Effet de la surexpression de ΔFosB sur la signalisation induite par les récepteurs opioïdes et cannabinoïdes dans le noyau accumbens (2011)

Neuropharmacologie. 2011 Dec;61(8):1470-6. doi: 10.1016/j.neuropharm.2011.08.046.

Sim-Selley LJ, Cassidy MP, Sparta A, Zachariou V, Nestler EJ, Selley DE.

Source

Département de pharmacologie et de toxicologie et Institut d'études sur les drogues et l'alcool, École de médecine de l'Université du Commonwealth de Virginie, Richmond, VA 23298, États-Unis.

Abstrait

Le facteur de transcription stable ΔFosB est induit dans le noyau accumbens (NAc) par une exposition chronique à plusieurs drogues faisant l'objet d'abus et l'expression transgénique de ΔFosB dans le striatum renforce les propriétés valorisantes de la morphine et de la cocaïne.e. Cependant, la base mécanistique de ces observations n’est pas complètement comprise. Nous avons utilisé un modèle de souris bitransgénique avec expression inductible de ΔFosB dans dopamine Neurones striataux contenant le récepteur D (1) / la dynorphine afin de déterminer l'effet de l'expression de ΔFosB sur la signalisation des récepteurs opioïdes et cannabinoïdes dans le NAc. Les résultats ont montré que l'activité de la protéine G médiée par les opioïdes mu et l'inhibition de l'adénylyl cyclase étaient augmentées dans le NAc de souris ayant exprimé le ΔFosB. De même, l’inhibition de l’adénylyl cyclase par les opiacés kappa a été accrue chez les souris exprimant ΔFosB.. En revanche, la signalisation médiée par le récepteur cannabinoïde ne différait pas entre les souris surexprimant ΔFosB et les souris témoins. TCes résultats suggèrent que les signaux des récepteurs opioïdes et cannabinoïdes sont modulés de façon différentielle par l'expression de ΔFosB et indiquent que l'expression de ΔFosB pourrait produire certains de ses effets via une signalisation accrue des récepteurs opioïdes mu et kappa dans la NAc.

Mots clés: Protéine G, adénylyl cyclase, striatum

1. Introduction

Récepteurs d'opioïdes et CB cannabinoïdes1 récepteurs (CB1R) sont les cibles neurobiologiques de deux classes de médicaments largement utilisées, notamment la morphine, l'héroïne et les opioïdes d'ordonnance et la marijuana (Δ9-tétrahydrocannabinol (THC)), respectivement. Les effets aigus des opioïdes et des cannabinoïdes sont médiés par des récepteurs couplés aux protéines G qui activent principalement la Gi / o protéines et produisent des réponses effectrices en aval telles que l'inhibition de l'adénylyl cyclase (Childers, 1991, Childers, et al., 1992, Howlett et al., 2002). Les effets moteurs, altérateurs de la mémoire et psychoactifs de Δ9-THC sont produits par CB1R (Huestis et al., 2001, Zimmer et al., 1999), qui sont largement distribués dans le cerveau, avec des niveaux élevés dans les ganglions de la base, l'hippocampe et le cervelet (Herkenham et al., 1991). Les effets analgésiques et enrichissants de la plupart des opioïdes cliniquement pertinents et maltraités sont principalement médiés par les récepteurs opioïdes mu (MOR) (MOR) (Matthes et al., 1996), qui sont enrichis dans le système limbique et le tronc cérébral (Mansour et al., 1994). Le système mésolimbique, composé de projections dopaminergiques de la région tegmentale ventrale (VTA) vers le noyau accumbens (NAc), joue un rôle important dans les effets bénéfiques des opioïdes et des cannabinoïdes (Bozarth et Wise, 1984, Vaccarino et al., 1985, Zangen et al., 2006), ainsi que d'autres drogues d'abus (Koob et Volkow, 2010). De plus, les systèmes opioïdes et cannabinoïdes endogènes participent aux effets gratifiants de multiples classes de drogues psychoactives (Maldonado, et al., 2006, Trigo et al., 2010). Il est donc important d’élucider les mécanismes par lesquels les opioïdes et les CB1La signalisation R est réglementée dans le NAc.

Une question centrale dans le domaine de la toxicomanie a été d'identifier les protéines qui interviennent dans la transition des effets aigus des effets à long terme des drogues psychoactives. Le facteur de transcription AP-1 ΔFosB est particulièrement intéressant car c’est un produit variant d’épissage tronqué stable du fosb gène qui s’accumule lors d’expositions répétées à des drogues ou à des récompenses naturelles (McClung et al., 2004, Nestler, 2008, Nestler, et al., 1999). Nous avons constaté que ΔFosB est induit dans le cerveau après une exposition répétée à la morphine, Δ9-THC, cocaïne ou éthanol, chaque drogue produisant un motif régional unique d'expression de ΔFosB (Perrotti et al., 2008). Un résultat constant parmi les médicaments a été que ΔFosB était fortement induit dans le striatum, les quatre médicaments induisant ΔFosB dans le noyau NAc et tous sauf Δ9-THC a induit de manière significative l'expression dans la coquille de NAc et le putamen caudé.

