های رفتاری به کوکائین را نیز تحت تاثیر قرار می دهد. در واقع، مهار فارماکولوژیک G9a و GLP به طور قابل توجهی افزایش ترجیح کوکائین و کاهش H3K9me2 در NAc (شکل 2F، G).
تجویز تکراری کوکائین تراکم ستون های دندریتیک را بر روی نورونهای کروی متوسط NAc (17)، یک روند مرتبط با تغییرات عملکردی در سیناپس گلوتاماترگیک هیجان انگیز بر روی این نورون ها (18-19) و پاسخ های رفتاری حساس به دارو (17, 20). به این ترتیب ما فرض کردیم که کاهش غلظت فعالیت G9a در NAc توسط کوکائین مکرر می تواند توانایی کوکائین را برای تنظیم چگالی ستون فقرات دندریتیک نورون NAc را مد نظر قرار دهد. با استفاده از ايمن سازي كروماتين (ChIP) با يك آنتي بادي anti-G9a، چند هدف از اهداف ژن G9a را در NAc شناسايي كرديم كه هركدام از آنها قبلا در پلاستيكي دندريتيك ناشي از کوكائين (شکل 3A) (20-26) ما دریافتیم که مصرف مداوم کوکائین به طور قابل توجهی کاهش G9a اتصال و همچنین سطح H3K9me2، در این پروموتر ژن (شکل 3B) در مقابل، تزریق حاد کوکائین به سرعت G9a را به برخی از این پروتئین های ژنی استخراج کرد، که مطابق با افزایش بیان G9a در ساعت NAc 1 پس از دوز حاد کوکائین (شکل S6) گرچه اتصال G9a در پروموترهای ژنی خاص با تغییرات بیان آن مرتبط است، هنوز مشخص نیست که آیا چنین رویدادهایی با تغییرات جهانی سطح G9a در NAc و یا با تفاوت در استخدام G9a پس از حاد در مقابل تجویز مکرر کوکائین.
بر اساس تنظیم G9a از ژن های مرتبط با پلاستیک در NAc، ما مستقیما بررسی کردیم که آیا حفظ بیان G9a در این ناحیه مغز پس از درمان مکرر کوکائین کافی برای جلوگیری از تشکیل ستون فقرات دندریتیک ناشی از کوکائین است. با استفاده از پروتکل درمان کوکائین قبلا نشان داد که القاء ستون فقرات دندریتیک در NAc (20)، تراکم ستون فقرات در حیوانات تزریقی یا HSV-GFP یا HSV-G9a مورد بررسی قرار گرفت. با توافق با یافته های قبلی، افزایش قابل توجهی در تراکم ستون فقرات دندریتیک در NAc پس از درمان کوکائین مشاهده شد، اثر کاملا توسط G9a بیش از حد مسدود شده (شکل 3C) غلظت بیش از حد G9a به تنهایی برای کاهش چگالی ستون فقرات دندریتیک NAc در فقدان کوکائین کافی نبود. برای تکمیل این اطلاعات، G9afl / fl موش ها تزریق داخل HSV-Cre را دریافت کردند و تراکم ستون فقرات کم است و در مقایسه با حیوانات دریافت کننده HSV-GFP در غیاب کوکائین مقایسه شد. ناکامی بیان G9a به طور قابل توجهی افزایش چگالی ستون فقرات بر روی نورون های نازک متوسط NAc (شکل 3C).
با توجه به شواهدی که کاهش غلظت G9a در NAc پس از تکرار کوکائین بوسیله ΔFosB ارزیابی می شود، بعدا بررسی کردیم که آیا این عامل رونویسی نیز در تنظیم دهانه های دندریتی NAc نقش دارد. اگر چه ΔFosB قبلا به علت چنین پلاستیک دندریتیکی مرتبط نبوده است، چندین اهداف آن، از جمله زیرمجموعه های Cdk5 و NFκB، تا حدودی مرتبط بوده اند (20-23), و بیان پایدار ΔFosB در نورون NAc با افزایش تراکم ستون فقرات دندریتیک پس از درمان مکرر کوکائین (27) اولا ما دریافتیم که القاء ΔFosB در موش های بتانسژنیک در غیاب کوکائین، که بیانات G9a و H3K9me2 را پایین آورد (شکل 1D، E)، اتصال G9a را به ژن های مرتبط با پلاستیک های متعددی کاهش داد، که بسیاری از آنها نیز به عنوان اهداف مستقیم ΔFosB (شکل 3D) (3, 6). بعدا ما نشان داد که بیش از حد بیان ویروسی ΔFosB در NAc به طور قابل توجهی تراکم ستون فقرات دندریتیک را در شرایط پایه افزایش داد، مشابه آنچه که پس از تجویز مکمل کاکائین مشاهده شد (شکل 3E). برعکس، بیان بیش از حد در NAc ΔJunD، یک پروتئین جهش یافته غالب منفی که فعالیت αFosB را متوقف می کند، توانایی کوکائین مکرر را برای افزایش شکل دهانه رحم در NAc مسدود می کند (شکل 3C).
