Cdk5 phosphoryle le récepteur de la dopamine D2 et atténue la signalisation en aval (2013)

Commentaires: semble montrer que le Cdk5 provoque une régulation négative des récepteurs dopaminergiques D2. Étonnamment, le facteur de traduction deltafosb induit la production de Cdk5. Conclusion Deltafosb joue un rôle majeur à la fois dans la sensibilisation et la désensibilisation


Jeong J, Park YU, Kim DK, Lee S, Kwak Y et al. (2013) PLOS ONE 8 (12): e84482. doi: 10.1371 / journal.pone.0084482

Abstrait

Le récepteur D2 de la dopamine (DRD2) est un récepteur clé qui assure la médiation des fonctions cérébrales associées à la dopamine, telles que l'humeur, la récompense et les émotions. La kinase cycline-dépendante 5 (Cdk5) est une sérine / thréonine kinase dirigée par la proline dont la fonction a été impliquée dans le circuit de récompense du cerveau. Dans cette étude, nous avons révélé que le résidu sérine 321 (S321) dans la troisième boucle intracellulaire de DRD2 (D2i3) est un nouveau site de régulation de Cdk5. La phosphorylation de S5 dépendante de Cdk321 dans D2i3 a été observée chez in vitro et systèmes de culture cellulaire.

Nous avons en outre observé que la phosphorylation de S321 altérait l'expression de surface de DRD2 stimulée par un agoniste et diminuait le couplage de la protéine G à DRD2. De plus, la voie de l'AMPc en aval était affectée dans le système hétérologue et dans les cultures neuronales primaires d'embryons knock-out de p35, probablement en raison de l'activité inhibitrice réduite de DRD2. Ces résultats indiquent que la phosphorylation de S5 induite par Cdk321 inhibe la fonction DRD2, fournissant un nouveau mécanisme de régulation pour la signalisation de la dopamine.

Figures

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Citation: Jeong J, Park YU, Kim DK, Lee S, Kwak Y et al. (2013) Cdk5 phosphoryle le récepteur de la dopamine D2 et atténue la signalisation en aval. PLoS ONE 8 (12): e84482. doi: 10.1371 / journal.pone.0084482

Rédacteur en chef: James Porter, Université du Dakota du Nord, États-Unis d'Amérique

reçu: Mai 20, 2013; Accepté: Novembre 14, 2013; Publié le: 31 décembre 2013

Droits d'auteur: © 2013 Jeong et al. Ceci est un article en accès libre distribué selon les termes de la Licence Creative Commons Attribution, qui autorise une utilisation, une distribution et une reproduction sans restriction sur tout support, à condition que l'auteur et la source d'origine soient crédités.

Financement: Ce travail a été soutenu par les subventions (NRF-2012R1A2A2A01012923 et NRF-2012R1A4AXUMX) du gouvernement coréen (MSIP) et a également bénéficié d'un soutien dans le cadre du programme de coopération internationale géré par NRF de Corée (1028200KXXXXXXXH). Programme de recherche fondamentale de MSIP (2012-2). SKP a été récipiendaire des prix des jeunes chercheurs de l’Alliance nationale pour la recherche sur la schizophrénie et la dépression (NARSAD) 1 et 2033117. Les bailleurs de fonds n'ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publication ou la préparation du manuscrit.

Intérêts concurrents: Les auteurs ont déclaré qu'ils n'existaient pas de conflit d'intérêts.

Introduction

La signalisation de la dopamine est impliquée dans diverses fonctions cérébrales, notamment la coordination motrice, le contrôle de l'humeur et les mécanismes de récompense. [1]. Une composante majeure de la signalisation de la dopamine chez les vertébrés est exercée par les neurones épineux de type striatal (MSN) qui expriment de manière sélective un sous-ensemble de récepteurs de la dopamine et reçoivent une entrée dopaminergique provenant principalement de la région tégmentale ventrale (VTA) et de la substance noire (SN).) [2]. Les récepteurs de la dopamine sont des récepteurs couplés à la protéine G (GPCR) avec sept domaines transmembranaires et se composent de deux sous-types, Récepteurs de type D1 et D2, qui induisent des actions réciproques dans la signalisation de la dopamine [1]. Par exemple, les récepteurs dopaminergiques de type D1 (D1, D5) activent l'adénylyl cyclase par l'intermédiaire de Gαs et augmenter le niveau intracellulaire d'AMPc, mais les récepteurs de type dopamine D2 (D2, D3, D4) inhibent l'adénylyl cyclase par l'intermédiaire de Gαi et diminuer le niveau intracellulaire de l'AMPc [1], [3].

Parmi les récepteurs de la dopamine, le récepteur D2 (DRD2) est impliqué dans la physiopathologie de multiples troubles psychiatriques majeurs tels que la schizophrénie et la toxicomanie. [4], de sorte que de nombreux médicaments antipsychotiques ciblent au moins partiellement DRD2. Il est également connu que l'activité de DRD2 est bien corrélée aux conséquences comportementales des drogues d'abus chez les modèles animaux. [5]. Les antidépresseurs et l'efficacité des stabilisateurs de l'humeur ont également été liés à des altérations de l'expression de DRD2 à la surface cellulaire ou à une signalisation intracellulaire en aval transmise par PKA, ERK et GSK3. [1], [4], [6]. Malgré ces rôles critiques pour DRD2 dans le cerveau, les mécanismes de régulation détaillés conférant l'hétérogénéité et la complexité aux propriétés de DRD2 ne sont pas complètement compris.