Des études pharmacologiques ont montré que la co-administration de dopamine D1 récepteur (D1R) l'antagoniste SCH 23390 a bloqué l'induction du ΔFosB dans le NAc et le caudé-putamen après l'administration intermittente de cocaïne ou de morphine, suggérant l'importance potentielle du D1Neurones exprimant R (Muller et Unterwald, 2005, Nye et al., 1995). L’effet de l’induction du ΔFosB sur les comportements liés au médicament a été étudié à l’aide de souris bitransgéniques exprimant ΔFosB dans des populations neuronales spécifiques du NAc et du striatum dorsal (Chen et al., 1998). Souris exprimant ΔFosB dans la dynorphine / D1Les neurones R positifs du NAc et du striatum dorsal (lignée 11A) présentent une réponse altérée aux drogues faisant l'objet d'abus, notamment une sensibilité accrue aux effets bénéfiques de la cocaïne ou de la morphine (Colby et al., 2003, Kelz et al., 1999, Zachariou et al., 2006). Ces modifications se sont produites en l'absence de modifications des taux de MOR ou de diverses sous-unités de la protéine G. Cependant, les niveaux d’ARNm de la dynorphine étaient réduits dans le NAc de souris exprimant ΔFosB (Zachariou et al., 2006), suggérant qu'une des cibles de ΔFosB est un gène codant pour un peptide opioïde endogène. L'induction du ΔFosB pourrait également entraîner des changements de comportement en régulant la signalisation du récepteur dans le NAc, mais cette possibilité n'a pas encore été étudiée. Par conséquent, les présentes études ont utilisé le modèle murin bitransgénique pour déterminer si la surexpression de ΔFosB dans la dynorphine / D1Les neurones striataux contenant du R modifient l'activité de la protéine G médiée par le MOR et l'inhibition de l'adénylyl cyclase médiée par le MOR et le KOR dans le NAc. L'effet de ΔFosB sur CB1L’activité de la protéine G médiée par R a également été évaluée car Δ9L’administration de -THC induit ΔFosB dans le NAc (Perrotti et al., 2008) et le système endocannabinoïde est connu pour réguler les circuits de récompense du cerveau (Gardner, 2005, Maldonado, et al., 2006), mais l’effet de ΔFosB sur le système endocannabinoïde n’a pas été étudié.

2. Matériaux et méthodes

2.1. Réactifs

[35S] GTPγS (1250 Ci / mmol), [α-32P] ATP (800 Ci / mmol) et [3H] AMPc (26.4 Ci / mmol) ont été achetés à PerkinElmer (Shelton, CT). L'ATP, le GTP, le GDP, l'AMPc, l'albumine de sérum bovin, la créatine phosphokinase, la papavérine, l'imidazole et WIN-55212-2 ont été achetés auprès de Sigma Aldrich (St. Louis, MO). Le GTPyS a été acheté chez Roche Diagnostic Corporation (Chicago, IL). DAMGO a été fourni par le programme d'approvisionnement en médicaments du National Institute on Drug Abuse (Rockville, MD). Le fluide à scintillation Econo-1 a été obtenu auprès de Fisher Scientific (Norcross, GA). Le fluide de scintillation Ecolite a été obtenu auprès de ICN (Costa Mesa, CA). Tous les autres produits chimiques ont été obtenus auprès de Sigma Aldrich ou Fisher Scientific.

2.2. Des souris

Des souris bitransgéniques mâles dérivées de NSE-tTA (ligne A) x TetOp-AFOSB (ligne 11) ont été générées comme décrit dans Kelz et al. (Kelz et al., 1999). Des souris bitransgéniques ont été conçues et élevées sur de la doxycycline (100, µg dans de l’eau de boisson) pour supprimer l’expression du transgène. Aux semaines 8, la doxycycline était omise de l'eau chez la moitié des souris pour permettre l'expression du transgène, tandis que les souris restantes étaient maintenues sous doxycycline pour supprimer le transgène. Des cerveaux ont été recueillis 8 quelques semaines plus tard, le moment où les effets transcriptionnels de ΔFosB sont maximaux (McClung et Nestler, 2003). Une seconde lignée de souris transgénique a été utilisée dans laquelle Acc-Jun, un antagoniste négatif dominant de c-Jun, est exprimé en D1R / dynorphine et D2Cellules R / enképhaline du striatum, de l'hippocampe et du cortex pariétal (Peakman, et al., 2003). Les protéines C-Jun et apparentées de la famille Jun se dimérisent avec les protéines de la famille Fos et se lient au site AP-1 des gènes cibles pour réguler la transcription. Cependant, la troncature de l'extrémité N-terminale de c-Jun (Ac-Jun) rend le complexe inactif sur le plan de la transcription et capable d'obstruer la liaison à l'ADN de complexes actifs AP-1. Des souris bitransgéniques mâles dérivées de NSE-tTA (ligne A) x TetOp-FLAG-Acc-Jun (ligne E) ont été générées comme décrit dans Peakman et al. (Peakman, et al., 2003). Des souris bitransgéniques ont été conçues et élevées sur de la doxycycline (100, µg dans de l’eau de boisson) pour supprimer l’expression du transgène. Les porcelets ont été sevrés à la semaine 3, génotypés et séparés en groupes, la moitié étant maintenue dans de l’eau contenant de la doxycycline et la moitié dans de l’eau de boisson ordinaire pour induire l’expression de FLAG-Δc-Jun. Les cerveaux ont été recueillis 6 quelques semaines plus tard, le moment auquel les niveaux maximaux de FLAG-Δc-Jun ont été mesurés (Peakman, et al., 2003). Toutes les procédures chez les animaux ont été menées conformément au Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health.

