Rôle essentiel de l'histone méthyltransférase G9a dans la plasticité induite par la cocaïne (2010)

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Abstrait

Les altérations de l'expression des gènes induites par la cocaïne entraînent des modifications de la morphologie neuronale et du comportement pouvant sous-tendre la dépendance à la cocaïne. Nous avons identifié un rôle essentiel pour la diméthylation de l'histone 3 lysine 9 (H3K9) et de la lysine diméthyltransférase G9a dans la plasticité structurelle et comportementale induite par la cocaïne. L'administration répétée de cocaïne a réduit les niveaux globaux de diméthylation de H3K9 dans le noyau accumbens. TSa réduction de la méthylation de l'histone était médiée par la répression de G9a dans cette région du cerveau, qui était régulée par le facteur de transcription ΔFosB induit par la cocaïne. En utilisant la mutagenèse conditionnelle et le transfert de gène à médiation virale, nous avons constaté que la régulation négative de G9a augmentait la plasticité de la colonne vertébrale dendritique des neurones du noyau accumbens et augmentait la préférence pour la cocaïne, établissant ainsi un rôle crucial pour la méthylation de l'histone dans les actions à long terme de la cocaïne.

Introduction

L'exposition répétée à la cocaïne est caractérisée par des changements persistants dans l'expression des gènes et une altération de la morphologie neuronale dans le noyau accumbens (NAc), un composant clé du circuit de récompense du cerveau (1-2). Le remodelage de la chromatine est important dans les modifications aberrantes de la transcription dans cette région du cerveau pouvant être à la base de certains aspects de la dépendance à la cocaïne. (3-9). La régulation de la structure de la chromatine par la cocaïne dans le NAc résulte en partie de modifications induites directement par la cocaïne de la machinerie enzymatique de la chromatine, entraînant des modifications de l'acétylation et de la phosphorylation des histones (4, 7-9) Cependant, les rôles des enzymes contrôlant la méthylation de l'histone n'ont pas encore été étudiés.

Une analyse récente du promoteur à l'échelle du génome utilisant l'immunoprécipitation de la chromatine couplée à des microréseaux (ChIP-Chip) a identifié des profils altérés de méthylation de l'histone répressive H3 lysine 9 (H3K9) et de 27 (H3K27) à la suite de la survenue de la septa6). Nous avons donc mis en évidence de nombreuses lysine méthyltransférases (KMT) et déméthylases (KDM) connues pour contrôler la méthylation de H3K9 ou H3K27 (Fig. 1A). Seules deux enzymes, G9a et GLP, ont présenté une régulation transcriptionnelle persistante 24 heures après l'administration répétée de cocaïne, lorsque l'expression des deux gènes était significativement régulée à la baisse.. Étant donné que G9a et GLP catalysent spécifiquement la diméthylation de H3K9 (H3K9me2), leur régulation à la baisse par la cocaïne est compatible avec la diminution des niveaux globaux de H3KXNXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX observés à ce jour (Fig. 1B). En revanche, les niveaux globaux de méthylation de H3K27 hétérochromatique ne sont pas modifiés par une exposition répétée à la cocaïne (Fig. S1 dans le support de matériel en ligne). En raison de son activité catalytique élevée, à la fois in vitro et in vivo (10), nous avons entrepris d’examiner plus avant la signification fonctionnelle de la répression de G9a après une exposition répétée à la cocaïne dans le NAc. Les taux de protéine G9a, ainsi que les taux de son ARNm, ont été réduits de manière significative en 24 heures après une administration répétée de cocaïne (Fig. S2). Bien que l'expression de l'ARNm de G9a ait été réduite de 35% dans le NAc, une analyse immunohistochimique a révélé une réduction plus modeste en 15% du taux de protéine G9a, ce qui est cohérent avec la diminution observée en% de H21KXNXXXXXXXXXXXXXXX, après l'administration répétée de cocaïne (Fig. 1B). L’expression de l’ARNm de G9a a également été réduite de 20 dans cette région cérébrale après l’auto-administration répétée de cocaïne (Fig. S3).

Fig. 1  

La cocaïne répétée réprime l'expression de G9a dans NAc via un mécanisme dépendant de ΔFosB. (A) Expression de l'ARNm des KMT et KDM H3K9 / K27 dans NAc 24 hr après avoir répété la cocaïne. (B) Taux de H3K9me2 dans NAc 24 h après la prise répétée de cocaïne. (C) Analyse de gène ...

Pour déterminer si les modifications de H3K9me2 euchromatique sont corrélées aux altérations du gène dans l'expression génique dans le NAc, nous avons utilisé des analyses par micropuce pour examiner les profils d'expression génique induits par une dose d'attaque de cocaïne chez des animaux présentant ou non des antécédents d'exposition antérieure à la cocaïne (voir complément d'information). listes de gènes dans Tables S1 – S3). Les animaux qui avaient reçu de la cocaïne répétée présentaient une expression du gène 1 augmentée de façon spectaculaire heure après une provocation à la cocaïne par rapport aux animaux traités de manière aiguë (Fig. 1C). Cette expression génique accrue s'est encore produite en réponse à une provocation à la cocaïne administrée après la semaine 1 de sevrage de la cocaïne répétée. Conformément aux rapports précédents, un faible pourcentage de gènes (~ 10%) présentait des réponses transcriptionnelles désensibilisées à la suite de l'administration répétée de cocaïne (Fig. 1C; voir Table S1) (5). Pour étudier directement le rôle de la régulation à la baisse de G9a dans l’expression accrue des gènes observée après la cocaïne répétée, les souris ont reçu des injections intra-NAc de vecteurs du virus Herpes simplex (HSV) exprimant GFP ou G9a et ont été traités avec de la cocaïne saline ou répétée afin de déterminer s’ils surexprimaient G9a. était suffisante pour bloquer l’augmentation répétée de l’expression génique induite par la cocaïne. À partir d’un ensemble de gènes 12 sélectionnés au hasard, affichant des niveaux d’expression élevés après des cocaïnes répétées, nous avons observé que G9a réduisait de manière significative l’expression accrue de 50% de ces gènes (Table S4).