مشاهدات ما نشان می دهد که ΔFosB بیان G9a را در NAc تنظیم می کند و ΔFosB و G9a تعدادی از همان ژن های هدف را تنظیم می کنند و ما را به بررسی دیگر تعاملات بین ΔFosB و G9a. بعد از کوکائین حاد، وقتی سطح G9a افزایش می یابد، اتصال G9a به fosB ژن افزایش یافته است، در حالی که پس از تکرار کوکائین، هنگامی که بیان G9a سرکوب شد، اتصال G9a به fosB ژن کاهش یافت (شکل 3A) چنین کاهش G9a اتصال پس از کوکائین مکرر برای مشاهده نشد c-fos جایی که اتصال G9a با کوکائین مکرر (شکل S7) این سازگار با این واقعیت است که، بر خلاف fosB, C-fos به تحت تاثير قرار گرفتن در معرض روانشناسی مزمن (5) بیش از حد بیان ΔFosB در موش های بوت استرژن به اندازه کافی برای اتصال G9a به کافی بود فوب ژن (شکل 3D) علاوه بر این، بیان بیش از حد G9a برای کاهش بیان افزایش ΔFosB پس از تجویز مکمل کاکائین (جدول S4). این داده ها نشان دهنده یک حلقه اتخاذ تصادفی است که G9a در ابتدا القاء ΔFosB را با تجویز حاد کوکائین محدود می کند. با این حال، به عنوان ΔFosB با قرار گرفتن در معرض مواد مکرر تجمع می یابد، G9a را سرکوب می کند و به این ترتیب، القاء بعدی خود را تقویت می کند.
در نتیجه، ما نشان داده ایم که متیلاسیون لیسین هیستون در NAc به طور انتقادی در تنظیم علامت ژن نورون در واکنش به کوکائین دخیل است. سرکوب G9a و H3K9me2 پس از تجویز مکمل تکراری کوکائین، ترجیح کوکائین را، به طور جزئی، از طریق فعال سازی رونویسی ژن های متعدد شناخته شده برای تنظیم شکل های غیر ارادی پلاستیک دندریتیک، ترویج می دهد. به دست آوردن درک بهتر از ژن هایی که از طریق چنین مکانیزمی تنظیم می شود، دانش ما را در زمینه پایه پیچیده بیولوژیکی اعتیاد به مواد مخدر بهبود می بخشد و می تواند در ایجاد درمان های موثر تر اختلالات اعتیادآور کمک کند.
مواد و روش ها
حیوانات و درمان
به غیر از مواردی که ذکر شد، موش ها در هر قفس در یک کلنی با چرخه نور / تاریکی ساعت 12 (چراغ از 7: 00 AM به 7: 00 PM) در دمای ثابت (23 ° C) ad libitum دسترسی به آب و غذا. تمام پروتکل های حیوانی توسط IACUC در هر دو مرکز پزشکی UT Southwestern و مدرسه پزشکی کوه سینا تایید شده است.
برای آزمایش های کوکائین [immunohistochemitry، western blotting، PCR کمی (qPCR)، تجزیه و تحلیل میکروارگانیسم و کروماتین ایزوپروپارتیشن (ChIP)]، موش های C8BL / 10J مردانه 57-6 استفاده شد. حیوانات تزریق روزانه یا «سالین» (درمان 7 saline، ip)، کوکائین «حاد» (درمان 6 saline + یک درمان 20 mg / kg کوکائین-HCl، ip) یا کوکائین مکرر (درمان 7 20 mg / kg) کوکائین-HCl، ip). موش ها در هر ساعت 1 یا ساعت 24 پس از درمان نهایی قربانی شدند. برای مطالعات میکروارگانیسم، حیوانات به صورت روزانه به صورت سالین (درمان 15 saline، ip)، کوکائین "حاد" (درمان 14 سالین + 1 درمان 20 mg / kg کوکائین-HCl، ip)، کوکائین "تکرار + حاد" درمان 7 سالین + درمان 8 20 mg / kg کوکائین-HCl، ip) یا کوکائین تکرار کناره گیری + حاد "(درمان 7 20 mg / kg کاکائوین-HCl + 7 درمان سالین + 1 چالش درمان 20 mg / kg کوکائین HCl، Ip) و پس از درمان نهایی، 1 قربانی شد. در آزمایش های رفتاری، موش ها به صورت جداگانه پس از جراحی قرار گرفتند و با 10 mg / kg کوکائین-HCl، ip تحت عنوان شرح داده شد. برای تجزیه و تحلیل دندریتیک ستون فقرات و ردیابی میکروارگانی پس از عفونت HSV-GFP و HSV-G9a-GFP، موش ها با "سالین" (درمان 5 saline، ip) و یا "مکمل تکراری کوکائین" (درمان 5 20 mg / kg کوکائین-HCl، ip ) در طی دوره های 3، به این دلیل که قبلا نشان داده شده است پروتکل تزریق برای افزایش تراکم ستون فقرات بر روی هسته accumbens (NAc) نورون در مدت زمان بیان ویروس هرپس سیمپلکس (HSV) بیان (مکمل S1 تکمیلی) موشهای مورد استفاده برای تجزیه و تحلیل ستون فقرات دندریتیک 4 ساعت پس از آخرین درمان قربانی شدند.