Les éléments de preuve convergents indiquent que plusieurs modifications post-traductionnelles sont impliquées dans le réglage précis de l'activité de DRD2. Une glycosylation extensive de DRD2 a été révélée lors d'études de marquage précoce par photo-affinité [7]et la formation de liaisons disulfure au sein de DRD2 ont également été identifiées comme une modification importante de la liaison du ligand [8]. De plus, les sites de phosphorylation de DRD2 ont été initialement identifiés par in vitro test avec radio-isotopes, fournissant des voies pour diverses voies de régulation médiées par diverses kinases [9]. En effet, la protéine kinase C (PKC) régule la mobilisation du calcium intracellulaire par le biais de DRD2 et module l’interaction de DRD2 avec les protéines du cytosquelette [10]. La phosphorylation par la kinase GPCR 2 (GRK2) régule les profils de resensibilisation induits par un agoniste de DRD2 [11].

La kinase cycline-dépendante 5 (Cdk5) est une sérine / thréonine kinase dirigée vers la proline qui a une activité préférentielle en raison de l'expression de ses activateurs essentiels, spécifique au cerveau. p35 et p39 [12]. Cdk5 est impliqué dans divers processus neuronaux, dont la migration neuronale et le guidage axonal, et les souris Cdk5 et p35 null présentent des défauts de superposition corticale. [13]. Récemment, il a été démontré que la phosphorylation de WAVE1 et de l’hexhexine par Cdk5 régule la morphogenèse de la colonne vertébrale dendritique. [14]. De plus, Cdk5 régule également les niveaux d'expression de surface des récepteurs NMDA, NR2B et des courants NMDA médiés par NR2A [15], [16]. Il est à noter que plusieurs éléments de preuve suggèrent une relation intime entre Cdk5 et le système dopaminergique. Cdk5 phosphoryle la tyrosine hydroxylase (TH) en régulant sa stabilité et en maintenant ainsi l'homéostasie dopaminergique [17]. Dans les neurones postsynaptiques, lorsque le résidu T75 de la phosphoprotéine-32kD régulée par l'AMP cyclique (DARPP-32) est phosphorylé par Cdk5, il peut inhiber l'activité de la PKA et antagoniser ainsi la dopamine induite par la PKA induite par la DRK. [18]. Fait intéressant, lorsque la cocaïne, un agoniste indirect des récepteurs de la dopamine, est administrée de façon chronique chez le rat, les niveaux d'ARNm et de protéines de Cdk5 augmentent dans les neurones à épineuse moyenne. [19]. Collectivement, Cdk5 semble être impliqué dans les adaptations synaptiques induites par un médicament. Dans cette étude, nous montrons une interaction fonctionnelle de DRD2 et Cdk5 qui étend davantage le rôle de Cdk5 dans la signalisation de la dopamine.

Matériels et méthodes

Anticorps

Les sérums anti-lapins ont été élevés contre des peptides contenant la phospho-sérine 321 (pS321) de la troisième boucle intracellulaire de DRD2 (D2i3). Le phospho-peptide, CNPDpSPAKPEK (PEPTRON), a été utilisé pour préparer une colonne de peptides conjugués pour la purification par affinité (20401, PIERCE). L'anticorps anti-pS321 a été enrichi par un système de purification par affinité conformément aux instructions du fabricant. Le phospho-anticorps purifié a été stocké dans du PBS avec 0.1% azoture de sodium et 0.1% gélatine. Les anticorps anti-souris Cdk5 (sc-249) et anti-p35 de lapin (sc-820) ont été utilisés pour le Western Blot et l'immunocytochimie de Cdk5 / p35. Un anticorps anti-souris anti-GFP de souris (sc-9996) a été utilisé pour l'immunoprécipitation et le Western Blot de DRD2-GFP. Anticorps anti-FLAG de lapin (sc-807), anticorps anti-HA de lapin (sc-805), anticorps anti-souris de la GST (sc-138) et anticorps anti-GAPDH de la souris (sc- 32293) ont été achetés à Santa Cruz Biotechnologies.

Animaux

La souris knock-out p35 était un cadeau du Dr. Katsuhiko Mikoshiba du RIKEN Brain Science Institute au Japon et était utilisée pour la culture de neurones primaires. Les ensembles d’amorces pour le génotypage étaient 5′-GGTCTCCTCTTCTGTCAAGAAG, 5′-GCTCTGCTAGACACATACTGTAC et 5′-TCCATCT GCACGAGACTAGT tels que décrits précédemment. [20]. Des souris ICR et des rats Sprague Dawley ont été utilisés pour la préparation de lysat dans le cerveau. Toutes les procédures relatives aux animaux ont été approuvées par le comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'université des sciences et technologies de Pohang.

Constructions plasmidiques

L'isoforme DRD2 long humain dans un vecteur plasmidique EGFP-N1 et la troisième boucle intracellulaire de DRD2 (212 – 373, résidus d'acide aminé supplémentaires, uniques à DRD29) dans un plasmide pFLAG-CMV-2 ont été utilisés. Le Cdk2 humain a été inséré dans un vecteur plasmidique pCMV-HA et le p5 humain a été inséré dans un vecteur plasmidique pcDNA 35. Cdk3.1 humain a été inséré sous un promoteur du cytomégalovirus (CMV) avec p5 humain dans un vecteur pcDNA 35 pour produire un produit d'assemblage à double expression (Cdk3.1 / p5) en vue d'une immunocytochimie, essai d'internalisation du récepteur, [35S] -GTPγEssai de liaison au S, essai de liaison au radioligand et dosage immunoenzymatique de l'AMPc.

