Proc Natl Acad Sci USA A. 2005 فوریه 1؛ 102(5): 1737-1742
چکیده
کوکائین، یک دارو سوء استفاده، باعث افزایش سطوح سیناپسی دوپامین در استریاتوم می شود و مسدود کردن مجدد دوپامین در ترمینال های آکسون است. یافته های این تحقیق نشان می دهد که پس از مداخله مزمن با کوکائین، سلول های وابسته به سیکلین 5 (Cdk5) و فعال کننده آن p35، پروتئین هایی که در فسفوریلاسیون بسترها در نورون های پس از کشف قرار دارند، تنظیم می شوند. برای بررسی بیشتر اثرات القاء Cdk5 و p35 در سیگنالینگ دوپامین ماژور، ما دو خط موش های مستقل ترانس ژنیک را تولید کردیم که در آن Cdk5 یا p35 به طور خاص در نورون ها بیان شد. ما در اینجا گزارش می دهیم که افزایش فعالیت Cdk5 به علت p35، اما نه بیان بیش از حد Cdk5، منجر به تضعیف سیگنالینگ دوپامین می شود. افزایش فسفوریلاسیون دوپامین و فسفو پروتئین تنظیم شده با cAMP، توده مولکولی 5 kDa (DARPP-32) در Thr-32، همراه با کاهش فسفوریلاسیون DARPP-75 در Thr-32 بود. افزایش فسفریلاسیون Cdk34 توسط گیرنده سیگنال گیرنده سیگنال 5 در Thr-1 همراه با کاهش فعالیت کیناز 286 / 1 تنظیم شده توسط سیگنال سلولی است. این اثرات منجر به تضعیف فسفوریلاسیون ناشی از کوکائین از پروتئین اتصال دهنده عنصر پاسخ cAMP و نیز القاء کمتر c-fos در striatum شد. این نتایج از این ایده پشتیبانی می کند که فعالیت Cdk2 در بیان ژن تغییر یافته پس از در معرض قرار گرفتن در معرض کوکائین دخالت دارد و از این طریق تغییرات طولانی مدت در عملکرد عضلانی تحت تاثیر اعتیاد کوکائین را تحت تاثیر قرار می دهد.
کوکائین باعث افزایش سطح دوپامین سیناپتیک در استریاتوم می شود و بیان ژن را در نورون های dopaminoceptive تغییر می دهد با فعال سازی مسیرهای داخل سلولی که سیگنال اولیه را از گیرنده D1 دوپامین به هسته (1) قرار گرفتن در معرض مکرر به کوکائین تعدادی از عوامل رونویسی را تعدیل می کند و منجر به تغییرات طولانی مدت در بیان ژن می شود که به نظر می رسد سازگاری های نورونی در معتادان کوکائین (2) ΔFosB، به عنوان یک عامل فاکتور رونویسی شناخته شده (3) نشان داده شده است که پاسخ های رفتاری حیوانات را به کوکائین (4, 5) بنابراین، انتظار می رود شناسایی ژن های هدف که توسط القاء ΔFosB تنظیم می شوند، به درک بیشتر از مکانیزم مولکولی وابستگی کوکائین بستگی دارد. به تازگی، درمان مزمن حیوانات با کوکائین نشان داده شده است که بیان سینین وابسته به کیناز 5 (Cdk5) و فعال کننده آن p35 در striatum از طریق القاء ΔFosB (6, 7).
