Formation de la colonne vertébrale dendritique induite par la cocaïne dans les neurones épineux moyens du récepteur de la dopamine D1 et D2 dans le noyau accumbens (2006)

Proc Natl Acad Sei US A. février 28, 2006; 103 (9): 3399 – 3404.
Publié en ligne février 21, 2006. est ce que je:  10.1073 / pnas.0511244103
PMCID: PMC1413917
Neuroscience
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Abstrait

L'altération induite par les psychostimulants des épines dendritiques sur les neurones dopaminoceptifs dans le noyau accumbens (NAcc) a été émise comme une réponse neuronale adaptative liée à des comportements addictifs durables. Le NAcc est en grande partie composé de deux sous-populations distinctes de neurones épineux de taille moyenne exprimant des niveaux élevés de récepteurs dopaminergiques D1 ou D2. Dans la présente étude, nous avons analysé la densité de la colonne vertébrale dendritique après un traitement chronique à la cocaïne dans des neurones épineux de taille moyenne distincts du récepteur D1 ou D2 du NAcc. Ces études ont utilisé des souris transgéniques exprimant EGFP sous le contrôle du promoteur du récepteur D1 ou D2 (Drd1-EGFP ou Drd2-EGFP). Après 28 jours de traitement à la cocaïne et 2 jours de sevrage, la densité de la colonne vertébrale a augmenté dans les neurones tant Drd1-EGFP que Drd2-EGFP. Cependant, l'augmentation de la densité de la colonne vertébrale n'a été maintenue que dans les neurones 1 positifs pour Drd30-EGFP après le retrait du médicament. Notamment, une expression accrue de ΔFosB a également été observée dans les neurones positifs Drd1-EGFP et Drd2-EGFP après des jours de sevrage du médicament 2, mais uniquement dans des neurones positifs du Drd1-EGFP après des jours de retrait du médicament 30. Ces résultats suggèrent que la densité accrue de la colonne vertébrale observée après un traitement chronique à la cocaïne est stable uniquement dans les neurones contenant le récepteur D1 et que l'expression de ΔFosB est associée à la formation et / ou au maintien d'épines dendritiques dans D1 ainsi que des neurones contenant le récepteur D2 dans NAcc.

La voie dopaminergique mésolimbique est composée de neurones situés dans la région tegmentale ventrale qui innervent le noyau accumbens (NAcc), le tubercule olfactif, le cortex préfrontal et l’amygdale (1), alors que les neurones dopaminergiques nigrostriataux de la substantia nigra (pars compacta) fournissent une projection ascendante vers le striatum dorsal (2) Les psychostimulants élèvent les concentrations synaptiques de dopamine dans les NACC: cocaïne, en bloquant l'absorption de dopamine par la fente synaptique, et d'amphétamine, en favorisant la libération de dopamine par les terminaisons nerveuses (3-5) L'administration répétée et intermittente de psychostimulants entraîne une augmentation des réactions comportementales (sensibilisation) aux effets stimulants aigus de ces médicaments (6-8) La plupart des sources de données suggèrent que les modifications adaptatives dans le système dopaminergique de la région tégmentale ventrale – NAcc sont essentielles aux modifications de la plasticité dépendant de l'expérience qui sous-tend le comportement induit par le médicament.

En plus de la dopamine, le glutamate est nécessaire au développement de la sensibilisation comportementale en réponse aux psychostimulants (9, 10) Les neurones épineux de taille moyenne (MSN) du striatum ventral reçoivent des projections glutamatergiques excitatrices du cortex préfrontal qui se synapse sur la tête des épines dendritiques. Les MSN sont également la cible principale des axones dopaminergiques qui se synapse sur le cou de la colonne vertébrale (1, 11, 12) Par conséquent, les épines dendritiques dans les MSN représentent le compartiment cellulaire où la transmission dopaminergique et glutamatergique est initialement intégrée.