Pour identifier les événements de transcription en amont qui interviennent dans la répression répétée de l'expression de G9a induite par la cocaïne, nous avons étudié le rôle possible de ΔFosB, un produit d'épissage très stable du gène précoce immédiat. FOSB. Le ΔFosB s’accumule dans le NAc après une exposition répétée à la cocaïne, où il a été associé à une augmentation de la récompense de la cocaïne (11). ΔFosB peut agir comme activateur ou répresseur de transcription en fonction du gène cible impliqué (3, 5, 6, 12). Utilisation de NSE- bitransgéniquetTA × tetOP-ΔFosB souris, où l'expression de ΔFosB peut être induite sélectivement dans le NAc et le striatum dorsal d'animaux adultes (13), nous avons examiné l'impact de l'expression de ΔFosB sur la régulation de la cocaïne de H3K9me2 et des KMT dans la NAc. La surexpression de ΔFosB était suffisante pour réduire les niveaux de H3K9me2 (Fig. 1D) et l'expression de G9a (Fig. 1E), imitant ainsi les effets de la cocaïne répétée. En revanche, ΔFosB n'a pas réduit l'expression des BPL dans cette région du cerveau et n'a eu aucun effet sur SUV39H1 et EZH2, les principales enzymes triméthylantes de H3K9 et H3K27, respectivement (Fig. S4). Pour confirmer ces données en utilisant un système indépendant de surexpression de ΔFosB, des souris adultes de type sauvage ont reçu des injections bilatérales intra-NAc de vecteurs de virus adéno-associés (AAV) exprimant la GFP ou ΔFosB. La surexpression de ΔFosB induite par le virus a diminué les niveaux d’expression de G9a dans cette région du cerveau (Fig. 1E).

Cette régulation spécifique et prononcée de G9a nous a incités à rechercher si la modification de l'expression de G9a spécifiquement dans les neurones NAc régule les réponses comportementales à la cocaïne. Des souris de type Wild ont reçu des injections intra-NAc de vecteurs HSV exprimant GFP ou G9a et ont ensuite été analysées en utilisant un paradigme de préférence de lieu conditionné avec de la cocaïne sans biais, qui fournit une mesure indirecte de la récompense du médicament. La surexpression virale de G9a dans les neurones NAc a été confirmée à la suite de tests comportementaux (Fig. 2A). La surexpression de G9a a significativement diminué la préférence pour la cocaïne par rapport aux animaux surexprimant la GFP (Fig. 2B) et l’augmentation des niveaux de H3K9me2 dans le NAc (Fig. 2C). Surexpression d’un mutant catalytiquement mort de G9a (G9aH1093K) (14) n'a pas affecté la préférence pour la cocaïne (Fig. 2B) et n'a eu aucun effet sur les niveaux de H3K9me2 dans cette région du cerveau (Fig. 2C).

Fig. 2 

G9a dans NAc régule la plasticité comportementale induite par la cocaïne. (A) Image représentative de l'expression du transgène médiée par le HSV dans NAc. Le dessin de la tranche de cerveau coronale a été pris de l'atlas du cerveau de souris. (B) Préférence de place conditionnée pour la cocaïne et ...

Approfondir l’étude du rôle de G9a dans les effets comportementaux de la cocaïne, et plus précisément d’imiter la répression répétée induite par la cocaïne de l’expression de G9a dans le NAX, G9a adultefl / fl des souris (14) ont reçu des injections intra-NAc de vecteurs AAV exprimant Cre recombinase ou GFP en tant que contrôle. Knockdown AAV-Cre de G9a dans le NAc, qui a été confirmé par immunohistochimie (Fig. S5), a significativement augmenté les effets de la cocaïne dans les expériences sur le conditionnement en place et a diminué les niveaux de H3K9me2 dans le NAc (Fig. 2D, E). Un inhibiteur pharmacologique de G9a et de GLP, BIX01294 (disponible dans le commerce) disponible dans le commerce15-16), a été utilisé pour déterminer si l'inhibition de l'enzyme affecte de manière similaire les réponses comportementales à la cocaïne. En effet, l'inhibition pharmacologique de G9a et de GLP a significativement augmenté la préférence pour la cocaïne et diminué H3K9me2 dans le NAc (Fig. 2F, G).

L’administration répétée de cocaïne augmente la densité des épines dendritiques sur les neurones à épine moyenne de NAc (17), processus associé à des modifications fonctionnelles au niveau des synapses glutamatergiques excitatrices sur ces neurones (18-19) et des réactions comportementales sensibilisées à la drogue (17, 20). Nous avons donc émis l'hypothèse que la régulation négative de l'activité de G9a dans le NAc par la cocaïne répétée pourrait influencer la capacité de la cocaïne à réguler la densité de la colonne vertébrale dendritique des neurones de NAc. En utilisant l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) avec un anticorps anti-G9a, nous avons identifié plusieurs gènes cibles du gène G9a dans le NAc, dont chacun a déjà été impliqué dans la plasticité dendritique induite par la cocaïne (Fig. 3A) (20-26). Nous avons constaté que l'administration répétée de cocaïne diminuait significativement la liaison de G9a, ainsi que les taux de H3K9me2, chez ces promoteurs de gènes (Fig. 3B). En revanche, l'administration aiguë de cocaïne a rapidement recruté G9a dans certains de ces mêmes promoteurs géniques, ce qui est cohérent avec une expression accrue de G9a observée dans le NAc 1 une heure après une dose aiguë de cocaïne (Fig. S6). Bien que la liaison de G9a à des promoteurs de gènes spécifiques soit en corrélation avec des modifications de son expression, il n’est pas clair si de tels événements sont médiés par une modification des taux globaux de G9a dans la NAc et / ou par des différences de recrutement de G9a après une exposition aiguë. vs. administration répétée de cocaïne.

