Lähde
Nathan Kline -instituutti, Orangeburg, New York, 10962, USA. [sähköposti suojattu]
Abstrakti
Lapset ja nuoret ovat yhä alttiimpia psykostimulaattoreille joko laittomasti tai tavallisten neuropsykiatristen tilojen hoitoon, kuten tarkkaavaisuusvaikeushäiriöön hyperaktiivisuuden kanssa ja ilman. Huolimatta psykomotoristen stimulanttien laajasta käytöstä nuoremmissa ikäryhmissä, tiedetään vain vähän kroonisista molekulaarisista neuroadaptiveista vasteista näille aineille epäkypsissä aivoissa. Tässä osoitamme, että psykostimulanttien kroonisen antamisen jälkeen kokaiini ja amfetamiini, transkriptiotekijä deltaFosB on säädetty ylemmälle ytimelle periadolescent hiiret mutta ei vieroituksessa tai aikuisessa hiiret. Induktio deltaFosB esiintyy myös yksinomaan caudate putamen of periadolescent hiiret jälkeen amfetamiini antoa. Nämä tulokset osoittavat kriittisen molekyylin nuoren aivojen ainutlaatuisen plastisuuden, joka säätelee psykostimulanttia ja viittaa siihen, että nämä neuroadaptiviset muutokset voivat osallistua tehostettu riippuvuussuuntaukset nuoressa suhteessa aikuiseen.
esittely
Psykostimulaattoreita käytetään yleisten lapsuushäiriöiden, kuten huomion alijäämän hyperaktiivisuuden hoidossa. Lisäksi stimulanttien, mukaan lukien amfetamiinin ja kokaiinin, väärinkäyttö on yleistä nuorten keskuudessa, ikä, jolla on todisteita aikuisten lisääntyneistä riippuvuussuhteista (Estroff et ai., 1989; Myers ja Anderson, 1991). Huolimatta kehityksellisesti säännellyistä käyttäytymisvaikutuksista osoittavista tiedoista on vähän tiedossa molekyylien neuroadaptivista vasteista epäkypsissä aivoissa, joita esiintyy näiden aineiden antamisen aikana. Kokaiini ja amfetamiini voivat vaikuttaa pitkäkestoisiin käyttäytymismuutoksiin osittain dopamiini D: n stimuloinnin kautta1reseptoreiden ja transkriptiotekijöiden, mukaan lukien ΔFosB: n, tasojen nousu selkästriatumissa (ts. caudate putamen) ja ventral striatumissa (ts.Chen et ai., 1997). ΔFosB: n tasojen lisääntyminen, mahdollisesti proteiinituotteiden stabiloinnin kautta, jatkuu usean viikon ajan kokaiinin tai amfetamiinin kroonisen altistumisen jälkeen, ja sitä säännellään ainakin osittain dopamiinin signaalitransduktiopolulla (Chen et ai., 1997; Nestler et ai., 2001).
Nuorten eläinten keskeinen dopaminerginen järjestelmä on hyvin muuttumassa kriittisten molekyylien muuttuvien tasojen seurauksena normaalin kehityksen aikana, mukaan lukien dopamiini D1reseptori DARPP-32 (dopamiini ja cAMP: n säätämä fosfoproteiini; Mr 32 kDa) ja cAMP (Ehrlich et ai., 1990;Teicher et ai., 1993; Perrone-Capano et ai., 1996; Tarazi et ai., 1999;Andersen, 2002). Tämän jakson aikana altistuminen psykostimulanteille, jotka parantavat dopaminergista neurotransmissiota, voivat siten johtaa kvantitatiivisesti ja / tai kvalitatiivisesti erilaisiin molekyylivasteisiin, mukaan lukien muutokset AFosB-ilmentymiseen. Hypoteesin testaamiseksi, että psykostimulanteille altistumisen aikana esiintyy ikään perustuvia neuroadaptivisia vasteita, analysoitiin kolmea hiiriryhmää sarjakokeissa: aikuiset (60 d vanha injektion alussa), periadolescent (33 d vanha injektion alussa), ja vieroituksen jälkeen (24 d vanha injektion alkaessa). Tämä on ensimmäinen suora vertailu molekyyli- neuroadaptiviin vasteisiin krooniseen psykostimuloivaan altistukseen näissä kolmessa ikäryhmässä. Havaitsimme, että samanlaisten käsittelyparadigmien jälkeen periadolescent hiiret osoittavat parannettua ΔFosB-ylösregulaatiota vasteena sekä kokaiinille että amfetamiinille.