برای تحریک حذف موضعی متن G9a که محدود به نورون NAc است، از موشهای جهش یافته برای یک آلل G9a floxed استفاده کردیم که در جاهای دیگر شرح داده شده است (S2) نوترکیب القا شده توسط Cre تولید اکسون 22 به 25 خارج از فریم splaising منجر به تجزیه بی معنی از میان رونویسی جهش یافته است. ما از موشهای Floxed G9a استفاده کردیم که به طور کامل به موشهای C57BL / 6J کشیده شدند. موش ها از طریق استرپتوكسیكی به NAc با ویروس های Aeno (AAV) (serotype 2) تزریق می شوند كه GFP یا Cre-GFP را بین سن 7 و 10 تجویز می كنند. برای بررسی کارآیی نوکلئوتید متصل به کروم از آنالیز ایمونوهیستوشیمی استفاده شده است (نگاه کنید به شکل اضافی S5) ما از حیوانات تزریقی AAV به مدت 21 پس از عمل جراحی استفاده کردیم زیرا نوترکیب در موش های فلکس G9a پایدار و حداکثر در این نقطه زمان بود، مطابق با گزارش های منتشر شدهS3-S4) آزمایش G9a و ΔJunD بیش از حد بیان شده به طور مشابه با استفاده از بردارهای ویروس HSV بیان GFP، G9a-GFP نوع وحشی، G9aH1093K-GFP مرطوب کاتالیستی یا ΔJunD-GFP (نگاه کنید به S2 برای جزئیات در مورد توسعه ساختارهای G9a). از موش های بیش از حد HSV استفاده می شود از 3 روز پس از عمل جراحی از آنجا که بیش از حد بیان حداکثر در این نقطه زمان است، که از طریق ایمونوهیستوشیمی مشاهده شده است. با توجه به ماهیت گذرا بیان HSV و طبیعت قابل ملاحظه ای باقی مانده از بیان AAV، ویروس های HSV در آزمایش هایی که نیاز به بیان سریع و کوتاه مدت ترانس ژن داشتند استفاده شد، در حالی که ویروس های AAV در آزمایش هایی که نیاز به دوره های طولانی بیان ترانسژن دارند استفاده شد. هر دو بردار در مطالعات قبلی گسترده نشان داده اند که فقط سلول های عصبی بدن را در داخل ناحیه تزریق شده مغز، بدون عفونت عصب های عصبی یا عصبی، آلوده می کنند.
برای آزمایش های رفتاری با استفاده از مهار کننده G9a / GLP دارویی، BIX01294 (25 ng / μl)، موش ها با دو پمپ مینی پمپ زیر جلدی و همچنین کانال های راهنمای دو طرفه به NAc وارد شدند. مینی پمپ ها 12 ساعت قبل از لانه گزینی شروع به تحویل مداوم (0.25 μl / hour) هر وسیله نقلیه (5 hydroxypropyl β-cyclodextrin) یا دارو برای روز 14، در طی آن زمان ارزیابی رفتاری انجام شد.
برای ΔFosB تجربیات بیش از حد بیان [western blotting، qPCR، و ChIP]، NSE-TTA × tetOP-ΔFosB موش ها (هفته 10) مورد استفاده قرار گرفتند، که در صورت عدم وجود داکسی سایکلین مشتق شده از تتراسایکلین (8 هفته ها را از داکسی سایکلین)، حیوانات نشان دادند که ساختار ثابت محدودی از ΔFosB (S5) بیش از حد بیان ΔFosB در این موش ها از طریق qPCR تایید شد. برای تایید یافتن با استفاده از NSE-TTA × tetOP-ΔFosB موش ها، موش های نر C8BL / 57J هفته ای 6 هفته ایی با تزریق استاتاكسیكی درون ناخن با AAV vectors بیانگر GFP یا ΔFosB-GFP بودند. بردارهای AAV در این مورد برای اطمینان از حداکثر بیان ΔFosB در هفته 8 پس از عمل جراحی، اجازه می دهد تا مقایسه مستقیم بین موش های بیش از حد بیان ΔFosB آلوده و transransgens βFransBen. بیش از حد بیان ویروسی با استفاده از qPCR در هفته 8 بعد از جراحی تایید شد (پانچ های 15 سنج NAc زیر محل تزریق تجزیه شد). موشهای بیش از حد AAV-GFP و AAV-ΔFosB-GFP که برای qPCR مورد استفاده قرار نگرفتند با درمان با سالین (درمان 14 saline، ip) و یا تکرار کوکائین (درمان 14 30 mg / kg کوکائین-HCl، Ip) عمل جراحی. 6 روز بعد از درمان نهایی، مغز با 4٪ paraformaldehyde ثابت، بر روی vibratome طبقه بندی شده و مورد استفاده برای تجزیه و تحلیل دندریتیک ستون فقرات.