La dopamine agit sur deux sous-familles de récepteurs majeures, la sous-famille D1 (sous-types D1 et D5) et la sous-famille D2 (D2, sous-types D3) (13) Dans le striatum dorsal, des études anatomiques ont montré que les MSN striatonigraux contiennent de hauts niveaux de récepteurs D1 (ainsi que la substance P et la dynorphine), alors que les MSN striatopallidaux expriment principalement les récepteurs D2 (ainsi que l’enképhaline) (14-17) Les projections du NAcc sont plus complexes que dans le striatum dorsal, la coquille et les parties centrales du NAcc faisant saillie dans des sous-régions distinctes du pallidum ventral et dans la région du tegmental ventral et de la substantia nigra (18) Alors que les récepteurs D2 et l’enképhaline sont fortement exprimés dans les projections sur le pallidum ventral, les récepteurs D1 et la substance P se trouvent également répartis dans les projections sur le pallidum ventral et la région tégmentale ventrale (19) Des études d'agonistes et d'antagonistes sélectifs des récepteurs D1 ou D2 ont montré que les récepteurs D1 et D2 sont nécessaires aux changements de comportement dépendants des psychostimulants (20-25) Cependant, les rôles de ces récepteurs semblent être différents. Par exemple, la stimulation des récepteurs D1 atténue la recherche de cocaïne induite par les injections d’amorces de cocaïne et les signaux environnementaux liés à la cocaïne, tandis que la stimulation des récepteurs D2 facilite la réintégration induite par la cocaïne (26-28).

Les anomalies comportementales associées à la dépendance aux psychostimulants ont une durée de vie extrêmement longue. Par conséquent, il y a eu un intérêt considérable pour l'identification de modifications durables induites par le médicament aux niveaux moléculaire et structural dans les circuits neuronaux régulés par la dopamine et le glutamate (29-32) Il a notamment été observé qu'une exposition à long terme à la cocaïne ou à l'amphétamine augmentait le nombre de points de branchement dendritiques et d'épines de MSN dans NACC (33-35) Il a été démontré que ces modifications structurelles persistent jusqu'à la 1 – 3.5 mois après la dernière exposition au médicament (30, 35) et ont été suggérées pour être à la base de modifications durables de la plasticité synaptique associées à une exposition à un psychostimulant.

Le but de la présente étude était d’examiner les altérations structurelles des épines dendritiques induites par la cocaïne dans les sous-populations de MSN accumbal exprimant les récepteurs D1 ou D2. Dans ces études, nous avons utilisé des souris transgéniques de chromosome artificiel bactérien (BAC) exprimant EGFP sous le contrôle du promoteur du récepteur dopaminergique D1 (Drd1) ou D2 (Drd2-EGFP) (36) Les résultats indiquent que, bien qu'une augmentation de la densité de la colonne vertébrale se produise initialement dans les MSN contenant le récepteur D1 et les MSN contenant le récepteur D2, la densité modifiée de la colonne vertébrale est stable uniquement dans les neurones contenant le récepteur D1. De plus, nous trouvons des changements similaires dans l’expression du facteur de transcription ΔFosB, ce qui suggère que ΔFosB pourrait être impliqué dans la formation et / ou le maintien d’épines dendritiques dans D1 ainsi que dans les neurones contenant le récepteur D2 dans NAcc.

Resultats

Analyse des MSN dans des souris transgéniques Drd1-EGFP et Drd2-EGFP BAC.

Le modèle de projection des MSN du striatum dorsal et ventral chez les souris transgéniques Drd1-EGFP ou Drd2-EGFP BAC a été caractérisé par l’analyse de l’expression de la GFP (36) L’expression différentielle de la GFP dans les MSN du striatum dorsal correspond généralement à celle des récepteurs endogènes D1 ou D2, respectivement (36) Nous avons en outre analysé l’expression différentielle de la GFP dans le NAcc chez des souris Drd1-EGFP ou Drd2-EGFP (Fig. 1a et b) Bien que %58% des neurones dans NAcc aient exprimé la GFP chez des souris Drd1-EGFP (Fig. 1a), ≈48% des neurones dans la GFP exprimée par NAcc chez des souris Drd-2-EGFP (Fig. 1b). Les MSN représentent 90 – 95% de tous les neurones dans NAcc (12, 37). Les récepteurs D1 sont exprimés uniquement dans les MSN et les récepteurs D2 dans les MSN et dans les interneurones cholinergiques, qui représentent 1 – 3% des neurones du striatum (37). Tenant compte de ces facteurs, les résultats suggèrent qu’au minimum, ≈10 – 15% des MSN dans NAcc sont susceptibles d’exprimer les récepteurs D1 et D2.

Figue. 1. 

