HUOMAUTUKSIA: Todisteet siitä, että deltafosb jättää jälkiä jälkeensä pitkään toipumisen jälkeen riippuvuudesta. Erityisesti riippuvuus aiheuttaa epigeneettisiä muutoksia, jotka johtavat deltafosbin paljon nopeampaan induktioon, kun uusiutuminen tapahtuu. Tämä selittää, miten uusiutuminen, jopa vuosien jälkeen, voi nopeasti kärjistyä täyteen puhallettuun riippuvaan tilaan.
J Neurosci. Kirjoittajan käsikirjoitus; saatavilla PMC 2013 tammikuussa 25.
Abstrakti
ΔFosB, a FosB geenituote, indusoituu ydinsoluissa (NAc) ja caudate putamenissa (CPu) toistuvalla altistumisella huumeille, kuten kokaiinille. Tämä induktio edistää geenien ilmentymisen poikkeavia malleja ja käyttäytymispoikkeavuuksia, joita havaitaan toistuvalla lääkeaineen altistuksella.
Tällöin arvioimme, voiko rottien altistuminen lääkeaineen etäisyydelle muuttaa indusoituvuutta FosB kokaiinialtistuksen aiheuttama geeni. Osoitamme, että aikaisempi krooninen kokaiinihoito, jota seuraa pitkäaikainen vetäytyminen, lisää indusoituvuutta FosB NAc: ssä, mikä on osoituksena ΔFosB-mRNA: n akuutista induktiosta ja ΔFosB-proteiinin nopeammasta kertymisestä kokaiinin toistuvan altistumisen jälkeen. Ei tällaista pohjustettua FosB induktio havaittiin CPu: ssa, itse asiassa AFosB-mRNA: n seuraava akuutti induktio tukahdutettiin CPu: ssa.
Nämä epänormaalit kuviot FosB ilmentyminen liittyy kromatiinin modifikaatioihin FosB geenin promoottori. Ennen kroonista kokaiinin antamista indusoidaan pitkäaikainen RNA-polymeraasi II: n (Pol II) lisääntyminen FosB vain NAc: n promoottori, mikä viittaa siihen, että Pol II: n "pysähtyminen" on alkanut FosB indusoitumista tässä alueella kokaiinille altistumisen jälkeen. Kokaiiniprojekti laukaisee sitten Pol II: n vapautumisen geenipromoottorista, mikä mahdollistaa nopeamman FosB transkriptio. Kokaiinin haasteena myös vähenee repressiiviset histonimuutokset FosB promoottori NAc: ssä, mutta lisää tällaisia sorron merkkejä ja vähentää aktivointimerkkejä CPu: ssa.
Nämä tulokset antavat uuden käsityksen kromatiinin dynamiikasta FosB promoottori ja paljastaa uuden mekanismin alustalle FosB induktio NAc: ssä uudelleen altistumisen jälkeen kokaiiniin.
esittely
Huumausaineiden väärinkäytöstä on tunnusomaista pakonomainen huumeiden etsiminen ja sen ottaminen vakavista haittavaikutuksista huolimattaKalivas et ai., 2005; Hyman et ai., 2006). Krooninen lääkeaineen altistuminen aiheuttaa jatkuvia muutoksia geenien ilmentymiseen ventral striatum (tai nucleus accumbens; NAc) ja dorsal striatum (tai caudate putamen; CPu), striatal rakenteita liittyy huumeiden palkita ja riippuvuus (Freeman et ai., 2001; Robinson ja Kolb, 2004; Shaham ja Hope, 2005; Maze ja Nestler, 2011). AFosB, lyhyt ja stabiili proteiini, jota koodaa välittömästi varhaisen geenin, FosB, on hyvin karakterisoitu transkriptiotekijä, joka on indusoitu NAc: ssä ja CPu: ssa kroonisella altistumisella käytännössä kaikkiin väärinkäytön lääkkeisiin, jossa se välittää herkistettyjä käyttäytymisvasteita toistuvaan lääkkeen antamiseen (Nestler, 2008). Kuitenkin onko aikaisempi krooninen altistuminen lääkkeen väärinkäytölle muuttaa AFosB: n myöhempää induktiota, ei ole vielä tiedossa.