Cdk5 یکی از اعضای خانواده Cdk از سریین / ترینین کیناز است. بر خلاف دیگر Cdks که تنظیم کننده های اصلی پیشرفت سلول چرخه هستند، Cdk5 عمدتا در فسفریلاسیون بسترها در نورون های پس از نیترات نقش دارد (8) ويژگي نوروني فعاليت Cdk5 از طريق ارتباط با فعال کننده هاي آن، p35 يا p39 است که عمدتا در نورون هاي پس از ليپوس (8) علاوه بر نقش اساسی Cdk5 در توسعه مغز (9, 10)، منt نیز در انتقال دوپامینرژیک در مغز پس از تولد (11, 12) مهار فعالیت Cdk5 منجر به افزایش آزادی دوپامین در striatum می شود، که نشان دهنده عملکرد پیش داکپتیک Cdk5 به عنوان یک تنظیم کننده منفی انتشار دوپامین است (11) علاوه بر این، Cdk5 اثربخشی سیگنالینگ dopamin postynaptic را با استفاده از فسفورلیز کردن فسفو پروتئین تنظیم شده با dopamine و cAMP، توده مولکولی 32 kDa (DARPP-32) در Thr-75 مدون می کند که DARPP-32 را به یک مهار کننده از کیناز وابسته به cAMP (PKA) (12).
این مشاهدات نشان می دهد که Cdk5 و p35 رگولاتورهای پایین دست فعال شدن طولانی مدت سیگنال dopamine پس از قرار گرفتن در معرض مزمن کوکائین و در نتیجه اعتیاد به کوکائین است. برای بررسی بیشتر نقش Cdk5 در سیگنالینگ دوپامین ماژور، ما دو خط موش های ترانس ژنیک تولید کردیم که هر دو Cdk5 یا p35 به طور خاص در نورون تحت کنترل پروموتر p35 بیش از حد بیان شدند. یافته های ما نشان داد که فعالیت Cdk5 با افزایش سطح پروتئین p35، اما نه پروتئین Cdk5 تنظیم می شود، که نشان می دهد سطح پروتئین p35 برای فعالیت Cdk5 محدودیت دارد. ما اینجا ارائه می دهیم در داخل بدن شواهدی مبنی بر افزایش فعالیت Cdk5 در نتیجه بیان بیش از حد p35 منجر به تضعیف سیگنالینگ دوپامین توسط کوکائین به هسته به وسیله مهار کردن آبشارهای PKA و سلولهای کیناز تنظیم شده توسط سیگنال (ERK) می شود.
مواد و روش ها
آنتیبادی ها. آنتی بادیهای پلی کلنال به Cdk5 (C-8) و p35 (C-19) از Biotechnology Santa Cruz خریداری شده است. آنتی بادی های وابسته به فسفوریلاسیون و وابسته به آنزیم ERK kinase (MEK) 1 / 2، ERK1 / 2 و پروتئین اتصال دهنده پروتئین واکنش cAMP (CREB) از فناوری Cell Signaling (Beverly، MA) بدست آمد. آنتی بادی های فسفو Thr-34 DARPP 32 (13)، فسفو تری-75 DARPP-32 (12)، کل DARPP-32 (12) و c-fos (14) به عنوان شرح داده شد. یک آنتی بادی برای آکتین از سیگما خریداری شد.
حیوانات تجربی. ما قبلا ژن p35 ماوس را کپی کردیم Cdk5r1، که پروتئین p35 را کدگذاری می کند و ساختار ژنومی آن را مشخص می کند (15) برای تولید موش ترانس ژنیک با بیان بیش از حد نورون از p35 (Tgp35)، 6-kb محیط زیستRI-محیط زیستقطعه RI حاوی ناحیه پروموتر 1.2-kb به یک پلاسمید pGEM9Z (-) زیر کلون شده و یک برچسب 45-bp حاصل از SV40 به داخل Kpnمن سایت پایین دست Poly (A+) سیگنال (شکل 1A) برچسب حاوی یک SPEمن برای ژنوتیپ حیوانات سایت هستم. قطعه 6-kb از پلاسمید خارج شد و خالص شد و به دنبال آن تزریق پرونوکراتیو ترانس ژن برای تولید موش های ترانس ژنیک بود. برای بررسی مشخصات بیان ترانس ژن تحت کنترل کننده پروتئین p1.2 35-kb در داخل بدنموش دوبار ترانس ژنیک (Tgp35؛ p35 - / -) با استفاده از یک استراتژی پرورش دو مرحله ای که با استفاده از آن ماوس Tgp35 در یک پسزمینه p35-null endogenous بازسازی شد، تولید شد. سایر مدل های موش که در این تحقیق مورد استفاده قرار گرفت شامل p35 +/-، p35 - / -، Cdk5 +/- و موش ترانس ژنیک با بیش از حد بیان نورون Cdk5 (TgCdk5) (9, 16, 17) ژنوتیپ های این موش ها با انجام تجزیه و تحلیل غلظت Southern blot یا PCR روی DNA ژنومی جدا شده از بیوپسی های دم تعیین شد. موش ها تحت چرخه تاریک 12-h / 12-h قرار گرفته اند. تمام مراقبت ها مطابق با دستورالعمل های مؤسسه ملی بهداشت در مورد مراقبت و استفاده از حیوانات آزمایشی و آزمایشی داده شده است.
