(HUMAIN) Les réponses comportementales et structurelles à la cocaïne chronique nécessitent une boucle de feedforward impliquant la protéine kinase II dépendante du calcium / de la calmoduline dans la coquille de Nucleus Accumbens (2013)

Le facteur de transcription ΔFosB et la protéine kinase II dépendante du calcium/calmoduline (CaMKIIα), abondante dans le cerveau, sont induits dans le noyau accumbens (NAc) par une exposition chronique à la cocaïne ou à d'autres psychostimulants. Ces deux protéines sont impliquées dans la sensibilisation aux drogues. Bien que ΔFosB et CaMKIIα régulent tous deux l'expression et la fonction des récepteurs AMPA du glutamate dans le NAc, la formation des épines dendritiques des neurones épineux moyens (MSN) du NAc et la sensibilisation locomotrice à la cocaïne, aucun lien direct entre ces molécules n'avait jusqu'à présent été établi. Dans cette étude, nous démontrons que ΔFosB est phosphorylé par CaMKIIα au niveau du résidu Ser27, stabilisant ainsi la protéine, et que CaMKII est nécessaire à l'accumulation de ΔFosB induite par la cocaïne dans le NAc du rat.

À l’inverse, nous montrons que ΔFosB est à la fois nécessaire et suffisant pour l’induction par la cocaïne de l’expression du gène CaMKIIα in vivo, un effet sélectif pour les MSN de type D ₁ dans la sous-région de la coquille NAc.

En outre, l'induction des épines dendritiques sur les MSN NAc et la réactivité comportementale accrue à la cocaïne après la surexpression de NAc de ΔFosB dépendent toutes deux de la CaMKII.

De manière significative, nous démontrons pour la première fois l'induction de ΔFosB et de CaMKII dans le noyau accumbens de patients dépendants à la cocaïne , suggérant ainsi des cibles potentielles pour de futures interventions thérapeutiques. Ces données établissent que ΔFosB et CaMKII participent à une boucle de rétroaction positive spécifique au type cellulaire et à la région cérébrale, constituant un mécanisme clé de la régulation du circuit de la récompense cérébrale en réponse à une consommation chronique de cocaïne.

Introduction

De plus en plus de données suggèrent que des modifications de l'expression génique contribuent aux mécanismes de la toxicomanie ( Robison et Nestler, 2011 ). Parmi les médiateurs importants de ces modifications figure ΔFosB, un facteur de transcription de la famille Fos ( Nestler, 2008 ). L'administration chronique de pratiquement toutes les drogues induit une accumulation durable de ΔFosB dans le noyau accumbens (NAc), une région limbique essentielle aux comportements de récompense. Cette induction semble spécifique aux neurones épineux moyens (MSN) du NAc exprimant les récepteurs dopaminergiques D1. La surexpression inductible de ΔFosB dans ces MSN de type D1 du NAc augmente les réponses locomotrices et gratifiantes à la cocaïne et à la morphine ( Kelz et al., 1999 ; Zachariou et al., 2006 ), notamment l'auto-administration de cocaïne ( Colby et al., 2003 ). De plus, le blocage génétique ou viral de l'activité transcriptionnelle de ΔFosB réduit les effets gratifiants de ces médicaments ( Zachariou et al., 2006 ), indiquant que cette induction soutenue de ΔFosB est un médiateur essentiel des changements durables induits dans le NAc par l'administration chronique de médicaments.

La stabilité inhabituelle de ΔFosB (comparativement à toutes les autres protéines de la famille Fos) est à la fois une propriété intrinsèque de la molécule, due à la troncature des domaines dégrons présents dans la protéine FosB complète ( Carle et al., 2007 ), et un processus régulé. ΔFosB est phosphorylée in vitro et in vivo sur la sérine 27 (Ser27), et cette réaction stabilise davantage ΔFosB, d'un facteur 10 environ, en culture cellulaire et dans le noyau accumbens (NAc) in vivo ( Ulery-Reynolds et al., 2009 ). Bien que Ser27-ΔFosB se soit révélé être un substrat de la caséine kinase-2 in vitro ( Ulery et al., 2006 ), son mécanisme de phosphorylation in vivo demeure inconnu.

La protéine kinase II dépendante du calcium/calmoduline (CaMKII) est une sérine/thréonine kinase fortement exprimée dont les isoformes α et β forment des holoenzymes dodécamériques homo- et hétéro-holoenzymes in vivo et sont essentielles à de multiples formes de neuroplasticité ( Lisman et al., 2002 ; Colbran et Brown, 2004 ). L’expression de CaMKIIα est induite sélectivement dans le noyau accumbens (NAc) par l’amphétamine ( Loweth et al., 2010 ). Le blocage pharmacologique de l’activité de CaMKII dans le NAc réduit la sensibilisation comportementale à l’amphétamine ( Loweth et al., 2008 ) et à la cocaïne ( Pierce et al., 1998 ), tandis que la surexpression virale de CaMKIIα dans cette sous-région du NAc augmente la sensibilisation locomotrice à l’amphétamine et l’auto-administration de cette substance ( Loweth et al., 2010 ). La CaMKIIα peut affecter les comportements de récompense via la modulation des sous-unités du récepteur du glutamate AMPA ( Pierce et al., 1998 ), car l'activité de la CaMKIIα est depuis longtemps associée à la fonction du récepteur AMPA et au ciblage synaptique dans plusieurs formes de neuroplasticité ( Malinow et Malenka, 2002 ).

Cette littérature met en évidence plusieurs similitudes entre ΔFosB et CaMKII : toutes deux sont nécessaires et suffisantes pour de multiples effets comportementaux des drogues d’abus, toutes deux augmentent le nombre d’épines dendritiques dans différents types de cellules neuronales in vivo ( Jourdain et al., 2003 ; Maze et al., 2010 ), et toutes deux exercent au moins certains de leurs effets comportementaux par la modulation des récepteurs AMPA ( Kelz et al., 1999 ; Malinow et Malenka, 2002 ; Vialou et al., 2010 ). Malgré ces similitudes, aucun lien fonctionnel entre ΔFosB et CaMKII n’est connu. Dans cette étude, nous établissons une régulation réciproque entre ΔFosB et CaMKII et démontrons que ces deux protéines forment une boucle de rétroaction positive spécifique aux neurones épineux moyens de type D1 (MSN) dans le noyau accumbens (NAc), induite par la cocaïne et régulant diverses réponses à cette drogue in vivo.

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Matériels et méthodes

Expérience 1 : Analyse protéomique iTRAQ de la coquille et du noyau du NAc après traitement à la cocaïne ( Fig 1A )

Des rats mâles adultes (8 semaines) ont reçu une injection intrapéritonéale de 20 mg/kg de cocaïne ou de solution saline (véhicule) une fois par jour pendant sept jours. Vingt-quatre heures après la dernière injection, la coquille et le noyau du noyau accumbens (NAc) ont été microdisséqués ( Fig. 1A ) et congelés instantanément. Les analyses iTRAQ ont été réalisées selon le protocole décrit précédemment ( Ross et al., 2004 ; Davalos et al., 2010 ).

Figure 1

Induction spécifique de Shell de CaMKII dans NAc par la cocaïne

Expérience 2 : Quantification des changements protéiques dans le noyau et la coquille du NAc du rat après traitement à la cocaïne ( Fig. 1B–D )

Des rats mâles adultes (8 semaines) ont reçu quotidiennement, pendant sept jours, une injection intrapéritonéale (IP) de 10 mg/kg de cocaïne ou de solution saline (véhicule) dans des cages d'enregistrement de l'activité locomotrice. Les réponses locomotrices à une injection unique de cocaïne (5 mg/kg IP) ont été enregistrées chez les animaux préalablement traités à la cocaïne (groupe « chronique ») et chez une partie de ceux traités à la solution saline (groupe « aigu »). Les réponses locomotrices à la solution saline seule ont été enregistrées chez les animaux restants du groupe « témoin ». Les tests d'activité locomotrice ont été réalisés selon le protocole décrit par Hiroi et al. (1997 ). Brièvement, les rats mâles adultes ont été placés pendant 30 minutes dans des cages d'enregistrement en champ ouvert PAS (San Diego Instruments) de 18 cm × 24 cm pour l'habituation, puis ont reçu une injection IP unique de solution saline et ont été observés pendant 30 minutes supplémentaires. Ils ont ensuite reçu une injection IP unique de 5 mg/kg de cocaïne et ont été observés pendant 30 minutes supplémentaires.

Vingt-quatre heures après la dernière injection, les rats ont été décapités sans anesthésie afin d'éviter l'influence des anesthésiques sur les niveaux de protéines neuronales et leur état de phosphorylation. Les cerveaux ont été découpés en tranches sériées de 1.2 mm d'épaisseur (Braintree Scientific). Le tissu cible a été prélevé dans une solution saline tamponnée au phosphate contenant des inhibiteurs de protéases (Roche) et de phosphatases (Sigma Aldrich). Le noyau du NAc a été prélevé à l'aide d'un emporte-pièce de calibre 14, et la coquille du NAc à l'aide d'un emporte-pièce de calibre 12 (voir Fig. 1A ). Les échantillons ont été immédiatement congelés sur glace carbonique. Ils ont ensuite été homogénéisés par sonication légère dans un tampon RIPA modifié : Tris base 10 mM, chlorure de sodium 150 mM, EDTA 1 mM, dodécylsulfate de sodium 0.1 %, Triton X-100 1 %, désoxycholate de sodium 1 %, pH 7.4, avec les inhibiteurs de protéases et de phosphatases mentionnés précédemment. Après l'ajout du tampon Laemmli, les protéines ont été séparées sur des gels à gradient de polyacrylamide 4–15 % (Criterion System, BioRad), et le Western blot a été réalisé à l'aide du système Odyssey (Li-Cor) selon les protocoles du fabricant.

Expérience 3 : Quantification des changements protéiques dans le noyau et la coquille du NAc du rat après le sevrage de la cocaïne ( Fig 1E )

Des rats mâles adultes (8 semaines) ont reçu une injection intrapéritonéale (IP) de 10 mg/kg de cocaïne ou de solution saline (véhicule) une fois par jour pendant sept jours. Quatorze jours après la dernière injection, les animaux ayant reçu la solution saline ont reçu une nouvelle injection de solution saline (groupe témoin), tandis que ceux ayant reçu la cocaïne ont reçu soit une nouvelle injection de solution saline (groupe sevrage de 14 jours ou « 14j WD »), soit une injection unique de cocaïne (groupe test « 14j WD Chal »). Une heure après la dernière injection, les animaux ont été décapités et un Western blot a été réalisé selon le protocole de l’expérience 2.