2.3. Préparation de la membrane

Les cerveaux ont été conservés à -80 ° C jusqu'au jour du test. Avant le dosage, chaque cerveau était décongelé et le NAc était disséqué sur de la glace. Chaque échantillon a été homogénéisé dans du Tris-HCl 50 mM, du MgCl 3 mM.2, 1 mM EGTA, pH 7.4 (tampon de membrane) avec coups 20 provenant d'un homogénéisateur de verre à 4 ° C. L’homogénat a été centrifugé à 48,000 × g à 4 ° C pour 10 min, remis en suspension dans un tampon membranaire, centrifugé à nouveau à 48,000 × g à 4 ° C pour 10 min et remis en suspension dans 50 mM Tris-HCl, 3 mM MgCl2, 0.2 mM EGTA, 100 mM NaCl, pH 7.4 (tampon de dosage). Les taux de protéines ont été déterminés par la méthode de Bradford (Bradford, 1976) en utilisant l’albumine de sérum bovin (BSA).

2.4. Agoniste-Stimulé [35S] Liaison GTPγS

Les membranes ont été pré-incubées pendant quelques minutes 10 à 30 ° C avec de l'adénosine désaminase (3 mU / ml) dans du tampon de dosage. Les membranes (protéines 5 – 10 en µg) ont ensuite été incubées pendant 2 h à 30 ° C dans un tampon de test contenant 0.1% (p / v) BSA, 0.1 nM [35S] GTPγS, 30 µM ​​GDP et adénosine désaminase (3 mU / ml) avec et sans les concentrations appropriées de DAMGO ou de WIN55,212-2. La liaison non spécifique a été mesurée avec 20 µM ​​GTPγS. L'incubation a été terminée par filtration sur des filtres en fibres de verre GF / B, puis par des lavages 3 avec 3 ml 50 mM Tris-HCl, pH 7.4. La radioactivité liée a été déterminée par spectrophotométrie à scintillation liquide après extraction pendant une nuit des filtres dans un fluide à scintillation Econo-1.

2.5. Dosage adenylyl cyclase

Les membranes (protéine 5 – 25 µg) ont été préincubées avec l'adénosine désaminase comme décrit ci-dessus, puis incubées pendant 15 min à 30 ° C en présence ou en absence de forskoline 1µM, avec ou sans DAMGO, U50,488H ou WINXUMX-55,212, en mémoire tampon. 2 µM ​​ATP, [α-32P] ATP (1.5 µCi), 0.2 mM DTT, 0.1% (w / v) BSA, 50 µM ​​AMP cyclique, 50 µM ​​GTP, 0.2 mM papavérine, 5 mM phosphocreatine, 20 unités / ml de créatinine et d’alcine. / ml) dans un volume final de 3 µl. Dans ces conditions, le total [α-32Le p] AMPc récupéré était généralement inférieur à 1% de la quantité totale de [α-32P] ATP dans chaque échantillon. La réaction a été arrêtée par ébullition pendant 3 min et [32P] L’AMP cyclique a été isolé par la méthode à double colonne (Dowex et alumine) de Salomon (Salomon, 1979) [3Du H] AMPc (10,000 dpm) a été ajouté à chaque tube avant la chromatographie sur colonne en tant qu'étalon interne. La radioactivité a été déterminée par spectrophotométrie à scintillation liquide (% d'efficacité 45 pour 3H) après 4.5, on dissout ml de l'éluat dans 14.5 ml de fluide de scintillation Ecolite.

2.6. L'analyse des données

Sauf indication contraire, les données sont rapportées sous forme de valeurs moyennes ± SE des expériences séparées 4 – 8, chacune d'entre elles ayant été réalisée en triple. Net-stimulée [35La liaison S] GTPγS est calculée en tant que liaison stimulée par un agoniste moins une liaison basale. L’activité adénylylcyclase nette stimulée par la forskoline est définie comme l’activité stimulée par la forskoline - activité de base (pmol / mg / min). Le pourcentage d'inhibition de l'activité de l'adénylyl cyclase stimulée par la forskoline est défini comme (activité nette stimulée par la forskoline en l'absence d'activité agoniste - nette stimulée par la forskoline en présence d'activité agoniste / nette stimulée par la forskoline en l'absence d'agoniste) × 100. Toutes les analyses statistiques et d’ajustement de courbe ont été effectuées à l’aide de Prism 4.0c (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). Les courbes de concentration-effet ont été analysées par régression itérative non linéaire pour obtenir la CE50 et emax valeurs. La signification statistique des données de concentration-effet a été déterminée par analyse de variance à deux voies (ANOVA), en utilisant la dose d'agoniste et l'induction génique (activée ou désactivée) comme facteurs principaux. Signification statistique des valeurs d'ajustement de courbe (Emax ou EC50) a été déterminée par le test t de Student bilatéral non apparié, en utilisant la correction de Welch ou la transformation de la racine carrée des données si nécessaire pour corriger les variances inégales (détectées par le test F) dans EC50 valeurs.