تحلیل بلوتوث جنوبی. DNA ژنومی استخراج شده از بیوپسی های دم با آن هضم شد محیط زیستRI و SPEI، الکتروفورز بر روی ژل آگارز 0.9٪ و به غشاء نایلون منتقل شد. غشا با یک برش تصادفی، هیبریداسیون شد 32پروب با برچسب P با 42 ° C یک شبه. پروب 485-bp برای ژنوتایپ کردن موشهای ناقص p35 (p35 - / -) و Tgp35 با استفاده از پرايمرهای زير ساخته شد: 5'-ACATCCTGCTGCCACGGTGAC-3 و 5-CCACTGTAAAAGCAACAAGA-3. غشای هیبریداسیون دو بار در 2 × SSC / 0.1٪ SDS در 42 ° C برای 10 دقیقه و دو بار در 0.1 × SSC / 0.1٪ SDS در 65 ° C برای 20 دقیقه شسته شد و در معرض فیلم اشعه ایکس قرار گرفت.
درمان دارویی کوکائین (سیگما) در محلول استریل حل شده است. حیوانات پس از تزریق با کوکائین (15 mg / kg) یا حجم برابر سالین در طی ماه 3 تزریق شدند. آنها توسط تزریق در زمان های مختلف (15، 30، 60 و 120 min) کپک زده شدند. مغزها به سرعت حذف شده و در PBS یخ خشک سرد می شوند. سپس ستاره ها از بین رفته و به تجزیه و تحلیل بلوط شمالی یا غرب منتهی می شوند. برای تجزیه و تحلیل ایمونوهیستوشیمی شیمیدرهای 2 h بعد از تزریق، از بخشهای رحمی دریافت شد.
تحلیل بلات شمالی. کل RNA از striata با reagent TRIzol (Invitrogen Life Technologies، Carlsbad، CA) استخراج شده و به تجزیه و تحلیل بلوط شمالی تحت عنوان (18) برای تشخیص mRNA c-fos، یک قطعه 189-bp از cDNA موش c-fos به عنوان پروب مورد استفاده قرار گرفت (19) سطوح mRNA c-fos با اندازه گیری تراکم نوری باند خاص با استفاده از یک سیستم تحلیل تصویر با نرم افزار تصویر Nih، نسخه 1.62 اندازه گیری شد.
تحلیل غربی Blot. بافت X-ray سینوس در 1٪ SDS سانتریفیوژ شده و برای 10 دقیقه جوش داده شده است. غلظت پروتئین در هر نمونه توسط آزمون پروتئین BCA (Pierce) تعیین شد. مقادیر برابر با پروتئین توسط SDS / PAGE قبل از انتقال به غشای نیتروسلولوز جدا شد. غشاء در 1 × PBS که حاوی 5٪ شیر نابالغ و 0.05٪ Tween 20 مسدود شده بود و در یک شب در 4 ° C با آنتیبادیهای اولیه انکوباتور شدند. انکوباسيون با IgG ضد موش يا آنتي باکتری پراکسيداز-کنجوژاز (Sigma) در دماي اتاق برای 60 min انجام شد. سیگنال با افزایش شیمیایی لومنسانس (Pierce) تشخیص داده شد و تراکمهای نوری این گروهها به صورت مقادیری اندازهگیری شد، همانطور که در بالا توضیح داده شد.