In vitro Dosage de la kinase

IP-lié in vitro le dosage de la kinase a été effectué comme suit. Un cerveau de souris entier a été lysé dans du tampon de lyse érythrocytaire 3 mL (ELB) (50 mM Tris (pH 8.0), 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40) par coups 20 d'un homogénéisateur Dounce pour obtenir des noyaux de cerveau homogène . Les lysats ont été incubés sur de la glace pendant 30 min, soumis à une sonication et centrifugés à 16,000 × g pour 10 min. Les surnageants ont été immunoprécipités avec un anticorps anti-p35 anti-lapin pour obtenir un complexe actif Cdk5 / p35. Le complexe Cdk5 / p35 et la protéine de fusion GST purifiée ont été mélangés à de l'adénosine 5'-triposphate, [γ-32P] (NEG-502H, PerkinElmer) et incubé dans un tampon kinase (30 mM HEPES (pH 7.2), 10 mM MgCl2, 0.2 mM DTT) pour 1 h à température ambiante [18], [21]. Le complexe purifié Cdk5 / p25 (14 – 516, Millipore) a également été utilisé pour in vitro dosage de kinase tel que décrit ci-dessus. Le tampon de chargement d'échantillon 2 × a été ajouté au mélange réactionnel et porté à ébullition à 100 ° C. Les échantillons ont ensuite été soumis à une SDS-PAGE et le gel séché a été évalué par autoradiographie.

Chromatographie en phase liquide (LC) - spectrométrie de masse (MS) / analyse par MS

La protéine recombinante GST-D2i3 a été analysée par LC-MS / MS après injection de in vitro dosage de kinase. Nous avons effectué une identification peptidique des données LC-MS / MS en utilisant X !! Tandem (version Dec-01-2008). Chaque fichier de données RAW a d'abord été converti en mzXML à l'aide du pipeline trans-protéomique (TPP; version 4.3). Les balayages MS / MS dans les mzXML convertis ont ensuite été soumis à une recherche dans la base de données de séquences de protéines de souris UniProt (version 2010_07) comprenant la séquence GST-D2i3 en utilisant X !! Tandem. La tolérance a été fixée à 3 Da pour les ions précurseurs et à 2 Da pour les ions fragments. La spécificité enzymatique de la trypsine a été utilisée. Des options de modification variables ont été utilisées pour la carbamidométhylation de la cystéine (57.021 Da), l’oxydation de la méthionine (15.995 Da), l’hydrolyse de l’asparagine (0.987 Da) et la phosphorylation de la sérine (79.966 Da).

Immunoprécipitation

L'immunoprécipitation a été réalisée sur des lysats de cellules dans du tampon de lyse ELB. Un anticorps anti-GFP a été ajouté aux lysats et incubé pendant 3 h à 4 ° C. Les immunocomplexes ont été purifiés en utilisant de la protéine A-agarose. Les précipités ont été incubés avec du tampon de chargement d'échantillon SDS pour 30 min à 37 ° C et soumis à une SDS-PAGE et à des transferts de Western.

Test de réduction de la TPS

10 µg de GST et de GST – D2i3 purifiés ont été incubés avec du lysat de cerveau de rat pour 1.5 h à 4 ° C. 30 µL de perles Sepharose 4B (17-0756-01, GE Healthcare) conjuguées au glutathion (GSH) équilibrées avec du tampon de lyse a été ajouté et incubé pendant 1 supplémentaire. Les billes ont été recueillies par centrifugation à 2,000 ×g et rincé avec le tampon de lyse 4 fois [22], [23]. Les précipités ont été analysés par Western blot en utilisant des anticorps anti-Cdk5 et anti-p35.

Immunocytochimie

Les cellules HEK 293 transfectées et les neurones striataux cultivés sur des lamelles ont été lavés une fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et fixés par immersion dans du 4% paraformaldéhyde / PBS froid pour 30 min. L'anticorps primaire a été dilué dans la solution de blocage (2% sérum de cheval et 1% Triton X-100 dans du PBS). Un anticorps anti-souris conjugué à Alexafluor-647 (A20990, Invitrogen) et un anticorps anti-lapin conjugué à Alexafluor-568 (A11011, Invitrogen) ont été utilisés comme anticorps secondaires. Hoechst ont été utilisés pour la coloration du noyau. Les images ont été obtenues par microscopie confocale (Olympus, FluoView-1000).

Test d'internalisation des récepteurs

24 h après la transfection, les cellules ont été traitées avec du quinpirole 1 µM ​​(Q102, Sigma) pour 30 min et 90 min à 37 ° C. Les cellules ont été remises en suspension dans du PBS froid 2 mL et des aliquotes de 200 µL ont été utilisées pour chaque réaction. Les traitements médicamenteux ont été effectués à la température ambiante pour 3 h aux concentrations suivantes; 3 nM [3H] -spipérone (NET-565, PerkinElmer), 3 µM ​​sulpiride (895, TOCRIS), 10 µM ​​halopéridol (H1512, Sigma). Hydrophobe [3La H] -spipérone a été utilisée pour marquer les récepteurs exprimés totaux et le sulpiride hydrophile a été utilisé pour remplacer le récepteur membraneux lié [3Signaux H] -spipérone. Les signaux des récepteurs associés aux membranes ont été calculés en soustrayant les valeurs des récepteurs intracellulaires des valeurs totales des récepteurs exprimés. Les cellules ont été filtrées sur un filtre GF / B (Millipore) et lavées 3 fois avec du tampon de lavage (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Les filtres ont été séchés et la radioactivité résiduelle a été mesurée à l'aide d'un compteur à scintillation liquide. [24].