3. Résultats

3.1. Effet de l'expression de ΔFosB sur l'activation de la protéine G induite par les récepteurs opioïdes et cannabinoïdes

Déterminer si MOR ou CB1L'activation de la protéine G médiée par le R était altérée par l'expression transgénique inductible de ΔFosB dans le NAc, stimulé par un agoniste [35La liaison de S] GTPγS a été examinée dans des membranes isolées préparées à partir de cette région de souris bitransgéniques exprimant de manière conditionnelle (ΔFosB on) ou n'exprimant pas (ΔFosB off) le transgène ΔFosB. DAMGO, un analogue de l'enképhaline, sélectif pour le MOR, a été utilisé pour activer le MOR et l'aminoalkylindole, un cannabinoïde WIN55,212-2, pour activer le CB1R. Il a déjà été démontré que ces ligands sont des agonistes à part entière chez MOR et CB.1R, respectivement (Breivogel et al., 1998, Selley et al., 1997). Il n’était pas possible d’examiner l’activité de la protéine G médiée par le KOR car le signal était trop faible dans le cerveau des rongeurs (Childers, et al., 1998). Les résultats ont montré une stimulation dépendante de la concentration de l'activité de la protéine G par DAMGO et WIN55,122-2 dans le NAc de ΔFosB off et de ΔFosB chez la souris (Figure 1). Pour l'activité stimulée par DAMGO (Figure 1A), une ANOVA bidirectionnelle des données concentration-effet a révélé des effets principaux significatifs du statut ΔFosB (p <0.0001, F = 22.12, df = 1) et de la concentration de DAMGO (p <0.0001, F = 29.65, df = 5) sans interaction significative (p = 0.857, F = 0.387, df = 5). L'analyse de régression non linéaire des courbes concentration-effet a révélé un DAMGO E significativement plus élevémax valeur en ΔFosB chez la souris (Emax = 73 ± 5.2% de stimulation) par rapport aux souris AFFB off (Emax = 56 ± 4.1% de stimulation; p <0.05 différent de ΔFosB sur souris par le test t de Student). DAMGO EC50 les valeurs n'étaient pas différentes entre les souris AFOSB on et les souris AFSB off (302 ± 72 nM vs 212 ± 56 nM, respectivement, p = 0.346).

Figure 1 

Effet de l'expression de ΔFosB sur [stimulé par un agoniste]35Liaison S] GTPγS dans le NAc. Les membranes de souris exprimant ΔFosB (ΔFosB on) ou de contrôle (ΔFosB off) ont été testées comme décrit dans la section Procédés utilisant des concentrations variables ...

Contrairement aux résultats obtenus avec l'agoniste MOR, DAMGO, aucune différence d'activation de la protéine G dépendante du statut ΔFosB n'a été observée avec l'agoniste des cannabinoïdes WIN55,212-2 (Figure 1B). Une ANOVA bidirectionnelle des données sur l'effet concentration-effet de WIN55,212-2 a révélé un effet principal significatif de la concentration de WIN55,212-2 (p <0.0001, F = 112.4, df = 7), mais pas de l'état ΔFosB (p = 0.172 , F = 1.90, df = 1) et il n'y a pas eu d'interaction (p = 0.930, F = 0.346, df = 7). De même, il n'y avait aucun effet du statut ΔFosB sur WIN55,212-2 Emax Valeurs (103 ± 6% versus 108 ± 8% stimulation chez les souris ΔFosB activées ou non, respectivement, p = 0.813 selon le test t de Student) ou EC50 valeurs (103 ± 20 nM versus 170 ± 23 nM chez les souris ΔFosB activées et désactivées, respectivement, p = 0.123).

D'après la forme des courbes et le fait que nos études précédentes ont montré des courbes biphasiques concentration-effet WIN55,212-2 dans le cerveau (Breivogel et al., 1999, Breivogel et al., 1998), les courbes WIN55,212-2 ont également été analysées à l’aide d’un modèle à deux sites. L’analyse des données moyennes a montré une légère amélioration de la qualité de l’ajustement en utilisant le modèle à deux sites (R2 = 0.933 et 0.914, somme des carrés = 3644 et 5463 chez les souris ΔFosB activées et désactivées, respectivement) par rapport au modèle à site unique (R2 = 0.891 et 0.879, somme des carrés = 6561 et 6628 chez les souris ΔFosB activées et désactivées, respectivement). Cependant, aucune différence significative n’a été constatée entre les souris ΔFosB activées et désactivées, que ce soit chezmax ou EC50 valeurs des sites de haute ou basse puissance (Tableau supplémentaire 1), bien qu’il y ait une tendance à la baisse des prix CE50 valeur au site de haute activité chez la souris avec ΔFosB activé (CE50Élevée = 28.0 ± 10.6 nM) par rapport à ceux avec ΔFosB off (EC50Élevée = 71.5 ± 20.2 nM; p = 0.094). De plus, l’état de ΔFosB n’a pas d’effet sur le basal [35Liaison S] GTPγS dans les membranes NAc (253 ± 14 versus 226 ± 14 fmol / mg chez des souris AFOSB sur et hors souris, respectivement, p = 0.188). Ces données indiquent que l’expression transgénique inductible de ΔFosB dans le NAc de souris a augmenté l’activation de la protéine G médiée par MOR, sans affecter significativement la CB.1Activité de la protéine G basale ou médiée par R