Analyse des MSN chez les souris Drd1-EGFP et Drd2-EGFP. (a et b) Tranches de cerveau fixes du NAcc de Drd1-EGFP (a) ou Drd2-EGFP (b) Les souris transgéniques BAC ont été immunocolorées pour GFP et NeuN (en tant que marqueur neuronal général). Les images fusionnées montrent, en jaune, une colocalisation ...

Analyse des épines dendritiques chez les souris Drd1-EGFP et Drd2-EGFP.

L'expression de la GFP chez les souris Drd1-EGFP et Drd2-EGFP s'est avérée utile pour la coloration de corps de cellules neuronales. Cependant, le signal de la GFP dans les dendrites et les épines dendritiques était trop faible pour permettre leur analyse après immunomarquage avec des anticorps anti-GFP. La libération balistique médiée par les particules de colorants fluorescents a récemment été utilisée pour marquer les populations neuronales de manière rapide et efficace (38). Des neurones entiers peuvent être étiquetés en utilisant cette technique, et la méthode semble être comparable à la coloration de Golgi-Cox. Pour analyser la morphologie dendritique des neurones dans NAcc, des coupes d'accumulations fixées ont été marquées avec le colorant lipophile à fluorescence 1,1′-diotadécyl-3,3,3 ', 3′-tétraméthylindocarbocyanine (DiI) en utilisant un canon à gènes. Un exemple de MSN teinté par DiI est présenté dans Fig. 1c. Dans les conditions utilisées, nous avons généralement observé des neurones marqués sans aucune dendrite chevauchante provenant d'autres neurones marqués. À plus fort grossissement, une morphologie dendritique détaillée, comprenant des épines dendritiques, pouvait être observée (Fig. 1d).

Nous avons ensuite utilisé une combinaison de marquage DiI et d’immunohistochimie pour la GFP chez des souris transgéniques Drd1-EGFP ou Drd2-EGFP, ce qui a été rendu possible par l’utilisation d’une faible concentration de détergent pour la perméabilisation des tissus (voir ci-dessous). Méthodologie). En comparant soigneusement la coloration DiI et l’expression de la GFP dans les corps cellulaires des MSN, nous avons pu identifier des neurones DiI et GFP positifs ou DiI positifs et GFP négatifs dans Drd1-EGFP (Fig. 2a) ou Drd2-EGFP (Fig. 2b) des souris. Pour les études suivantes, nous avons analysé la morphologie dendritique dans les neurones positifs pour DiI et GFP de souris Drd1-EGFP ou Drd2-EGFP.

Figue. 2. 

Analyse des épines dendritiques chez les souris Drd1-EGFP et Drd2-EGFP. Les neurones dans NAcc de souris Drd1-EGFP (a) ou des souris Drd2-EGFP (b) ont d'abord été marqués avec DiI (rouge) puis soumis à une immunohistochimie en utilisant un anticorps anti-GFP (EGFP, vert). Seulement ...

Un traitement chronique à la cocaïne entraîne une augmentation de la densité de la colonne vertébrale dans les MSN accumbal exprimant Drd1-EGFP ou Drd2-EGFP.

Les souris Drd1-EGFP ou Drd2-EGFP ont été injectées à plusieurs reprises avec de la cocaïne (30 mg / kg) ou une solution saline pendant quatre semaines consécutives (voir Méthodologie). Deux jours (2WD) ou 30 jours (30WD) après le dernier traitement médicamenteux, les cerveaux ont été traités pour le marquage DiI et l'immunohistochimie comme décrit ci-dessus. Une étude antérieure avait montré qu'un traitement chronique à l'amphétamine augmentait la densité de la colonne vertébrale sur les dendrites distales mais non proximales des MSN dans le cancer de la prostate (35). Nous avons donc limité notre analyse aux dendrites distales (c'est-à-dire ayant des branches du deuxième ou du troisième ordre), y compris les régions terminales. Lors de l'analyse à 2WD, il a été constaté que la densité de la colonne vertébrale augmentait dans les MSN positives pour Drd1-EGFP (128% du groupe de solution saline) (Fig. 3a et c) et dans une moindre mesure dans les neurones positifs Drd2-EGFP (115% du groupe de solutions salines) (Fig. 3 b et d). Après 30WD, l’augmentation de la densité de la colonne vertébrale a été maintenue dans les neurones positifs pour Drd1-EGFP (118% du contrôle salin) (Fig. 3 a et c) mais pas dans les neurones positifs Drd2-EGFP (Fig. 3 b et d).