Fig. 3  

G9a dans NAc régule la plasticité de la colonne vertébrale dendritique induite par la cocaïne. (A) G9a quantitative ChIP dans NAc provenant d’animaux traités de manière intense ou répétée à la cocaïne, à 1 ou 24 h, respectivement. APRT a été utilisé comme contrôle négatif. Les données sont présentées comme le relatif ...

Sur la base de la régulation par G9a de nombreux gènes liés à la plasticité dans la NAc, nous avons directement examiné si le maintien de l'expression de G9a dans cette région cérébrale après un traitement répété à la cocaïne était suffisant pour bloquer la formation d'épines dendritiques induite par la cocaïne. En utilisant un protocole de traitement à la cocaïne précédemment démontré pour promouvoir l'induction de la colonne dendritique dans le NAc (20), nous avons examiné la densité de la colonne vertébrale chez des animaux ayant reçu une injection de HSV-GFP ou de HSV-G9a. En accord avec les résultats précédents, nous avons observé une augmentation significative de la densité de la colonne vertébrale dendritique dans le NAc après un traitement à la cocaïne, un effet totalement bloqué par la surexpression de G9a (Fig. 3C). La surexpression de G9a seule n’était pas suffisante pour réduire la densité de la colonne vertébrale dendritique de NAc en l’absence de cocaïne. Pour compléter ces données, G9afl / fl les souris ont reçu des injections intra-NAc de HSV-Cre et la densité de la colonne vertébrale a été quantifiée et comparée aux animaux recevant HSV-GFP en l'absence de cocaïne. La réduction de l’expression de G9a a significativement augmenté la densité de la colonne vertébrale des neurones épineux de NAc moyen (Fig. 3C).

Compte tenu de la preuve que la régulation négative de G9a dans le NAc après la cocaïne répétée est médiée par ΔFosB, nous avons ensuite examiné si ce facteur de transcription était également impliqué dans la régulation des épines dendritiques du NAc.. Bien que ΔFosB n'ait jamais été lié de manière causale à une telle plasticité dendritique, plusieurs de ses cibles, y compris les sous-unités Cdk5 et NFKB, ont été impliquées de la sorte. (20-23), et l'expression persistante de ΔFosB dans les neurones NAc est corrélée à une densité accrue de la colonne dendritique après un traitement répété à la cocaïne (27). Premièrement, nous avons découvert que l’induction de ΔFosB chez des souris bitransgéniques en l’absence de cocaïne, ce qui a entraîné une régulation négative de l’expression de G9a et de H3KXNXXXXXUMX (Fig. 1D, E), une diminution de la liaison de G9a à de nombreux gènes liés à la plasticité, dont beaucoup se sont également révélés être des cibles directes de ΔFosB lui-même (Fig. 3D) (3, 6). Nous avons ensuite montré que la surexpression virale de ΔFosB dans le NAc augmentait significativement la densité de la colonne vertébrale dendritique dans des conditions basales, similaire à celle observée après l'administration répétée de cocaïne (Fig. 3E). À l'inverse, la surexpression dans le NAc de ΔJunD, une protéine mutante négative dominante antagoniste de l'activité transcriptionnelle de ΔFosB, a bloqué la capacité d'une cocaïne répétée à augmenter la formation d'épines dendritiques dans le NAc. (Fig. 3C).

Notre observation selon laquelle ΔFosB régule l'expression de G9a dans le NAc et que ΔFosB et G9a régissent certains des mêmes gènes cibles nous a conduit à examiner d'autres interactions entre ΔFosB et G9a. Après la cocaïne aiguë, lorsque les taux de G9a ont augmenté, la liaison de G9a au FOSB gène a augmenté, et après répétition de la cocaïne, lorsque l'expression de G9a a été supprimée, la liaison de G9a à la FOSB le gène était diminué (Fig. 3A). On n'a pas observé de diminution de la liaison de G9a après l'administration répétée de cocaïne. c-fos, la liaison de G9a est augmentée par la cocaïne répétée (Fig. S7). Ceci est cohérent avec le fait que, contrairement à FOSB, c-fos est réprimée et non induite par une exposition chronique aux psychostimulants (5). La surexpression de ΔFosB chez les souris bitransgéniques était suffisante pour diminuer significativement la liaison de G9a à la fosb gène (Fig. 3D). De plus, la surexpression de G9a était suffisante pour réduire l’expression accrue de ΔFosB à la suite de l’administration répétée de cocaïne (Table S4). Ces données suggèrent une boucle autorégulatrice dans laquelle G9a limite initialement l'induction de ΔFosB par une administration aiguë de cocaïne. Cependant, comme ΔFosB s’accumule avec une exposition répétée au médicament, il réprime G9a et potentialise ainsi sa propre induction.