تحلیل وسترن بلات
پالس های 14 سنج NAc از جنس 1 میلیمتر کرونال بدست آمده با استفاده از یک ماتریس مغز موش بزرگ مغز فولاد ضد زنگ گرفته شده و در 1 M HEPES بافر لیز (1٪ SDS) حاوی مهار کننده های پروتئاز و فسفاتاز با استفاده از سانتریفوژ مورد استفاده قرار گرفتند. 10-نمونه های پروتئین کل پروتئین 30 μg بر روی ژل های 18٪ SDS الکتروفورز شد. پروتئین ها به غشاء PVDF منتقل شدند و با هر دو ضد H3K9me2 (موس تک سلولی، 1: 500)، ضد β-tubulin (موش مونوکلونال، 1: 60,000)، هیستون ضد کلون H3 (پلی کلونال خرگوش، 1: 5,000)، انکوبه شدند. anti-GFP (برای تایید علامت ویروسی برابر با بافت های پانچ) (anti-H1: 1000)، anti-H3K27me3 (پلی کلونال خرگوش، 1: 500) و یا آنتی بادی های ضد آنتی (موس monoclonal، 1: 60,000) در شبانه در 4 ° C (تمام غشاها در شیر 5٪ یا آلبومین سرم گاو 5 مسدود شدند). سپس غشاء با آنتی بادی های ثانويه برچسب پراکسیداز (1: 15,000-1: 60,000 بسته به آنتیبادی اولیه مورد استفاده قرار می گیرد) و نوارها با استفاده از Substrate SuperSignal West Dura تجسم یافتند. گروهها با NIH Image J Software و Bands of H3K9me2 با هر دو Actin یا β-Tubulin و هیستون H3 برای کنترل بارگذاری برابر، عادی شده اند. کوکائین تکرار بر روی سطوح آکتین (شکل S8) یا کل هیستون 3 (شکل S1) در NAc. علاوه بر این، عفونت HSV-G9a-GFP و HSV-G9aH1093K-GFP بر میزان کل β-tubulin در NAc (شکل S8).
ایمونوهیستوشیمی
موش ها با دوز مرگبار هیدرات کلرال و با استفاده از 4٪ پارافورالدئید با استفاده از یک یا دو ایزو هیستوشیمی تجزیه شدند که قبلا شرح داده شده است (S6) به طور خلاصه، مغز پس از ثابت شدن در دمای اتاق به مدت یک شب در 30٪ سقز در دمای 35 μm (مغز مورد استفاده برای تجزیه و تحلیل ستون فقرات دندریتیک در بخش vibrant در بخش 100 μm در غیاب 30 درصد ساکارز) انکوباتور شد. قسمت های NAc آزاد شناور با 1X PBS، مسدود شده (3٪ سرم نرمال ناز، 0.1٪ tritonX، 1X PBS) شسته شدند و بعد با انتی با GFP (پلی کولونال مرغ، 1: 8000) و / یا anti-G9a (خرگوش پلی کلونال ، 1: 500) در محلول مسدود کننده. بخش های مورد بررسی برای دندان های دندریتیک با یک آنتی بادی anti-GFP پلی کلونال خرگوش در 1: 200 انکوب گردید. پس از انکوباسیون شبانه، بخش های NAc به مدت 3 برای 10 دقیقه با 1X PBS شسته شد و سپس آنکوباسیون با Cy2 و / یا Cy3 با آنتی بادی های ثانویه متصل به فلورسنت همراه در 1X PBS حلال برای 2 ساعت است. بخش هایی که برای مطالعات مورفولوژی مورد استفاده قرار می گیرند، در آنتی بیوتیک ثانویه در دمای اتاق انکوباس شدند. رنگ آمیزی هسته ای با انکوباسیون بخش های 1X PBS حاوی DAPI (1: 50,000) برای 10 دقیقه به دست آمد. بخش ها بار دیگر شستشو داده شدند و پس از آن با کمبود آب اتانول و نصب DPX. تمام بخش ها با استفاده از میکروسکوپ پاپوکال تصویر برداری شدند.