Préparation de la membrane cellulaire

Les cellules confluentes dans des boîtes de culture 100 mm après transfection ont été lavées avec du PBS glacé et récoltées dans un tampon 1 mL HME (25 mM HEPES (pH 7.5), 2 mM MgCl2, 1 mM EDTA). Les lysats homogénéisés ont été centrifugés avec 500 × g pour 15 min et les surnageants ont ensuite été centrifugés avec 36,000 × g pour 30 min. Des pastilles remises en suspension dans du tampon HME ont été utilisées pour les dosages.

[35S] -GTPγEssai de liaison S

Les fractions de la membrane cellulaire ont été pré-incubées avec du quinpirole 1 µM ​​(Q102, Sigma) dans le tampon de dosage (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA et 0.01 mM GDP) pour 10 min. [35S] -GTPγS (NET-030H, PerkinElmer) a été ajouté à la concentration finale de 3 nM dans 30 µL et a ensuite été incubé pendant 90 min. 170 µL de tampon glacé (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2et 0.1 mM GTP) a été ajouté pour arrêter la réaction. Les membranes ont été filtrées sur un filtre GF / B (Millipore) et lavées 3 fois avec du tampon de lavage (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Les filtres ont été séchés et la radioactivité a été mesurée à l'aide du compteur à scintillation. [25], [26].

Dosage de liaison de radioligand

Les membranes cellulaires préparées ont été incubées avec 0.01 nM [3H] -spipérone (NET-565, PerkinElmer) et concentrations croissantes de quinpirole (Q102, Sigma) pour 30 min dans le tampon de dosage (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA). Les membranes ont été filtrées sur un filtre GF / B (Millipore) et lavées 3 fois avec du tampon de lavage (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). La réaction a été terminée par filtration rapide à travers des filtres GF / C. La radioactivité résiduelle a été mesurée à l'aide d'un compteur à scintillation liquide [27]-[29].

dosage immunoenzymatique de l'AMPc

Les cellules HEK 293 transfectées ont été prétraitées avec du rolipram 10 µM ​​(R6520, Sigma) pour 1 h, puis traitées avec de la forskoline 0.1 µM ​​(F6886, Sigma) et des concentrations croissantes de quinpirole (Q102, Sigma) pour 30 min. Les neurones striataux de culture primaire ont été traités avec 10 µM ​​rolipram pour 1 h, puis 1 µM ​​dopamine pour 1 h [22]. Les lysats cellulaires ont été préparés avec 0.1 M HCl et les taux d'AMPc ont été détectés par un kit de dosage immunoenzymatique d'AMPc (Sapphire Bioscience) en suivant les instructions du fabricant.

Neurone Striatal Primaire Cultivé

La zone striatale a été isolée du cerveau embryonnaire de souris (E15). Le tissu disséqué a été dissocié dans un milieu essentiel minimal (XM) (11095, Invitrogen) contenant 0.25% trypsine (T4549-100, Sigma) et 0.1% DNase I pour 6 min à 37 ° C. Les cellules ont été remises en suspension dans le milieu de placage (MEM avec 0.01 M HEPES (pH 7.4) et 10% (vol / vol) de sérum de cheval (16050-122, GIBCO)). Les neurones ont été cultivés pendant des jours 7 in vitro (DIV 7) dans le MEM avec le supplément B27 (17504-044, Invitrogen) avant d’être appliqué aux dosages immunoenzymatiques de l’AMPc.

Resultats

Cdk5 Phosphorylates De La Serine 321 Dans La Troisième Boucle Intracellulaire De DRD2 in vitro

Pour identifier de nouveaux substrats Cdk5, nous avons effectué une recherche systématique en utilisant (S / T) PX (K / H / R) en tant que séquences consensus de reconnaissance Cdk5. [30] et identifié DRD2 en tant que substrat candidat. La séquence consensus, y compris la sérine 321, est située dans la troisième boucle intracellulaire de DRD2 (D2i3) où différents mécanismes de régulation ont été impliqués. [3], [10], [11]. La séquence est conservée au cours de l'évolution dans DRD2 chez les vertébrés, ce qui implique une importance fonctionnelle du résidu (Fig. 1A).

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Figure 1. Cdk5 phosphoryle la serine 321 dans la troisième boucle intracellulaire de DRD2 in vitro.

(A) Alignement de la séquence d'acides aminés montrant les régions conservées du DRD2 de différentes espèces (ombrées). Le site de phosphorylation potentiel de Cdk5 est indiqué par un astérisque. (B) lié à l'IP in vitro dosage de la kinase avec les protéines mutantes recombinantes GST-D2i3 et GST-D2i3. Le complexe Cdk5 / p35 enrichi à partir d'extrait de cerveau de souris par immunoprécipitation anti-p35 a été utilisé pour les réactions kinases. Une autoradiographie de protéines phosphorylées est présentée avec une coloration au bleu brillant de Coomassie du même gel. La tête de flèche indique le signal radioactif correspondant aux GST-D2i3 et la pointe de flèche ouverte indique les signaux radioactifs de p35. (C) Spectre MS / MS du fragment peptidique phosphorylé de D2i3. Les modèles de fragmentation théoriques sont présentés sous le spectre. Parmi tous les ions fragments, les ions y et b détectés sont désignés dans le spectre. Ils6 et y7 les ions indiquent fortement la phosphorylation de la serine 321. (RÉ) In vitro dosage de la kinase avec le complexe purifié Cdk5 / GST-p25 en utilisant les protéines mutantes GST-D2i3 et GST-D2i3. Les protéines phosphorylées ont été montrées dans une autoradiographie, avec une coloration au bleu brillant de Coomassie. La tête de flèche indique le signal radioactif correspondant à GST-D2i3 et la pointe de flèche ouverte indique les signaux radioactifs provenant de GST-p25.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g001