Oletimme äskettäin, että kromatiinimuutokset vasteena krooniselle lääkeaineen altistukselle saattavat muuttaa tiettyjen geenien indusoituvuutta kohde-aivojen alueilla (Robison ja Nestler, 2011). Lisääntyvä näyttö on osoittanut, että kroonisen annostelun jälkeen käytettävät huumeet muuttavat kromatiinin rakennetta ja transkriptiokäyttöä lukuisilla muunnelmilla, mukaan lukien fosforylaatio, asetylointi ja histonihan metylointi. Tuoreempi työ soluviljelyjärjestelmissä on keskittynyt RNA-polymeraasin II (Pol II) rekrytointiin "indusoituvien" geenien promoottoriin ennen niiden ilmentymistä, jolloin Pol II sitoutui pysyvästi proksimaalisiin promoottorialueisiin ja transkription aloituspaikan (TSS) ympärille. ) "pysähtyneessä" tilassa (Core ja Lis, 2008; Nechaev ja Adelman, 2008). Pysyvän Pol II: n aktivoinnin uskotaan olevan vastuussa sen pakenemisesta promoottori- ja TSS-alueilta ja niiden transkription näistä "pohjustetuista" geeneistä (Zeitlinger et ai., 2007; Saha et ai., 2011; Bataille et ai., 2012).
Tässä osoitamme, että aikaisempi krooninen altistuminen kokaiinille, jota seurasi pitkäaikainen vetäytymisaika, muuttaa sen induktiivisuutta FosB geeni myöhempää kokaiinin antamista varten, ja NAc on pohjustettu induktiolle, kun taas CPu ei ole. Sitten tunnistamme erilliset kromatiinin allekirjoitukset FosB geenipromoottori NAc: ssä ja CPu: ssa, jotka liittyvät sellaiseen aberrantin indusoituvuuteen FosB geeni mukaan lukien pysähtyneen Pol II: n rekrytointi FosB proksimaalinen promoottori vain NAc: ssä sekä muutokset useissa aktivoivissa tai tukahduttavissa histonimuutoksissa molemmissa aivojen alueilla. Nämä tulokset antavat uuden käsityksen kromatiinin dynamiikasta FosB geenipromoottori ja osoittavat ensimmäistä kertaa mekanismin, jolla Pol II -primeiden pysähtyminen FosB suuremmaksi aktivoimiseksi NAc: ssä, kun kokaiinille altistuminen tapahtuu uudelleen.
Materiaalit ja menetelmät
Eläimet
Kaikissa kokeissa käytettyjä urospuolisia Sprague Dawley -rottia (250-275 g; Charles River Laboratories) pidettiin pareittain ilmastoidussa huoneessa 12 hr -valo / pimeässä syklissä (valot palasivat 7 AM: ssä), ja niillä oli pääsy elintarvikkeisiin ja vesi ad libitum. Kaikki eläimet injektoitiin kahdesti vuorokaudessa kymmenen päivän ajan kokaiinilla (15 mg / kg, ip) tai suolaliuoksella (ip) kotihäkkinsä. Eläinkokeet hyväksyttiin Sinai-vuoren laitoseläinten hoito- ja käyttövaliokunnassa (IACUC).
Liikuntamittaukset
Eläimet tapah- tettiin liikkuvaan kammioon ensimmäisenä päivänä 1 h: n ajan ja seurattiin sitten liikkuvuuden aktiivisuutta suolaliuoksen injektion jälkeen käyttämällä Photobeam-aktiivisuusjärjestelmää (San Diego Instruments). Kun 1 hr-tottumukset tapahtuivat joka päivä liikkuvissa kammioissa, kokaiinia (15 mg / kg, ip) annettiin päivittäin 2-päiville ja eläimiä seurattiin jälleen liikkuvuuden aktiivisuuden suhteen 1 hr: ssa.
immunohistokemia
Eläimet perfundoitiin 24 hr: lla viimeisen lääkeaineen altistuksen jälkeen. AFosB / FosB-immunoreaktiivisuus havaittiin kuvatulla tavalla (Perrotti et ai., 2004). Western-blottaus vahvisti, että kaikki AFosB / FosB: n kaltaiset immunoreaktiivisuudet havaitsivat 24 hr tai kauemmin sen jälkeen, kun kokaiinin injektiot heijastivat AFosB: tä, jolloin FosB ei ollut havaittavissa (ei esitetty).
RNA-eristys, käänteinen transkriptio ja PCR
NAc: n ja dorsolateraalisen / dorsomediaalisen CPu: n kahdenväliset 12-mittari-lyönnit saatiin kuvatulla tavalla (Perrotti et ai., 2004), jäädytetty kuivalla jäällä ja käsitelty julkaistujen \ tCovington et ai., 2011). AFosB ja FosB mRNA mitattiin käyttäen kvantitatiivista PCR: ää (qPCR) isoformaatti-spesifisillä AFosB- ja FosB-alukkeilla (Alibhai et ai., 2007). FosB- ja FosB-mRNA-tasot normalisoitiin GAPDH-mRNA-tasoille, joita kokaiinialtistus ei vaikuttanut (ei esitetty).