تست کیناز Cdk5. Lysates Striatal با یک بافر لیزسی متشکل از 50 mM Tris · HCl، pH 7.4 / 50 mM NaCl / 5 mM EDTA / 1٪ تریتون X-100 / 1mMDTT / 1 mM فنیل methylsulfonyl fluoride / 1 μg / ml aprotinin / 1 μg / میلی لیتر بازدارنده لوپتپین / فسفاتاز (مخلوط بازدارنده فسفاتاز I و II، سیگما). لیزات با استفاده از آنتی بادی های ضد Cdk5 (C-8) یا anti-p35 (C-19) ايمن گردیدند. ايمن سازي Cdk5 توسط انكوباسيون μl 300 μl از ليسانت (مطابق با 300 μg پروتئين) با آنتي بادي ضد X-CUMKX (5 μg) در شبانه روز در 3 ° C و سپس انكوباسيون بيشتر با 4 μl دانه هاي پروتئين A-agarose (25 ٪ انحلال در بافر لیز؛ بیوتکنولوژی سانتا کروز) برای 50 ساعت در 3 ° C. برای آماده سازی p4 ايمن سازي شده، 35 μl لیزات (مربوط به mg پروتئین 500) با آنتی بادی anti-p1 (35 μg) به عنوان فوق توضیح داده شد. ايمونوپراسپيت ها دو بار با بافر ليز و دو بار با يک بافر کيناز متشکل از 3 mM Tris · HCl، pH 50 / 7.4 mM MgCl2/ 1 mM EDTA / 1 mM EGTA / 1 mM DTT، دوباره در 60 μl بافر کیناز مجددا تزریق می شود. فعالیت کیناز با استفاده از هیستون H1 به عنوان سوبسترا (18).
ایمونوهیستوشیمی موش ها توسط تزریق آی پی avertin (250 mg / kg، Fluka) بیهوشی و با پروکسی کاتالیزوری با 0.1 M سدیم فسفات بافر، PH 7.4، و سپس Fixative Streck Tissue (Streck Laboratories، La Vista، NE)، فیبرویسی غیر متقاطع، بیهوش شد. مغز منقبض شده بیشتر به مدت یک شب در 37 ° C ثابت شد. سپس مغزها در پارافین قرار گرفتند، به بخشهای کرونالی ضخیم 5-μm تقسیم شدند و با استفاده از روش مجتمع آویدین-بیوتین پراکسیداز (Laboratories Vector) با دیامینو بنزیدین به عنوان یک سوبسترا تحت ایمونوهیستوشیمی قرار گرفتند. این بخش ها با یک آنتیبادی پلکلوانی خنثی شده ضد C-FOS به مدت یک شب در 4 ° C انکوباتور شدند. ويژگی رنگ آميزی با حذف آنتی بادی اوليه ارزيابی شد.
نتایج
تولید موش های ترانس ژنیک با غلظت بیش از حد عصاره عصبی p35. ترانسژن مورد استفاده برای دستیابی به افزایش بیان عصبی p35 شامل قطعه 6-kb از ژن p35 موش کلون شده حاوی پروموتر 1.2-kb و تمام توالی کدگذاری p35 (شکل 1 A) ژنوتیپ های موش ها با استفاده از یک پروب که با هدف تشخیص موش های p35 - / - و Tgp35 از موش های وحشی (شکل 1 A و B). برای بررسی بیان ترانس ژن تحت کنترل پروتئین p1.2 35-kb، ما تولید موش های دوگانه ترانس ژن (Tgp35؛ p35 - / -) که در آن بیان p35 تنها از ترانس ژن رانده شد. بیان p35 در Tgp35؛ p35 - / - موش فقط در مغز مشاهده شد (شکل 1C)، که در آن الگوی بیان فضایی شبیه به موشهای وحشی بود (شکل 1D) عدم وجود p35 به ساختار لایه بندی غیر طبیعی در قشر مغزی و هیپوکامپ موش (10) با این حال، موش Tgp35؛ p35 - / - یک نجات کامل از فنوتیپ p35 - / - مغز (شکل 1E) این داده ها نشان می دهد که پروموتر 1.2-kb p35 بیان بیان ترانس ژن را با یک پروتئین بیان مشابه نسبت به p35 از ژن p35 درون زا کنترل می کند.