MATERIAALIT JA MENETELMÄT
Eläimet ja lääkkeiden antaminen. Urospuoliset CD-1-hiiret (Charles River Laboratories, Kingston, NY) sijoitettiin 12 hr -valo / pimeään jaksoon (6: 00 AM - 6: 00 PM) ad libitumpääsy ruokaan ja veteen. Eläimien annettiin sijoittua eläinhuoneeseen vähintään 10 d: een ennen injektioiden aloittamista. Eläimiä käsittelivät kaksi tutkijaa, jotka suorittivat kaikki injektiot samassa huoneessa, jossa eläimet oli sijoitettu. Kaikki eläimet vieroitettiin iässä 21 d. Injektiot aloitettiin 24-hoidossa (vieroituksen jälkeen), 33 (periadolescent) tai 60 (aikuinen) d. Eläimet saivat 20 mg / kg kokaiinia (Sigma, St. Louis, MO), 5 mg / kg amfetamiinia (Sigma) tai yhtä paljon suolaliuosta vatsakalvonsisäisesti 4: 00: n ja 5: n välillä: 00 PM päivittäin 7: lle. Eläimet lopetettiin pilkkomalla lyhyen CO-altistuksen jälkeen2 10: 00 AM: llä viimeisen injektion jälkeisenä päivänä. Aivot poistettiin välittömästi pääkallosta, ja caudate putamen ja nucleus accumbens leikattiin nopeasti jäällä. Kaikki dissektiot suoritettiin koronaalisista aivojen viipaleista yhdellä tutkijalla, ja proteiiniuutteet valmistettiin tuoreesta kudoksesta ilman jäädyttämistä. Eläinten hoito- ja käyttövaliokunta hyväksyi kaikki eläinkäsittelyt ja ne olivat kansallisten terveyslaitosten mukaisia Opas laboratorioeläinten hoitoon ja käyttöön.
Western blot -analyysi. Western blot -analyysejä varten kuhunkin näytteeseen lisättiin yhtä suuret määrät proteiinia (40 μg caudate putamenille ja 20 μg ytimelle accumbens) jokaisen 10% SDS-polyakryyliamidigeelin kaistalle proteiinikonsentraatioiden mittaamisen jälkeen BCA-määrityksellä (Pierce, Rockford, IL). Yhdenvertainen proteiinikuormitus varmistettiin myös visualisoimalla kokonaisproteiini Ponceau Red: lla sen jälkeen, kun se oli siirretty nitroselluloosaan ja / tai blottaukseen anti-aktiinivasta-aineella (1: 500; Sigma). Fosiin liittyvän antigeenin (FRA) antiseerumin, joka tunnistaa FosB-isoformit, antoivat anteliaasti tohtori M. Iadarola (National Health Institutes of Health, Bethesda, MD) ja sitä käytettiin 1: n konsentraatiossa: 4000. Aiemmat opinnot (Chen et ai., 1997; Hiroi et ai., 1997), mukaan lukien FRA-antiseerumin imeytyminen M-peptidin immunogeeniin, osoitti tämän antiseerumin spesifisyyden. DNPX-32 5a -monoklonaalista vasta-ainetta, jota käytettiin 1: 10,000: ssa, tarjosivat runsaasti Drs. Hugh Hemmings ja Paul Greengard (Rockefellerin yliopisto, New York, NY). Dopamiini-transporterin (DAT) vasta-aine oli peräisin Chemicon (Temecula, CA). Blotit saatettiin reagoimaan NEN-DuPont (Boston, MA) kemiluminesenssijärjestelmän kanssa ja altistettiin kalvolle. AFosB-immunoreaktiivisuuden densitometriset arvot saatiin käyttämällä ScanAnalysis for Apple (Biosoft, Ferguson, MO). Tilastollinen merkitsevyys määritettiin käyttämällä yksisuuntaista ANOVAa, jota seurasi post hoc Tukeyn moninkertainen vertailutesti tai parittomat, kaksihäntäiset opiskelijat t koe kuten kuvioissa on esitetty. Lääkehoitokokeissa jokaisen ikäryhmän analyysi suoritettiin erillisellä blotilla, ja siksi kullekin suolaliuokselle osoitettiin mielivaltaisesti 100% -arvo ikäryhmien vertailua varten. Ontogeneettisiä tutkimuksia varten näytteitä kaikista ikäryhmistä analysoitiin yhdessä yhdellä blotilla.