Western-blottaus
NAc- ja CPu-lävistimet kerättiin edellä kuvatulla tavalla ja käsiteltiin Western-blottaukseen kuvatulla tavalla (Covington et ai., 2011) käyttäen vasta-aineita ERK44 / 42 [solunulkoinen signaali säännelty kinaasi-44 / 42] ja fosfoERK44 / 42 (pERK), AKT [tymoma-viruksen proto-onkogeeni] ja p-AKT, SRF (seerumin vastekerroin) ja pSRF, CREB [cAMP-vaste-elementin sitova proteiini] ja pCREB. Kullekin kaistalle blottatun proteiinin määrä normalisoitiin aktiinin tai tubuliinin tasoille, joita kokaiinialtistus ei vaikuttanut.
Kromatiinin immunosaostus (ChIP)
Juuri leikatut NAc- ja CPu-lyönnit valmistettiin ChIP: lle kuvatulla tavalla (Maze et ai., 2010). Kukin koeolosuhteet analysoitiin kolmena kappaleena riippumattomilta eläinryhmiltä. Kullekin ChIP-näytteelle kahdenväliset NAc- ja CPu-lävistimet yhdistettiin viidestä rotasta (10-rei'it). Konkreettisiin histonimuutoksiin käytetyt vasta-aineet ovat samat kuin julkaistut (Maze et ai., 2010); vasta-aineet Pol II: n fosforyloimiksi sen karboksyyliterminaalisen domeenin (CTD) Ser5: ssa (Pol II-pSer5) saatiin abcam 5131: ltä. Neljä ChIP-alukkeiden sarjaa on suunniteltu FosB (Lazo et ai., 1992; Mandelzys et ai., 1997): 1F: GTACAGCGGAGGTCTGAAGG, 1R: GAGTGGGATGAGATGCGAGT; 2F: CATCCCACTCGGCCATAG, 2R: CCACCGAAGACAGGTACTGAG; 3F: GCTGCCTTTAGCCAATCAAC, 3R: CCAGGTCCAAAGAAAGTCCTC; 4F: GGGTGTTTGTGTGTGAGTGG, 4R: AGAGGAGGCTGGACAGAACC. Kromatiinin modifikaatioiden tasoja verrataan syötetyn DNA: n tasoihin, kuten on kuvattu (Maze et ai., 2010).
Tilastollinen analyysi
Kaikki ilmoitetut arvot ovat keskiarvoja ± puoli Tiedot liikkumisaktiivisuudesta ja solujen laskemisesta analysoitiin kaksisuuntaisilla ANOVA: illa tekijöinä hoito ja injektio. qPCR-kokeet analysoitiin aikapistettä kohti yksisuuntaisilla ANOVA-menetelmillä, joissa käsittely oli tekijä. Kun havaittiin merkittäviä päävaikutuksia (p <0.05), Bonferroni-post-hoc-testit tehtiin vertailua varten lääkkeettömillä suolaliuoksella hoidetuilla eläimillä (^ luvuissa) ja huumeita käyttämättömillä kokaiinilla hoidetuilla eläimillä (* kuvina). Parittomia kaksihäntäisiä Student-t-testejä käytettiin Western-blottaus- ja ChIP-tietoihin, korjattuina useita vertailuja varten.
tulokset
suurempi Kokaiinilla kokeneiden rottien Fosb-indusoitavuus NAc: ssä, mutta ei CPu: ssa
Tutkitaan aikaisemman kroonisen kokaiinin vaikutusta, jota seurasi pitkäaikainen vetäytymisjakso. \ T FosB geeni vasteena myöhemmälle kokaiinialtistukselle, rotille, joille oli aiemmin injektoitu ip kahdesti päivässä suolaliuoksella tai kokaiinilla (15 mg / kg) 10-päiville, annettiin lääkeaineen altistusannoksia 28: n poistopäivien jälkeen (Kuva 1A). Ensin mitattiin lokomotorivasteet yhdessä eläinryhmässä vahvistaaksemme lokomotorisen herkistymisen induktion aikaisemmalla kokaiinialtistuksella, joka on lääkkeen antamisen odotettu pysyvä seuraus. Kokaiinilla kokeneilla ja -voitetuilla rotilla oli vastaava lähtötilanteinen liikuntatoiminta, ja kokaiinin haittavaikutus ei ollut aikaisemmin hoidetuilla eläimillä, mikä lisäsi niiden liikkumista (Kuva 1B. Toistuvat toimenpiteet kaksisuuntaiset ANOVA, käsittely: F1,66 = 30.42, p <0.0001; kokaiinihaaste: F2,66= 58.39, p <0.0001; hoito x kokaiinialtistus: F2,66= 8.56, p = 0.0005, Bonferronin jälkitestit ^p <0.001). Tämä kokaiinialtistus aiheutti merkittävästi suuremman liikunta-aktiivisuuden, ts. Herkistymisen, kokaiinia kokeneilla rotilla (Bonferroni-testit * p <0.001).