Figue. 3. 

Augmentation chronique de la densité de la colonne vertébrale induite par la cocaïne dans les MSN positives pour Drd1-EGFP ou Drd2-EGFP dans le traitement de cancer de la prostate. (a et b) Drd1-EGFP (a) ou Drd2-EGFP (b) les souris ont été traitées avec une solution saline (Sal) ou de la cocaïne (Coc, 30 mg / kg) pendant des semaines 4. Les cerveaux de souris 2WD ou 30WD ont été traités ...

La morphologie des épines dendritiques varie en fonction de leur longueur et de la largeur de leur tête. Nous avons donc classé les protrusions dendritiques en quatre classes d'épines (épaisse, champignons, maigres et filopodes) à 2WD à partir de cocaïne (données non présentées). La densité de type de champignon (119.7 ± 4.0%, P <0.01) et fines épines (120.0 ± 3.4%, P <0.01) a été augmentée par le traitement à la cocaïne chez les MSN Drd1-EGFP-positifs, alors que la densité de stubby (182.4 ± 21.6%, P <0.05) et épines de champignons (122.5 ± 5.0%, P <0.01) était augmentée chez les MSN Drd2-EGFP positifs. Il n'y avait pas d'augmentation significative des épines courtes dans les neurones Drd1-EGFP-positifs ou des épines minces dans les neurones Drd2-EGFP-positifs.

La cocaïne chronique induit l'expression de ΔFosB dans les MSN Drd1-EGFP ou Drd2-EGFP dans NAcc.

ΔFosB est un membre de la famille des facteurs de transcription Fos. Alors que l’administration aiguë de cocaïne induit une induction rapide et transitoire de plusieurs isoformes de Fos dans le cancer de la peau, l’exposition répétée à la cocaïne augmente le taux de ΔFosB. De plus, l'augmentation de l'expression de ΔFosB persiste dans les NAcc pendant des semaines, voire des mois après la fin de l'exposition au médicament. Il a été suggéré qu'elle serait impliquée dans la régulation durable de l'expression génique, même après l'arrêt de la prise du médicament (29, 39, 40).

Pour examiner l’induction de ΔFosB dans les NAcc de souris Drd1-EGFP ou Drd2-EGFP après traitement à la cocaïne, nous avons analysé l’expression de FosB et de GFP par un double marquage (Fig. 4 et Tableau 1) L’anticorps anti-FosB reconnaît toutes les formes de FosB, mais nous supposons que l’immunostain accru représente ΔFosB (voir Méthodologie pour plus ample discussion). Chez les souris traitées avec une solution saline, 16% des neurones positifs Drd1-EGFP et 15% des neurones Drd2-EGFP positifs ont exprimé l'immunoréactivité de FosB avec une intensité relativement faible (Fig. 4 a et b et Tableau 1). Un traitement répété à la cocaïne suivi de 2WD a entraîné une augmentation significative du nombre de neurones positifs pour Drd1-EGFP qui co-exprimaient ΔFosB (55% de neurones positifs pour GFP) (Fig. 4c et Tableau 1). Une augmentation plus faible, mais néanmoins significative, de l'expression de ΔFosB a été observée dans les neurones positifs Drd2-EGFP (% 25 des neurones positifs GFP) (Fig. 4d et Tableau 1). Comme pour les modifications de la densité de la colonne vertébrale, l’expression accrue de ΔFosB a été maintenue dans les neurones positifs Drd1-EGFP (46% des neurones GFP positifs), mais pas dans les neurones positifs Drd2-EGFP (15% des neurones positifs GFP) après 30WD (Fig. 4 e et f et Tableau 1). Notez que l’expression accrue de ΔFosB observée dans Fig. 4f est présent dans les neurones négatifs Drd2-EGFP.

Figue. 4. 

La cocaïne chronique induit l'expression de ΔFosB dans les MSN Drd1-EGFP ou Drd2-EGFP positives dans NAcc. Drd1-EGFP (a, cet e) ou Drd2-EGFP (b, det f) les souris ont été traitées avec une solution saline ou de la cocaïne chronique comme décrit dans Fig. 3. 2WD (c et d) ou 30WD (e et ...
Tableau 1. 