TULOKSET
ΔFosB: n induktio kokaiinin ja amfetamiinin jälkeen tapahtuu vain periadolescent-hiirten ytimessä.
ΔFosB: n ilmentyminen mitattiin vierekkäisen, periadolescentin ja aikuisten hiirien ytimessä accumbens ja caudate putamen amfetamiinin tai kokaiinin antamisen jälkeen 7 d: n jälkeen. Tumman accumbens on aivojen alue, jonka uskotaan olevan kriittisin psykostimulanttien palkitsevien vaikutusten välittämisessä. AFosB-immunoreaktiivisuus (35 kDa) indusoitiin selektiivisesti periadolescent-eläinten ytimessä, kun amfetamiini annettiin kroonisesti (kuvio 1). 1 A) tai kokaiinia (kuva 1). 1 B). Sitä vastoin ΔFosB: n (35 kDa) tasot eivät muuttuneet merkittävästi vieroituksen jälkeen tai aikuisilla eläimillä (kuvio 1).1 A,B). Caudate putamenissa ΔFosB-tasot (35 kDa) kohosivat myös merkittävästi kroonisen amfetamiinin antamisen jälkeen vain periadolescent-eläimissä (kuvio 1).2 A). Kaikkien kolmen ikäryhmän ΔFosB (35 kDa) -ilmaisu lisääntyi merkittävästi caudate putamenissa, kun kokaiinia annettiin kroonisesti.2 B). Induktion suuruus oli kuitenkin suurin periadolescent-eläimissä, erityisesti verrattuna post-weanlingsiin (kuvio 1). 2 B). Muut FRA- ja Fos-isoformit olivat muuttumattomia kaikissa ikäryhmissä (tietoja ei ole esitetty).
AFosB: n immunoreaktiivisuus ydinakkeissa kroonisen psykostimulantin antamisen jälkeen. CD-1-hiiriä injektoitiin kerran päivässä suolaliuoksella, amfetamiinilla tai kokaiinilla 7 d: lle, joka alkoi päivänä 24 (P24; vieroituksen jälkeen), päivä 33 (P33; periadolescent) tai päivä 60 (Aikuinen). ΔFosB (35 kDa) -immunoreaktiivisuuden tasot ytimen accumbensissa esitetään kroonisen amfetamiinin jälkeen (A) tai kokaiinia (B) hallinto. Edustavat immunoblotit suolaliuoksesta (S), amfetamiini (A) ja kokaiinia (C) ruiskutettu vieroituksen jälkeen (P24), periadolescent (P33) ja aikuiset hiiret on esitetty yläpaneelit. Pohjalevyt osoittavat keskiarvon ± SEM-prosenttiosuuden ΔFosB-perusarvosta. n kunkin ryhmän arvot näkyvät baarit. AFosB: n merkittäviä lisäyksiä havaittiin vain periadolescent-hiirten ytimessä. *p <0.05; **p <0.01 (opiskelijan t testata; suolaliuos vs. lääke).