Tämän kokaiini-esikäsittelyohjelman vaikutusten arvioimiseksi AFosB: n ilmentymiseen NAc: ssä ja CPu: ssa mitattiin AFosB-proteiinia immunohistokemiallisilla menetelmillä 24 hr kokaiinilla ei-aiemmin hoidettujen ja kokaiinilla kokeneiden eläinten hoidossa 0, 1, 3 tai 6 päivittäin kokaiiniprojekti injektiot (15 mg / kg; ks Kuva 1A). Kuten aiemmin (Nye et ai., 1995), 3-kokaiinin injektiot olivat riittäviä indusoimaan merkittävästi ΔFosB-proteiinia lääkevalmisteella ei-aikaisemmin eläinten NAc: ssä ja CPu: ssa, ja sen kertyminen säilyi merkittävänä 6-päivien jälkeen kokaiinin injektioissa (Kuva 1C. Toistuvat toimenpiteet kaksisuuntaiset ANOVA, NAc-ydin, käsittely: F1,28= 23.5, p <0.0001; kokaiinihaaste: F3,28= 49.16, p <0.0001; hoito x kokaiinialtistus: F3,28= 6.83, p = 0.0014; NAc-kuori, käsittely: F1,28= 18.69, p <0.0001; kokaiinihaaste: F3,28= 31.52, p <0.0001; hoito x kokaiinialtistus: F3,28= 3.21, p <0.05; CPu, hoito: F1,28= 9.47, p <0.001; kokaiinihaaste: F3,28= 19.74, p <0.0001; hoito x kokaiinialtistus: F3,28= 0.94, p> 0.05. NAc-ytimessä, kuoressa ja CPu: ssa Bonferroni-jälkitestit ^p <0.05). Kokaiinia kokeneilla eläimillä ei ollut todisteita jatkuvasta ΔFosB-induktiosta NAc: ssä tai CPu: ssa 28 päivän vetäytymisen jälkeen, aikaisempien raporttien mukaisesti, että ΔFosB-signaali haihtuu täysin tähän aikaan (Nye et ai., 1995), miksi tätä ajankohtaa käytettiin tässä tutkimuksessa. Silmiinpistävällä tavalla kokaiinilla kokeneilla rotilla, jotka saivat 3- tai 6-kokaiiniprojektiot, oli huomattavasti suurempi ΔFosB-proteiinin induktio NAc: ssä, mikä näkyy sekä ydin- että kuoriosatoilla (Kuva 1C. Bonferroni-testit * p <0.05). Sitä vastoin tällaista suurempaa AFosB-proteiinin induktiota ei havaittu CPu: ssa; sen sijaan vastaava ΔFosB-induktio havaittiin tällä alueella 3 tai 6 päivän kokaiinialtistuksen jälkeen kokaiinia aikaisemmin käyttämättömillä ja kokeneilla rotilla (Kuva 1C).
Saadakseen oivalluksen NAc: ssä ja CPu: ssa esiintyvistä transkriptiomuutoksista vasteena kokaiiniprobleemille tutkittiin AFosB- ja FosB-mRNA-transkriptien indusoitavuuden aikakäyrää (45, 90 ja 180 min) yksittäisen kokaiinin tai suolaliuoksen injektion yhteydessä. kokaiinilla ei-aikaisemmin ja kokeneille rotille 28-päivän vetäytymispäivien jälkeen (ks. ks. \ t Kuva 1A). Suhteessa suolaliuokseen haasteeseen kokaiinin aiheuttama haaste aiheutti ΔFosB- ja FosB-mRNA-tasojen nopean nousun kaikissa kolmessa ajankohdassa sekä NAc: ssä että CPu: ssa, kun kokaiinilla ei ole aiemmin eläimiä (Kuva 1D. Toistuvat toimenpiteet yhden suuntaisen ANOVA: n kohdalla ajankohtana; Bonferronin jälkitestit ^p <0.05). NAc: ssä havaitsimme suuremman ΔFosB- ja FosB-mRNA-induktion kokaiinilla kokeneilla eläimillä verrattuna kokaiinivastaaviin eläimiin kokaiinialtistuksen jälkeen, jolloin vaikutus oli merkittävä 90 minuutin kohdalla, kun taas päinvastoin ΔFosB- ja FosB-mRNA: n indusoituvuus CPu: ssa oli merkittävästi kokaiinia kokeneilla eläimillä (Kuva 1D. Bonferronin jälkitestit %p = 0.08, * p <0.05).