Expérience 4 : Quantification des changements protéiques dans le noyau et la coquille du NAc du rat après auto-administration de cocaïne ( Fig 2A–C )

Les rats ont été entraînés à s'auto-administrer 0.5 en mg / kg / perfusion de cocaïne par séances d'une heure, selon un calendrier de traitement par 1 à rapport fixe, pendant neuf jours. Après neuf séances de base, les rats ont été divisés en deux groupes équilibrés par la consommation de cocaïne lors des deux dernières séances. Un groupe de rats a été autorisé à s'auto-administrer de la cocaïne (0.5 en mg / kg / perfusion) en une heure (accès court, ShA), tandis que l'autre groupe de rats s'est auto-administré en six heures (accès de longue durée, LgA). ) pendant dix jours supplémentaires (sessions d'escalade).

Des coupes de cerveau ont été traitées pour l'immunohistochimie selon le protocole décrit par Perrotti et al. (2004 ). Les cerveaux ont été perfusés 18 à 24 heures après la dernière exposition au médicament, ce qui a entraîné la dégradation de toute protéine FosB résiduelle de pleine longueur, de sorte que toute l'immunoréactivité restante reflète la mutation ΔFosB. Cette dégradation a été confirmée par Western blot, qui n'a révélé aucun marquage significatif avec un anticorps dirigé contre l'extrémité C-terminale de la protéine FosB de pleine longueur et ne reconnaissant pas la mutation ΔFosB (données non présentées). Après découpe en sections de 35 µm, le nombre de cellules immunopositives pour ΔFosB a été quantifié par un observateur en aveugle dans deux sections du noyau accumbens (NAc) de chaque rat, et les valeurs moyennes par champ (grossissement ×40) ont ensuite été calculées par région pour chaque animal. Chaque animal a été considéré comme une observation individuelle pour l'analyse statistique. Les régions d'intérêt ont été identifiées selon la méthode de Paxinos et Watson ( Paxinos et Watson, 2007 ).

La quantification de l'immunoréactivité de CaMKIIα a été réalisée à l'aide d'un système Licor, comme décrit précédemment ( Covington et al., 2009 ). Les intensités intégrées de CaMKII et de GAPDH ont été déterminées avec le logiciel Odyssey. Les résultats sont présentés sous forme de valeurs d'intensité intégrée par mm² ^et correspondent à la moyenne ± erreur standard à la moyenne ( n = 4–10 par groupe). Les valeurs de GAPDH ont servi de référence pour normaliser l'intensité de CaMKII en fonction de l'épaisseur de coupe et des conditions expérimentales.

Figure 2

Induction de CaMKII dans la coquille NAc de rats auto administrés et de toxicomanes humains à la cocaïne

Expérience 5 : Quantification des niveaux de protéines chez les humains dépendants à la cocaïne ( Fig. 2D )

Procédure

Des tissus cérébraux humains post-mortem ont été obtenus auprès de la Banque de cerveaux de suicidés du Québec (Institut universitaire en santé mentale Douglas, Montréal, Québec, Canada). La conservation des tissus a été réalisée selon la méthode décrite par Quirion et al. (1987 ). Brièvement, après extraction, le cerveau est placé sur de la glace fondante dans une boîte en polystyrène et transporté d'urgence à la Banque de cerveaux de suicidés du Québec. Les hémisphères sont immédiatement séparés par une coupe sagittale médiane, distinguant le cerveau, le tronc cérébral et le cervelet. Les vaisseaux sanguins, la glande pinéale, les plexus choroïdes, la moitié du cervelet et la moitié du tronc cérébral sont généralement disséqués de l'hémisphère gauche, qui est ensuite coupé coronalement en tranches de 1 cm d'épaisseur avant d'être congelé. La moitié du cervelet est coupée sagittalement en tranches de 1 cm d'épaisseur avant d'être congelée. Les tissus sont congelés instantanément dans du 2-méthylbutane à −40 °C pendant environ 60 secondes. Tous les tissus congelés sont conservés séparément dans des sacs en plastique à −80 °C pour une conservation à long terme. Des régions cérébrales spécifiques sont disséquées à partir de coupes coronales congelées sur une plaque en acier inoxydable entourée de glace carbonique afin de contrôler la température ambiante. Le Western blot a été réalisé selon le protocole décrit dans l'expérience 2.

Cohorte

La cohorte était composée de 37 hommes et 3 femmes, âgés de 15 à 66 ans. Tous les sujets sont décédés subitement, sans agonie prolongée ni maladie chronique . Dans chaque cas, la cause du décès a été établie par le Bureau du coroner du Québec, et un dépistage toxicologique a été effectué sur des échantillons de tissus afin d'obtenir des informations sur la consommation de médicaments et de substances illicites au moment du décès. Le groupe expérimental comprenait 20 individus répondant aux critères de dépendance à la cocaïne du SCID-I. Le groupe témoin était composé de 20 sujets sans antécédents de dépendance à la cocaïne ni de diagnostic psychiatrique majeur. Tous les sujets sont décédés subitement de causes sans influence directe sur le tissu cérébral. Les groupes ont été appariés selon l'âge moyen, le délai de réfrigération et le pH. Pour tous les sujets, des autopsies psychologiques ont été réalisées selon la méthode décrite précédemment ( Dumais et al., 2005 ), nous permettant d'accéder à des informations détaillées sur leurs antécédents psychiatriques et médicaux, ainsi qu'à d'autres données cliniques et sociodémographiques pertinentes. En résumé, un enquêteur formé a mené l' Entretien clinique structuré pour les troubles psychiatriques du DSM-IV (SCID-I) auprès d'un ou plusieurs proches du défunt. Un panel de cliniciens a examiné les résultats du SCID-I, les rapports de cas, les notes du médecin légiste et les dossiers médicaux afin d'établir un diagnostic psychiatrique consensuel.

Expérience 6 : Immunoprécipitation de la chromatine pour le NAc du rat ( Fig 3A–C )

Des rats mâles adultes (semaines 8) ont reçu 10 mg / kg de cocaïne ou une solution saline IP une fois par jour pendant sept jours. 24 heures après la dernière injection, la coquille et le noyau de NAc ont été microdissectés. Une immunoprécipitation de chromatine (ChIP) a été réalisée en regroupant des poinçons NAC bilatéraux de coquille ou de noyau de sept rats par groupe dans les groupes totaux 14 (total d'animaux 98, pools de cocaïne 7, pools de solution saline 7). Les tissus ont été réticulés, lavés et stockés à -80 ° C jusqu'au cisaillement de la chromatine par sonication. La chromatine cisaillée a été incubée pendant une nuit avec des anticorps préalablement liés à des billes magnétiques (Dynabeads M-280, Invitrogen). Des IgG non immunes ont été utilisées comme contrôle. Après réticulation inverse et purification de l'ADN, la qPCR a été utilisée pour mesurer les niveaux d'ADN du promoteur CaMKIIα. Les amorces ont été conçues pour amplifier une région contenant une séquence consensus AP-1 située ~ 450 pb avant le site de départ de la transcription (Forward: ACTGACTCAGGAAGAGGGATA; Reverse: TGTGCTCCTCAGAATCCACAA).

Figure 3

Induction ΔFosB De CaMKIIα spécifique au type cellulaire et à la région in vivo

Expérience 7 : Mesure de l'expression de l'ARN messager et de la protéine CaMKII avec surexpression de ΔFosB spécifique au type cellulaire ( Fig 3D )

Des souris mâles bitransgéniques, issues des croisements NSE-tTA (lignée A) × TetOp-ΔfosB (lignée 11) et NSE-tTA (lignée B) × TetOp-FLAG-ΔfosB (lignée 11) ( Chen et al., 1998 ; Kelz et al., 1999 ; Werme et al., 2002 ; Zachariou et al., 2006 ), ont été conçues et élevées sous doxycycline (100 µg/ml) afin de supprimer l'expression de ΔFosB durant leur développement. Au sevrage, les souris d'une même portée ont été divisées en deux groupes : un groupe a continué à recevoir de la doxycycline, l'autre a reçu de l'eau. Les animaux ont été utilisés 8 à 11 semaines plus tard, lorsque les effets transcriptionnels de ΔFosB sont maximaux ( Kelz et al., 1999 ; McClung et Nestler, 2003 ). Pour les analyses transcriptionnelles, les souris ont été rapidement décapitées, et leurs cerveaux prélevés et placés sur de la glace. Des dissections du noyau accumbens (NAc) ont été réalisées à l'aide d'un emporte-pièce à aiguille de calibre 14, puis congelées rapidement sur glace carbonique jusqu'à l'extraction de l'ARN. L'isolement de l'ARN, la qPCR et l'analyse des données ont été effectués selon le protocole décrit précédemment ( LaPlant et al., 2009 ). Brièvement, l'ARN a été isolé avec le réactif TriZol (Invitrogen), purifié avec le kit RNeasy micro (Qiagen) et sa qualité vérifiée avec le Bioanalyzer d'Agilent. La transcription inverse a été réalisée avec le kit iScript (BioRad). La qPCR a été effectuée avec un système RT-PCR Applied Biosystems 7900HT selon le protocole suivant : 10 min à 95 °C ; 40 cycles de 1 min à 95 °C, 30 s à 60 °C et 30 s à 72 °C ; chauffage progressif jusqu'à 95 °C pour générer les courbes de dissociation et confirmer la présence de produits PCR uniques. Des analyses immunohistochimiques de l'expression des protéines ΔFosB et CaMKIIα ont été réalisées comme décrit dans l'expérience 4.

Expérience 8 : Effets des antagonistes des récepteurs de la dopamine D1 et D2 intra-NAc sur les changements protéiques induits par la cocaïne ( Fig 3H )

Des rats mâles adultes (8 semaines) ont reçu une injection intrapéritonéale (IP) de 10 mg/kg de cocaïne ou de solution saline (groupe « véhicule ») une fois par jour pendant sept jours. Trente minutes avant chaque injection de cocaïne, les rats ont reçu par voie IP soit l’antagoniste des récepteurs D1, le SCH 23390 (0.5 mg/kg, groupe « D1 Ant »), soit l’antagoniste des récepteurs D2, l’éticlopride (0.5 mg/kg, groupe « D2 Ant »), soit une injection de solution saline (groupe témoin « cocaïne »). Vingt-quatre heures après la dernière injection, les animaux ont été décapités et les protéines ont été quantifiées par Western blot, comme décrit dans l’expérience 2.