Quantification des neurones EGFP-positifs exprimant ΔFosB

Discussion

Des adaptations durables de la neurotransmission dopaminergique sont supposées sous-tendre les comportements de dépendance associés aux médicaments psychostimulants. En particulier, on a émis l'hypothèse que les augmentations induites par les psychostimulants de la densité de la colonne vertébrale dendritique dans les NAcc seraient liées à la réorganisation de la connectivité synaptique (30). Le NAcc est en grande partie composé de deux sous-populations distinctes de MSN exprimant des niveaux élevés de récepteurs dopaminergiques D1 ou D2. Dans la présente étude, nous avons analysé la densité de la colonne vertébrale dans des MSN distincts contenant des récepteurs D1 ou D2 dans des NAcc après un traitement chronique à la cocaïne. Les résultats obtenus montrent que, bien que l'augmentation de la densité de la colonne vertébrale se produise initialement dans les MSN contenant le récepteur D1 et les MSN contenant le récepteur D2, la densité de la colonne vertébrale modifiée n'est stable que dans les neurones contenant le récepteur D1. De plus, nous trouvons un modèle similaire de changements dans l'expression du facteur de transcription AFosB dans les MSN contenant les récepteurs D1 et D2.

Ces études ont utilisé des souris transgéniques BAC exprimant la GFP dans des sous-populations spécifiques de MSN sous le contrôle du promoteur du récepteur D1 ou du promoteur D2. De plus, nous avons développé une méthode de double marquage associant immunohistochimie pour la GFP et marquage balistique de neurones utilisant DiI. Des études antérieures utilisaient la méthode de Golgi – Cox pour analyser l'effet des psychostimulants sur la densité de la colonne vertébrale (34), et la méthode DiI utilisée ici a donné des résultats quantitativement comparables. Nous avons développé la méthode de double marquage car la coloration de Golgi n’est pas compatible avec l’immunohistochimie. L'immunomarquage nécessite généralement une perméabilisation des tissus avec des détergents, processus qui conduit généralement à la solubilisation des colorants lipophiles à partir de la membrane (38). Cependant, dans nos études actuelles, l’immunomarquage à la GFP ne nécessitait pas une concentration élevée de détergent pour la perméabilisation des tissus et pouvait donc être utilisé conjointement avec le marquage par un colorant lipophile. Notre méthode de double marquage devrait être généralement utile pour l’étude des modifications structurelles des épines dendritiques, par exemple lorsqu’elle est utilisée pour l’analyse de lignées de souris transgéniques BAC dans lesquelles la GFP est exprimée dans des populations spécifiques de neurones du cortex (36).

Bien que cela reste quelque peu controversé, on pense que les récepteurs D1 et D2 sont en grande partie ségrégés anatomiquement aux neurones de projection striatale directe (striatonigral) et indirecte (striatopallidal) (17, 41). La caractérisation initiale de la localisation de la GFP chez les souris Drd1-EGFP et Drd2-EGFP concordait avec cette conclusion (36). De plus, notre analyse du nombre de neurones GFP-positifs dans NAcc provenant de souris Drd1 et Drd2-EGFP est cohérente avec la conclusion selon laquelle ≈50% des MSN expriment uniquement les récepteurs D1, 35-40% n'expriment que les récepteurs D2. et que ≈10 – 15% coexprime les récepteurs D1 et D2. Cette valeur de co-expression est similaire à celle suggérée par les études sur le striatum dorsal associant une analyse patch-clamp de neurones striataux uniques à des techniques de RT-PCR pour isoler et amplifier des ARNm (co17% coexpression de l'enképhaline et de la substance P) (42). Il convient de noter que nos études actuelles n'abordent pas la question de l'expression des récepteurs D3, D4 et D5, ni la question des faibles niveaux d'expression des récepteurs D1 dans les MSN exprimant des niveaux élevés de récepteurs D2, ou inversement.