Kokaiinilla kokeneiden rottien NAc: n ja CPu: n ylävirran signaalireittien karakterisointi
Yksi mahdollinen selitys. \ T FosB NAc: n ja CPu: n geeni aikaisemman kroonisen kokaiinin jälkeen on, että kokaiinialtistuksen etähistoria voi aiheuttaa pysyviä muutoksia signalointireiteillä, jotka ovat ylävirtaan FosB geenin induktio niin, että kokaiinin altistuminen indusoi geenin poikkeavassa määrin. Tämän hypoteesin selvittämiseksi analysoimme kaksi transkriptiotekijää, SRF ja CREB, jotka on äskettäin osoitettu vaadittavan ΔFosB: n kokaiinin induktiota näissä aivojen alueilla (Vialou et ai., 2012) yhdessä ylävirran proteiinikinaasien, ERK: n ja AKT: n kanssa, myös kokaiinitoimintaan (Valjent et ai., 2000; Lu et ai., 2006; Boudreau et ai., 2009). Emme pystyneet havaitsemaan mitään muutoksia näiden eri proteiinien kokonais- tai fosforyloiduissa tasoissa, jotka voisivat selittää muutetun indusoituvuuden. FosB havaittu, mukaan lukien muutokset SRF: ssä, CREB: ssä tai AKT: ssäKuva 2B, C). PsRF: n ja pCREB: n muutoksen puute NAc: ssä vastauksena kokaiiniprobleemiin on yhdenmukainen äskettäisen raportin kanssa, joka havaitsi sekä kroonisen kokaiinin aiheuttaman merkitsevän vaikutuksen (Vialou et ai., 2012).
Aikaisemmin hoidettujen eläinten NAc- ja CPu-arvoissa 20 min aloitusannoksen jälkeen (Kuva 2A), yksi kokaiinin haasteena on alentaa pERK42 / 44-\ tKuva 2B, C. Kaksi hännän opiskelijan t-testi: * p <0.05). Aiemmin on raportoitu pERK-tasojen noususta näillä alueilla akuutin kokaiinin antamisen jälkeen (Valjent et ai., 2000). Tätä on vaikea verrata muihin asiakirjoihin, joissa tutkitaan ERK: n fosforylaatiota NAc: ssä peruuttamisen yhteydessä toistuvista kokaiinin injektioista (Boudreau et ai., 2007; Shen et ai., 2009), kuten tutkimuksessamme pERK kvantifioitiin 28-päivien vetäytymisen jälkeen ja kokaiinin tai suolaliuoksen jälkeen. Suhteessa aikaisemmin kokaiinia sairastaviin eläimiin, jotka kokaiinilla oli kokaiinilla kokeneilla rotilla, 28-vetäytymispäivien jälkeen uusiutunut kokaiini lisääntyi merkittävästi pERK42 / 44-tasoilla CPu: ssa (Kuva 2B, C. Kahden hännän opiskelijan t-testi: * p <0.05).
Kromatiinin maisema Fosb-geenin promoottori NAc: ssä ja CPu: ssa kokaiinilla kokeneilla rotilla
Seuraavaksi tutkimme, tapahtuvatko muutokset FosB geenin indusoituvuus liittyy sen kromatiinirakenteen muutoksiin. ChIP suoritettiin NAc: llä ja CPu: lla käyttäen vasta-aineita, jotka oli suunnattu histonimuutosten kolmea hyvin karakterisoitua muotoa vastaan: histonin H4: n Lys3: n (H3K4me3) trimetylointi, joka on liittynyt geenin aktivointiin, ja H3K27me3 ja H3K9me2, jotka liittyvät geenin repressioon. Analysoimme kokaiinin ja aiemmin kokeneet rotat 28-poistumispäivien jälkeen joko ilman kokaiinin injektionestettä tai sen jälkeen, kun eläimiä tutkittiin myöhemmin 1 hr.Kuva 3A). NAc: ssä ei havaittu mitään merkittäviä muutoksia minkään näiden kolmen histonin muutoksen sitoutumiseen FosB geenipromoottori ilman kokaiinin haastetta, vaikka H3K9me2: n alentuneita tasoja oli \ tKuva 3B-D. Kaksiosainen opiskelija-t-testi. #p = 0.2 verrattuna vastaaviin Drug Naïve-kontrolleihin). Tämä vaikutus tuli merkittäväksi kokaiinin haasteen jälkeen ja oli spesifinen geenin proksimaaliselle promoottorialueelle (Kuva 3C. * p <0.05). Vaikka H3K9me2: n tasot ovat joillakin geeneillä hyvin alhaiset, FosB geenipromoottorilla on huomattavia määriä tätä merkkiä NAc: ssä kontrolliolosuhteissa (Maze et ai., 2010, tietoja ei ole esitetty). Sitä vastoin CPu: ssa löysimme pieniä mutta merkittäviä H3K4me3-sidoksen vähenemisiä ja lisääntyivät H3K27me3-sidonnassa, FosB promoottori kokaiiniprojektin puuttuessa, haasteen jälkeen menetetyt vaikutuksetKuva 3D. * p <0.05).