Expérience 9 : Effets de la surexpression de ΔFosB médiée par AAV sur l'expression des protéines ( Fig 4 A–C )

Une chirurgie stéréotaxique a été réalisée chez des rats mâles adultes (8 semaines) pour injecter l'AAV-GFP (protéine fluorescente verte) ou l'AAV-GFP-ΔFosB ( Maze et al., 2010 ). Des aiguilles de calibre 33 (Hamilton) ont été utilisées pour toutes les interventions. Au cours de ces interventions, 0.5 µl de virus purifié à titre élevé a été perfusé bilatéralement en 5 minutes, suivi d'une période de repos de 5 minutes après la perfusion. Toutes les distances sont mesurées par rapport au bregma : angle de 10°, AP = +1.7 mm, Lat = 2.5 mm, DV = −6.7 mm. Quatorze jours après l'intervention, les animaux ont reçu une injection intrapéritonéale unique de 10 mg/kg de cocaïne dans des chambres de surveillance de l'activité locomotrice afin d'évaluer les effets comportementaux de la surexpression de ΔFosB. Vingt-quatre heures après la dernière injection, les rats ont été décapités selon le protocole de l'expérience 2 , et une microdissection tissulaire a été réalisée sous contrôle microscopique à fluorescence afin d'obtenir du tissu NAc GFP-positif. Un Western blot a ensuite été effectué selon le protocole de l'expérience 2.

Figure 4

ΔFosB est à la fois nécessaire et suffisant pour l’induction de CaMKIIα dépendante du récepteur D1 induite par la cocaïne dans la coquille de NAc

Expérience 10 : Effets de la surexpression de ΔJunD médiée par AAV sur l’expression de protéines dépendantes de la cocaïne ( Fig. 4 D–F )

L'injection stéréotaxique d'AAV-GFP ou d'AAV-GFP-ΔJunD a été réalisée selon le protocole de l'expérience 8. Quatorze jours après l'intervention chirurgicale, les animaux ont reçu une injection intrapéritonéale (IP) de 10 mg/kg de cocaïne ou de solution saline une fois par jour pendant sept jours dans des chambres d'enregistrement de l'activité locomotrice. Les réponses locomotrices à une injection unique de cocaïne (5 mg/kg IP) ou de solution saline ont été enregistrées. Vingt-quatre heures après cette dernière injection, les rats ont été décapités, les tissus prélevés et des western blots ont été réalisés comme dans l'expérience 9.

Expérience 11 : Essais de protéine kinase in vitro ( Fig. 5A–D )

Les protéines recombinantes CaMKIIα et ΔFosB ont été purifiées à partir de cellules d'insectes ( Brickey et al., 1990 ; Jorissen et al., 2007 ), et des tests d'activité protéine kinase ont été réalisés ( Colbran, 1993 ), comme décrit précédemment. Brièvement, la CaMKII a été préincubée sur glace avec 2.5 µM (ou la concentration indiquée) de ΔFosB, 1 mM de Ca²⁺ ^, 40 mM de Mg²⁺ ^, 15 µM de calmoduline et 200 mM d'HEPES à pH 7.5. La phosphorylation a été initiée par l'ajout de 200 µM d'ATP, avec ou sans [γ- ^³²P ]ATP, et poursuivie pendant 10 min à température ambiante ( Fig. 5A et B ) ou 2 min sur glace ( Fig. 5C et D ). Les produits ont été séparés par Western blot ( Fig. 5A et B ) ou par autoradiogramme et comptage de scintillation (Fig. B à D).

Figure 5

ΔFosB est un puissant substrat pour CaMKIIα

Expérience 12 : Identification de la phosphorylation de Ser27 ΔFosB ( Fig 5E )

Des tests d'activité kinase in vitro ont été réalisés selon le protocole de l'expérience 11. Les protéines ont été séparées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS (SDS-PAGE), et les bandes correspondant à ΔFosB ont été excisées puis analysées par spectrométrie de masse en tandem. Les valeurs m/z des fragments ioniques correspondants sont indiquées au-dessus des pics ioniques dans tous les panneaux. Par manque de place, certains fragments ioniques ne sont pas étiquetés. Généralement, les étiquettes des fragments ioniques sont en noir, sauf lorsqu'elles confirment ou apportent des preuves supplémentaires de la présence des sites de phosphorylation d'intérêt ; dans ce cas, elles sont marquées en rouge. La présence de produits de fragmentation du squelette peptidique est mise en évidence dans la séquence du phosphopeptide, le site de phosphorylation détecté étant indiqué en rouge par une lettre désignant l'acide aminé. La description numérique des fragments ioniques observés est également indiquée sur la séquence peptidique : ions b et y. Les facteurs de zoom permettant de visualiser les fragments ioniques de plus faible intensité sur l'axe m/z sont indiqués en haut de chaque spectre de masse. Les ions fragments présentés dans le panneau H confirment la présence de l'isoforme phosphorylée en Ser27, cependant, au sein d'un mélange d'autres isoformes phosphorylées aux sites Ser28, Ser31, Ser34 et Thr37. La présence des ions pa5, pa5-P, pb5 et pb5-P confirme sans équivoque la phosphorylation du résidu Ser27.

Expérience 13 : Quantification de la phosphorylation de Ser27 ( Fig 5F )

Les peptides standards ont été conçus en imitant les formes phospho et non phospho de Ser27 ΔFosB. Après synthèse et purification, chaque peptide idiotypique «lourd» a été dissous dans un tampon acétonitrile / eau 50 / 50 et envoyé pour analyse des acides aminés afin de déterminer la concentration absolue sur la solution mère de peptide synthétique. Chaque peptide «lourd» a ensuite été directement injecté dans le spectromètre de masse (MS) 4000 QTRAP afin de déterminer la meilleure énergie de collision pour la fragmentation MS / MS et deux à quatre transitions MRM. Ensuite, les peptides «lourds» purs ont été soumis à une LCMS sur le 4000 QTRAP pour assurer la séparation des peptides. L'instrument a été exécuté en mode triple quadripôle, avec Q1 défini sur la valeur spécifique du précurseur m / z (Q1 n'est pas en cours d'analyse) et Q3 défini sur la valeur spécifique m / z correspondant à un fragment spécifique de ce peptide. En mode MRM, une série de réactions simples (transitions d’ions précurseurs / fragments dans lesquelles l’énergie de collision est ajustée pour optimiser l’intensité des ions fragments d’intérêt) a été mesurée de manière séquentielle et le cycle (généralement 1 – 2 sec) a été bouclé. la durée totale de la séparation par HPLC. Les transitions MRM ont été déterminées à partir des spectres MS / MS des peptides existants. Deux transitions par peptide, correspondant à des ions fragments de haute intensité, ont ensuite été sélectionnées et l'énergie de collision optimisée pour maximiser la force du signal des transitions MRM à l'aide d'un logiciel d'automatisation. Les pics résultant des peptides standards et des échantillons de ΔFosB exposés à la CaMKII ou à un témoin ont ensuite été comparés pour déterminer l'abondance absolue de chaque forme de peptide dans la réaction. L'analyse des données sur les données LC-MRM est effectuée à l'aide du logiciel AB Multiquant 1.1.

Expérience 14 : Induction de ΔFosB chez des souris surexprimant CaMKII ( Fig. 5G et H )

Des souris transgéniques surexprimant la CaMKII T286D ( Mayford et al., 1996 ; Kourrich et al., 2012 ) et des souris sauvages de la même portée ont été élevées en l’absence de doxycycline afin de permettre l’expression du transgène. Les souris adultes ont reçu une injection intrapéritonéale de 20 mg/kg de cocaïne ou de solution saline une fois par jour pendant 14 jours. Vingt-quatre heures après la dernière injection, les animaux ont été décapités et une analyse immunohistochimique ainsi que la quantification de l’expression de ΔFosB ont été réalisées comme dans l’expérience 4.

Expérience 15 : Effets de la surexpression de ΔFosB médiée par HSV et de l’inhibition de CaMKII sur les épines dendritiques NAc ( Fig 6A–E )

Des souris mâles adultes (8 semaines) ont reçu une injection stéréotaxique dans le noyau accumbens (NAc) de HSV-GFP, HSV-GFP-ΔFosB ( Olausson et al., 2006 ), HSV-GFPAC3I ou HSV-GFPAC3I-ΔFosB. Dans ces constructions, AC3I, un inhibiteur peptidique de l'activité de CaMKII, est fusionné à l'extrémité C-terminale de la GFP. GFPAC3I a été cloné par PCR en utilisant le vecteur pMM400 contenant GFPAC3I comme matrice, avec les amorces suivantes : GFP-AC3I-F : 5' CC GCTAGC GCCGCCACC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT 3' (clampNheIKozakmet) ; GFP-AC3I-R : 5' CC TCCGGA TTACAGGCAGTCCACGGCCT 3' (clampBspEIstop). Le produit de PCR obtenu a été inséré dans les vecteurs p1005+ et p1005+-Δ FosB en utilisant les sites NheI et BspEI. La construction a été validée par séquençage. Les coordonnées stéréotaxiques étaient les suivantes : angle de 10°, AP = +1.6 mm, Lat = +1.5 mm, DV = −4.4 mm (Barrot et al., 2002). La perfusion et la section du cerveau ont été réalisées selon le protocole de l’expérience 4.

L'analyse des épines dendritiques a été réalisée selon la méthode décrite par Christoffel et al. (2011 ). Brièvement, des segments dendritiques situés entre 50 et 150 µm du soma ont été sélectionnés aléatoirement parmi des cellules infectées par le HSV et exprimant la GFP. Les images ont été acquises à l'aide d'un microscope confocal LSM 710 (Carl Zeiss) pour l'analyse morphologique avec le logiciel NeuronStudio et l'algorithme de balayage de rayons. NeuronStudio classe les épines en trois catégories : fines, en forme de champignon ou courtes, selon les valeurs suivantes : (1) rapport d'aspect, (2) rapport tête/col et (3) diamètre de la tête. Les épines possédant un col peuvent être classées comme fines ou en forme de champignon, tandis que celles sans col significatif sont classées comme courtes. La classification des épines en deux catégories (fines ou en forme de champignon) dépend du diamètre de leur tête.