En conclusion, nous avons démontré que la méthylation de l'histone-lysine dans le NAc joue un rôle essentiel dans la régulation de l'expression des gènes neuronaux en réponse à la cocaïne. La répression de G9a et de H3K9me2 après une administration répétée de cocaïne favorise la préférence de la cocaïne, en partie, par l'activation transcriptionnelle de nombreux gènes connus pour réguler les formes aberrantes de plasticité dendritique. Mieux comprendre les gènes régulés par de tels mécanismes améliorera notre connaissance des bases biologiques complexes de la toxicomanie et pourrait contribuer à la mise au point de traitements plus efficaces des troubles de la dépendance.

Matériels et méthodes

Animaux et traitements

Sauf indication contraire, les souris ont été logées quatre à cinq par cage dans une colonie à cycle heure / lumière 12 (lumières allumées de 7: 00 AM à 7: 00 PM) à température constante (23 ° C) avec ad libitum accès à l'eau et à la nourriture. Tous les protocoles animaux ont été approuvés par l'IACUC au centre médical UT Southwestern et à l'école de médecine Mount Sinai.

Pour les expériences sur la cocaïne [immunohistochimie, Western blotting, PCR quantitative, analyse par microréseau et immunoprécipitation de la chromatine (ChIP)], des souris mâles C8BL / 10J âgées de 57 à 6 ont été utilisées. Les animaux ont reçu des injections quotidiennes de «solution saline» (traitements 7, IP), de cocaïne «aiguë» (traitements 6 + un traitement 20 mg / kg cocaïne-HCl, ip) ou de cocaïne «répétée» (traitements 7 20 mg / kg cocaïne-HCl, ip). Les souris ont été sacrifiées à l'heure 1 ou à l'heure 24 après le traitement final. Pour les études sur puces à ADN, les animaux ont été traités quotidiennement avec l'une des solutions suivantes: «solution saline» (traitements 15, IP), cocaïne «aiguë» (traitements 14, solution saline + traitement 1 20 mg / kg cocaïne-HCl, ip), cocaïne «répétée + aiguë» ( Traitements 7 solution saline + traitements 8 20 mg / kg cocaïne-HCl, ip) ou «sevrage répété + aigu» cocaïne (traitements 7 20 mg / kg cocaïne-HCl + 7 traitements sérum + 1 challenge treatment 20 mg / kg cocaïne-HCl, ip) et ont été sacrifiés 1 une heure après le traitement final. Dans des expériences comportementales, des souris ont été logées séparément après une intervention chirurgicale et ont été traitées avec 10 mg / kg de cocaïne-HCl, ip, comme décrit ci-dessous. Pour l'analyse du rachis dendritique et la validation du microréseau après infection par HSV-GFP et HSV-G9a-GFP, les souris ont été traitées avec une solution saline (traitement au 5, solution saline, ip) ou à la «cocaïne répétée» (traitements 5, 20 mg / kg cocaïne-HCl, ip ) au cours des jours 3, il a déjà été prouvé que ce protocole d’injection augmentait la densité de la colonne vertébrale des neurones du noyau accumbens (NAc) au cours de l’expression transgénique du virus Herpes simplex (HSV) (Référence supplémentaire S1). Les souris utilisées pour l'analyse du rachis dendritique ont été sacrifiées 4 heures après le dernier traitement.

Pour induire une suppression locale du transcrit G9a limité aux neurones NAc, nous avons utilisé des souris mutantes homozygotes pour un allèle G9a floxé, qui ont été décrites en détail ailleurs (S2). La recombinaison induite par Cre produit l'exon 22 à 25, un épissage hors cadre conduisant à une désintégration non sensée du transcrit muté. Nous avons utilisé des souris Floxed G9a entièrement rétrocroisées avec des souris C57BL / 6J. Des souris ont été injectées de manière stérile dans le NAc avec des vecteurs du virus adéno-associé (AAV) (sérotype 2) exprimant la GFP ou Cre-GFP entre l'âge de 7 et les semaines 10. L’analyse immunohistochimique a été utilisée pour vérifier l’efficacité de la recombinaison induite par Cre (voir Fig. Supplémentaire S5). Nous avons utilisé les animaux injectés AAV 21 quelques jours après la chirurgie, car la recombinaison chez les souris G9a floxed était stable et maximale à ce moment-là, ce qui concorde avec les rapports publiés (S3-S4). Des expériences de surexpression de G9a et ΔJunD ont été conduites de manière similaire en utilisant des vecteurs du virus HSV exprimant soit la GFP, la G9a-GFP de type sauvage, la G9aH1093K-GFP de type sauvage, (voir S2 pour plus de détails concernant le développement des constructions G9a). Les souris surexprimant le VHS ont été utilisées 3 quelques jours après la chirurgie, car la surexpression était maximale à ce stade, comme cela a été observé par immunohistochimie. En raison de la nature transitoire de l'expression du HSV et de la nature beaucoup plus stable de l'expression de l'AAV, les vecteurs HSV ont été utilisés dans des expériences nécessitant une expression transgénique rapide à court terme, tandis que les vecteurs AAV étaient utilisés dans des expériences nécessitant de longues périodes d'expression du transgène. Des études antérieures approfondies ont montré que les deux vecteurs n'infectent que les corps de cellules neuronales de la zone cérébrale injectée, sans aucune infection de neurones afférents ou efférents.

Pour les expériences comportementales utilisant l'inhibiteur pharmacologique G9a / GLP, BIX01294 (25 ng / µl), les souris ont été implantées de manière stérotaxique avec deux mini-pompes sous-cutanées, ainsi qu'une canule guide bilatérale, dans le NAc. Les mini-pompes ont été activées 12 heures avant l'implantation, en commençant par l'administration continue (0.25 μl / heure) de véhicule (5 hydroxypropyl β-cyclodextrine) ou de médicament pendant les jours 14, pendant lesquels des évaluations comportementales ont été effectuées.