Seuraavaksi tutkimme Pol II: n sitoutumista FosB geeni, joka perustuu soluviljelmän viimeaikaisiin havaintoihin, että Pol II: n pysäyttäminen TSS: issä, jolle on tunnusomaista sen fosforylaatio Ser 5: ssä sen CTD-toistosalueella, liittyy geenien alkuunpanoon (katso Johdanto). Täten analysoimme Pol II-pSer5: n sitoutumisen FosB geenin neljällä eri alueella (Kuva 3B). Tämä analyysi paljasti Pol II-pSer5: n merkittävän rikastumisen FosB geeni sen proksimaalisessa promoottorialueella ja sen TSS: n ympärillä NAc: ssä kokaiinilla kokeneiden eläinten jälkeen pitkittyneen vetäytymisen jälkeen, ilman kokaiinivaikutusta verrattuna kontrolleihin (Kuva 3E. * p <0.05). Tämä rikastuminen ei ollut ilmeistä FosB, joka on sopusoinnussa yksinkertaisissa kokeellisissa järjestelmissä kuvatun Pol II: n pysähtymisen kanssa. Mielenkiintoista on, että kokaiinihaasteen jälkeen Pol II-pSer5-sitoutumisella oli edelleen merkkejä rikastumisesta, mutta ei enää merkittävästi, FosB proksimaalinen promoottorialue (Kuva 3E. %p = 0.1), mutta palasi kontrollitasoille TSS: ssä. CPu: n havainnot olivat vaihtelevampia, eikä havaittu selkeää Pol II-pSer5-sitoutumisen kuviota.
Keskustelu
Tämä tutkimus antaa uuden käsityksen kestävästä sääntelystä FosB viikon kuluttua kokaiinin toistuvan altistuksen lopettamisesta. Osoitamme, että aikaisempi krooninen kokaiinihoito tekee FosB geeni, joka on indusoitavissa paremmin NAc: ssä, mikä johtaa nopeampaan AFosB: n kertymiseen lääkkeen uudelleen altistumisen jälkeen. Koska todisteita siitä, että ΔFosB-induktio NAc: ssä välittää herkistettyjä käyttäytymisvasteita kokaiinille (Nestler, 2008) löydöksemme paljastaa uuden mekanismin tällaisten herkistettyjen reaktioiden nopeamman palauttamisen jälkeen pitkittyneen vetäytymisen jälkeen.
Osoitamme, että AFosB: n lisääntynyt induktio NAc: ssä liittyy kromatiinimuutoksiin FosB geenin, jonka odotetaan alkavan suuremmalle induktiolle. Niinpä osoitamme lisääntyneen Pol II: n sitoutumisen geenin proksimaaliseen promoottoriin ja TSS-alueisiin, jotka ovat läsnä 4-viikkojen jälkeen ennen kroonisen kokaiinin antoa. Tällainen PolII-rikastus TSS: ssä häviää nopeasti kokaiinin haasteen ja FosB induktio, joka on sopusoinnussa sellaisen soluviljelmän mallin kanssa, joka pysäytti Pol II: n vapautumisen TSS: istä geeniaktivaation jälkeen (katso Johdanto). Kokaiiniprobleemi aiheuttaa myös nopean vähenemisen H3K9me2: n sitoutumisessa, joka on merkki geenipressiosta. FosB promoottori. Sitä vastoin havaitsimme pysyvää induktiota useista transkriptiotekijöistä tai niiden ylävirran kinaaseista, joiden tiedetään välittävän FosB kokaiinin induktio. Nämä tulokset tukevat olettamustamme, että AFosB: n lisääntynyt induktio NAc: ssä välittyy epigeneettisen alukkeen avulla. FosB geenin eikä ylöspäin tapahtuvien tapahtumien säätämisen kautta.