3.2. Effet de ΔFosB sur l'inhibition de l'adénylyl cyclase induite par les récepteurs aux opioïdes et aux cannabinoïdes

Pour évaluer l'effet de l'expression transgénique inductible de ΔFosB sur la modulation de l'activité effectrice en aval par MOR et CB1R, l’inhibition de l’activité adénylyl cyclase stimulée par la forskoline 1 µM ​​a été examinée dans les membranes NAc. En plus de MOR- et CB1L'inhibition de l'activité de l'adénylyl cyclase induite par le R et les effets de l'activité de la KOR ont également été examinés à l'aide de l'agoniste complet sélectif pour la KOR, U50,488 (Zhu et al., 1997), car des résultats antérieurs avaient montré que l'ARNm de la dynorphine était une cible de ΔFosB dans le modèle bitransgénique (Zachariou et al., 2006). Les résultats ont montré que DAMGO, U50,488 et WIN55,212-2 produisaient chacun une inhibition dépendante de la concentration de l'activité de l'adénylyl cyclase à la fois chez ΔFosB off et chez ΔFosB chez la souris (Figure 2). ANOVA à deux voies des données d'effet de la concentration de DAMGO (Figure 2A) ont révélé des effets principaux significatifs du statut ΔFosB (p = 0.0012, F = 11.34, df = 1) et de la concentration de DAMGO (p <0.0001, F = 29.61, df = 6), mais aucune interaction significative (p = 0.441, F = 0.986 , df = 6). L'analyse de régression non linéaire des courbes concentration-effet DAMGO a révélé une EC DAMGO significativement plus faible50 valeur en ΔFosB sur souris (101 ± 11 nM) comparée à ΔFosB hors souris (510 ± 182 nM, p <0.05 par le test t de Student). Cependant, il n'y avait pas de différence significative dans DAMGO Emax valeurs (20.9 ± 1.26% versus 19.8 ± 1.27% d’inhibition chez les souris ΔFosB on et off, respectivement, p = 0.534).

Figure 2 

Effet de l'expression de ΔFosB sur l'inhibition de l'activité de l'adénylyl cyclase dans le NAc. Les membranes provenant de souris exprimant ΔFosB (ΔFosB on) ou de contrôle (ΔFosB off) ont été testées comme décrit dans la section Procédés en présence de 1 µM. ...

L’inhibition de l’adenylyl cyclase induite par la KOR différait également en fonction de l’expression transgénique inductible de ΔFosB (Figure 2B). Une ANOVA bidirectionnelle des données de concentration-effet U50,488 a montré des effets principaux significatifs du statut ΔFosB (p = 0.0006, F = 14.53, df = 1) et de la concentration U50,488 (p <0.0001, F = 26.48, df = 3) , sans interaction significative (p = 0.833, F = 0.289, df = 3). L'analyse de régression non linéaire des courbes concentration-effet a révélé un U50,488 E supérieurmax valeur en ΔFosB sur souris (18.3 ± 1.14% d'inhibition) par rapport à ΔFosB off souris (12.5 ± 2.03% d'inhibition; p <0.05 différent de ΔFosB sur par le test t de Student), sans différence significative en U50,488 XNUMX EC50 valeurs (310 ± 172 nM versus 225 ± 48 nM chez les souris ΔFosB activées et désactivées, respectivement, p = 0.324).

Contrairement aux effets observés avec MOR et KOR, il n’existait aucun effet significatif de l’expression de ΔFosB transgénique sur l’inhibition de l’adénylyl cyclase par l’agoniste des cannabinoïdes WIN55212-2 (Figure 2C). L'ANOVA bidirectionnelle des données de WIN55,212-2 sur l'effet de la concentration a montré un effet significatif de la concentration du médicament (p <0.0001, F = 23.6, df = 2), mais pas du statut ΔFosB (p = 0.735, F = 0.118, df = 1) ni d'interaction significative (p = 0.714, F = 0.343, df = 2). En outre, il n'y avait aucun effet du statut ΔFosB sur l'activité adénylyl cyclase basale ou stimulée par la forskoline en l'absence de tout agoniste. L'activité adénylyl cyclase basale était de 491 ± 35 pmol / mg / min dans ΔFosB sur des souris comparée à 546 ± 44 dans ΔFosB off souris (p = 0.346 par le test t de Student). De même, l'activité adénylyl cyclase en présence de 1 uM de forskoline était de 2244 ± 163 pmol / mg / min dans ΔFosB sur les souris contre 2372 ± 138 pmol / mg / min chez ΔFosB off souris (p = 0.555).