Pour les expériences de surexpression de ΔFosB [Western blotting, qPCR et ChIP], NSE- bitransgénique mâletTA × tetOP-ΔFosB des souris ont été utilisées (semaine 10). En l'absence de la doxycycline, un dérivé de la tétracycline (8 week of doxycycline), les animaux ont présenté une expression constitutive robuste ΔFosB avec restriction striataleS5). La surexpression de ΔFosB chez ces souris a été confirmée par qPCR. Pour confirmer les résultats en utilisant NSE-tTA × tetOP-ΔFosB des souris, des souris mâles C8BL / 57J âgées de la semaine 6, de type sauvage, ont reçu une injection intra-NAc avec des vecteurs AAV exprimant soit la GFP, soit la ΔFosB-GFP. Les vecteurs AAV ont été utilisés, dans ce cas, pour assurer une expression maximale de ΔFosB à 8 plusieurs semaines après la chirurgie, permettant ainsi une comparaison directe entre les souris surexprimant ΔFosB bitransgéniques infectées par le virus. La surexpression virale a été confirmée par qPCR plusieurs semaines après l’opération 8 (les poinçons NAc de calibre 15 ont été disséqués sous le site d’injection). Les souris surexprimant AAV-GFP et AAV-AFOSB-GFP qui n'étaient pas utilisées pour la qPCR ont été traitées avec du sérum physiologique (traitements 14, IP) ou de la cocaïne répétée (traitements 14 mg / kg cocaïne-HCl, ip) à partir de la semaine 30 (semaines). chirurgie. 6 jours après le traitement final, les cerveaux ont été fixés avec 4% paraformaldéhyde, sectionnés sur un vibratome et utilisés pour l'analyse de la colonne vertébrale dendritique.

Analyse de transfert de Western

Des poinçons NAc de calibre 14 ont été prélevés dans des sections coronales de mm 1 obtenues en utilisant une matrice cérébrale de souris en acier inoxydable et ont été soniqués dans du tampon de lyse 1 M HEPES (1% SDS) contenant des inhibiteurs de protéase et de phosphatase. 10-Des échantillons de 30 μg de protéines totales ont été soumis à une électrophorèse sur gels 18% SDS. Les protéines ont été transférées sur des membranes de PVDF et incubées avec un anti-H3KXNXXXXXXUMX (monoclonal de souris, 9: 2), un anti-β-tubuline (monoclonal de souris, 1: 500), un anti-total H1 (XBX, 60,000). anti-GFP (utilisé pour la vérification de l'expression virale égale dans le tissu perforé) (lapin polyclonal, 3: 1), anti-H5,000K1me1000 (lapin polyclonal, 3: 27) ou anti-actine (souris monoclonal, 3: 1) 500 ° C (toutes les membranes ont été bloquées dans 1% lait ou 60,000% albumine de sérum bovin). Les membranes ont ensuite été incubées avec des anticorps secondaires marqués à la peroxydase (4: 5-1: 60,000 en fonction de l'anticorps primaire utilisé) et les bandes ont été visualisées en utilisant un substrat SuperSignal West Dura. Les bandes ont été quantifiées avec NIH Image J Software et H3K9me2 ont été normalisées à l'actine ou à la β-tubuline et à l'histone total H3 afin de contrôler un chargement égal. La cocaïne répétée n'a eu aucun effet sur les niveaux d'actine (Fig. S8) ou histone total 3 (Fig. S1) dans le NAc. En outre, l’infection par HSV-G9a-GFP et HSV-G9aH1093K-GFP n’a eu aucun effet sur les niveaux totaux de β-tubuline dans le NAc (Fig. S8).

Immunohistochimie

Les souris ont été mises sous sédation avec une dose létale d’hydrate de chloral et perfusées avec 4% paraformaldéhyde avant d’être analysées par immunohistochimie simple ou double comme décrit précédemment (S6). Brièvement, les cerveaux post-fixés ont été incubés à la température ambiante pendant une nuit dans 30% saccharose avant d’être sectionnés à 35 µm (les cerveaux utilisés pour l’analyse de la colonne dendritique ont été sectionnés sur un vibratome à des sections 100 µm en l’absence de 30% saccharose). Des sections de NAc flottantes ont été lavées avec du PBS 1X, bloquées (sérum d'âne normal 3%, 0.1% tritonX, PBS 1X) et ensuite incubées avec de l'anti-GFP (poulet polyclonal, 1: 8000) et / ou anti-G9a (polyclonal de lapin). , 1: 500) anticorps en solution bloquante. Les coupes analysées pour les épines dendritiques ont été incubées avec un anticorps anti-GFP polyclonal de lapin à 1: 200. Après une nuit d'incubation, les sections NAc ont été rincées fois 3 pendant quelques minutes avec 10X PBS, puis incubées avec Cy1 et / ou Cy2 anticorps secondaires couplés à la fluorescence dans une solution de blocage 3X PBS pendant 1. Les sections utilisées pour les études de morphologie ont été incubées dans l'anticorps secondaire pendant une nuit à la température ambiante. La coloration nucléaire a été obtenue en incubant des sections dans du 2X PBS contenant du DAPI (1: 1) pendant minutes 50,000. Les sections ont été à nouveau lavées, suivies d'une déshydratation à l'éthanol et d'un montage avec du DPX. Toutes les sections ont été imagées en utilisant une microscopie confocale.