جداسازی RNA و qPCR
مشت های NAc 14 دو طرفه در Trizol همگن شده و طبق دستورالعمل سازنده پردازش شدند. RNA با ستون های RNAesy Micro خالص شد و طیف سنجی تایید کرد که جیره های RNA 260/280 و 260/230> 1.8 بودند. سپس RNA با استفاده از کیت iScript Bio-Rad رونویسی شد. cDNA توسط qPCR با استفاده از SYBR Green کمی شد. هر واکنش در دو نسخه یا سه تکرار اجرا شد و با استفاده از روش ΔΔCt همانطور که قبلاً با استفاده از گلیسرآلدئید-3-فسفات دهیدروژناز (GAPDH) به عنوان کنترل نرمال سازی شرح داده شد ، تجزیه و تحلیل شد (S7) دیدن جدول مکمل جدول S5 برای توالی های پرایمر mRNA.
تجزیه و تحلیل میکروارگانی DNA
چهار گروه (تکرار بیولوژیکی مستقل 3 در هر گروه) برای مطالعه میکروارگانیسم، مجموع میکروارائی های 12 مورد استفاده قرار گرفتند. 1 ساعت بعد از آخرین تزریق کوکائین، حیوانات به سرعت Decapitated و مغز برداشته شد و قرار داده شده بر روی یخ. Dissection از NAc با استفاده از یک پانچ سوزن 15 اندازه گیری شد و به سرعت به یون خشک تبدیل شد تا RNA استخراج شد. پانچ های دو طرفه از 4 حیوان در هر تکرار جمع شده و مجموع موش های 12 در هر گروه. جداسازی RNA، پردازش ریزپردازنده و تجزیه و تحلیل داده ها همانطور که قبلا شرح داده شد (S8) به طور خلاصه ، RNA همانطور که در بالا توضیح داده شد جدا و خالص شد و از نظر کیفیت با استفاده از تجزیه و تحلیل بیولوژیکی Agilent بررسی شد. رونویسی معکوس ، تقویت ، برچسب گذاری و ترکیبی از آرایه های Illumina MouseWG-6 v2.0 با استفاده از روش های استاندارد توسط هسته ریزآرایه UT Southwestern انجام شد. داده های خام با استفاده از نرم افزار Beadstudio پس زمینه کم و نرمال شد. داده های نرمال شده با استفاده از نرم افزار GeneSpring مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت و متخصصان لیست با استفاده از معیارهای اهمیت قطع 1.3 برابر تغییر همراه با قطع غیر دقیق p-value از p <0.05 تولید شدند.
ما به دلایل متعددی اعتماد به نفس در این داده ها را حفظ می کنیم. ابتدا تمام حیوانات تحت همان شرایط تحت درمان، کشت و کشت قرار گرفتند. همچنین، تمام پردازش های RNA و آرایه در همان زمان انجام شد. دوم، ما آرایه های سه گانه را انجام دادیم و حیوانات چندگانه را در یک نمونه آرایه جمع کردند، در نتیجه موجب به حداقل رساندن تفاوت ها با توجه به تنوع فردی و افزایش قدرت آماری (S9) سوم، معیارهای تجزیه و تحلیل داده مورد استفاده برای مطالعه ما توسط پروژه کنترل کیفی MicroArray توصیه می شود، زیرا این معیارها اعتبار داده شده اند تا سطح بالایی از قابلیت تکرارپذیری داخل وریدی و بازتولید بین و عرضی (S10-S11).
ساخت بردارهای ویروسی
با توجه به محدودیت اندازه ورودی بردار ویروسی، توالی کدگذاری برای هر نوع ژن G9a (G9a) و یا G9a مرده کاتالیستی (G9aH1093K) به پلاسمید bxistycin پلاسمیس p1005 + HSV بیان شده تحت کنترل پروموتور سیتومگالوویروس سریع CMV (G9a اندازه درج × 3.96 kb بود که از حداکثر اندازه درج برای بردارهای AAV-2 فراتر می رود. پروموتر IE4 / 5 درایو بیان G9a. قطعه ها به پلاسمید p1005 + HSV bicistronic به وسیله پلاسمید های پایان خونی با Clenow تحت درمان PmeI و EcoRI هضم شده G9a (از pcDNA3.1) و CIP تحت درمان p1005 + پس از هضم EcoRI subcloned. برای تولید HSV-ΔJunD-GFP، توالی کدگذاری ΔJunD به وسیله سایت های محدود کننده EcoRI بوسیله PCR با استفاده از الیگونوکلئوتید پرایمر حاوی سایت EcoRI تولید می شود. سپس محصول PCR به محل EcoRI از بردار p1005 + لیگاد شده شد. بیان موضعی کرم recombinase در نورون NAc توسط تحویل ژن به وسیله انتقال ویروسی با استفاده از یک بردار AAV به دست آمده به دست آمده است (S12) GFP یا همگرایی N-terminal GFP به Cre به یک بردار نوترکیب AAV-2 حاوی پروموتر CMV با یک دنباله پذیرنده donors و سیگنال پلیآدنیل شدن زیرکلون شد. تمام درجهای بردار توسط توالی انتخابی دیودوزیک تایید شد. بردارهای ویروسی با استفاده از روش انتقال سه گانه، بدون کمپلکس تولید شده، همانطور که قبلا شرح داده شد (S13) ویروس خالص در -80 ° C ذخیره شد. کیفیت ویروسی توسط تيتر عفونی بررسی شده در سلولهای HEK293 ارزيابی شد. ویروس های AAV-ΔFosB-GFP به طور مشابه تهیه شده اند. برای HSV-Cre، بیان Cre توسط یک promoter IRES به عنوان مخالف با promoter IE4 / 5 هدایت شده بود، به منظور به حداقل رساندن بیان Cre و جلوگیری از مسمومیت نورونی (نگاه کنید به S14 برای ساخت ویروسی). در هر حال، بیش از حد بیان ویروسی هر دو مورد تایید شد در شرایط in vitro و در in vivo از طریق qPCR و ویروس ها ایمونو هیستوشیمیایی برای نشان دادن بیان محدود NAc پس از جراحی تایید شدند.