CPu: lle saatiin hyvin erilaisia tuloksia. Ei ollut näyttöä siitä, että Pol II olisi pysähtynyt FosB kokaiinilla kokeneilla rotilla ennen kokaiinin haastetta, vaikka oli olemassa pieniä mutta merkittäviä histonimuutoksia, jotka olivat sopusoinnussa geenin repressointiin: lisääntynyt H3K27me3-sitoutuminen ja alentunut H3K4me3-sitoutuminen. Ei ollut myöskään muutoksia ylävirran transkriptiotekijöissä tai kinaaseissa, jotka olisivat pienentyneet FosB induktio. Nämä havainnot viittaavat siihen, että kroonisen kokaiinin antamisen jälkeen epigeneettiset muutokset heikentävät FosB geenin indusoituvuus CPu: ssa, toisin kuin NAc: ssä havaittu priming. Vaikka nämä vaikutukset tukahduttavat AFosB: n mRNA: n induktion uudelleen altistumisen yhteydessä kokaiinille, ΔFosB-proteiinin kertymisessä ei ole menetystä. Tämän paradoksin taustalla oleva mekanismi vaatii nyt lisätutkimuksia.
Yleisemmin, tulostemme tukevat mallia, jossa kromatiinimaiseman muutokset tiettyihin geeneihin vasteena krooniselle kokaiinin antamiselle pyrkivät alkamaan tai tylsistämään näitä geenejä myöhempää indusointia varten, kun ne altistetaan uudelleen lääkkeelle. Tällaiset kromatiinin muutokset, joita voidaan pitää "epigeneettisinä arpeina", jäävät vaille geenien vakaan tilan mRNA-tasojen analyyseissä. Tällä tavoin riippuvuuden epigeenin karakterisointi lupaa paljastaa tuoreita tietoja häiriön molekyylipatogeneesistä, jota voidaan kaivaa uusien hoitojen kehittämiseksi.
Viitteet
- Alibhai IN, Green TA, Potashkin JA, Nestler EJ. FosB- ja DeltafosB-mRNA-ilmentymisen säätely: in vivo ja in vitro -tutkimukset. Brain Res. 2007;1143: 22-33. [PMC vapaa artikkeli] [PubMed]
- Bataille AR, Jeronimo C, Jacques PE, Laramee L, Fortin ME, Forest A, Bergeron M, Hanes SD, Robert F. Universal RNA -polymeraasi II CTD-sykli on järjestetty kompleksisilla väleillä kinaasin, fosfataasin ja isomeraasientsyymien välillä geenejä pitkin. Mol Cell. 2012;45: 158-170. [PubMed]
- Boudreau AC, Reimers JM, Milovanovic M, Wolf ME. Solun pinnan AMPA-reseptorit lisääntyvät rotan ytimessä kokaiinin poiston aikana, mutta sisäistyvät kokaiinin altistumisen jälkeen mitogeeniaktivoitujen proteiinikinaasien muuttuneen aktivaation yhteydessä. J Neurosci. 2007;27: 10621-10635. [PMC vapaa artikkeli] [PubMed]
- Boudreau AC, Ferrario CR, Glucksman MJ, Wolf ME. Signalointireittien mukautukset ja uudet proteiinikinaasi-A-substraatit, jotka liittyvät käyttäytymiseen herkistymiseen kokaiiniin. J Neurochem. 2009;110: 363-377. [PMC vapaa artikkeli] [PubMed]
- Core LJ, Lis JT. Transkription säätely RNA-polymeraasin II promoottorin proksimaalisen tauon avulla. Science. 2008;319: 1791-1792. [PMC vapaa artikkeli] [PubMed]
- Covington HE, 3rd, Maze I, Sun H, Bomze HM, DeMaio KD, Wu EY, Dietz DM, Lobo MK, Ghose S, Mouzon E, Neve RL, Tamminga CA, Nestler EJ. Repressoivan histonin metylaation rooli kokaiinin aiheuttamassa haavoittuvuudessa stressiin. Neuron. 2011;71: 656-670. [PMC vapaa artikkeli] [PubMed]
- Freeman WM, Nader MA, Nader SH, Robertson DJ, Gioia L, Mitchell SM, Daunais JB, Porrino LJ, Friedman DP, Vrana KE. Krooninen kokaiinivälitteinen muutos ihmisen kädellisten ydinaseessa accumbens geeniekspressiota. J Neurochem. 2001;77: 542-549. [PubMed]
- Hyman SE, Malenka RC, Nestler EJ. Riippuvuuden hermomekanismit: palkkioon liittyvän oppimisen ja muistin rooli. Annu Rev Neurosci. 2006;29: 565-598. [PubMed]
- Kalivas PW, Volkow N, Seamans J. Hallitsemattoman motivaation riippuvuus: patologia prefrontal-accumbens-glutamaattilähetyksessä. Neuron. 2005;45: 647-650. [PubMed]