Isolement de l'ARN et qPCR

Des poinçons NAc bilatéraux de calibre 14 ont été homogénéisés dans Trizol et traités selon les instructions du fabricant. L'ARN a été purifié avec des colonnes RNAesy Micro et la spectroscopie a confirmé que les rations ARN 260/280 et 260/230 étaient> 1.8. L'ARN a ensuite été transcrit en sens inverse en utilisant un kit Bio-Rad iScript. L'ADNc a été quantifié par qPCR en utilisant SYBR Green. Chaque réaction a été effectuée en double ou en triple et analysée suivant la méthode ΔΔCt comme décrit précédemment en utilisant la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) comme contrôle de normalisation (S7). Voir Tableau supplémentaire S5 pour les séquences d'amorces d'ARNm.

Analyse de puces à ADN

Quatre groupes (réplicats biologiques indépendants de 3 par groupe) ont été utilisés pour l'étude de puces à ADN, totalisant les puces à ADN 12. 1 heure après la dernière injection de cocaïne, les animaux ont été rapidement décapités et les cerveaux ont été prélevés et placés sur de la glace. Les dissections de NAc ont été prises en utilisant un poinçon à aiguille de calibre 15 et ont été rapidement congelées sur de la neige carbonique jusqu'à l'extraction de l'ARN. Les poinçons bilatéraux ont été regroupés à partir de quatre animaux par réplicat, totalisant des souris 12 par groupe. L’isolation de l’ARN, le traitement par micropuce et l’analyse des données ont été effectués comme décrit précédemment (S8). En bref, l'ARN a été isolé et purifié comme décrit ci-dessus et sa qualité a été vérifiée à l'aide du Bioanalyzer Agilent. La transcription inverse, l'amplification, le marquage et l'hybridation à des matrices Illumina MouseWG-6 v2.0 ont été effectuées en utilisant des procédures standard par le noyau de microarray de UT Southwestern. Les données brutes ont été soustraites de fond et normalisées quantiles à l'aide du logiciel Beadstudio. Les données normalisées ont été analysées à l'aide du logiciel GeneSpring et les listes génétiques ont été générées en utilisant des critères de signification d'un seuil de changement de 1.3 fois couplé à un seuil de valeur p non rigoureux de p <0.05.

Nous maintenons un haut degré de confiance dans ces données pour plusieurs raisons. Premièrement, tous les animaux ont été manipulés, traités et mis à mort au même moment et dans les mêmes conditions. De plus, tous les traitements d'ARN et de matrice ont été effectués en même temps. Deuxièmement, nous avons réalisé des matrices en triple exemplaire et regroupé plusieurs animaux par échantillon de matrice, minimisant ainsi les différences dues à la variabilité individuelle et à l’augmentation de la puissance statistique (S9). Troisièmement, les critères d'analyse des données utilisés dans notre étude sont recommandés par le projet de contrôle de la qualité de MicroArray, car ils ont été validés pour fournir un degré élevé de reproductibilité intersite et de reproductibilité inter et intra-plate-forme (S10-S11).

Construction de vecteurs viraux

En raison de contraintes de taille pour l’insertion de vecteurs viraux, des séquences codantes pour le type sauvage G9a (G9a) ou le G9 (G9a catalytiquement mort) exprimant GFP ont été sous-clonées dans le promoteur plasmidique bicistronique p1093 + HSV sous le contrôle du cytomeovirus précoce immédiat (HSA), développé par la suite. la taille d'insertion était ~ 1005 kb, ce qui dépasse la taille d'insertion maximale pour les vecteurs AAV-9). Le promoteur IE3.96 / 2 pilote l'expression de G4a. Les fragments ont été sous-clonés dans le plasmide bicistronique p5 + HSV via des ligatures aux extrémités franches avec PmeI traité par Klenow et G9a digéré par EcoRI (provenant de pcDNA1005) et p9 + traité par CIP après digestion par EcoRI. Pour la production de HSV-ΔJunD-GFP, la séquence codante de ΔJunD flanquée par les sites de restriction EcoRI a été générée par PCR en utilisant des oligonucléotides d'amorce contenant le site EcoRI. Le produit de PCR a ensuite été ligaturé dans le site EcoRI du vecteur p3.1 +. L’expression locale de la recombinase Cre dans les neurones NAc a été obtenue par une délivrance génique à médiation virale utilisant un vecteur AAV tel que décrit (S12). La GFP ou une fusion N-terminale de GFP avec Cre a été sous-clonée dans un vecteur AAV-2 recombinant contenant un promoteur CMV avec une séquence accepteur donneur d'épissage et un signal de polyadénylation. Toutes les insertions de vecteur ont été confirmées par séquençage didésoxy. Les vecteurs viraux ont été produits en utilisant une méthode de triple transfection, sans helper, comme décrit précédemment (S13). Le virus purifié a été stocké à -80 ° C. La qualité virale a été évaluée par le titre infectieux évalué dans les cellules HEK293. Les virus AAV-AFOSB-GFP ont été préparés de manière similaire. Pour le HSV-Cre, l’expression Cre a été conduite par un promoteur IRES, par opposition au promoteur IE4 / 5, afin de minimiser l’expression de Cre et de prévenir la toxicité neuronale (voir ci-dessous). S14 pour la construction virale). Dans tous les cas, la surexpression virale a été validée, à la fois in vitro et in vivo, via la qPCR, une confirmation immunohistochimique des virus après une intervention chirurgicale a été confirmée.