3.3. Effet de ΔcJun sur l'inhibition de l'adénylyl cyclase induite par les récepteurs opioïdes et cannabinoïdes

Parce que l'expression transgénique inductible de ΔFosB augmentait la transduction du signal inhibiteur de MOR et KOR en adénylyl cyclase dans le NAc, il était intéressant de déterminer si un inhibiteur négatif dominant de la transcription médiée par ΔFosB modulerait la signalisation des récepteurs opioïdes de manière opposée. Pour répondre à cette question, l'inhibition de l'activité de l'adénylyl cyclase stimulée par la forskoline par DAMGO et U50,488 a été examinée dans des membranes préparées à partir du NAc de souris bitransgéniques exprimant conditionnellement Acjun. Les résultats n'ont montré aucun effet significatif de l'expression de ΔcJun sur l'inhibition de l'activité de l'adénylyl cyclase par MOR ou KOR (Figure 3). L'ANOVA bidirectionnelle des courbes concentration-effet de DAMGO a montré un effet principal significatif de la concentration de DAMGO (p <0.0001, F = 20.26, df = 6), mais pas de statut ΔcJun (p = 0.840, F = 0.041, df = 1) et il n'y avait pas d'interaction significative (p = 0.982, F = 0.176, df = 6). De même, il n'y avait pas de différence significative dans Emax ou EC50 valeurs entre souris avec ΔcJun sur (Emax = 23.6 ± 2.6%; CE50 = 304 ± 43 nM) ou ΔcJun désactivé (Emax = 26.1 ± 2.5%, p = 0.508; CE50 = 611 ± 176 nM, p = 0.129). Des résultats similaires ont été observés avec U50,488, de sorte qu'une ANOVA bidirectionnelle des courbes concentration-effet a montré un effet significatif de concentration (p <0.0001, F = 11.94, df = 6), mais pas de statut ΔcJun (p = 0.127 , F = 2.391, df = 1) et il n'y avait pas d'interaction significative (p = 0.978, F = 0.190, df = 6). De même, il n'y avait pas de différences significatives dans Emax ou EC50 valeurs entre souris avec ΔcJun sur (Emax = 14.8 ± 2.9%; CE50 = 211 ± 81 nM) ou désactivé (Emax = 16.7 ± 1.8%, p = 0.597; CE50 = 360 ± 151 nM, p = 0.411).

Figure 3 

Effet de l'expression de ΔcJun sur l'inhibition de l'activité de l'adénylyl cyclase dans le NAc. Des membranes de souris exprimant ΔcJun (Acjun on) ou témoins (Acjun off) ont été incubées en présence de DAMGO (A), U50,488H (B) ou WIN55,212-2 ...

L'expression de ΔcJun n'a pas non plus affecté de manière significative l'inhibition de l'adénylyl cyclase dans la NAc par l'agoniste cannabinoïde. L'ANOVA bidirectionnelle des courbes d'effet de concentration de WIN55,212-2 a montré un effet principal significatif de la concentration de WIN55,212-2 (p <0.0001, F = 15.53, df = 6), mais pas de génotype (p = 0.066, F = 3.472, df = 1) et il n'y avait pas d'interaction significative (p = 0.973, F = 0.208, df = 6). De même, il n'y avait pas de différences significatives dans WIN55,212-2 Emax Valeurs (13.0 ± 2.3% et 13.6 ± 0.9% d'inhibition chez les souris ΔcJun on versus off, respectivement, p = 0.821) et ou EC50 valeurs (208 ± 120 nM et 417 ± 130 nM chez les souris AcJun contre versus, respectivement, p = 0.270). Ainsi, malgré une légère tendance à la diminution de la puissance de WIN55,212-2 chez les souris exprimant ΔcJun, le transgène n’altère pas de manière significative l’inhibition de l’adénylyl cyclase par les cannabinoïdes. De plus, le statut de ΔcJun n’a pas eu d’effet sur l’activité adénylyl cyclase basale ou stimulée par la forskoline. L'activité adénylylcyclase basale était 1095 ± 71 pmol / mg / min et 1007 ± 77 pmol / mg / min (p = 0.403) chez des souris avec ΔcJun activé ou désactivé, respectivement. L'activité de l'adénylyl cyclase stimulée par la forskoline 1 µM ​​était 4185 ± 293 pmol / mg / min versus 4032 ± 273 pmol / mg / min (p = 0.706) chez des souris avec ΔcJun activé ou désactivé, respectivement.

3.4. Discussion

Les résultats de cette étude ont révélé une activation accrue de la protéine G médiée par MOR et une inhibition de l'adénylyl cyclase dans le NAc de souris présentant une expression transgénique inductible de ΔFosB dans le dynorphin / D1R contenant des neurones. L'inhibition de l'activité de l'adénylyl cyclase induite par le KOR a également été renforcée chez les souris exprimant le NAc, suggérant que ΔFosB régule le système opioïde endogène dans le NAc. Le DAMGO Emax la valeur était supérieure pour le MOR stimulé [35Liaison S] GTPγS et son CE50 la valeur était inférieure pour l'inhibition de l'adénylyl cyclase, chez les souris surexprimant ΔFosB par rapport aux souris témoins. Ces découvertes suggèrent la possibilité d'une réserve de récepteur pour la modulation de l'effecteur mais pas pour l'activation de la protéine G dans les conditions de dosage examinées. La découverte que l'expression de ΔFosB affectait l'inhibition maximale de l'adénylyl cyclase par l'agoniste du KOR suggère une réserve de récepteurs faible pour la réponse médiée par le KOR, ce qui concorde avec les faibles niveaux de sites de liaison au KOR dans le cerveau de souris (Unterwald, et al., 1991). En revanche, CB1L'activité de la protéine G médiée par R et l'inhibition de l'adénylyl cyclase n'étaient pas affectées par l'expression de ΔFosB, ce qui suggère que les systèmes opioïde et cannabinoïde diffèrent par leur réponse à ΔFosB dans ces neurones NAc.