سطح پروتئین p35 محدودیت سرعت برای تنظیم مقررات فعالیت Cdk5 است. ما عوارض ژن دوز از ژن هایی که p35 و Cdk5 را کدگذاری کرده اند بر روی بیان پروتئین در عصاره های Striatal از موش های p35 - / -، p35 +/-، نوع وحشی، Tgp35، Cdk5 +/- و TgCdk5 در سن 3 ماه مورد بررسی قرار گرفتند. سطح پروتئین p35 و پروتئین Cdk5 به ترتیب با دوزهای ژنی همبستگی مثبت داشت (شکل 2 A و B) موش Tgp35 نشان داد که در سطح پروتئین p1.6 ≈35 برابر با موشهای وحشی، در حالی که سطح پروتئین Cdk5 با سطوح مختلف پروتئین p35 تأثیری نداشت. موش TgCdk5 در مقايسه با موشهای وحشی نوع Δ1.9 افزايش يافته در سطح پروتئين Cdk5 را نشان داد، در حالي که سطح پروتئين p35 با سطوح مختلف پروتئين Cdk5 تأثير نداشت. برای بررسی اثرات مقادیر مختلف پروتئین p35 در فعالیت Cdk5، Cdk5 از عصاره استرادیلی با استفاده از آنتی بادی anti-Cdk5 ائتلاف شد و فعالیت کیناز اندازه گیری شد. به همین ترتیب، برای بررسی اثرات مقادیر مختلف پروتئین Cdk5 در فعالیت کیناز، p35 از عصاره استرادیلی با آنتیبادی ضد p35 ايمن گردید و فعالیت كیناز اندازه گیری شد. فعالیت Cdk5 به خوبی با سطح پروتئین p35 همبستگی دارد، اما نه با سطح پروتئین Cdk5 (شکل 2 C و D) این نتایج نشان داد که مقدار پروتئین p35 یک عامل محدود کننده سرعت برای فعالیت Cdk5 است. بنابراین ما از موش Tgp35 برای بررسی اثرات افزایش فعالیت Cdk5 در سیگنالینگ دوپامین موضعی استفاده کردیم.
فسفوریلاسیون ناشی از کوکائین DARPP-32 در Thr-34 در موش Tgp35 تضعیف می شود. عملکرد DARPP-32 بستگی به حالت فسفریلاسیون آن در چندین سایت دارد (20) PKA فسفریلید DARPP-32 در Thr-34، در حالیکه Cdk5 فوروپلاستیک DARPP-32 را در Thr-75 فسفریل می کند. بدین منظور، وضعیت فسفوریلاسیون DARPP-32 را در عصاره های ستون فقرات از موش های وحشی و Tgp35 مورد بررسی قرار دادیم. سطح فسفات Thr-75 DARPP-32 در موش Tgp35 بالاتر بود (شکل 3A؛ 1.6 ± 0.2 برابر مقدار موشهای وحشی). ما بعدا اثرات افزایش فعالیت Cdk5 را بر سیگنالینگ دوپامین ماوراء الطبیعه بررسی کردیم. ما با بررسی وضعیت فسفوریلاسیون DARPP-35 در Thr-32، فعالسازی PKA ناشی از کوکائین را در موش Tgp34 بررسی کردیم. سطح فسفات Thr-34 DARPP-32 در موشهای وحشی 15 دقیقه پس از تزریق کوکائین (شکل 3B؛ 1.8 ± 0.2 برابر سطح پایه). با این حال، اثر کوکائین در فسفوریلاسیون Thr-34 DARPP-32 در موش Tgp35 (1.2 + 0.3 برابر سطح پایه) تضعیف شد. این نتایج نشان داد که افزایش فعالیت Cdk5 باعث کاهش فعال شدن PKA ناشی از کوکائین احتمالا از طریق فسفوریلاسیون DARPP-32 در Thr-75 (6, 12) همچنین ممکن است که افزایش فعالیت پیش داکپاتیک Cdk5 منجر به کاهش انتشار دوپامین شود و این باعث کاهش اثر کوکائین می شود. به طور مشخص، تزریق تک کوکائین بر سطوح پروتئین p35 و Cdk5 و همچنین فعالیت کیناز (شکل 3 C و D) این در مقایسه با یک مطالعه قبلی است که در معرض قرار گرفتن در معرض کوکائین مزمن نشان داده شده است که بیان p35 و Cdk5 (6).