جراحی Stereotaxic
تحت بیهوشی کتامین (100 mg / kg) / xylazine (10 mg / kg) بیهوشی، موشها در یک ابزار Stereotaxic کوچک حیوان قرار گرفتند و سطح سر و گردن در معرض قرار گرفتند. سی و سه سوزن سرنگ اندازه گیری شده برای دوبار تزریق 0.5 μl ویروس به NAc در یک زاویه 10 ° (AP + 1.6؛ ML + 1.5؛ DV - 4.4) با سرعت 0.1 μl / min استفاده شد. حیواناتی که تزریق HSV دریافت می کردند، پس از جراحی، به مدت 2 بهبود می یابند، در حالیکه موش ها برای آزمایش رفتاری استفاده می شدند و بردارهای AAV به مدت 20 روز قبل از قرار گرفتن در معرض تهویه قرار گرفتند. این زمانها با دوره های حداکثر بیان ترانسژن ژن ویروسی برای دو بردار سازگار است. برای تزریق BIX01294 هر یک از دو مینی پمپ به صورت زیر جلدی بر روی پشت موش قرار گرفتند. قرار دادن کانولا با حفاری دو سوراخ مغزی کوچک بالای NAc و تحویل کانول از برگی (AP + 1.5؛ ML + 1.0؛ DV - 5.4) به دست آمد. موش ها مجددا از جراحی برای 4 تا 5 پس از شروع درمان آماده سازی محل به کوکائین به عنوان شرح زیر اجازه داده شد.
ترجیح محل موثر
روش تهيه محل به صورت قبلي شرح داده شد و با تغييرات زير (S7) به طور خلاصه ، 3 روز پس از تزریق داخل NAc HSV-G9a-GFP ، HSV-G9aH1093K-GFP یا HSV-GFP ، موش ها در محفظه های تهویه قرار گرفتند ، که از سه محیط مجزا تشکیل شده است. موش هایی که اولویت قابل توجهی برای هر دو اتاق تهویه مطبوع نشان دادند از مطالعه خارج شدند (<10٪ از کل حیوانات). سپس گروه های تهویه مطبوع متعادل شدند تا بتوانند هرگونه تعصب محفظه ای را که هنوز وجود دارد تنظیم کنند. در روزهای بعدی ، به حیوانات نمک نمک تزریق می شد و بعد از ظهر به مدت 30 دقیقه در یک محفظه نگهداری می شد و سپس کوکائین (10 میلی گرم بر کیلوگرم ، IP) به آنها تزریق می شد و به مدت 30 دقیقه در غروب به مدت 2 دقیقه در اتاق دیگر نگهداری می شد (دو سالین و دو جفت کوکائین). در روز آزمایش ، موش ها بدون درمان به مدت 20 دقیقه داخل دستگاه قرار گرفتند و آزمایش شدند تا ارزیابی کنند کدام طرف را ترجیح می دهند. پاسخ حرکتی به کوکائین از طریق شکست پرتو در اتاق های جفت شده کوکائین ارزیابی شد تا از اثربخشی درمان دارویی اطمینان حاصل شود. برای آزمایش های AAV و BIX01294 CPP ، یک پروتکل کمی اصلاح شده استفاده شد. به حیوانات مجدداً نمک نمک یا کوکائین (10 میلی گرم در کیلوگرم ، IP) تزریق شد و به مدت 30 جلسه در اتاق های خاص محدود شد ، اما در عوض فقط یک بار در روز به مدت 4 روز شرطی شدند ، سپس آزمایش در روز 5 انجام شد (حیوانات شرطی شدند در عصر و درمانهای تهویه جایگزین شدند). برای همه گروه ها ، حرکت پایه در پاسخ به محلول نمکی مورد ارزیابی قرار گرفت تا اطمینان حاصل شود که تحت تأثیر درمان ویروسی یا مهار کننده ، حرکت به جایی نرسیده است.