L'effet de ΔFosB sur la signalisation médiée par les récepteurs opioïdes est conforme à notre rapport précédent, selon lequel l'expression de ΔFosB dans le striatum modifiait les effets aigus et chroniques de la morphine (Zachariou et al., 2006). L’une des conclusions de cette étude était que des souris ayant une expression transgénique de ΔFosB dans la dynorphine / D1Les neurones R striataux étaient plus sensibles à la morphine que les témoins. En outre, cet effet a été imité par l'expression de ΔFosB à médiation virale par injection au site dans le NAc. Ces observations sont cohérentes avec les résultats actuels qui montrent une signalisation améliorée du MOR dans le NAc.

Nous avons précédemment identifié le gène codant la dynorphine en tant que cible de ΔFosB et a suggéré que la réduction de la dynorphine serait compatible avec l’amélioration des propriétés enrichissantes de la morphine chez les souris bitransgéniques ΔFosB (Zachariou et al., 2006). Les présents résultats montrent que l'inhibition de l'adénylyl cyclase dans le NAc induite par le KOR est renforcée chez les souris exprimant ΔFosB, ce qui pourrait refléter une augmentation compensatoire de la sensibilité au KOR après réduction de la dynorphine. Des études antérieures ont montré que KOR était régulé positivement dans certaines régions du cerveau de souris knock-out prodynorphines, y compris NAc (Clarke et al., 2003).

Contrairement à ΔFosB, l'expression transgénique inductible de ΔcJun, le mutant tronqué dominant négatif du partenaire de liaison à ΔFosB, cJun, n'a pas modifié l'inhibition de l'adénylyl cyclase par les agonistes de MOR ou de KOR. Ces résultats suggèrent que les niveaux basaux d'expression de ΔFosB, qui sont relativement faibles, ne jouent pas un rôle significatif dans le maintien de la signalisation des récepteurs opioïdes à ce niveau de transduction du signal dans le NAc. Le fait que l’effet gratifiant conditionné de la morphine ait été diminué de l’expression de ΔcJun dans notre étude précédente (Zachariou et al., 2006) suggère que l'induction de ΔFosB par la morphine pendant la procédure de conditionnement est importante pour la régulation des réponses comportementales au médicament ou que des effets transcriptionnels de ΔFosB autres que ceux affectant la signalisation proximale par les récepteurs opioïdes pourraient influer sur la récompense opioïde. En tout état de cause, les résultats de la présente étude montrent clairement que, lorsque l'expression de ΔFosB est supérieure aux niveaux de base dans la dynorphine / D striatale1Dans les neurones exprimant R, il existe une forte augmentation du couplage de MOR et de KOR à l’inhibition de l’adénylyl cyclase dans le NAc.

Les mécanismes par lesquels la surexpression de ΔFosB à médiation par MOR et KOR sont améliorés ne sont pas clairs, mais nous avons déjà montré que les niveaux de MOR, évalués par [3Liaison au H] naloxone, ne diffèrent pas entre les souris NAc de ΔFosB sur et off (Zachariou et al., 2006). La même étude a révélé que GαiLes niveaux de protéines 1 et 2 n'ont pas été affectés dans cette région par l'expression de AFOSB. Cependant, les analyses précédentes du réseau d’expression génique montraient que le Gao L’ARNm a été régulé positivement dans le NAc de ΔFosB chez la souris (McClung et Nestler, 2003). Dans de futures études, il sera intéressant d'examiner de manière exhaustive l'effet de l'expression du ΔFosB transgénique sur l'expression de la sous-unité de la protéine G au niveau de la protéine, ainsi que sur l'expression de nombreuses protéines modulatrices de la protéine G.