Figure 6

Le blocage de l'activité CaMKII empêche les effets morphologiques et comportementaux de ΔFosB dans NAc

Expérience 16 : Effets de la surexpression de ΔFosB médiée par HSV et de l’inhibition de CaMKII sur les réponses à la cocaïne ( Fig. 6F )

Des souris mâles adultes ont reçu des injections de virus conformément à l'expérience 15 , et les réponses locomotrices à une seule injection de 5 mg/kg de cocaïne ont été mesurées conformément à l'expérience 9. Les données locomotrices sont exprimées en nombre total d'interruptions de faisceau sur 30 min après l'injection de cocaïne.

Informations complémentaires

Logement pour animaux

Des rats mâles Sprague Dawley (250–275 g ; Charles River Laboratories) ont été logés par paires. Des souris mâles C57BL/6J âgées de huit semaines (The Jackson Laboratory) ont été logées en groupe, à raison de cinq animaux maximum par cage. Tous les animaux ont été acclimatés à l’animalerie pendant au moins une semaine avant les manipulations expérimentales et maintenus dans des pièces climatisées (23–25 °C) avec un cycle lumière/obscurité de 12 heures (lumière allumée à 7 h 00), avec accès à l’eau et à la nourriture à volonté . Les expériences ont été menées conformément aux directives de la Society for Neuroscience et du comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux (IACUC) du Mount Sinai.

Médicaments

Les médicaments ont été administrés par voie intraveineuse et dissous dans une solution saline stérile, notamment de la cocaïne (5 – 20 en mg / kg par 10 en ml pour les souris, par 1 en ml pour les rats, NIDA) et du chlorhydrate de SCH 23390 ou de l'éticlopride (0.5 en mg / kg pour 1 en mg, Tocris) . Pour la chirurgie stéréotaxique, les souris ont été anesthésiées avec un «cocktail» de kétamine (100 mg / kg) et de xylazine (10 mg / kg) (Henry Schein) dans une solution saline stérile.

Anticorps

CaMKIIα (total): Upstate 05 – 532, 1: 5,000

CaMKII phospho-Thr286: Promega V111A, 1: 1,000

ΔFosB (total): signalisation cellulaire 5G4, 1: 250

ΔFosB phospho-Ser27: Phosphosolutions, 1: 500

GluA1 (total): Abcam, Ab31232, 1: 1,000

GluA1 phospho-Ser831: Millipore N453, 1: 1,000

GluA1 phospho-Ser845: Chemicon Ab5849, 1: 2,000

GluA2: Millipore 07 – 598, 1: 2,000

NR2A: Sigma HPA004692, 1: 2,500

NR2B: Millipore Ab1557P, 1: 1,000

Analyses statistiques

Toutes les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide du progiciel Prism 6 (GraphPad). Les tests t de Student ont été utilisés pour toutes les comparaisons par paires (indiqué dans Résultats où la valeur t est donnée) et une ANOVA unidirectionnelle a été utilisée pour toutes les comparaisons multiples (indiquée dans la section des résultats où la valeur F est donnée).

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Résultats

La cocaïne chronique induit le CaMKII dans la coquille NAc

De nombreuses études ont montré que les neurones épineux moyens (MSN) du noyau et de la coquille du NAc présentent des réponses biochimiques et physiologiques différentes à une exposition chronique aux drogues ( Kourrich et Thomas, 2009 ; Loweth et al., 2010 ) et que ces deux sous-régions régulent différemment les comportements de recherche de drogue ( Ito et al., 2004 ). Afin de déterminer les effets différentiels de la cocaïne sur les constituants protéiques du noyau et de la coquille du NAc, nous avons utilisé le marquage isobarique multiplexé (iTRAQ) et la spectrométrie de masse en tandem (MS/MS). Des rats mâles adultes ont reçu quotidiennement, pendant 7 jours, une injection intrapéritonéale de cocaïne (20 mg/kg) ou de solution saline. Vingt-quatre heures après la dernière injection, le noyau et la coquille du NAc ont été microdisséqués ( Fig. 1A ) et congelés instantanément. Les protéines de ces échantillons ont ensuite été quantifiées par iTRAQ. Les quatre isoformes de CaMKII ont présenté une forte augmentation d’expression après le traitement à la cocaïne, spécifique à la coquille du NAc par rapport à la coquille. Plusieurs phosphatases de protéines, notamment les sous-unités catalytiques et régulatrices de PP1 et PP2A, précédemment associées à divers substrats de CaMKII dans d'autres systèmes ( Colbran, 2004 ), ont présenté un profil similaire. Ces résultats ont apporté des preuves nouvelles et objectives que la voie de signalisation de CaMKII est fortement régulée par la cocaïne dans le noyau accumbens (NAc) de manière spécifique à cette région.

Pour valider ce résultat de manière plus quantitative, nous avons traité des rats comme décrit précédemment avec de la cocaïne (à différentes doses) ou une solution saline et mesuré leurs réponses locomotrices à une dose de cocaïne (5 mg/kg) ou de solution saline. L'exposition répétée à 10 mg/kg de cocaïne a induit le profil typique de sensibilisation locomotrice ( Fig. 1B ). Des études complémentaires avec ce protocole d'administration ont révélé, par Western blot, que l'administration répétée de cocaïne induit sélectivement l'expression de CaMKIIα dans le noyau accumbens (NAc) 24 heures après la dernière injection de cocaïne ( Fig. 1C et D ; p = 0.0019 ; F = 7.943 ; ddl = 29). De plus, la phosphorylation du substrat canonique de CaMKII, la Ser831 de la sous-unité GluA1 du récepteur AMPA, était significativement augmentée dans la coquille du NAc, mais pas dans son noyau (p = 0.0261 ; F = 4.208 ; ddl = 28), tandis que l'autophosphorylation de la Thr286 de CaMKIIα présentait une forte tendance à l'induction, non significative, uniquement dans la coquille ( Fig. 1D ). Plusieurs autres récepteurs du glutamate restaient inchangés. Contrairement à ces mesures de CaMKII, les mêmes échantillons tissulaires présentaient une induction de ΔFosB à la fois dans la coquille (p = 0.0260 ; F = 4.189 ; ddl = 29) et dans le noyau (p = 0.0350 ; F = 3.807 ; ddl = 29) du NAc ( Fig. 1C et D ), ce qui concorde avec des résultats antérieurs ( Perrotti et al., 2008 ).

Plusieurs études antérieures sur la régulation des récepteurs AMPA par la cocaïne ayant analysé des animaux environ 14 jours après le sevrage d'une consommation chronique de cocaïne (voir Discussion), nous avons répété ces analyses biochimiques à ce moment précis. Nous avons constaté que, 14 jours après la dernière injection de cocaïne, le ΔFosB reste élevé dans le NAc (p = 0.0288 ; F = 4.258 ; ddl = 22), tandis que ni la CaMKII ni la phosphorylation de GluA1 Ser831 ne restent augmentées ( Fig. 1E ). Cependant, une heure après l'administration d'une dose unique de 10 mg/kg de cocaïne, les niveaux de CaMKII totale (p = 0.0330 ; F = 3.947 ; ddl = 26) et de phosphorylation de GluA1 Ser831 (p = 0.0213 ; F = 4.509 ; ddl = 27) sont tous deux élevés à un degré similaire à celui observé après la première exposition chronique à la cocaïne ( Fig. 1E ). Ces données indiquent que les neurones du noyau accumbens (NAc) sont prédisposés à l'induction de CaMKII lors de périodes prolongées d'abstinence, probablement par activation directe du promoteur du gène CaMKII (voir Discussion). De plus, la persistance plus marquée de l'induction de ΔFosB par rapport à celle de CaMKII suggère l'existence de mécanismes additionnels, dépendants de la chromatine ou non, qui exercent un frein sur la régulation de CaMKII, comme évoqué dans la Discussion.

Pour étayer ces observations, nous avons exploré des modèles d'auto-administration de cocaïne, impliquant la consommation volontaire de la drogue. Des rats mâles adultes ont eu un accès limité ou prolongé à la cocaïne ; comme prévu ( Ahmed et Koob, 1998 ), seul un accès prolongé a entraîné une augmentation de l'auto-administration de la drogue ( Fig. 2A ). L'expression de ΔFosB était plus fortement induite par un accès prolongé à la cocaïne que par un accès limité, aussi bien dans la coquille (p = 0.0011 ; F = 11.12 ; ddl = 17) que dans le noyau (p = 0.0004 ; F = 13.86 ; ddl = 17) du NAc. En revanche, l'expression de CaMKIIα était induite dans la coquille du NAc uniquement par un accès prolongé à la cocaïne ( Fig. 2B et C ; p = 0.0236 ; F = 4.957 ; ddl = 16). Il est intéressant de comparer la consommation quotidienne moyenne de cocaïne chez les animaux à accès limité (environ 12 mg/kg IV), les animaux à accès prolongé (environ 70 mg/kg IV) et les animaux ayant reçu l'administration par l'expérimentateur (10 mg/kg), et de s'interroger sur les raisons pour lesquelles ces derniers induisent une forte expression de ΔFosB et de CaMKII, contrairement aux animaux à accès limité. Cette différence est probablement due à des variations de la concentration plasmatique maximale de cocaïne (la cocaïne administrée par l'expérimentateur se présente sous forme d'un bolus unique par voie intrapéritonéale, tandis que la cocaïne auto-administrée est administrée par plusieurs injections intraveineuses) ou à des différences de durée d'exposition au médicament (7 jours pour l'administration par l'expérimentateur, 19 jours pour l'auto-administration).

Malgré l'abondante littérature sur le rôle de ΔFosB et de CaMKII dans l'action de la cocaïne, aucune étude n'a porté sur ces protéines chez les consommateurs humains de cocaïne. Nous présentons ici les premières preuves d'une augmentation des niveaux de ΔFosB (p = 0.0316 ; t = 1.921 ; dl = 34) et de CaMKII (p = 0.0444 ; t = 1.755 ; dl = 32) dans le noyau accumbens (NAc) de personnes dépendantes à la cocaïne ( Fig. 2D , Tableau 1 ). Ces données indiquent que notre étude de l'induction de ΔFosB et de CaMKII par la cocaïne dans le NAc de rongeurs présente un intérêt clinique pour la dépendance à la cocaïne chez l'humain.