Plusieurs études antérieures ont examiné la localisation neuronale de l’expression de Fos induite par un psychostimulant et le rôle des récepteurs D1 et D2 (43-45). Ces études ont corroboré la conclusion selon laquelle l'induction de Fos et de ΔFosB est médiée par l'activation des récepteurs D1. Cependant, la localisation cellulaire de l'expression de Fos est influencée par le contexte environnemental dans lequel les médicaments psychostimulants sont administrés (46, 47). Par exemple, l'amphétamine ou la cocaïne administrée dans la cage de la maison induit des gènes précoces immédiats (dont Fos), de préférence dans les cellules P-positives de la substance qui co-expriment les récepteurs D1. En revanche, ces médicaments peuvent induire l’expression de Fos dans les MSN contenant les récepteurs D1 et D2 lorsqu’ils sont administrés dans un nouvel environnement. Le protocole utilisé dans nos études actuelles n'incluait pas l'association d'injection de drogue à une exposition à un nouvel environnement. Cependant, nous ne pouvons pas exclure une sorte de stress dépendant du contexte qui est responsable de l'expression de ΔFosB dans les MSN contenant le récepteur D2.

Une caractéristique notable des présents résultats est le motif parallèle d'augmentation de la densité de la colonne vertébrale et de l'expression de ΔFosB. Une densité accrue de la colonne vertébrale et une expression de ΔFosB se sont initialement produites dans des MSN exprimant Drd1-EGFP et Drd2-EGFP. Cependant, ces modifications n'étaient stables que dans les neurones contenant le récepteur D1. Une explication possible de l'observation selon laquelle une augmentation de la densité de la colonne vertébrale et de l'expression de ΔFosB a été trouvée de manière transitoire dans les neurones contenant le récepteur D2 est que cela s'est produit dans la petite fraction de MSN qui co-expriment à la fois les récepteurs dopaminergiques D1 et D2. Ainsi, la nature transitoire de ces augmentations peut être associée à des effets antagonistes de l'activation du récepteur D2 sur les voies de signalisation dépendantes de D1 (48). Il est intéressant de noter que les modifications de la densité de la colonne vertébrale et de l’expression de ΔFosB étaient réversibles, ce qui pourrait refléter l’aptitude des voies de signalisation dépendantes du récepteur D2 à influer sur la stabilité de ΔFosB.

L'observation de changements parallèles dans l'expression de ΔFosB et de la densité de la colonne vertébrale va dans le sens de l'idée que ΔFosB est impliqué dans la formation initiale et le maintien ultérieur des épines dendritiques dans les neurones contenant le récepteur D1 dans NAcc. L’expression de ΔFosB est contrôlée par la voie de signalisation dépendante de D1 / DARPP-32 / PP1 dans les MSN (49). Plusieurs études ont montré que ΔFosB joue un rôle important dans les actions de stimulation et d’activation locomotrice des psychostimulants (39), probablement en influençant l’expression de plusieurs gènes, notamment les récepteurs des neurotransmetteurs, les protéines de signalisation et les protéines impliquées dans la régulation de la morphologie neuronale (50). Cependant, les mécanismes moléculaires spécifiques impliqués dans la formation de colonne vertébrale chronique induite par la cocaïne ne sont pas connus à ce jour. Nos précédentes études avaient montré que la perfusion intra-abdominale de roscovitine atténuée, induite par la cocaïne, induite par la cocaïne, augmentait la densité de la colonne vertébrale (51). De plus, Cdk5 est un gène cible en aval de ΔFosB et a été impliqué dans des modifications adaptatives compensatoires associées au traitement chronique de la cocaïne (52). Par conséquent, la modification de la phosphorylation dépendante de Cdk5 est un mécanisme plausible sous-jacent à la formation de colonne vertébrale induite par la cocaïne et / ou à la stabilité de la colonne vertébrale. PAK (53), la β-caténine (54), PSD-95 (55) et de la spinophiline (56) sont des substrats de Cdk5 et sont tous impliqués dans la régulation de la morphogenèse de la colonne vertébrale (57-60). Une caractérisation plus poussée de ceux-ci et d'autres substrats Cdk5 dans les épines éclairera, espérons-le, les mécanismes impliqués dans la régulation de la formation d'épines par des psychostimulants.

Méthodologie

Animaux.

Des souris portant un transgène EGFP sous le contrôle des récepteurs de la dopamine D1 ou D2 ont été générées par le projet transgénique Gensat BAC (36). Les souris transgéniques utilisées dans cette étude avaient 4 – 5 en semaines et étaient d'origine suisse – Webster. Les souris ont été maintenues dans un cycle lumière / obscurité 12: 12-h et logées dans des groupes de 2 – 5 avec de la nourriture et de l'eau disponibles à volonté. Tous les protocoles animaux étaient conformes au Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire des Instituts nationaux de la santé et ont été approuvés par le Comité de protection et d'utilisation des animaux en établissement de l'Université Rockefeller.