Pour évaluer la capacité de Cdk5 à phosphoryler D2i3, nous avons effectué une analyse IP in vitro tests de kinases utilisant un complexe actif Cdk5 / p35 enrichi à partir de lysat de cerveau de souris par immunoprécipitation de p35 avec des protéines GST-D2i3 recombinantes purifiées comme substrats. Nous avons observé des signaux de phosphorylation dans les protéines GST-D212i373 et GST-D2i3 S2A purifiées, mais le signal a été significativement diminué en utilisant les protéines GST-D3i297 S2A (Fig. 1B). Pour vérifier davantage la phosphorylation de la sérine 321 dans le GST-D2i3, nous avons effectué une analyse LC-MS / MS des échantillons à partir de in vitro tests de kinase utilisant la spectrométrie de masse LTQ XL. De manière consistante, les phospho-peptides correspondant à la masse des peptides phospho-sérine 321 ont été récupérés (Fig. 1C). Considérant que l’acquisition dépendante des données au cours de l’analyse LC-MS / MS tend à détecter des protéines abondantes dans l’échantillon [31], ces données suggèrent que le résidu sérine 321 est le site de phosphorylation dominant de Cdk5 dans la région D2i3. Pour prouver la phosphorylation directe de la sérine 321 dans le GST-D2i3 par Cdk5, in vitro un dosage de kinase utilisant un complexe purifié Cdk5 / GST-p25 avec des protéines GST-D2i3 recombinantes purifiées a été réalisé. Nous avons identifié un signal de phosphorylation significatif dans le GST-D2i3 qui était absent dans le GST-D2i3 S321A (Fig. 1D). Pris ensemble, ces résultats indiquent que le résidu D2i3 S321 est une cible préférentielle pour la phosphorylation médiée par Cdk5.

Cdk5 Phosphorylates De La Serine 321 Dans La Troisième Boucle Intracellulaire De DRD2 Dans Les Cellules

Pour identifier la phosphorylation de la sérine 321, nous avons développé un anticorps spécifique de la phospho-sérine 321 (pS321). Échantillons de l'IP-lié in vitro Les dosages de kinases ont été analysés par Western blot en utilisant un anticorps anti-pS321. Les transferts ont montré une bande distincte dans la réaction de kinase qui dépendait de GST-D2i3 (Fig. 2A). Pour vérifier le potentiel de phosphorylation de la sérine 321 dans DRD2 par Cdk5 dans des cellules, des immunoprécipités anti-GFP de cellules HEK 293 exprimant DRD2 et GXXXX en mémoire anticorps anti-pS2. Les signaux caractéristiques des bandes maculées par les anticorps anti-GFP, dus à une glycosylation excessive de DRD321, sont observés uniquement en présence de DRD5-GFP et les anticorps anti-pS35 ont détecté des signaux DRD321 similaires uniquement avec la co-expression Cdk2 / p2 (Fig. 2B) [7]. Pour vérifier davantage la phosphorylation de la sérine 321 par Cdk5, D2i3 (FLAG-D2i3) et la forme mutante de D2i3 (FLAG-D2i3 S321A) ont été générés. Les séquences FLAG-D2i3 et FLAG-D2i3 S321A exprimées avec ou sans HA-Cdk5 et p35 dans des cellules HEK 293 ont été analysées par un test de décalage de mobilité SDS-gel. Un décalage de mobilité dépendant de Cdk5 significatif a été observé pour FLAG-D2i3, mais pas pour FLAG-D2i3 S321A (Fig. 2C). Nous avons également évalué le niveau de phosphorylation de DRD2 chez Ser321 lors de la stimulation par un agoniste. Les cellules HEK 293 exprimant les complexes DRD2-GFP et Cdk5 / p35 ont été stimulées par le quinpirole et les immunoprécipités anti-GFP des lysats cellulaires ont été analysés par Western blot en utilisant des anticorps anti-GFP et anti-pS321. Nous avons constaté que la phosphorylation de DRD5 sous Ser2 médiée par Cdk321 n'était pas affectée par la stimulation par un agoniste, qui semble différente des phosphorylations médiées par GRK et PKC (Fig. 2D) [32], [33]. Ensemble, ces résultats indiquent que Cdk5 peut phosphoryler le résidu de sérine 321 de DRD2 dans l'environnement cellulaire.

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Figure 2. Cdk5 phosphoryle la sérine 321 dans la troisième boucle intracellulaire de DRD2 dans les cellules.