Tableau 1

Caractérisation d'échantillons de toxicomanes humains et d'un groupe témoin apparié

AFOSB régule la transcription CaMKII de manière sélective dans les MSN de type D1 du shell NAc

La découverte que CaMKII et ΔFosB sont tous deux surexprimés par la cocaïne dans le noyau accumbens (NAc) du rongeur nous a conduits à déterminer si ΔFosB pouvait réguler la transcription du gène CaMKII. Nous avions précédemment identifié CaMKIIα comme une cible potentielle de ΔFosB dans une analyse non biaisée par microréseau du NAc ( McClung et Nestler, 2003 ), mais cette observation n'avait pas été confirmée par la suite. Nous avons d'abord utilisé la technique de ChIP quantitative (qChIP – ChIP suivie d'une PCR quantitative) pour déterminer si ΔFosB se lie au promoteur du gène CaMKIIα dans le NAc de rats mâles adultes. De façon remarquable, nous avons constaté que cette liaison est significativement augmentée, après administration chronique de cocaïne, dans la sous-région externe (p = 0.0133 ; t = 2.901 ; ddl = 12), mais pas dans la sous-région centrale ( Fig. 3A ). Afin de mieux comprendre les mécanismes liés à cette différence de liaison de ΔFosB au promoteur de CaMKIIα, spécifique à cette sous-région, nous avons utilisé la technique qChIP pour caractériser l'état des modifications d'histones dans cette région génomique. Des études antérieures ont démontré l'induction par la cocaïne de l'acétylation de l'histone H3 au niveau du promoteur de CaMKIIα dans le noyau accumbens (NAc) total de la souris ( Wang et al., 2010 ). En revanche, nous avons constaté que la cocaïne diminue l'acétylation de l'histone H3 au niveau du promoteur de CaMKIIα de manière sélective dans le noyau du NAc ( Fig. 3B ; p = 0.0213 ; t = 2.726 ; ddl = 10), sans modification apparente dans la coquille, ce qui est cohérent avec des altérations de la chromatine spécifiques à cette sous-région, au-delà de la liaison de ΔFosB. L'analyse qChIP de la marque répressive, la diméthylation de la lysine 9 de l'histone H3 (H3K9me2), a révélé une tendance à la diminution dans les deux sous-régions (noyau et coquille) ( Fig. 3C ).

Afin de déterminer si ΔFosB régule la transcription de CaMKIIα in vivo , nous avons utilisé deux lignées de souris bitransgéniques surexprimant de manière inductible ΔFosB spécifiquement dans les neurones MSN de type D1 par rapport aux neurones MSN de type D2, et ce, de façon contrôlée par l'administration de doxycycline dans l'eau de boisson ( Chen et al., 1998 ; Kelz et al., 1999 ; Werme et al., 2002 ). Chez les souris mâles adultes surexprimant ΔFosB uniquement dans les neurones MSN de type D1, les niveaux d'ARNm de CaMKIIα dans le NAc étaient significativement augmentés (p = 0.0337 ; t = 1.996 ; ddl = 13), un effet non observé chez les souris surexprimant ΔFosB principalement dans les neurones MSN de type D2 ( Fig. 3D ). L'augmentation de l'ARNm de CaMKIIα, induite par l'expression de ΔFosB dans les neurones MSN de type D1, s'accompagne d'une augmentation concomitante de la protéine CaMKIIα dans la coquille (p = 0.0030 ; t = 3.578 ; ddl = 14) et le noyau (p = 0.0392 ; t = 2.275 ; ddl = 14 ; Fig. 3E et F ) du NAc. Ces données démontrent que ΔFosB est capable d'induire l'expression du gène CaMKIIα dans les neurones MSN de type D1 dans les deux sous-régions. Cependant, la figure 3B suggère que des modifications de la chromatine induites par la cocaïne au niveau du promoteur de CaMKIIα (par exemple, une acétylation réduite) empêchent ΔFosB de réguler positivement l'expression de CaMKIIα dans le noyau après administration de cocaïne.

Nos données sur des souris transgéniques ayant indiqué que l'induction de l'expression du gène CaMKII par ΔFosB est spécifique aux neurones épineux moyens de type D1 dans le noyau accumbens (NAc), nous avons ensuite cherché à déterminer si la régulation positive de CaMKII induite par la cocaïne nécessitait l'activation du récepteur dopaminergique D1. Des rats mâles adultes ont reçu une administration chronique de cocaïne ou de solution saline, comme précédemment. Trente minutes avant chaque injection, les rats du groupe cocaïne ont reçu une injection intrapéritonéale (IP) de solution saline, de l'antagoniste D1 SCH 23390 (0.5 mg/kg) ou de l'antagoniste du récepteur D2 éticlopride (0.5 mg/kg). Les animaux ont été analysés 24 heures après la dernière injection de cocaïne. L'analyse par Western blot a révélé que l'antagoniste D1, mais pas l'antagoniste D2, bloquait complètement l'augmentation de ΔFosB induite par la cocaïne (p < 0.0001 ; F = 18.96 ; ddl = 18), comme précédemment décrit ( Nye et al., 1995 ), ainsi que celle de CaMKII (p = 0.0005 ; F = 10.99 ; ddl = 18 ; Fig. 3G et H ). Ces résultats confirment l'hypothèse selon laquelle la cocaïne induit une augmentation de l'expression du gène CaMKII, via ΔFosB, spécifiquement dans les neurones épineux moyens de type D1 du noyau accumbens (NAc). Il serait important, dans de futures études, de démontrer directement cet effet spécifique de la cocaïne sur l'expression de CaMKII dans cette région cérébrale.

Le ΔFosB est à la fois nécessaire et suffisant pour l’induction de la CaMKII par la cocaïne dans un shell NAc

Pour compléter l'utilisation de souris bitransgéniques, nous avons ensuite étudié le rôle de ΔFosB dans l'induction de CaMKIIα par la cocaïne, grâce à un transfert de gène par vecteur viral chez le rat. Nous avons injecté bilatéralement des particules virales adéno-associées (AAV) dans le noyau accumbens (NAc) de rats mâles adultes (où le noyau peut être ciblé sélectivement) afin de surexprimer ΔFosB et la GFP, ou la GFP seule. Les animaux ont ensuite reçu une injection intrapéritonéale unique de 10 mg/kg de cocaïne. Les animaux surexprimant ΔFosB/GFP ont présenté une augmentation de leur activité locomotrice par rapport à ceux surexprimant la GFP seule ( Fig. 4A ). Vingt-quatre heures après l'injection de cocaïne, le tissu NAc GFP-positif a été prélevé chez ces animaux par dissection sous lumière fluorescente. L'analyse par Western blot de ce tissu ( Fig. 4B et C ) a révélé une forte surexpression de ΔFosB ainsi qu'une augmentation significative de la protéine CaMKIIα totale par rapport aux animaux GFP (p = 0.0070 ; t = 2.894 ; ddl = 30), similaire à l'induction observée après administration chronique de cocaïne. De plus, l'autophosphorylation de CaMKIIα en Thr286 (indicateur d'activation enzymatique) était augmentée par la surexpression de ΔFosB (p = 0.0330 ; t = 2.243 ; ddl = 28), de même que la phosphorylation du substrat de CaMKII, Ser831 de GluA1 (p = 0.0540 ; t = 2.012 ; ddl = 28), mimant là encore les effets de la cocaïne administrée de façon chronique ( Fig. 1C et D ). Prises ensemble, ces données fournissent une preuve supplémentaire que l'expression de ΔFosB dans la coquille NAc est suffisante pour la sensibilisation locomotrice à la cocaïne et pour l'induction et l'activation de CaMKII dans cette sous-région.

Nous avons utilisé une approche similaire pour déterminer si ΔFosB est également nécessaire à l'induction de CaMKIIα par la cocaïne dans le noyau accumbens (NAc). Un vecteur AAV a été utilisé pour surexprimer une protéine JunD tronquée, appelée ΔJunD, qui est un régulateur négatif de l'activation transcriptionnelle de ΔFosB ( Winstanley et al., 2007 ), en présence ou non de GFP. Deux semaines plus tard, lorsque l'expression du transgène est maximale, les animaux ont reçu quotidiennement de la cocaïne (10 mg/kg) ou une solution saline pendant 7 jours, et leurs réponses locomotrices à une injection de cocaïne (5 mg/kg) ont été évaluées 24 heures après la dernière injection chronique ( Fig. 4D ). La surexpression de ΔJunD a empêché la sensibilisation locomotrice à la cocaïne, ainsi que l'induction et l'activation de CaMKIIα dans le noyau accumbens ( Fig. 4E et F ; p = 0.0437 ; F = 2.997 ; ddl = 38), indiquant que l'activité transcriptionnelle de ΔFosB est nécessaire à l'induction de CaMKIIα par la cocaïne dans cette sous-région. De façon intéressante, nous avons constaté que ΔJunD réduisait les niveaux de ΔFosB aussi bien en présence de sérum physiologique qu'après traitement à la cocaïne (p = 0.0004 ; F = 8.110 ; ddl = 35), suggérant que l'expression de ΔFosB pourrait dépendre de l'activité d'AP-1.

CaMKII Phosphorylates ΔFosB chez Ser27

L'utilisation de in vitro Nous avons déterminé que le ΔFosB purifié est un substrat robuste pour la CaMKIIα. Incubation de son₆-AFosB avec CaMKIIα et ATP a provoqué une augmentation de la mobilité électrophorétique de ΔFosB (Fig 5A) les nombreuses bandes résultantes ont suggéré plusieurs sites de phosphorylation. Similaire in vitro tests de kinase utilisant [γ-³²P] ATP a montré l’incorporation de phosphate radiomarqué dans les bandes décalées de ΔFosB (Fig 5B), démontrant la phosphorylation directe de la protéine. Nous avons généré un anticorps phospho-spécifique du Ser27 de ΔFosB (précédemment décrit)Ulery et al., 2006). Bien que cet anticorps ne produise pas de signal contre les extraits de cerveau contenant du ΔFosB phosphorylé par Ser27 (données non présentées), nous avons pu détecter la phosphorylation de Ser27 dans le in vitro dosage de kinase à l'aide de CaMKII (Fig 5B). Les analyses cinétiques de la phosphorylation de ΔFosB par CaMKII indiquent qu’il s’agit d’un puissant substrat pour la kinase (Fig 5C), avec un K apparent_M de 5.7 ± 2.0µM et K_CHAT de 2.3 ± 0.3min^-1. Ces résultats sont comparables à ceux de nombreuses études bien caractérisées. in vivo substrats de CaMKII (Colbran et Brown, 2004). De plus, nous avons déterminé que la CaMKII phosphorylait la ΔFosB avec une stoechiométrie de 2.27 ± 0.07 mol / mol (Fig 5D), indiquant qu'il existe au moins trois sites de phosphorylation de CaMKII dans la₆-AfosB, en accord avec Fig 5A.