ΔFosB-immunoreaktiivisuus caudate-putamenissa kroonisen psykostimulantin antamisen jälkeen. CD-1-hiiriä injektoitiin kerran päivässä suolaliuoksella, amfetamiinilla tai kokaiinilla 7 d: lle, joka alkoi päivänä 24 (P24; vieroituksen jälkeen), päivä 33 (P33; periadolescent) tai päivä 60 (Aikuinen). AFosB (35 kDa) -immunoreaktiivisuuden tasot caudate-putamenissa esitetään kroonisen amfetamiinin jälkeen (A) tai kokaiinia (B) hallinto. Edustavat immunoblotit suolaliuoksesta (S), amfetamiini (A) ja kokaiinia (C) injektoidut periadolescent-hiiret (P33) näkyvätyläpaneelit. Pohjalevyt osoittavat keskiarvon ± SEM-prosenttiosuuden ΔFosB-perusarvosta. n kunkin ryhmän arvot näkyvät baarit. Merkittäviä amfetamiinin indusoimia AFosB-immunoreaktiivisuuden lisääntymisiä havaittiin vain periadolescent-hiirien caudate-putamenissa (A). Krooninen kokaiinihoito lisäsi ΔFosB-arvoa kaikissa kolmessa ikäryhmässä (B). *p <0.05; **p <0.01 (opiskelijan t testata; suolaliuos vs. lääke).
DAT- ja DARPP-32-tasot eivät muutu kroonisen kokaiinin tai amfetamiinin jälkeen
Useat dopaminergisten ja / tai dopaminoseptisten neuronien ilmentämät avainmolekyylit, mukaan lukien DARPP-32, D1 dopamiinireseptori ja DAT, edistävät akuutteja ja kroonisia vasteita psykostimulanteille (Moratalla et ai., 1996; Fienberg et ai., 1998; Sora et ai., 1998; Gainetdinov et ai., 2001). DARPP-32, D: n tiedot1 reseptori ja DAT null- ja DAT-knock-down -hiiret osoittavat niiden tasojen, dopaminergisen aktiivisuuden säätelyn ja psykostimulanttien vasteiden välisen monimutkaisen suhteen. Itse asiassa ΔFosB-induktiota ei tapahdu DARPP-32 null -hiirissä, jotka saavat kroonista kokaiinia (Fienberg et ai., 1998). Aikuisilla hiirillä 7 d altistuminen 20 mg / kg kokaiinille ei kuitenkaan muuta DARPP-32: n kokonaismääriä (Fienberg et ai., 1998). DAT-proteiinin säätelyä ei ole raportoitu aiemmin psykostimuloiville kroonisesti altistuneille hiirille, vaikka joissakin lajeissa on raportoitu muutoksia radioligandin sitoutumisessa dopamiinin kuljettajaan psykostimulanttien altistumisen jälkeen.Letchworth et ai., 2001). Tässä mitattiin DARPP-32- ja DAT-proteiinin tasot sen määrittämiseksi, muutetaanko näiden proteiinien ekspressio kroonisen psykostimulantin antamisen jälkeen missä tahansa hiiren kolmesta iästä. Tuloksemme osoittavat, että kokonaista DAMPP-32- tai DAT-tasoa ei ole tapahtunut merkittävinä muutoksina koko caudate-putamenissa tai ytimessä, kun kokaiinia tai amfetamiinia on käytetty kroonisesti kaikissa kolmessa ikäryhmässä (taulukko 1).
DARPP-32: n ja DAT: n suhteelliset densitometria-arvot amfetamiini- ja kokaiinilla käsitellyissä P24-, P33- ja aikuisten hiirissä suhteessa kontrolliin, suolaliuosarvoihin, asetettu mielivaltaisesti arvoon 100%
ΔFosB: n lähtötasot on kehitetty kehityksessä
Tutkimme AFosB: n ontogeenia, koska aikuisilla hiirillä, joilla on geneettisesti muokattu AFosB: n ilmentyminen striatumissa, on lisääntynyt käyttäytymisvaste psykostimulanteille (Kelz et ai., 1999). Havaitsimme, että AFosB: n lähtötasot olivat nuoremmilla eläimillä merkittävästi alhaisemmat kuin aikuisilla sekä caudate putamenissa että ydinsoluissa (kuvio 1).3 A). Dopamiinijärjestelmän funktionaalisten merkkien tasot, mukaan lukien DARPP-32 (Ehrlich et ai., 1990), DAT (Perrone-Capano et ai., 1996) ja dopamiinireseptorit (Teicher et ai., 1993; Tarazi et ai., 1999) on myös kehitetty kehitykseen. Aikaisemmat raportit CD-1-hiiristä osoittavat huippunopeuden striatan DARPP-32: ssa postnataalipäivänä 28 (P28) (Ehrlich et ai., 1990). Rotan caudate putamen ja nucleus accumbens, D1reseptorin tasot P28: sta P40: iin (Teicher et ai., 1993; Tarazi et ai., 1999), mutta vastaavia tutkimuksia ei ole tehty hiirellä. Sitä vastoin tässä havaittiin, että DAT-proteiinitasot caudate-putamenissa ja ytimessä accumbens olivat vakiona postnataalisen päivän 24: n ja aikuisen välillä (kuvio 1). 3 B). Siten suhteelliset suhteet D: n välillä1 DAT-, DARPP-32- ja AFosB-reseptorit eroavat toisistaan ikäryhmittäin, mikä voi johtaa D: n \ t1 reseptorin aktiivisuus, joka voisi vaikuttaa ΔFosB-induktion asteeseen.