La phosphorylation de la sérine 5 induite par Cdk321 a été analysée à l'aide d'un anticorps anti-pS321. (A) Échantillons d'IP-liés in vitro Le dosage de kinase utilisant les protéines GST-D2i3 a été analysé par Western blotting (WB) avec les anticorps indiqués. Les flèches indiquent GST-D2i3. (B) DRD2-GFP et DRD2 S321A-GFP ont été exprimés avec ou sans HA-Cdk5 et p35 dans des cellules HEK 293. Les immunoprécipités anti-GFP ont été analysés par Western blot en utilisant des anticorps anti-GFP et anti-pS321. Le crochet indique les signaux DRD2 et la pointe de flèche ouverte indique les signaux non spécifiques des immunoprécipités anti-GFP. "% input" est le% de volume du lysat total pour une réaction IP. Les astérisques indiquaient de faibles signaux Cdk5 endogènes. (C) Essai de décalage de mobilité sur gel. Les cellules HEK 293 transfectées comme indiqué ont été analysées par Western blot. (D) Les cellules HEK 293 transfectées ont été traitées avec du quinpirole et les immunoprécipités anti-GFP ont été analysés par Western blot avec des anticorps anti-GFP et anti-pS321. La pointe de flèche ouverte indique les signaux non spécifiques des immunoprécipités anti-GFP.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g002

Le complexe Cdk5 / p35 et DRD2 sont physiquement associés

Nous avons étudié l'interaction physique potentielle entre le complexe Cdk5 / p35 et DRD2 car de nombreux substrats de Cdk5 sont physiquement associés au complexe Cdk5 / p35. [23], [34], [35]. Tout d’abord, l’expérience de réduction de la TPS a été réalisée. La protéine GST-D2i3 recombinante purifiée a été incubée avec du lysat de cerveau de rat et les précipités déroulants de la GST ont été analysés pour le Western Blot. Comme représenté sur la Fig. 3A, Cdk5 et p35 endogènes ont été identifiés dans les précipités déroulés, ce qui indique une interaction physique entre DRD2 et le complexe Cdk5 / p35 (Fig. 3A). De plus, HA-Cdk5 et p35 ont été détectés dans les immunoprécipités anti-GFP de lysats de cellules HEK 293 exprimant DRD2-GFP et Cdk5 / p35 (Fig. 3B). En outre, nous avons effectué des analyses immunocytochimiques et avons observé que DRD2-GFP, HA-Cdk5 et p35 présentaient des signaux significatifs de co-localisation au niveau de la région membraneuse des cellules HEK 293 (Fig. 3C, panneaux supérieurs). Nous avons également étudié la co-localisation de DRD2 et de Cdk5 / p35 dans le contexte neuronal. De manière constante, DRD2-GFP a également montré une co-localisation significative avec Cdk5 et p35 endogènes dans les neurones striataux en culture (DIV7), renforçant ainsi les liens fonctionnels entre DRD2 et Cdk5 / p35 (Fig. 3C, panneaux inférieurs). Les résultats indiquent que DRD2 et Cdk5 / p35 peuvent former un complexe et confortent donc la notion selon laquelle DRD2 est un substrat physiologique de Cdk5.

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Figure 3. Cdk5 / p35 peut former un complexe avec DRD2.

(A) dosage de la GST utilisant la protéine GST-D2i3 recombinante purifiée avec un extrait de cerveau de rat. Les précipités d'arrachement de la GST ont été soumis à des analyses par Western blot. Le terme "perle" indique le précipité sans protéines GST. (B) Immunoprécipitation de DRD2 et du complexe Cdk5 / p35. Les IP anti-GFP de lysats de cellules transfectées ont été soumises à des analyses de Western Blot. Le crochet indique les signaux DRD2 et la pointe de flèche ouverte indique les signaux non spécifiques des immunoprécipités anti-GFP. Un blot surexposé pour les entrées est également présenté à droite. (C) Analyses immunocytochimiques de DRD2 et Cdk5 / p35. Les cellules HEK 293 exprimant DRD2-GFP et Cdk5 / p35 ont été colorées avec des anticorps anti-Cdk5 et anti-p35 (panneaux supérieurs). DRD2-GFP a été exprimé seul dans les neurones striataux en culture et coloré avec des anticorps anti-Cdk5 et anti-p35 (panneaux inférieurs). Hoechst ont été utilisés pour la coloration du noyau. La barre d'échelle est 5 µm. Toutes les images ont été obtenues par microscopie confocale (Olympus, FluoView-1000).

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La Phosphorylation De DRD5 Médiée Par Cdk2 Atténue L'activité Des Récepteurs

Il a été rapporté que la phosphorylation module les propriétés critiques des GPCR telles que le couplage de la protéine G, l'internalisation du récepteur, la localisation intracellulaire et l'association avec les protéines modulatrices. [9], [11], [24]. AL'internalisation des récepteurs induite par les gonistes est un processus de régulation essentiel de la transduction du signal. Nous avons étudié la modulation de l'internalisation de DRD5 par médiation par Cdk2. Les cellules HEK 293 exprimant DRD2-GFP et DRD2 S321A-GFP avec ou sans Cdk5 / p35 ont été incubées avec du quinpirole 1 µM ​​afin d'induire l'internalisation de DRD2 stimulée par un agoniste (Fig. 4A) [3Les signaux H] -spipérone des cellules exprimant DRD2-GFP étaient significativement réduits lors du traitement par 30 min au quinpirole et récupérés à 90 min. Fait intéressant, [3Les signaux de H] -spipérone des cellules exprimant DRD2-GFP et Cdk5 / p35 ont également été réduits lors du traitement par 30 min au quinpirole, mais n'ont pas été récupérés à 90 min (Fig. 4A, deuxième section). D'autre part, [3Les signaux H] -spipérone des cellules exprimant DRD2 S321A-GFP ont été réduits à 30 min et récupérés à 90 min, quelle que soit la co-expression avec Cdk5 / p35. Des études antérieures ont montré que le DRD2 intériorisé est recyclé vers la membrane plasmique lors d’une stimulation agoniste prolongée. [11]. TIl semble donc que la phosphorylation de DRD5 induite par Cdk2 soit impliquée dans les processus de resensibilisation à la suite de l'internalisation de DRD2 induite par un agoniste.