Pour étudier les sites de phosphorylation individuels, nous avons réalisé des analyses de spectrométrie de masse (SM) sur des échantillons issus de nos tests d'activité kinase in vitro . La figure 5E illustre la phosphorylation de ΔFosB au niveau de la Ser27, précédemment caractérisée, ainsi qu'à plusieurs autres sites (données non présentées). Compte tenu de la caractérisation fonctionnelle antérieure de la Ser27, nous avons concentré nos efforts sur ce site en générant des peptides synthétiques marqués mimant les états phosphorylé et non phosphorylé de la Ser27. Nous avons ensuite utilisé des quantités connues de ces peptides comme standards dans des analyses MRM de ΔFosB avant et après phosphorylation in vitro par la CaMKII. La quantification subséquente ( figure 5F ) confirme que la Ser27 est un substrat efficace pour la CaMKII. Ces résultats indiquent que, parmi les nombreux résidus phosphorylés de ΔFosB, la Ser27 est un substrat particulièrement efficace pour la CaMKII.

CaMKII médie l'accumulation de ΔFosB dans la coquille de NAc dans la cocaïne

Étant donné que la CaMKII peut phosphoryler ΔFosB in vitro sur un site qui augmente considérablement sa stabilité in vitro et in vivo ( Ulery et al., 2006 ; Ulery-Reynolds et al., 2009 ), nous avons cherché à déterminer si l’activité de la CaMKII contrôle les niveaux de ΔFosB dans le NAc in vivo . Pour ce faire, nous avons utilisé une lignée de souris surexprimant un mutant de CaMKIIα (T286D) indépendant du calcium dans plusieurs régions cérébrales, dont le NAc ( Mayford et al., 1996 ; Kourrich et al., 2012 ). Nous avons injecté quotidiennement, pendant 14 jours, 20 mg/kg de cocaïne ou de solution saline à des souris mâles adultes mutantes et sauvages, appariées en âge, puis analysé les animaux le lendemain de la dernière injection. Nous avons constaté une augmentation des niveaux basaux de ΔFosB chez les animaux mutants dans la coquille du NAc (p=0.0001 ; F=9.207 ; ddl=37), mais pas dans le noyau ( Fig. 5G et H ). De façon surprenante, l’induction de ΔFosB par la cocaïne était bloquée chez les animaux mutants, aussi bien dans la coquille que dans le noyau, suggérant que, bien que la CaMKII puisse réguler directement la stabilité de ΔFosB dans la coquille du NAc, elle pourrait également intervenir en amont de ΔFosB dans les voies activées par la cocaïne dans les deux sous-régions du NAc.

Activité CaMKII Est Requise Pour Plasticité Structurale Et Comportementale Médiée Par ΔFosB

L'induction de la formation d'épines dendritiques par la cocaïne sur les neurones épineux moyens (MSN) du noyau accumbens (NAc) est l'une des adaptations induites par les drogues les mieux établies dans cette région cérébrale. Cette induction est corrélée à une sensibilisation comportementale à la drogue ( Robinson et Kolb, 2004 ; Russo et al., 2010 ) et serait sélective pour les MSN de type D1 ( Lee et al., 2006 ). Nous avons récemment démontré que l'induction de la formation d'épines dendritiques par la cocaïne dans le NAc dépend de ΔFosB et de son programme transcriptionnel en aval ( Maze et al., 2010 ). Bien qu'il existe une littérature abondante concernant l'implication de la CaMKII dans la morphologie et l'induction des épines dendritiques dans d'autres régions cérébrales et systèmes expérimentaux ( Jourdain et al., 2003 ; Penzes et al., 2008 ; Okamoto et al., 2009 ), son rôle dans la formation des épines des MSN du NAc reste à explorer. Par conséquent, nous avons déterminé si l'activité de CaMKII est nécessaire à l'induction des épines dendritiques MSN médiée par ΔFosB en utilisant la surexpression médiée par HSV du peptide inhibiteur de CaMKII AC3I fusionné à la GFP, une construction dont il a été précédemment démontré qu'elle inhibait l'activité de CaMKII in vivo ( Zhang et al., 2005 ; Klug et al., 2012 ). La surexpression virale de ΔFosB dans le noyau accumbens (NAc) de souris adultes a induit une augmentation significative de la densité des épines dendritiques des neurones épineux moyens (MSN) (p < 0.0001 ; F = 8.558 ; ddl = 59 ; Fig. 6A et B ), comme précédemment décrit ( Maze et al., 2010 ). Cette augmentation était principalement due aux épines fines (p = 0.0027 ; F = 5.319 ; ddl = 59) et courtes (p = 0.0378 ; F = 2.988 ; ddl = 59), considérées comme immatures ( Fig. 6C–E ). Aucun effet n'a été observé sur les épines plus matures, en forme de champignon. Cependant, lorsque GFP-AC3I était coexprimé, l'induction des épines par ΔFosB était complètement abrogée ( Fig 6A–E ), indiquant que l'activité de CaMKII est nécessaire à l'induction des épines dendritiques par ΔFosB dans la coquille NAc.

Nous avons ensuite utilisé les mêmes outils viraux pour déterminer si l'activité de la CaMKII est nécessaire aux effets de ΔFosB sur la sensibilité comportementale à la cocaïne. Soixante-douze heures après l'injection virale dans le noyau accumbens (NAc), les animaux ont reçu une injection unique de 5 mg/kg de cocaïne et leur activité locomotrice a été enregistrée. Comme précédemment démontré avec une surexpression plus étendue de ΔFosB par AAV ( Fig. 4A ), la surexpression de ΔFosB induite par HSV a augmenté la sensibilité locomotrice à la cocaïne (p = 0.0002 ; F = 8.823 ; ddl = 37 ; Fig. 6F ). De même que pour l'induction des épines dendritiques, l'inhibition de l'activité de la CaMKII par la coexpression de GFP-AC3I a complètement bloqué l'augmentation de la sensibilité à la cocaïne induite par ΔFosB, indiquant que l'activité de la CaMKII est nécessaire aux altérations des effets comportementaux de la cocaïne induites par ΔFosB.

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Discussions

La présente étude décrit un nouveau mécanisme d'amplification par rétroaction positive où la cocaïne induit la délétion de FosB (ΔFosB) dans le noyau accumbens (NAc), ce qui stimule la transcription du gène CaMKIIα spécifiquement dans la coquille du NAc . CaMKIIα phosphoryle et stabilise ensuite ΔFosB, entraînant une accumulation accrue de ΔFosB et une induction supplémentaire de CaMKIIα ( Fig. 6G ). L'augmentation concomitante des niveaux de ces deux protéines lors d'une exposition chronique à la cocaïne contribue alors de manière essentielle à l'exacerbation des réponses comportementales à la drogue. Cette hypothèse est particulièrement intéressante car il a été démontré que ΔFosB et CaMKII sont tous deux nécessaires à l'augmentation des réponses comportementales à la cocaïne ( Pierce et al., 1998 ; Peakman et al., 2003 ), et nous reproduisons ce résultat pour ΔFosB dans la coquille du NAc spécifiquement en utilisant une approche virale ( Fig. 4 et 66 ).

Bien que la surexpression transgénique de ΔFosB dans les neurones MSN de type D1 puisse induire l'expression de CaMKII dans la coquille et le noyau du NAc chez les animaux naïfs à la cocaïne, en présence de cocaïne, l'accumulation de ΔFosB endogène, observée dans les deux sous-régions, induit l'expression de CaMKII spécifiquement dans la coquille du NAc. Cette différence pourrait être liée aux niveaux plus élevés de ΔFosB induits dans notre modèle bitransgénique ; cependant, elle pourrait également refléter la capacité de la cocaïne à modifier différemment le promoteur de CaMKIIα dans les neurones MSN de la coquille et du noyau, favorisant ainsi la liaison de ΔFosB dans la première ou l'inhibant dans la seconde. De fait, nos données ChIP, qui révèlent une désacétylation des histones induite par la cocaïne au niveau du promoteur du gène CaMKIIα uniquement dans le noyau du NAc, suggèrent l'implication possible d'un mécanisme chromatinien. Conformément à cette hypothèse, la surexpression de ΔFosB dans les neurones MSN de type D1 a induit l'expression de CaMKIIα dans le noyau accumbens (NAc) en l'absence de cocaïne ( Fig. 3F ), suggérant l'existence de modifications actives du promoteur de CaMKIIα qui empêchent cette induction lors d'une exposition chronique à la cocaïne. La régulation de l'organisation chromatinienne au niveau du promoteur de CaMKII pourrait également expliquer pourquoi CaMKII est induite par une dose de cocaïne dans la coquille du NAc chez des rats en sevrage chronique de cocaïne ( Fig. 1E ), mais pas chez des animaux naïfs ( Fig. 1D ). Ceci pourrait représenter un effet épigénétique d'« amorçage génique » de ΔFosB ( Robison et Nestler, 2011 ) et constituer ainsi un mécanisme moléculaire de l'incubation du besoin impérieux de cocaïne ( Pickens et al., 2011 ). Toutefois, pour que cette modification chromatinienne soit causalement liée à l'incubation du besoin impérieux, elle devrait s'amplifier au fil du temps. Il sera intéressant de déterminer si tel est le cas et d'étudier si d'autres gènes présentent une régulation dépendante de ΔFosB et spécifique à certaines sous-régions sous l'effet de la cocaïne. Il est également important de noter que la boucle de rétroaction positive que nous décrivons n'entraîne pas une accumulation infinie de CaMKII ou de ΔFosB ( Fig. 1E ) ; identifier le mécanisme moléculaire responsable de cette accumulation constitue un objectif important des études futures.