Il est intéressant de noter que l’expression de ΔFosB n’a pas amélioré la CB.1Signalisation à médiation R dans le NAc. Il est possible que des modifications dans CB1La signalisation R se produit dans une population discrète de neurones qui est obscurcie dans toute la préparation de NAc. Par exemple, l'administration de Δ9- Le THC a induit ΔFosB de manière significative dans le noyau, mais pas la coque, du NAc (Perrotti et al., 2008). jendeed, il a été démontré que le défi avec Δ9-THC après administration répétée de Δ9-THC a augmenté la libération de dopamine dans le noyau de NAc, mais a diminué la libération dans la coque (Cadoni et al., 2008). Il est également important de noter que la lignée 11A de souris bitransgéniques n’exprime ΔFosB que dans la dynorphine / D1Neurones épineux moyens R positifs du striatum, mais CB1R sont exprimés à la fois en dynorphine / D1R et enképhaline / D2Neurones striataux R positifs (Hohmann et Herkenham, 2000), ainsi que sur les bornes des afférences corticales (Robbe et al., 2001). L’expression du régulateur négatif dominant de la transcription médiée par ΔFosB, ΔcJun, n’a pas non plus d’effet significatif sur la signalisation des récepteurs aux cannabinoïdes, bien que ΔcJun soit exprimé de manière inductible à la fois.1 et d2contenant des populations de neurones épineux moyens chez ces souris (Peakman, et al., 2003). Il est toutefois possible que l'expression de ΔFosB basale soit suffisamment faible pour que ΔcJun n'affecte pas la signalisation du récepteur, comme le suggèrent les résultats obtenus avec MOR et KOR. Il est également possible que CB1La signalisation R est légèrement améliorée par l'expression basique de ΔFosB, de sorte qu'une augmentation supplémentaire de l'expression de ΔFosB ou un blocage de ses actions avec ΔcJun n'ont eu que de légers effets qui n'ont pas atteint le niveau de signification statistique. Le support indirect pour cette interprétation est visible en comparant WIN55,212-2 EC50 valeurs entre souris exprimant ΔcJun versus ΔFosB. Le rapport du WIN55,212-2 EC50 pour l'inhibition de l'adénylyl cyclase chez la souris avec expression induite de ΔcJun à son EC50 la valeur de l'activation de la protéine G chez les souris avec l'expression induite de ΔFosB était 4.0, alors que le même rapport chez les souris sans induction de l'un ou l'autre transgène était 1.2.

Les cannabinoïdes pourraient également induire l’expression de ΔFosB sans effet direct sur la CB.1R signalant. Dans ce scénario, les cannabinoïdes pourraient moduler la réactivité aux effets psychoactifs d'autres médicaments via une régulation transcriptionnelle médiée par ΔFosB. jen fait, administration de Δ9-THC produit une sensibilisation croisée aux opioïdes et à l'amphétamine (Cadoni et al., 2001, Lamarque et al., 2001), compatible avec cette hypothèse. De plus, il a été rapporté que l'administration répétée de CP55,940, un agoniste des cannabinoïdes, augmentait l'activation de la protéine G médiée par MOR dans le NAc, de manière similaire aux souris exprimant inductivement le ΔFosB dans la présente étude (Vigano et al., 2005). L'effet de l'expression de ΔFosB sur Δ9Les comportements induits par THC n'ont pas été évalués, mais les résultats actuels n'excluent pas une interaction. Les résultats de cette étude et de notre étude précédente (Zachariou et al., 2006) montrent des altérations induites par ΔFosB dans MOR et KOR / dynorphine dans le striatum. Les effets enrichissants de Δ9-THC, mesuré en fonction de la place, sont supprimés chez les souris MOR null, alors que la suppression de KOR atténuée9-THC place l'aversion et a révélé Δ9-THC préférence de lieu (Ghozland et al., 2002) De même, l'aversion de la place conditionnée à Δ9-THC est absent dans la knockout pro-dynorphine par rapport aux souris de type sauvage (Zimmer et al., 2001) Ces données suggèrent que Δ9-THC pourrait être plus gratifiant après l’induction de ΔFosB et l’induction consécutive de la signalisation MOR avec réduction de l’expression de la dynorphine.

En résuméy, les résultats de cette étude ont montré que l’expression de ΔFosB dans D1Les neurones striataux positifs R / dynorphine ont amélioré la signalisation à médiation par MOR et KOR au niveau de l'inhibition à médiation par la protéine G de l'activité de l'adénylyl cyclase dans le NAc. Cette découverte est cohérente avec les études qui ont démontré le rôle du système opioïde endogène dans la récompense (Trigo et al., 2010), et fournissent un mécanisme potentiel pour des effets médiés par ΔFosB sur la récompense. En revanche, CB1L'expression striatale de ΔFosB dans les conditions examinées n'a pas d'effet significatif sur la signalisation induite par le R, bien que d'autres études soient nécessaires pour déterminer l'effet de l'induction de ΔFosB sur le système endocannabinoïde.

Points saillants de la recherche

  • La signalisation MOR est améliorée dans le noyau accumbens des souris qui expriment ΔFosB
  • L’inhibition par la KOR de l’adénylyl cyclase est également renforcée chez les souris exprimant ΔFosB
  • L'expression de ΔFosB n'altère pas la CB1R signalisation dans le noyau accumbens

Matériel complémentaire

Remerciements

Les auteurs remercient Hengjun He, Jordan Cox et Aaron Tomarchio pour leur assistance technique concernant le [35Essais de liaison S] GTPγS. Cette étude a été financée par les subventions USPHS DA014277 (LJS), DA10770 (DES) et P01 DA08227 (EJN).

Notes

Avis de non-responsabilité de l'éditeur: Ceci est un fichier PDF d’un manuscrit non édité qui a été accepté pour publication. En tant que service à nos clients, nous fournissons cette première version du manuscrit. Le manuscrit subira une révision, une composition et une révision de la preuve résultante avant sa publication dans sa forme définitive. Veuillez noter que des erreurs pouvant affecter le contenu peuvent être découvertes au cours du processus de production, de même que tous les dénis de responsabilité qui s'appliquent à la revue.

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