بالا بردن فعالیت فعالیت Cdk5 موجب کاهش فعال شدن ERK1 / 2 شده توسط کوکائین می شود. شواهد اخیر نشان می دهد که فعال شدن گیرنده dopamine در striatum نیز دیگر آبشارهای سیگنالینگ را فعال می کند، از جمله مسیر ERK (21, 22) که نقش مهمی در پاسخ رفتاری به کوکائین دارد (23) بنابراین، ما بررسی کردیم که آیا فعالیت Cdk5 بر فعال شدن ناشی از کوکائین مسیر ERK اثر می گذارد. فعال شدن مسیر ERK پس از تزریق کوکائین در عصاره های استریایات از موش های وحشی مشاهده شد، که با افزایش فسفوریلاسیون MEK1 / 2 در Ser-217 و Ser-221 (1.5 ± 0.2 برابر بیش از سطح پایه) و ERK1 / 2 در Thr-202 و Tyr-204 (فسفوریلاسیون ERK2: 1.5 ± 0.2 برابر بالاتر از سطح پایه) (شکل 4 A و B) با این حال، فعال شدن کوکائین از MEK1 / 2 (1.2 ± 0.2 برابر سطح پایه) و ERK1 / 2 (فسفوریلاسیون ERK2: 1.2 ± 0.2 برابر بیش از سطح پایه) در موش Tgp35 (شکل 4 A و B) علاوه بر این، سطح پایه فسفو-ERK1 / 2 در موش Tgp35 (0.8 ± 0.2 برابر کمتر از مقدار موشهای نوع وحشی) پایین تر بود، در حالی که این روند از لحاظ آماری معنی دار نبود. این نتیجه دومی ممکن است به فسفریلاسیون وابسته به Cdk5 MEK1 در Thr-286 نسبت داده شود و در نتیجه کاهش فعالیت کاتالیزوری24) برای ارزیابی این احتمال، ما وضعیت فسفریلاسیون MEK1 را در Thr-286 مورد بررسی قرار دادیم و دریافتیم که سطوح بالاتر فسفو Thr-286 MEK1 در عصاره استرادیلی از موش Tgp35 (شکل 4C؛ 1.3 ± 0.1 برابر مقدار موشهای وحشی). علاوه بر این، وضعیت فسفوریلاسیون MEK1 در Thr-286 با تزریق تک کوکائین تغییر نکرده است، که مطابقت دارد با این نتیجه که فعالیت Cdk5 تحت درمان قرار نگرفته است (شکل 3D).
انتشار سیگنالینگ دوپامین به هسته با افزایش فعالیت Cdk5 تضعیف می شود. فعال سازی کوکائین چندین سیگنالینگ آبشارها شامل PKA و ERK منجر به فعال شدن فاکتور رونویسی CREB در هسته توسط فسفوریلاسیون آن در Ser-133 (22, 25) برای بررسی اینکه آیا اثرات مهار کننده Cdk5 بر روی آبشارهای فعال PKA و ERK ممکن است در فسفوریلاسیون CREB در هسته همگرا باشد، ما وضعیت فسفوریلاسیون CREB در Ser-133 را در عصاره های Striatal از موش های وحشی و Tgp35 مورد بررسی قرار دادیم. سطح پایه فسفو CREB در موش Tgp35 پایین تر بود (0.7 ± 0.1 برابر مقدار موش های وحشی) (شکل 5) در پاسخ به تزریق کوکائین، سطح فسفات-CREB در موش سوری از موش های وحشی (1.5 + 0.1 برابر بیش از سطح پایه) افزایش یافت، اما این پاسخ به کوکائین در موش های Tgp35 (1.2 + 0.1- برابر سطح پایه ()شکل 5).