تزریق داخل وریدی کوکائین
موش صحرایی نر بالغ نژاد Long-Evans با وزن 230-250 g در ابتدای آزمایش به دست آمد. آنها در یک محیط کنترل شده با رطوبت و دما در یک چرخه نور / تاریکی ساعت 12 معکوس (نور خاموش در 9: 00 am) با ad libitum دسترسی به غذا و آب موش ها در محيط جديد خود مجذوب شدند و هر روز قبل از شروع آزمايش، 1 تجويز شدند. تمام مراحل مطابق با مؤسسه ملی بهداشت راهنمای مراقبت و استفاده از حیوانات آزمایشگاهی انجام شد و توسط کمیته مراقبت از حیوانات و مراقبت از حیوانات کوه سینا مورد تایید قرار گرفت. تجهیزات خودمراقبتی با پرتوهای مادون قرمز برای اندازه گیری رفتار حرکتی نصب شد. خودكار كردن به صورت قبلي شرح داده شد (S15-S16) با کاتترهایی که تحت بیهوشی ایزوفلوران (2.4-2.7٪) در ورید ژوگولار راست کاشته می شوند. کاتترها با 0.1/10 میلی لیتر از محلول نمکی حاوی 50 U هپارین و آمپی سیلین (3 میلی گرم در کیلوگرم) شستشو داده شدند. پس از یک هفته بهبودی از جراحی ، آموزش خودمدیریتی در مرحله تاریک چرخه نور / تاریکی آغاز شد. حیوانات اجازه داشتند 0.75 ساعته روزانه به کوکائین (1/1 میلی گرم در کیلوگرم در هر بار تزریق) تحت یک برنامه تقویت کننده نسبت ثابت 1 (FR6) دسترسی پیدا کنند ، جایی که 15 فشار اهرم فعال منجر به تزریق منفرد دارو می شود. موش ها پس از 3 روز مصرف کوکائین خود را تثبیت کردند (<75٪ تغییر در نرخ پاسخ در 24 روز متوالی ، با حداقل XNUMX٪ پاسخ بر روی اهرم تقویت شده). XNUMX ساعت پس از آخرین جلسه خودآموزی ، موش ها به سرعت از بدن جدا شدند ، مغز به سرعت برداشته و برای جداسازی RNA و qPCR پردازش شد.
ايمن سازي کروماتين (CHIP)
پالس های NAc تازه، فرمالدئید متقابل و آماده شده برای ChIP است که قبلا شرح داده شده است (S17-S18) با تغییرات جزئی. به طور خلاصه، 4 14 سنجی NAc پانچ در هر حیوان (جمع آوری حیوانات 5 در هر نمونه)، با 1٪ فرمالدئید متصل شده و با گلیسین 2 M قبل از انجماد در -80 ° C خنک گردید. روز قبل 1 قبل از نمونهبرداری sonication، گوسفند ضد خرگوش / ماوس (بسته به نوع آنتیبادی رسوب) دانههای مغناطیسی IgG را با انکوباتور دانههای مغناطیسی مناسب با هر دو ضد G9a (خرگوش پلی کلونال ChIP grade) و یا anti-H3K9me2 (رده Chip monoclonal mouse) آنتی بادی ها در یک شب در 4 ° C تحت چرخش ثابت در محلول بلوک. Sonication بافتی و برش کروماتین به روش قبلا شرح داده شده است (S17) پس از سانتریفوژ، غلظت مساوی کروماتین به لوله های جدید منتقل شد و ~ 5٪ از محصولات نهایی به عنوان کنترل ورودی ذخیره می شد. پس از شستشوی کامل و مجدد مخلوط آن از مخلوط کنجوج شده آنتی بادی / مخلوطی از آنتی بادی / مخلوط دانه (~ 7.5 μg آنتی بادی / نمونه) به هر نمونه کروماتین افزوده شد و برای 16 ° C به مدت زمان ~ 4 ساعت انکوباتور شد. نمونه ها بیشتر شسته و معکوس متقابل در 65 ° C به مدت یک شب قبل از تخلیص DNA با استفاده از کیت تصفیه PCR. پس از پاکسازی DNA، نمونه ها تحت qPCR قرار گرفتند و به کنترل های ورودی مناسب خود که قبلا شرح داده شد ((S17) برای کنترل غلظت مناسب تقویت سیگنال، ایمونوفیزیک IgG موش صحرایی با استفاده از یک آنتی بادی ضد IgG پلی کلونال موش صحرایی انجام شد. آدنین فسفریبوسیلتransferase (APRT) به عنوان یک کنترل منفی برای آزمایش کوکائین و ΔFosB بیش از حد بیان شده است. دیدن جدول تکمیلی S5 برای توالی های پرایمر پروموتر.