Chirurgie stéréotaxique

Sous anesthésie à la kétamine (100 mg / kg) / xylazine (10 mg / kg), les souris ont été placées dans un instrument stéréotaxique de petit animal et la surface crânienne a été exposée. Trente-trois aiguilles de seringues ont été utilisées pour infuser bilatéralement 0.5 μl de virus dans le NAc à un angle 10 ° (AP + 1.6; ML + 1.5; DV - 4.4) à un débit de 0.1 μl / min. Les animaux recevant des injections de HSV ont été autorisés à récupérer pendant les jours 2 après la chirurgie, tandis que les souris utilisées pour les tests comportementaux recevant des vecteurs AAV étaient autorisées à récupérer pendant les jours à 20 avant d'être soumises au conditionnement de la place. Ces temps sont cohérents avec les périodes d'expression maximale du transgène à médiation virale pour les deux vecteurs. Pour les perfusions de BIX01294, chacune des deux mini-pompes était positionnée de manière sous-cutanée sur le dos de la souris. Les canules ont été placées en perçant deux petits trous crâniens au-dessus du NAc et en délivrant la canule de bregma (AP + 1.5; ML + 1.0; DV - 5.4). Les souris ont été autorisées à se remettre de 4 à 5 quelques jours avant de commencer la procédure de conditionnement de la cocaïne, comme décrit ci-dessous.

Préférence de lieu conditionné

La procédure de conditionnement de place a été effectuée comme décrit précédemment, avec les modifications suivantes (S7). En bref, 3 jours après les perfusions intra-NAc de HSV-G9a-GFP, HSV-G9aH1093K-GFP ou HSV-GFP, les souris ont été placées dans les chambres de conditionnement, qui se composent de trois environnements distincts. Les souris qui ont montré une préférence significative pour l'une des deux chambres de conditionnement ont été exclues de l'étude (<10% de tous les animaux). Les groupes de conditionnement ont ensuite été équilibrés pour s'adapter à tout biais de chambre qui pourrait encore exister. Les jours suivants, les animaux ont été injectés avec une solution saline et confinés dans une chambre l'après-midi pendant 30 minutes, puis injectés avec de la cocaïne (10 mg / kg, ip) et confinés pendant 30 minutes dans l'autre chambre le soir pendant 2 jours (deux saline et deux paires de cocaïne). Le jour du test, les souris ont été replacées dans l'appareil sans traitement pendant 20 minutes et testées pour évaluer de quel côté elles préféraient. Les réponses locomotrices à la cocaïne ont été évaluées via des interruptions de faisceau dans les chambres appariées à la cocaïne pour garantir l'efficacité du traitement médicamenteux. Pour les expériences AAV et BIX01294 CPP, un protocole légèrement modifié a été utilisé. Les animaux ont de nouveau reçu une injection de solution saline ou de cocaïne (10 mg / kg, ip) et confinés dans des chambres spécifiques pendant des séances de 30 minutes, mais à la place, ils n'ont été conditionnés qu'une fois par jour pendant 4 jours, suivis du test au jour 5 (les animaux ont été conditionnés le soir et les traitements de conditionnement étaient alternés). Pour tous les groupes, la locomotion de base en réponse à une solution saline a été évaluée pour s'assurer que la locomotion n'était pas affectée par un traitement viral ou inhibiteur.

Auto-administration intraveineuse de cocaïne

Des rats adolescents mâles Long-Evans pesant 230 – 250 g au début de l'expérience ont été obtenus. Ils ont été logés dans un environnement à humidité et à température contrôlées sur un cycle heure / jour inversé 12 (éclairage éteint à 9: 00 am) avec ad libitum accès à la nourriture et à l'eau. Les rats ont été autorisés à s'acclimater dans leur nouvel environnement et ont été traités quotidiennement pendant la semaine 1 avant le début de l'expérience. Toutes les procédures ont été menées conformément au Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire du National Institute of Health et ont été approuvées par le Comité de protection et d'utilisation des animaux du mont Sinaï. Le matériel d’auto-administration a été équipé de faisceaux infrarouges pour mesurer le comportement locomoteur. L’auto-administration a été réalisée comme décrit précédemment (S15-S16) avec des cathéters implantés dans la veine jugulaire droite sous anesthésie à l'isoflurane (2.4–2.7%). Les cathéters ont été rincés avec 0.1 ml d'une solution saline contenant 10 U d'héparine et d'ampicilline (50 mg / kg). Après une semaine de récupération après la chirurgie, la formation à l'auto-administration a commencé pendant la phase sombre du cycle lumière / obscurité. Les animaux ont eu droit à un accès quotidien de 3 heures à la cocaïne (0.75 mg / kg / perfusion) selon un programme de renforcement à ratio fixe-1 (FR1), où 1 pression active du levier a entraîné une seule perfusion de médicament. Les rats ont stabilisé leur consommation de cocaïne après 6 jours (<15% de variation du taux de réponse sur 3 jours consécutifs, avec au moins 75% répondant sur le levier renforcé). 24 heures après la dernière séance d'auto-administration, les rats ont été rapidement décapités, les cerveaux rapidement prélevés et traités pour l'isolement de l'ARN et la qPCR.

Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP)