ΔFosB: n ja DAT: n kehitysprosessi. A, ΔFosB (35-37 kDa) immunoreaktiivisuus naudimaisen CD-1-hiiren caudate-putamenissa ja ytimen accumbensissa iän funktiona. Edustavat immunoblotit on esitetty yläpaneelit.Pohjalevyt näytä keskiarvo ± SEM kolmelta hiireltä ryhmässä. *p <0.05, aikuinen vs. P24; #p <0.05, aikuinen vs. P36 (Tukeyn moninkertainen vertailutesti ANOVA: n jälkeen). B, DAT-immunoreaktiivisuuden densitometriset arvot caudate-putamenissa ja ytimen accumbensissa naiiveille CD-1-hiirille iän funktiona. DAT-tasot eivät eroa kolmen ikäryhmän välillä.
KESKUSTELU
Psykomotoristen stimulanttien käyttäytymisvaikutukset ovat ikäriippuvaisia. Riippuvuuden suuntaukset ovat suurimmat nuoruusiässä, kun laittomien aineiden käyttö lisääntyy (Estroff et ai., 1989; Myers ja Anderson, 1991). Itse asiassa nuoremmat lapset tulevat usein dysfääriksi, kun he altistuvat psykostimulaattoreille, kun taas nuoret ja aikuiset kokevat euforiaa (Rapoport et ai., 1980). Jyrsijöiden malleissa joissakin tutkimuksissa on todettu, että periadolescent-eläimillä on suurempi lähtötaso (Keihäs ja jarru, 1983) ja muuttuneet vasteet psykostimulanteille suhteessa nuorempiin ja vanhempiin eläimiin. Niinpä ne osoittavat vähemmän liikkuvuutta stimuloivaa ja uutuuden etsintää vasteena psykostimulanttien akuutille alhaisen annoksen antamiselle suhteessa vieroitukseen ja aikuisiin eläimiin, mutta lisääntynyt hyperaktiivisuus suuriannoksisen hoidon jälkeen. Kroonisen antamisen yhteydessä kokaiinin aiheuttamaan liikkumiseen herkistyminen on suurempi periadolescent rotilla verrattuna aikuisiin, kun taas herkistyminen stereotypialle on pienempi. Myös mikrodialyysitulokset ovat paljastaneet eroja periadoleenttien ja aikuisten rottien välillä amfetamiinin aiheuttaman dopamiinin vapautumisen herkistymisen suhteen (Laviola et ai., 1995; Adriani et ai., 1998; Adriani ja Laviola, 2000;Laviola et ai., 2001). On kuitenkin ristiriitaisia tutkimuksia pitkäaikaisesta reaktiivisuudesta kokaiinille metyylifenidaatin antamisen jälkeen nuorilla rotilla (Brandon et ai., 2001; Andersen et ai., 2002). Kahdessa jälkimmäisessä raportissa korostetaan vaikeuksia verrata tutkimuksia, kun käytetään erilaisia kokeellisia paradigmeja. Pyrkimyksiä verrata nuorempien eläinten käyttäytymistutkimuksia häiritsee edelleen eri lajien ja kantojen käyttö.