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Figure 4. La phosphorylation induite par Cdk5 atténue l'expression de surface et la signalisation en aval de DRD2.

(A) L’expression de surface de DRD2 mesurée par [3Essai de liaison à la H] -spipérone. Les cellules HEK293 transfectées ont été stimulées avec du quinpirole 1 µM ​​pendant le temps indiqué et ont été récoltées, suivies de 3 nM [3Traitement H] -spipérone pendant 3 h. La radioactivité a été mesurée et les signaux de surface ont été calculés. Les barres d'erreur représentent la moyenne ± SE (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01; ANOVA à un facteur avec test post hoc de Dunnett: comparer toutes les colonnes par rapport à la colonne de contrôle). (B) [35S] -GTPγEssai de liaison S. Les membranes cellulaires ont été préparées à partir des cellules transfectées comme indiqué. Les préparations membranaires ont été incubées avec 1 µM ​​quinpirole puis 3 nM [35S] -GTPγS pendant 90 min. Les barres d'erreur représentent la moyenne ± SE (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001; ANOVA à un facteur avec test post hoc de Bonferroni: comparer toutes les paires de colonnes). (C) En compétition avec la quinpirole [3Essai de liaison à la H] -spipérone. Les préparations membranaires issues de cellules transfectées ont été incubées avec 0.01 nM [3H] -spipérone et des concentrations croissantes de quinpirole pendant 30 min. Une régression non linéaire a été obtenue par GraphPad. Les barres d'erreur indiquent la moyenne ± SE (n = 3). (D) Dosages immunologiques enzymatiques de l'AMPc dans des cellules HEK 293 transfectées. Les cellules transfectées ont été prétraitées avec 10 pM de rolipram pendant 1 h, puis co-traitées avec 0.1 pM de forskoline et des concentrations croissantes de quinpirole pendant 30 min. Une régression non linéaire a été obtenue par GraphPad. Les barres d'erreur représentent la moyenne ± SE (n = 4; ** p <0.01; bilatéral t-tests). (E) Des neurones striataux cultivés à partir d'embryons de type sauvage et knock-out p35 (DIV 7) ont été traités avec 10 µM ​​rolipram pour 1 h suivi de 1 µM ​​dopamine pour 1 h. Les barres d'erreur représentent la moyenne ± SE (n = 4; **p<0.01; à deux queues t-tests).

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Nous avons en outre évalué un changement potentiel du couplage de la protéine G stimulé par un agoniste à DRD2 associé à une phosphorylation induite par Cdk5 en utilisant [35S] -GTPγEssai de liaison S [25], [26]. DRD2-GFP et DRD2 S321A-GFP avec ou sans Cdk5 / p35 ont été exprimés dans des cellules HEK 293. Les membranes ont été préparées et stimulées avec 1 µM ​​quinpirole et ensuite autorisées [35S] -GTPγS incorporation. DRD2-GFP et la membrane cellulaire exprimant Cdk5 / p35 ont montré une altération significative [35S] -GTPγLiaison de S par rapport à toutes les autres membranes cellulaires (Fig. 4B). Ces résultats indiquent que la phosphorylation médiée par Cdk5 régule à la baisse la liaison de la protéine G stimulée par un agoniste au niveau de DRD2.

De plus, les concurrents de quinpirole [3Des analyses de liaison à la H] -spipérone ont été effectuées pour étudier tout changement potentiel d'affinité pour les agonistes au niveau de DRD2 par phosphorylation induite par Cdk5. Liaison concurrentielle de [3La H] -spipérone a été mesurée lors du traitement de concentrations croissantes de quinpirole dans la préparation membranaire provenant de produits transfectés. Liaison concurrente du quinpirole et de [3H] -spiperone chez DRD2-GFP et DRD2 S321A-GFP fait un logK similairei des valeurs (-9.789 pour DRD2-GFP; -9.691 pour DRD2 S321A-GFP), indiquant que l'affinité du ligand pour DRD2 n'est pas affectée de manière significative par la phosphorylation induite par Cdk5 chez DRD2 (Fig. 4C).

La phosphorylation médiée par Cdk5 régule à la baisse la voie de signalisation DRD2-AMPc