Traitement médical.

Un traitement chronique à la cocaïne (mg / kg 30, par jour) aurait entraîné une forte augmentation de la densité de la colonne vertébrale de MSN tant chez le rat que chez le rat, mais une dose plus faible (15 mg / kg) n'augmentait la densité de la colonne vertébrale que chez l'homme). La coquille (61). Nous avons donc utilisé la dose plus élevée de cocaïne pour induire une modification structurelle dans les deux parties de NAcc. Les souris ont reçu une injection (ip) de 30 mg / kg cocaïne-HCl (ou une solution saline) tous les jours pendant 5, suivies de jours sans injection de 2, et cette procédure a été répétée pendant des semaines consécutives de 4. Les injections ont été effectuées dans la cage de la maison. 2WD ou 30WD, des cerveaux de souris ont été traités pour le marquage DiI et / ou l’immunohistochimie.

Marquage balistique avec le colorant fluorescent DiI.

Les souris ont été anesthésiées avec 80 mg / kg de pentobarbital de sodium et perfusées transcardialement avec 5 ml de PBS, puis perfusion rapide avec 40 ml de 4% paraformaldéhyde dans du PBS (20 ml / min). Les cerveaux ont été rapidement retirés du crâne et postfixés dans 4% paraformaldéhyde pendant 10 min. Des tranches de cerveau (100, um) ont été marquées par administration balistique de colorant fluorescent DiI (Molecular Probes) comme décrit dans la réf. 38. Une méthode combinée marquage-immunohistochimie DiI a été développée avec une faible concentration de détergent. Des coupes marquées au DiI ont été perméabilisées avec 0.01% Triton X-100 dans du PBS pour 15 min, puis incubées dans du 0.01% Triton X-100 et 10% du sérum de chèvre normal dans du PBS pour 1 h afin de minimiser l'étiquetage non spécifique. Les coupes de tissus ont ensuite été incubées avec 1% sérum de chèvre normal / 0.01% Triton X-100 et anticorps anti-GFP (Abcam, Cambridge, MA) pendant 2 h à température ambiante, lavées et incubées dans une dilution 1: 1,000 de FITC- anticorps secondaire conjugué (sondes moléculaires). Les sections ont été placées sur des lames de microscope et recouvertes avec un milieu de montage. La méthode de marquage balistique a permis une analyse détaillée de la structure de la colonne vertébrale dendritique et les résultats obtenus ont été qualitativement et quantitativement comparables à ceux d’études antérieures utilisant la méthode d’imprégnation de Golgi – Cox sur des tranches de cerveau de rat (34). Cependant, contrairement aux études précédentes, nous avons rarement observé des épines à deux têtes dans des neurones marqués au DiI. Cette différence peut être due à la sensibilité des méthodes de coloration ou à la variabilité du tissu de souris (cette étude) par rapport au tissu de rat (34).

Immunohistochimie.