Hiiri on tulossa yhä tärkeämmäksi eläinmalliksi psykostimulanttien käytön ja väärinkäytön tutkimuksessa, ja tämä on ensimmäinen systemaattinen analyysi molekyyli-neuroadaptivista vasteista kolmessa eri kehitysvuodessa hiirissä tai muissa yksittäisissä lajeissa. Aiemmat tutkimukset, joista saimme hoitoparadigmeja, ovat osoittaneet AFosB: n lisääntymisen villityypin aikuisten rottien eristetyssä selkä- ja vatsakerroksessa kroonisen kokaiinin ja amfetamiinin antamisen jälkeen (Hope et ai., 1994; Nye et ai., 1995; Turgeon et ai., 1997) mutta vain villityypin aikuisten hiirien yhdistetyssä selkä- ja vatsakerroksessa tai eristetyssä selkästriatumissa kroonisen kokaiinin jälkeen (Fienberg et ai., 1998; Zachariou et ai., 2001).
Näytämme nyt spatiaalisen ja kvantitatiivisen eron psykostimulantti-indusoidussa AFosB: ssä vieroituksessa, periadolescentissä ja aikuisilla hiirillä. Lisääntyneen vasteen havaitsemista periadolescent-eläimissä verrattuna aikuisiin ja vieroituksiin vahvistaa se tosiasia, että vaste on samanlainen kokaiini- ja amfetamiinilla hoidetuilla hiirillä. Sekä psykostimulaattorit kokaiini että amfetamiini lisäävät sekä synaptista dopamiinia että serotoniinia ja norepinefriiniä, mutta eri mekanismeilla. Kokaiini sitoutuu plasmalemma-kuljettimiin dopamiinin, serotoniinin ja noradrenaliinin suhteen ja estää niiden takaisinottoa presynaptisiin päätelaitteisiin. Sitä vastoin amfetamiini edistää näiden lähettimien vapautumista. AFosB: n selektiivinen induktio vain periadolescent-ikäryhmän ytimessä, joka on stimulanttien antamisen 7 d: n jälkeen, ja suhteellisen korkea FosB: n induktio caudate putamenissa voi olla neurobiologinen esitys tai syy aikaisemmin havaittuun lisääntyneeseen taipumukseen käyttää psykostimulantteja väärin tässä ikäryhmä (Estroff et ai., 1989; Myers ja Anderson, 1991) ja muut pitkän aikavälin muutokset geenien ilmentymisessä, jotka vaihtelevat eri ikäryhmien \ tAndersen et ai., 2002). Lisäksi nämä erot voivat olla luontaisesti säädeltyinä kehitysmuutoksilla avainmolekyylien tasoilla, mukaan lukien ΔFosB itse. ΔFosB: n perusviivojen erojen mahdolliset vaikutukset ikäryhmien välillä ovat samanlaisia kuin rotan kantojen väliset erot (Haile et ai., 2001). Itse asiassa odotamme, että sisäiset hiiret havaitsevat samanlaiset rasituserot. On myös mahdollista, että eri ikäiset hiiret näyttävät erilaisilta molekyylisopeutuksilta muilla aivojen alueilla kuin ytimen accumbens. Lisäanalyysi, jossa käytetään periadolescent-hiiriä, joilla on geneettisesti muokatut keskeisten molekyylien tasot ja samanaikaiset käyttäytymistarkoitukset, testaa edelleen näitä hypoteeseja.
alaviitteet
- Vastaanotetut Huhtikuu 8, 2002.
- Muutos vastaanotettu Elokuu 6, 2002.
- Hyväksytty Elokuu 8, 2002.
-
Tätä työtä tukivat kansalliset terveysinstituutit / National Neurological Disorders ja Stroke Grant NS41871 (MEE ja EMU) sekä National Institute for Drug Abuse Grant P30-DA13429 (EMU).
-
Kirjeenvaihto olisi osoitettava tohtori Michelle E. Ehrlichille, Thomas Jeffersonin yliopistolle, Curtis 310, 1025 Walnut Street, Philadelphia, PA 19107. Sähköposti: [sähköposti suojattu].
- Copyright © 2002 Neurotieteen yhteiskunta