Les fonctions connues de ΔFosB et CaMKII dans plusieurs systèmes expérimentaux et régions du cerveau convergent à plusieurs niveaux (Figue 6F). Les deux molécules sont intimement liées à la croissance de la colonne dendritique: CaMKII interagit avec le cytosquelette d'actine (Okamoto et al., 2009), régule la taille de la colonne vertébrale (Matsuzaki et al., 2004), et est à la fois nécessaire et suffisante pour l’augmentation du nombre de filopodes et de synapses induite par la plasticité dans les cultures de coupes organotypiques de l’hippocampe (Jourdain et al., 2003), wCependant, ΔFosB est à la fois nécessaire et suffisant pour la formation d’épine dendritique induite par la cocaïne dans les MSN NAc (Maze et al., 2010). De plus, les deux molécules ont été associées à la régulation des récepteurs AMPA du glutamate. CaMKII ne régule pas les niveaux totaux des sous-unités du récepteur AMPA, mais commande l’insertion des récepteurs AMPA dans les synapses et augmente la conductance du canal AMPA en phosphorylant GluA1 chez Ser831 dans les neurones pyramidaux de l’hippocampe en culture in vivo (examiné dans (Malinow et Malenka, 2002; Colbran et Brown, 2004)). Ce trafic accru de GluA1 vers la synapse a également été impliqué dans l'action chronique de la cocaïne (Boudreau et Wolf, 2005). De plus, les réponses comportementales à l'activation des récepteurs AMPA dans la NAc sont améliorées par la surexpression de CaMKIIα d'une manière dépendante du récepteur D1 (Singer et al., 2010). Il a été démontré que la surexpression de ΔFosB spécifique à D1 induisait la transcription de GluA2 dans NAc (Kelz et al., 1999), qui atténue les réponses AMPA médiées par GluA1, alors que nous montrons ici que la surexpression de ΔFosB à court terme - ainsi que l’exposition à la cocaïne à court terme - n’ont aucun effet sur cette sous-unité (Fig 1). Néanmoins, nous avons récemment constaté que la surexpression de ΔFosB à court terme réduisait néanmoins les réponses AMPA dans les MSN de type D1 dans NAc (Grueter et al., 2013). Ces données suggèrent des mécanismes temporellement distincts qui pourraient constituer une série de neuroadaptations à la cocaïne dépendantes du temps qui sous-tendent différents aspects de la progression de la toxicomanie encore mal compris. Sur le plan comportemental, CaMKII et ΔFosB sont nécessaires pour la sensibilisation locomotrice à la cocaïne (voir ci-dessus), et les deux sont nécessaires pour une auto-administration prolongée de cocaïne chez les rongeurs (Colby et al., 2003; Wang et al., 2010), suggérant que les deux protéines jouent un rôle important dans l'adaptation comportementale à l'exposition aux médicaments à court et à long terme, bien que via des mécanismes sous-jacents partiellement distincts. On présume que ΔFosB et CaMKII régulent de telles adaptations comportementales complexes en modifiant la fonction synaptique de NAc, bien qu'il reste encore beaucoup à faire pour lier directement les phénomènes synaptiques au changement de comportement.

L'holoenzyme CaMKII interagit simultanément avec diverses protéines synaptiques ( Robison et al., 2005 ), lesquelles réguleraient son ciblage vers la densité postsynaptique (PSD), un phénomène considéré comme important pour la plasticité synaptique. Plus précisément, l'interaction de CaMKII avec la sous-unité GluN2B du récepteur au glutamate de type NMDA s'est récemment révélée réguler à la fois la plasticité synaptique et l'apprentissage ( Halt et al., 2012 ). Le peptide AC3I, en mimant le domaine autoinhibiteur de CaMKII et en inhibant ainsi l'activité catalytique de l'enzyme, bloque également de multiples interactions protéine-protéine ( Strack et al., 2000 ; Robison et al., 2005 ). Ainsi, les effets comportementaux et morphologiques du HSV-GFP-AC3I rapportés ici pourraient se produire par le biais d'une phosphorylation réduite des protéines cibles de CaMKII, de changements dans le ciblage de CaMKII ou d'un changement dans le rôle structurel proposé de CaMKII au niveau des synapses ( Lisman et al., 2002 ).

La restriction de la boucle ΔFosB-CaMKII proposée à la coquille du NAc est particulièrement importante, car des travaux récents ont démontré plusieurs différences physiologiques entre la coquille et le noyau du NAc en réponse à l'administration de cocaïne, une notion confirmée par nos données iTRAQ non biaisées (Tableau S1). Les neurones MSN de la coquille du NAc présentent une diminution de leur capacité de décharge après une administration chronique de cocaïne, qui persiste pendant plusieurs semaines, tandis que les neurones MSN du noyau des mêmes animaux présentent une augmentation transitoire (1 à 3 jours) de leur capacité de décharge, qui revient à son niveau basal en deux semaines ( Kourrich et Thomas, 2009 ). De plus, de nombreuses protéines synaptiques sont régulées différemment dans la coquille et le noyau du NAc chez les animaux exposés à une administration chronique de cocaïne, notamment GluA2 ( Knackstedt et al., 2010 ). L'amphétamine induisant spécifiquement CaMKIIα dans la coquille du NAc ( Loweth et al., 2010 ), il n'est pas surprenant d'observer un effet similaire avec la cocaïne. Cependant, comme ΔFosB est induit à la fois dans la coquille et le noyau du NAc par la cocaïne chronique ( Perrotti et al., 2008 ), et puisque nous montrons que l'induction de CaMKIIα dans la coquille est dépendante de ΔFosB, nos résultats fournissent de nouvelles preuves de mécanismes transcriptionnels distincts au niveau du promoteur de CaMKIIα entre ces deux sous-régions, qui sont responsables de l'induction sélective de CaMKIIα dans la coquille.

De nombreux travaux récents se sont attachés à caractériser les différences entre les neurones épineux moyens (MSN) du noyau accumbens (NAc) de type D1 et D2. Bien que les récepteurs D1 et D2 soient tous deux impliqués dans les effets gratifiants de la cocaïne ( Self, 2010 ), des travaux récents démontrent que l'activation optogénétique des MSN de type D1 augmente les réponses comportementales à la cocaïne, tandis que l'activation des MSN de type D2 a l'effet inverse ( Lobo et al., 2010 ). Conformément à ces résultats, les souris invalidées pour le récepteur D1 présentent un déficit d'acquisition de l'auto-administration de cocaïne ( Caine et al., 2007 ), contrairement aux souris invalidées pour le récepteur D2 ( Caine et al., 2002 ). L'administration d'un agoniste D1 directement dans le NAc déclenche un comportement de recherche de cocaïne dans les paradigmes de réactivation ( Self, 2010 ). Il est intéressant de noter que cet effet nécessite des augmentations de l'activité de CaMKII dépendantes du récepteur D1 dans la coquille du NAc, mais pas dans le noyau ( Anderson et al., 2008 ), un résultat qui s'accorde bien avec la boucle ΔFosB-CaMKII spécifique au D1 et à la coquille proposée ici.

Nous avons précédemment montré que la Ser27 de ΔFosB peut être phosphorylée par la caséine kinase-2 ( Ulery et al., 2006 ). Cependant, nous démontrons ici que la CaMKII phosphoryle ΔFosB sur ce site et d'autres sites avec une cinétique et une stœchiométrie bien supérieures, et qu'elle peut reproduire l'augmentation apparente de la masse moléculaire relative (Mr ₎ observée pour ΔFosB ( Fig. 5A ) après exposition à la cocaïne in vivo ( Nestler, 2008 ). Nous savons déjà que la phosphorylation de la Ser27 accroît la stabilité et l'activité transcriptionnelle de ΔFosB ( Ulery et al., 2006 ; Ulery et Nestler, 2007 ; Ulery-Reynolds et al., 2009 ). Les travaux futurs porteront sur l'identification et les conséquences fonctionnelles des nouveaux sites de phosphorylation de ΔFosB mis en évidence par cette étude.

La boucle de rétroaction positive décrite ici offre un nouveau mécanisme plausible par lequel l'administration répétée de cocaïne induit des anomalies progressives dans le noyau accumbens (NAc). De ce fait, cette voie biochimique pourrait constituer une cible importante pour de futures interventions thérapeutiques dans les troubles addictifs. Étant donné que la CaMKII est omniprésente et essentielle à de nombreuses fonctions neuronales et comportementales basales, l'utilisation directe d'inhibiteurs de la CaMKII a été évitée dans le traitement de la dépendance. Nos données suggèrent qu'un ciblage plus précis du mécanisme d'induction de la CaMKII, spécifique à un type cellulaire et à une sous-région du circuit de la récompense cérébrale, pourrait constituer une cible thérapeutique permettant d'éviter les complications liées à l'inhibition systémique de la CaMKII.

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Remerciements

Ce travail a été financé par des subventions de l'Institut national de lutte contre l'abus des drogues (RJE), du Centre de protéomique NIDA-Yale DA018343 (AJR et RJE) et de la Fondation Hartwell (AJR). Les auteurs souhaitent remercier Gabby Rundenko pour le généreux don de ΔFosB purifié et Roger Colbran pour le généreux don de CaMKIIα purifié.