Les poinçons frais de NAc étaient réticulés au formaldéhyde et préparés pour la puce comme décrit précédemment (S17-S18) avec des modifications mineures. En résumé, des poinçons NAc de calibre 4 14 par animal (animaux 5 regroupés par échantillon) ont été recueillis, réticulés avec 1% formaldéhyde et trempés avec 2 M glycine avant congélation à -80 M °. Un jour 1 avant la sonication de l'échantillon, des billes magnétiques d'IgG anti-lapin / souris (en fonction de l'anticorps de précipitation) ont été préparées en incubant des billes magnétiques appropriées avec de la protéine anti-G9a (qualité ChIP polyclonale de lapin) ou anti-H3K9XXXXXXUMX (protéine de la puce monoclonale de souris). anticorps pendant une nuit à 2 ° C sous rotation constante dans une solution de blocage. La sonication des tissus et le cisaillement de la chromatine ont été effectués comme décrit précédemment (S17). Après la sonication, des concentrations égales de chromatine ont été transférées dans de nouveaux tubes et ~ 5% des produits finaux ont été conservés pour servir de témoins «d'entrée». Après lavage minutieux et remise en suspension des mélanges perle / anticorps conjugués, des volumes égaux de mélanges anticorps / perles (~ 7.5 μg anticorps / échantillon) ont été ajoutés à chaque échantillon de chromatine et incubés pendant environ 16 heures sous rotation constante à 4 ° C. Les échantillons ont ensuite été lavés et réticulés de manière inverse à 65 ° C pendant une nuit avant la purification de l'ADN à l'aide d'un kit de purification par PCR. Après purification de l'ADN, les échantillons ont été soumis à une qPCR et ont été normalisés en fonction de leurs témoins «d'entrée» appropriés, comme décrit précédemment (S17). Des immunoprécipitations normales d'IgG de souris utilisant un anticorps polyclonal de souris anti-IgG ont également été réalisées pour contrôler l'enrichissement approprié de l'amplification du signal. L'adénine phosphoribosyltransférase (APRT) a été utilisée comme contrôle négatif pour les expériences de cocaïne et de surexpression de ΔFosB. Voir Tableau supplémentaire S5 pour les séquences d'amorces promotrices.

Analyse de la colonne vertébrale dendritique

Pour étudier le rôle de G9a dans la régulation de la morphologie neuronale in vivo, nous avons utilisé les méthodes décrites précédemment avec les modifications suivantes (S1). Trois jours après l'injection de HSV-GFP, HSV-G9a-GFP, HSV-ΔJunD-GFP (tous les virus ont été utilisés chez des souris de type sauvage C57Bl / 6J), ou HSV-Cre-GFP (utilisés dans G9afl / fl souris), lorsque l'expression virale était maximale, les souris étaient perfusées, le cerveau était cryoprotégé et ensuite sectionné à 100 µm sur un vibratome. Les coupes ont ensuite été immunocolorées en utilisant un anticorps contre la GFP, comme décrit ci-dessus (voir Immunohistochimie). Pour évaluer les effets de la surexpression et de l'inhibition de G9a sur le nombre d'épines, ainsi que l'effet de la surexpression de ΔJunD, nous avons mesuré le nombre d'épines sur approximativement des neurites 1 – 2 par neurone égales à au moins 299 µm de dendrites secondaires provenant de Gf-exprimant NFC moyen neurones épineux (MSN). Etant donné que les MSN sont morphologiquement distincts des autres populations neuronales de la NAc, ainsi que de précédents rapports indiquant que le HSV infecte principalement les neurones exprimant DARPP-32 dans cette région du cerveau (S19), nous sommes confiants que les MSN ont été exclusivement évalués dans ces études. Pour chaque animal, nous avons examiné ~ neurones 6 – 8 chez les animaux 3 – 4 par groupe (groupes 7), après quoi une valeur moyenne a été obtenue pour chaque animal aux fins d'analyse statistique. Des expériences conçues pour examiner les effets de la surexpression de ΔFosB sur la densité de la colonne vertébrale de NAc ont été menées de la même manière que celle décrite ci-dessus, à l’exception de l’utilisation de vecteurs AAV pour exprimer la GFP ou la ΔFosB-GFP pendant de longues périodes (8 semaines). Toutes les images HSV ont été capturées à l'aide d'un microscope confocal avec un objectif à immersion dans l'huile 100X (les images AAV ont été capturées avec un objectif à immersion dans l'huile 63X). Les images ont été acquises avec le trou d'épingle défini à l'unité arbitraire 1 et à une taille d'image 1024 × 1024. La longueur dendritique a été mesurée à l'aide du logiciel NIH Image J, et l'expérimentateur principal a compté les nombres de rachis à l'aveugle, les lames ayant été codées avant le balayage expérimental. Le nombre moyen d'épines par 10 µm de dendrite a été calculé.

analyses statistiques

Des ANOVA à une et à deux voies ont été réalisées pour déterminer la signification des analyses de la préférence de lieu conditionnée et de la colonne dendritique avec plus de deux groupes. Les tests t de Student ont été utilisés pour d'autres comparaisons, notamment la qPCR, le Western Blot et l'analyse du rachis dendritique comparant HSV-GFP à HSV-Cre dans G9a.fl / fl souris, analyses de puces à ADN (voir ci-dessus) et expériences d'immunoprécipitation de chromatine. Les tests t prévus des étudiants ont été utilisés après une analyse ANOVA bidirectionnelle de la densité de la colonne dendritique après surexpression de ΔFosB avec confirmation des principaux effets significatifs du traitement médicamenteux et du virus. Toutes les valeurs incluses dans les légendes des figures représentent la moyenne ± SEM (* p ≤ 0.05; ** p <0.001). Analyses statistiques détaillées pour Les figs. 1-3 dans le texte principal sont donnés dans: Figure détaillée Légendes incluant des statistiques.

Matériel complémentaire

Notes

Je certifie qu’aucun des documents inclus dans le manuscrit intitulé Rôle Essentiel De L'histone Méthyltransférase G9a Dans La Plasticité Induite Par La Cocaïne ont déjà été publiées ou sont à l’étude ailleurs, y compris sur Internet.

Tous les travaux impliquant l'utilisation d'animaux ont été menés conformément aux directives de l'IACUC et aux directives du Centre médical du Sud-Ouest de l'Université du Texas et de l'école de médecine Mount Sinai.

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28. Ce travail a été financé par des subventions de l'Institut national de lutte contre l'abus des drogues: P01 DA08227 (EJN), R01 DA07359 (EJN) et P0110044 (PG).