فسفریلاسیون CREB در Ser-133 فعالیت های رونویسی آن را از طریق یک عنصر پاسخ cAMP در ناحیه پروموتر ژن های خاصی، از جمله ژن c-fos (26) بنابراین، القاء C-FOS در استریاتوم موشهای وحشی و Tgp35 بعد از تزریق کوکائین مورد بررسی قرار گرفت. در موشهای وحشی، سطح mRNA c-fos به مقدار حداکثر (1.8 ± 0.2 برابر بیشتر از سطح پایه) 30 دقیقه پس از تزریق کوکائین افزایش یافت و بعد از تزریق (120 دقیقه بعد از تزریق)شکل 6 A و B) با این حال، سطح mRNA c-fos در موش Tgp30 ≈35٪ پایین تر از موشهای وحشی بود تا 30 دقیقه بعد از تزریق (شکل 6 A و B) القاء کمتر C-FOS در موش Tgp35 بیشتر توسط ایمونوهیستوشیمی (شکل 6 C-F) تزریق کوکائین باعث افزایش ایمونوئوراکتیویتی c-fos شد، به شدت در قسمت های dorsomedial-dorsocentral striatum و ضعیف در قسمت های جانبی، در هر دو نوع موش وحشی و Tgp35. با این حال، افزایش تعداد سلولهای c-fos-immunopotentiator ناشی از کوکائین در ستون فقرات موش Tgp35 (شکل 6G) با هم، این نتایج نشان داد که افزایش دوپامین ماوراء بنفش با کوکائین به هسته در موش Tgp35 مهار شد، که احتمالا افزایش فعالیت Cdk5 بود.
بحث
Cdk5 و فعال کننده آن p35 به عنوان ژن هدف مورد بررسی قرار گرفته اند که از طریق قرار گرفتن در معرض مزاج کوکائین (6). ما در اینجا شواهدی مبنی بر افزایش فعالیت Cdk5 در نتیجه تنظیم مقادیر p35 به جای تنظیم مقررات Cdk5 نشان می دهد که موجب کاهش سیگنالینگ دوپامین در کوکان در نورونهای استریاتیت می شود. برای بررسی عواقب بیان منظم Cdk5 یا p35 در سیگنالینگ دوپامین ماژور، دو خط موش های ترانس ژنیک، موش TgCdk5 و Tgp35 مورد بررسی قرار گرفت. ما دریافتیم که فعالیت Cdk5 نسبت به افزایش سطح پروتئین p35 تنظیم شده است، اما با افزایش سطح پروتئین Cdk5 تأثیری ندارد. گزارش قبلی ما همچنین نشان داده است که فعالیت Cdk5 در مغز موش TgCdk5 پایین تر از مغز موش های وحشی است هنگامی که فعالیت با استفاده از Cdk5 immunoprecipitates (17)، نشان می دهد که بیش از حد بیان Cdk5 منجر به افزایش سطح Cdk5 مونومر می شود در صورتی که سطح p35 افزایش نمی یابد. این نتایج نشان داد که سطح پروتئین p35 یک عامل محدود کننده سرعت برای فعالیت Cdk5 است.
موشهای Tgp35 نشان دادند که فسفوریلاسیون CREB و c-fos در striatum پس از تزریق حاد کوکائین کمتر نشان داده می شود، که نشان می دهد واکنش استرادیول به کوکائین با افزایش فعالیت Cdk5 مهار شده است. کاهش دهنده سیگنالینگ دوپامین در کوکائین در موش Tgp35 به احتمال زیاد توسط مهار Cdk5 از چندین سیگنالینگ آبشار DARPP-32، PKA و ERK حاصل می شود. تزریق کوکائین باعث افزایش فسفریلاسیون PKA DARPP-32 در Thr-34 در موشهای وحشی شد، در حالی که این پاسخ در موش Tgp35 تضعیف شد. نشان داده شده است که فسفریلاسیون PKA DARPP-32 در Thr-34 مانع از فعالیت پروتئین فسفاتاز 1 (PP1)، آنزیم مسئول فسفریوریسیون Ser-133 از CREB (27) بنابراين فعاليت PP1 از طريق مسیر DARPP-32 / PP1 در موش Tgp35 ناسازگار نيست.