Nous avons ensuite examiné si la modification de DRD2 par Cdk5 avait une incidence sur les voies de signalisation en aval. Nous avons surveillé l'inhibition à médiation par DRD2 de la production d'AMPc stimulée par la forskoline par l'adénylyl cyclase dans les cellules exprimant DRD2-GFP et DRD2 S321A-GFP en utilisant le dosage immunoenzymatique de l'enzyme AMPc. Les cellules exprimant DRD2 présentaient une diminution des taux d'AMPc en réponse au quinpirole de manière dose-dépendante. De manière remarquable, la co-expression de Cdk5 / p35 a significativement réduit l’inhibition maximale de la formation de AMPc (Fig. 4D, panneau de gauche). Par ailleurs, dans les cellules exprimant DRD2 S321A-GFP, les formations d'AMPc étaient efficacement inhibées en réponse au traitement par le quinpirole, quelle que soit l'expression de Cdk5 / p35 (Fig. 4D, panneau de droite). Ces résultats indiquent que la phosphorylation de DRD5 induite par Cdk2 atténue l'activité inhibitrice de DRD2 sur la voie de signalisation de l'AMPc en aval. Pour confirmer davantage le phénomène dans un contexte plus physiologiquement pertinent, nous avons utilisé des neurones de culture primaires issus d'embryons knock-out déficients en p35, un activateur essentiel de Cdk5. Les neurones striataux de culture primaire ont été traités avec de la dopamine 1 µM ​​et analysés par immunodosage enzymatique de l'AMPc. Les neurones de souris knock-out p35 présentaient des taux d'AMPc réduits par rapport aux neurones de type sauvage lorsqu'ils étaient stimulés par la dopamine (Fig. 4E). TAprès analyse, nous avons conclu que la phosphorylation de DRD5 induite par Cdk2 entraîne une diminution du tonus inhibiteur de la voie de l'AMPc exercée par DRD2.

Discussion

Nous avons identifié DRD2 comme un nouveau substrat de Cdk5. La phosphorylation semble réguler à la baisse l'expression de la surface de DRD2 en modifiant le devenir de DRD2 après l'internalisation du récepteur, réduisant ainsi DRD2 G.i- couplage et voie AMPc en aval. Comme le résidu de phosphorylation S321 existe à la fois dans les isoformes longues et courtes de DRD2, le mécanisme proposé dans cette étude peut constituer un mode général de régulation de la signalisation médiée par DRD2..

DRD2 dans les neurones à épine moyenne a non seulement été considéré comme un sous-type majeur des récepteurs de la dopamine, mais a également été reconnu pour sa sensibilité aux changements de disponibilité en réponse à des stimuli environnementaux. La désensibilisation et la resensibilisation induites par les agonistes de DRD2 ont été largement étudiées [11], [24]. Un certain nombre d’études ont notamment montré que les effets de l’exposition chronique aux psychostimulants, tels que la cocaïne et l’amphétamine, qui augmentent le taux extracellulaire de dopamine dans la synapse striatale, s’accompagnent de modifications dynamiques de DRD2 à un stade post-synaptique. [36]. En effet, on sait que les consommateurs chroniques de cocaïne ont réduit les niveaux de DRD2 dans la zone striatale, et la disponibilité de DRD2 dans le noyau accumbens (NAcc) montre une corrélation négative avec les comportements de recherche de drogue et de renforcement chez les souris et les primates. [37]-[39]. Ces résultats indiquent que la fonctionnalité de DRD2 est très susceptible d'une régulation adaptative ou compensatoire en réponse à divers stimuli, notamment l'exposition chronique à un médicament. Nos résultats montrent que le résidu S321 dans la troisième boucle intracellulaire de DRD2 peut être phosphorylé par Cdk5, ce qui entraîne une diminution de l’effet inhibiteur de DRD2 sur la voie des AMPc. Cette interaction propose un nouveau mécanisme de régulation associé à Cdk5 dans les neurones dopaminoceptifs, qui pourrait être lié à la nature dynamique de la disponibilité de surface de DRD2.

Il convient de noter que Cdk5 est connu pour être un élément clé dans la médiation des modifications adaptatives de l'environnement neuronal. Par exemple, les altérations structurelles et fonctionnelles des épines dendritiques dans les neurones du circuit limbique sont l’une des conséquences d’une exposition répétée aux psychostimulants. [40]. Ces changements sont accompagnés de divers changements moléculaires, notamment l'induction de la protéine de liaison aux éléments de la réponse à l'AMPc (CREB) et de ΔFosB, facteurs de transcription qui présentent une régulation à la hausse durable en réponse à l'administration chronique de cocaïne. [41], [42]. Fait important, Cdk5 est une cible de ΔFosB [19], et de nombreux composants critiques impliqués dans la dynamique de la colonne vertébrale dendritique, tels que PSD-95, la kinase activée par p21 (PAK), la β-caténine et la spinophiline, ont été rapportés comme substrats Cdk5 [43]-[46]. De manière constante, les manipulations génétiques ou pharmacologiques de l'activité de Cdk5 induisent des altérations de la morphologie de la colonne dendritique et des réponses comportementales à la cocaïne, impliquant des rôles critiques pour Cdk5 dans les modifications moléculaires et morphologiques des circuits dopaminergiques mésolimbiques [47], [48]. Nos résultats montrant que DRD2 est une nouvelle cible de Cdk5 fournissent des informations supplémentaires sur les modifications adaptatives du système dopaminergique en réponse à des expositions médicamenteuses chroniques en raison de la régulation à la hausse de Cdk5 induite par ΔFosB, pouvant induire une augmentation tonique de la phosphorylation de DRDXNUM. . De plus, DRD2 est connu pour affecter de nombreux processus cellulaires, notamment la régulation des voies de l'AMPc et de la MAP kinase et les événements de transcription en aval. [42], [49]. Ainsi, les résultats de cette étude pourraient non seulement illustrer une régulation directe de DRD2 par Cdk5, mais également apporter un nouvel éclairage sur les réponses adaptatives du système dopaminergique à une exposition chronique à un médicament.

Contributions d'auteur

Conçu et conçu les expériences: JJ YUP DH SKP. Effectué les expériences: JJ YUP DKK YK. Analyse des données: JJ YUP DKK SL YK SAL HL YSG DH SKP. Réactifs, matériaux et outils d’analyse: YHS. A écrit le papier: JJ SKP.

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