تجزیه و تحلیل ستون فقرات دندریتیک
برای مطالعه نقش G9a در تنظیم مورفولوژی عصبی in vivo، ما از روش هایی که قبلا با تغییرات زیر (S1) سه روز پس از تزریق HSV-GFP، HSV-G9a-GFP، HSV-ΔJunD-GFP (همه ویروسها در موشهای C57Bl / 6J وحشی) یا HSV-Cre-GFP (مورد استفاده در G9afl / fl موش ها)، زمانی که بیان ویروسی حداکثر بود، موش ها فورا شدند، مغز ها محافظت شدند و سپس در 100 μm بر روی ارتعاشی قرار گرفتند. سپس با استفاده از یک آنتیبادی علیه GFP، همانطور که در بالا توضیح داده شد، بخش ها ایمن ساز شدند (به ايمونوهيستوشیمی مراجعه شود). برای ارزیابی اثرات بیان بیش از حد G9a و نابود شدن بر تعداد ستون فقرات و همچنین اثر بیش از حد بیان ΔJunD ما تعداد ستون ها را در حدود NEURITES 1-2 در هر نورون برابر با حداقل 299 μm از دندریت های ثانویه از محیط NAc بیان GFP نورونهای کروی (MSNs). با توجه به این که MSN ها مورفولوژی متمایز از دیگر جمعیت های عصبی در NAc و همچنین گزارش های قبلی نشان می دهد که HSV در ابتدا آلوده به DARPP-32 بیان نورون در این منطقه مغز (S19) ما مطمئن هستیم که MSNs به طور انحصاری در این مطالعات ارزیابی می شود. برای هر حیوانی، نورون های 6-8 را در حیوانات 3-4 در هر گروه (گروه های 7) مورد بررسی قرار دادیم و بعد از آن مقدار میانگین برای هر حیوانی برای تجزیه و تحلیل آماری بدست آمد. آزمایشات طراحی شده برای بررسی اثرات ΔFosB بیش از حد بیان بر تراکم ستون فقرات NAc انجام شد به طور مشابه با آنچه در بالا توضیح داده شد، به استثنا که بردارهای AAV برای بیان GFP یا ΔFosB-GFP برای دوره های طولانی مدت (8 هفته) مورد استفاده قرار گرفت. تمام تصاویر HSV با استفاده از یک میکروسکوپ کانکوکال با هدف 100X مایع غوطه وری گرفته شد (تصاویر AAV با هدف 63X مایع غوطه وری گرفته شد). تصاویر با پین هاله در واحد دلخواه 1 و اندازه قاب 1024 × 1024 بدست آمد. طول دندریتیک با استفاده از نرم افزار NIH Image J اندازه گیری شد و شمارش ستون فقرات توسط آزمایش کننده اولیه شمارش شد، زیرا اسلایدها قبل از اسکن آزمایش تجویز شده بودند. میانگین تعداد ستون ها در هر 10 μm دندریت محاسبه شد.
تحلیل آماری
آنالیز واریانس یک طرفه و دو طرفه برای تعیین اهمیت برای ارجحیت شرایط محیطی و تجزیه و تحلیل دندریتیک ستون فقرات با بیش از دو گروه انجام شد. تست های دانشجویی برای مقایسه های دیگر از جمله qPCR، غربالگری غربی، تجزیه و تحلیل دندریتیک ستون فقرات، مقایسه HSV-GFP با HSV-Cre در G9afl / fl آزمایش موش ، تجزیه و تحلیل ریز آرایه (نگاه کنید به بالا) و آزمایش های رسوب گذاری کروماتین. از آزمونهای t دانش آموز برنامه ریزی شده به دنبال تجزیه و تحلیل ANOVA دو طرفه تراکم ستون فقرات دندریتیک پس از بیان بیش از حد ΔFosB با تأیید تأثیرات اصلی قابل توجه درمان دارویی و ویروس استفاده شد. تمام مقادیر موجود در افسانه های شکل ، میانگین ± SEM را نشان می دهند (* p ≤ 0.05 ؛ ** p <0.001). تجزیه و تحلیل آماری دقیق برای انجیر. 1-3 در متن اصلی در زیر آمده است: افسانه های تفصیلی شامل آمار.
پانویسها و منابع
من تایید می کنم که هیچ یک از مواد موجود در دستنوشته تحت عنوان نقش اساسی Methyltransferase هیستون G9a در پوسته شدن ناشی از کوکائین قبلا منتشر شده یا در حال بررسی در جای دیگر، از جمله در اینترنت است.
تمام کارهای مربوط به استفاده از حیوانات مطابق با دستورالعمل های نهادی و IACUC در هر دو مرکز پزشکی جنوب غرب ایالات متحده تگزاس و مدرسه پزشکی کوه سینا انجام شد.
منابع و یادداشت ها
;