Les animaux ont été anesthésiés et perfusés comme décrit ci-dessus. Les cerveaux ont été prélevés et stockés pendant une nuit dans 4% paraformaldéhyde à 4 ° C. Les cerveaux ont été transférés dans 30% saccharose dans une solution de PBS pour la cryoprotection. Des coupes coronales (12, um) ont été découpées sur un microtome de congélation (Leica), puis traitées pour l'immunohistochimie. Des coupes de cerveau ont ensuite été perméabilisées dans 0.3% Triton X-100 dans du PBS pour 15 min et rincées deux fois dans du PBS. Les coupes ont été préincubées dans du sérum de chèvre normal 10% dans du PBS pour 1 h à 37 ° C, exposées à des anticorps primaires (diluées dans du sérum de chèvre 1% normal dans du PBS) pendant une nuit à 4 ° C, puis rincées dans du PBS et incubées avec du secondaire anticorps pour 1 h à 37 ° C. Les anticorps suivants ont été utilisés: anti-pan-FosB de lapin (SC-48, 1: 500; Santa Cruz Biotechnology), anti-NeuN de souris (Chemicon), anti-GFP de lapin, IgG anti-lapin de conjugaison FITC et rhodamine. IgG anti-souris conjuguée (sondes moléculaires). Pour le triple marquage (ΔFosB, NeuN et GFP), les sections du cerveau ont d'abord été immunocolorées avec un anticorps anti-pan FosB et un anticorps anti-NeuN, puis incubées avec des anticorps secondaires (IgG anti-lapin conjuguée à la rhodamine et IgG anti-souris conjuguée au cyan). ). Des sections du cerveau à double coloration ont ensuite été traitées pour l'immunomarquage GFP en utilisant la technologie de marquage Zenon (Zenon Alexa Fluor 488, Molecular Probes). L'anticorps anti-pan-FosB s'est élevé à l'extrémité N-terminale de FosB et a reconnu ΔFosB et FosB de longueur complète (62). D'après des études antérieures qui ont montré que le ΔFosB mais pas le FosB ou d'autres antigènes apparentés au Fos est exprimé de manière stable après un traitement chronique à la cocaïne, nous supposons que les augmentations prolongées de l'immunoréactivité représentent l'expression stable de ΔFosB. Cependant, l'identité du signal immunoréactif FosB observé chez les souris traitées avec une solution saline est inconnue. Analyse statistique en Tableau 1 utilisé l'étudiant t test.

Analyse de la colonne vertébrale dendritique.

Les MSN individuels du NAcc ont été choisis pour l'analyse de la colonne vertébrale en fonction de plusieurs critères. (i) Il n’y avait que peu ou pas de chevauchement avec d’autres cellules marquées afin de ne pas confondre les processus provenant de cellules différentes. (ii) Au moins trois dendrites primaires devaient être visibles pour que les cellules soient utilisées à des fins d’analyse. (iii) Les dendrites distales (dendrites terminales ou proches de la dendrite terminale) ont été examinées. Les dendrites des deux MSN dans le noyau et l'enveloppe du NAcc ont été analysées. Bien que nous ayons observé des MSN à épines clairsemées (épines de type II), nous n'avons analysé que des MSN à épines denses (à épines de type I). Pour calculer la densité de la colonne vertébrale, une longueur de dendrite (> 20 μm de long) a été tracée à l'aide d'un microscope confocal (Zeiss LSM 510) avec une lentille à immersion d'huile (× 40). Toutes les images de dendrites ont été prises à différents z niveaux (intervalles de profondeur 0.5 – 1 μm) pour examiner la morphologie des épines dendritiques. Toutes les mesures ont été effectuées avec le logiciel d’analyse d’images Metamorph (Universal Imaging, Downingtown, PA). L'analyse statistique a utilisé le test de Kolmogorov-Smirnov.

Les protrusions de dendrites ont été classées en quatre types en fonction de leur longueur, comme décrit dans les réf. 63 et 64. Les protubérances de classe 1, également appelées protubérances tronquées, mesuraient moins de 0.5 μm de longueur, n'avaient pas de grosse tête d'épine et ne semblaient pas avoir de cou; les épines de classe 2, ou en forme de champignon, mesuraient entre 0.5 et 1.25 μm de long et étaient caractérisées par un cou court et une grosse tête d'épine; la classe 3, ou épines minces, variait entre 1.25 et 3.0 μm et avait des cols allongés avec de petites têtes; la classe 4, ou extensions filopodiales, était de longues protubérances filamenteuses dépourvues d'une tête d'épine perceptible.

Remerciements

Ce travail a été financé par la subvention américaine DA10044 (à PG et ACN), ainsi que par la fondation Simons, la fondation Peter J. Sharp, la fondation Picower et la fondation FM Kirby.

Abréviations

  • NAcc
  • noyau accumbens
  • MSN
  • neurone épineux de taille moyenne
  • BAC
  • chromosome artificiel bactérien
  • Drd1
  • récepteur dopaminergique D1 piloté par promoteur
  • Drd2
  • récepteur dopaminergique D2 piloté par promoteur
  • DiI
  • Perchlorate de 1,1'-diotadécyl-3,3,3 ', 3'-tétraméthylindocarbocyanine
  • 2WD
  • 2 jours après le dernier traitement médicamenteux
  • 30WD
  • 30 jours après le dernier traitement médicamenteux.

Notes

 

Déclaration de conflit d'intérêts: Aucun conflit déclaré.

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