- Lazo PS, Dorfman K, Noguchi T, Mattei MG, Bravo R. FosB-geenin rakenne ja kartoitus. FosB laskee fosB-promoottorin toimintaa. Nucleic Acids Res. 1992;20: 343-350. [PMC vapaa artikkeli] [PubMed]
- Lu L, Koya E, Zhai H, Hope BT, Shaham Y. ERK: n rooli kokaiiniriippuvuudessa. Trendit Neurosci. 2006;29: 695-703. [PubMed]
- Mandelzys A, Gruda MA, Bravo R, Morgan JI. Pysyvästi kohonneen 37 kDa fos-liittyvän antigeenin ja AP-1-kaltaisen DNA: ta sitovan aktiivisuuden puuttuminen kainiinihapolla käsiteltyjen fosB-nullhiirien aivoissa. J Neurosci. 1997;17: 5407-5415. [PubMed]
- Maze I, Nestler EJ. Riippuvuuden epigeneettinen maisema. Ann NY Acad Sei. 2011;1216: 99-113. [PMC vapaa artikkeli] [PubMed]
- Maze I, Covington HE, 3rd, Dietz DM, LaPlant Q, Renthal W, Russo SJ, Mechanic M, Mouzon E, Neve RL, Haggarty SJ, Ren Y, Sampath SC, Hurd YL, Greengard P, Tarakhovsky A, Schaefer A, Nestler EJ. Histonimetyylitransferaasin G9a: n olennainen rooli kokaiinin aiheuttamassa plastisuudessa. Science. 2010;327: 213-216. [PMC vapaa artikkeli] [PubMed]
- Nechaev S, Adelman K. Promoottori-proksimaalinen Pol II: kun pysähtyminen nopeuttaa asioita. Solukierto. 2008;7: 1539-1544. [PubMed]
- Nestler EJ. Arvostelu. Riippuvuuden transkriptionaaliset mekanismit: DeltaFosB: n rooli. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2008;363: 3245-3255. [PMC vapaa artikkeli] [PubMed]
- Nye HE, Hope BT, Kelz MB, Iadarola M, Nestler EJ. Farmakologiset tutkimukset kokaiinin kroonisen FOS: een liittyvän antigeenin induktion säätelystä striatumissa ja ytimessä. J Pharmacol Exp Ther. 1995;275: 1671-1680. [PubMed]
- Perrotti LI, Hadeishi Y, Ulery PG, Barrot M, Monteggia L, Duman RS, Nestler EJ. DeltaFosB: n indusointi palkkioon liittyvissä aivorakenteissa kroonisen stressin jälkeen. J Neurosci. 2004;24: 10594-10602. [PubMed]
- Robinson TE, Kolb B. Rakenteellinen plastisuus, joka liittyy altistumiseen huumeisiin. Neurofarmakologia 47 Suppl. 2004;1: 33-46. [PubMed]
- Robison AJ, Nestler EJ. Transkriptionaaliset ja epigeneettiset riippuvuusmekanismit. Nat Rev Neurosci. 2011;12: 623-637. [PMC vapaa artikkeli] [PubMed]
- Saha RN, Wissink EM, Bailey ER, Zhao M, Fargo DC, Hwang JY, Daigle KR, Fenn JD, Adelman K, Dudek SM. Arcin ja muiden IEG: ien nopea aktiivisuus-indusoitu transkriptio perustuu valmiisiin RNA-polymeraaseihin II. Nat Neurosci. 2011;14: 848-856. [PMC vapaa artikkeli] [PubMed]
- Shaham Y, Hope BT. Neuroadaptoitumien rooli huumeiden etsinnässä. Nat Neurosci. 2005;8: 1437-1439. [PubMed]
- Shen HW, Toda S, Moussawi K, Bouknight A, Zahm DS, Kalivas PW. Muutettu dendriittisen selkärangan plastisuus kokaiinista poistetuilla rotilla. J Neurosci. 2009;29: 2876-2884. [PMC vapaa artikkeli] [PubMed]
- Valjent E, Corvol JC, sivut C, Besson MJ, Maldonado R, Caboche J. Ulkosolulaarisen signaalin säätelemän kinaasikasetin osallistuminen kokaiinia palkitseviin ominaisuuksiin. J Neurosci. 2000;20: 8701-8709. [PubMed]
- Zeitlinger J, Stark A, Kellis M, Hong JW, Nechaev S, Adelman K, Levine M, Young RA. RNA-polymeraasi, joka pysähtyy kehityskontrolligeeneihin Drosophila melanogaster -alkiossa. Nat Genet. 2007;39: 1512-1516. [PMC vapaa artikkeli] [PubMed]
- Vialou VF, Feng J, Robison AJ, Ferguson D, Scobie KN, Mazei-Robison M, Mouzon E, Nestler EJ. Seerumin vasteen tekijä ja cAMP-vaste-elementin sitova proteiini ovat molemmat välttämättömiä ΔFosB: n kokaiinin induktiolle. J Neurosci. 2012 hyväksytään. [PMC vapaa artikkeli] [PubMed]