فعال سازی کوکائین ناشی از ERK1 / 2 نیز در موش Tgp35 کاهش یافت. چندین مکان مشخص وجود دارد که Cdk5 می تواند فعال سازی ERK1 / 2 ناشی از کوکائین را مهار کند. اولا، فسفریلاسیون وابسته به Cdk5 DARPP-32 در Thr-75 می تواند PKA را مهار کند، منجر به مهار بعدی هر فعال سازی MEK1 / 2 که به PKA متعهد است که برای فعال سازی ERK1 / 2 مورد نیاز است. مطالعه اخیر نیز دریافت که فسفریلینگ DARPP-32 در Thr-34 برای فعال شدن کوکائین توسط ERK1 / 2 توسط مسیرهای چندگانه شامل تنظیم غیرمستقیم فعال سازی MEK و همچنین تنظیم تنظیم غده پروستات فسفاتاز، تریروزین فسفاتاز که به طور مستقیم بر روی ERK1 / 2 (28) حمایت از این احتمال توسط یافته های حاصل شده است که فسفریلاسیون ناشی از کوکائین MEK1 / 2 در Ser-217 و Ser-221 در موش Tgp35 لغو شد. یکی دیگر از راه های احتمالی، از طریق فسفریلاسیون وابسته به Cdk5 MEK1 در Thr-286 است که منجر به کاهش فعالیت کاتالیزوری آن و منجر به مهار فعالیت ERK1 / 2 می شود (24).
مهار فعالیت Cdk5 در استریاتوم اثبات شده است که اثرات رفتاری درمان کوکائین مزمن در حیوانات (6) مطابق با فرضیه این است که تنظیم مقررات فعالیت Cdk5 ممکن است به انطباق عصبی برای مقابله با اثرات تجویز مکمل کاکائین کمک کند (6)، ما دریافتیم که فسفریلاسیون DARPP-5 و MEK32، متمرکز شده توسط Cdk1، موجب کاهش فعالیت فعال شده توسط کوکائین ERK1 / 2 می شود و منجر به تزریق کمتر فسفوریلاسیون CREB و c-fos در striatum می شود. یافته های ما این ایده را مطرح می کند که افزایش فعالیت Cdk5 در نتیجه تنظیم p35 بالا می تواند بیان ژن در striatum را پس از قرار گرفتن در معرض مزاج کوکائین تغییر دهد. این ممکن است از طریق تغییرات در فعالیت های عوامل رونویسی مانند CREB و c-fos رخ دهد. بنابراین، فعال کننده Cdk5 p35 به علت اثرات محدود کننده آن بر فعالیت Cdk5 ممکن است به تغییرات طولانی مدت در عملکرد عضلانی وابسته به کوکائین کمک کند.
تشکر و قدردانی
ما از خانم ها سپاسگزاریم مری جی دانتون، فیلیپ گرانت و سشی کازوپانی برای خواندن انتقادی از این دستنوشته. این کار توسط موسسه ملی بهداشت Grant Z01DE00664-05 (به ABK)، خدمات بهداشت عمومی عمومی Grant DA10044، و کمک های بنیاد سیمونز، بنیاد Peter J. Sharp و Foundation Picower (به PG) پشتیبانی شد.
یادداشت
اختصارات: Cdk5، کیناز وابسته به سیکلین 5؛ ERK، کیناز تنظیم شده با سیگنال خارج سلولی؛ DARPP-32، دوپامین و فسفو پروتئین تنظیم شده با cAMP، توده مولکولی 32 kDa؛ PKA، کیناز وابسته به cAMP؛ مجاهدین خلق، ERK kinase؛ CREB، پروتئین اتصال دهنده به عنصر cAMP پاسخ.
منابع
;