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Références

1. Ahmed SH, Koob GF. Passage d'un apport modéré à un excès de médicament: modification du point de consigne hédonique. Science. 1998; 282: 298 – 300. [PubMed]
2. Anderson SM, célèbre KR, Sadri-Vakili G, Kumaresan V, Schmidt HD, Basse CE, Terwilliger EF, Cha JH, Pierce RC. CaMKII: un pont biochimique reliant les systèmes de dopamine et de glutamate d'Accumbens à la recherche de cocaïne. Nat Neurosci. 2008; 11: 344 – 353. [PubMed]
3. Boudreau AC, Wolf ME. La sensibilisation comportementale à la cocaïne est associée à une expression accrue de la surface du récepteur AMPA dans le noyau accumbens. J Neurosci. 2005; 25: 9144 – 9151. [PubMed]
4. DA Brickey, RJ Colbran, Fong YL, TR Soderling. Expression et caractérisation de la sous-unité alpha de la protéine kinase II dépendante de Ca2 + / calmoduline à l'aide du système d'expression du baculovirus. Biochem Biophys Res Commun. 1990; 173: 578 – 584. [PubMed]
5. Caine SB, SS Negus, Mello NK, S Patel, L Bristow, J Kulagowski, D Vallone, Saiardi A, Borrelli E. Rôle des récepteurs dopaminergiques de type D2 dans l'auto-administration de cocaïne: études sur les souris mutantes du récepteur D2 et le nouveau récepteur D2 antagonistes. J Neurosci. 2002; 22: 2977 – 2988. [PubMed]
6. Caine SB, Thomsen M., Gabriel KI, Berkowitz JS, Or LH, Koob GF, Tonegawa S, Zhang J, Xu M. Absence d'auto-administration de cocaïne chez des souris knock-out du récepteur de la dopamine D1. J Neurosci. 2007; 27: 13140 – 13150. [Article gratuit PMC] [PubMed]
7. Carle TL, Ohnishi YN, Ohnishi YH, Alibhai IN, Wilkinson MB, Kumar A, Nestler EJ. Mécanismes dépendants et indépendants du protéasome pour la déstabilisation de FosB: identification des domaines de FonB degron et implications pour la stabilité de DeltaFosB. Eur J Neurosci. 2007; 25: 3009 – 3019. [PubMed]
8. Chen J, MB Kelz, G Zeng, N Sakai, C Steffen, PE Shockett, MR Picciotto, RS Duman, EJ Nestler. Animaux transgéniques à expression génique ciblée et inductible dans le cerveau. Mol Pharmacol. 1998; 54: 495 – 503. [PubMed]
9. Christoffel DJ, Golden SA, Dumitriu D, Robison AJ, Janssen WG, Ahn HF, Krishnan V, Reyes CM, Han MH, Ables JL, Eisch AJ, Dietz DM, Ferguson D, Neve RL, Greengard P, Kim Y, Morrison JH Russo SJ. La kinase IkappaB régule la défaite sociale, la plasticité comportementale et synaptique induite par le stress. J Neurosci. 2011; 31: 314 – 321. [Article gratuit PMC] [PubMed]
10. Colbran RJ. Inactivation de la protéine kinase II dépendante de Ca2 + / calmoduline par autophosphorylation basale. J Biol Chem. 1993; 268: 7163 – 7170. [PubMed]
11. Colbran RJ. Protéines phosphatases et plasticité synaptique dépendant de la protéine kinase II dépendante du calcium / calmoduline. J Neurosci. 2004; 24: 8404 – 8409. [PubMed]
12. Colbran RJ, Brown AM. Protéine kinase II dépendante du calcium / calmoduline et plasticité synaptique. Voir Opin Neurobiol. 2004; 14: 318 – 327. [PubMed]
13. Colby CR, Whisler K, C Steffen, Nestler EJ, Self DW. La surexpression de DeltaFosB spécifique au type de cellule striatale renforce l’incitation à la cocaïne. J Neurosci. 2003; 23: 2488 – 2493. [PubMed]
14. Covington HE, 3rd, Maze I, LaPlant QC, Vialou VF, Ohnishi YN, Berton O, Fass DM, Renthal W, Rush AJ, XEUMXrd, Wu EY, Ghose S, Krishnan V, Russo SJ, Tamminga C, Hagmingy SJ, Nestler EJ. Actions antidépressives des inhibiteurs de l’histone déacétylase. J Neurosci. 3; 2009: 29 – 11451. [Article gratuit PMC] [PubMed]
15. Davalos A, C Fernandez-Hernando, Sowa G, B Derakhshan, Lin MI, Lee JY, H Zhao, R Luo, C Colangelo, WC Sessa. Protéomique quantitative des protéines régulées par la cavéoline-1: caractérisation de la polymérase i et du facteur de libération du transcrit / cellules CAVIN-1 IN dans les cellules endothéliales. Protéomique des cellules de Mol. 2010; 9: 2109 – 2124. [Article gratuit PMC] [PubMed]
16. Dumais A, AD Lesage, Alda M, Rouleau G, Dumont M, Chawky N, Roy M, JJ Mann, Benkelfat C et Turecki G. Facteurs de risque d'achèvement du suicide dans la dépression majeure: étude cas-témoins de comportements impulsifs et agressifs dans Hommes. Suis J psychiatrie. 2005; 162: 2116 – 2124. [PubMed]
17. Grueter BA, AJ Robison, Neve RL, Nestler EJ, Malenka RC. ΔFosB module différentiellement la fonction de voie directe et indirecte du noyau accumbens. Proc Natl Acad Sci USA. 2013 sous presse. [Article gratuit PMC] [PubMed]
18. Arrêt AR, Dallapiazza RF, Zhou Y, Stein IS, Qian H, S Juntti, S Wojcik, N Brose, Silva AJ, Hell JW. La liaison de CaMKII à GluN2B est critique lors de la consolidation de la mémoire. EMBO J. 2012; 31: 1203 – 1216. [Article gratuit PMC] [PubMed]
19. Hiroi N, Brown JR, Haile CN, Ye H, Greenberg ME, Nestler EJ. Souris mutantes FosB: perte de l'induction chronique de la cocaïne des protéines liées à Fos et sensibilité accrue aux effets psychomoteurs et gratifiants de la cocaïne. Proc Natl Acad Sei US A. 1997; 94: 10397-10402. [Article gratuit PMC] [PubMed]
20. Ito R, TW Robbins, Everitt BJ. Contrôle différentiel du comportement de recherche de cocaïne par le noyau accumbens et la coquille. Nat Neurosci. 2004; 7: 389 – 397. [PubMed]
21. Jorissen HJ, Ulery PG, Henry L, Gourneni S, Nestler EJ, Rudenko G. Propriétés de dimérisation et de liaison à l'ADN du facteur de transcription DeltaFosB. Biochimie. 2007; 46: 8360 – 8372. [PubMed]
22. Jourdain P, Fukunaga K, Muller D. La protéine kinase II dépendante du calcium / calmoduline contribue à la croissance des filopodes et à la formation de la colonne vertébrale dépendante de l'activité. J Neurosci. 2003; 23: 10645 – 10649. [PubMed]
23. Kelz MB, Chen J, Carlezon WA, Jr, Whisler K, Gilden AM, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, L Marotti, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, DJ Surmeier, Neve RL, Duman RS, Duman RS, Picciotto MR, Nestler EJ. L'expression du facteur de transcription deltaFosB dans le cerveau contrôle la sensibilité à la cocaïne. La nature. 1999; 401: 272 – 276. [PubMed]
24. Klug JR, BN Mathur, Kash TL, HD Wang, RT Matthews, AJ Robison, ME Anderson, AY Deutch, DM Lovinger, RJ Colbran, DG Winder. Inhibition Génétique De CaMKII Dans Les Neurones Épineux Moyens Striataux Dorsaux Réduit Les Synapses Excitatrices Fonctionnelles Et Améliore L'excitabilité Intrinsique. PLoS One. 2012; 7: e45323. [Article gratuit PMC] [PubMed]
25. Knackstedt LA, K Moussawi, R Lalumiere, M Schwendt, M Klugmann, Kalivas PW. L'entraînement à l'extinction après une auto-administration de cocaïne induit une plasticité glutamatergique pour empêcher la recherche de cocaïne. J Neurosci. 2010; 30: 7984 – 7992. [Article gratuit PMC] [PubMed]
26. Kourrich S, Thomas MJ. Neurones similaires, adaptations opposées: l’expérience psychostimulante modifie de façon différentielle les propriétés de mise à feu dans le noyau d’accumbens par rapport à la coque. J Neurosci. 2009; 29: 12275 – 12283. [Article gratuit PMC] [PubMed]
27. Kourrich S, Klug JR, M Mayford, Thomas MJ. L'effet indépendant d'AMPAR de l'alphaCaMKII striatal favorise la sensibilisation de la cocaïne. J Neurosci. 2012; 32: 6578 – 6586. [Article gratuit PMC] [PubMed]
28. LaPlant Q, Chakravarty S, Vialou V, Mukherjee S, Koo JW, G Kalahasti, Bradbury KR, Taylor SV, Maze I, Kumar A, Graham A, Birnbaum SG, Krishnan V, Truong HT, Neve RL, Neve RL, Nestler EJ, Russo SJ . Rôle du facteur nucléaire kappaB dans l'hypersensibilité au stress induite par les hormones ovariennes chez la souris femelle. Biol Psychiatry. 2009; 65: 874 – 880. [Article gratuit PMC] [PubMed]
29. Lee KW, Kim Y, Kim AM, Helmin K, Nairn AC, Greengard P. Formation de la colonne vertébrale dendritique induite par la cocaïne dans les neurones à épine moyenne du récepteur dopaminergique D1 et D2 dans le noyau accumbens. Proc Natl Acad Sci US A. 2006; 103: 3399 – 3404. [Article gratuit PMC] [PubMed]
30. Lisman J, Schulman H, Cline H. La base moléculaire de la fonction CaMKII dans la mémoire synaptique et comportementale. Nat Rev Neurosci. 2002; 3: 175 – 190. [PubMed]
31. Lobo MK, Covington HE, 3rd, Chaudhury D, Friedman AK, Sun H, Damez-Werno D, Dietz DM, Zaman S, Koo JW, PJ Kennedy, Mouzon E, Mogri M, Neve RL, Deisseroth K, Han MH, Nestler EJ. La perte de signalisation de BDNF spécifique à un type de cellule imite le contrôle optogénétique de la récompense de la cocaïne. Science. 2010; 330: 385 – 390. [Article gratuit PMC] [PubMed]
32. Loweth JA, Baker LK, T Guptaa, Guillory AM et Vezina P. L'inhibition de la CaMKII dans la coque du noyau accumbens diminue l'ingestion accrue d'amphétamine chez les rats sensibilisés. Neurosci Lett. 2008; 444: 157 – 160. [Article gratuit PMC] [PubMed]
33. Loweth JA, chanteur BF, Baker LK, Wilke G, Inamine H, Bubula N, Alexander JK, Carlezon WA, Jr, Neve RL, Vezina P. Surexpression transitoire d'alpha-Ca2 + / protéine dépendante de la calmoduline dans la coque du noyau accumbens améliore la réponse comportementale à l'amphétamine. J Neurosci. 2010; 30: 939 – 949. [Article gratuit PMC] [PubMed]
34. Malinow R, Malenka RC. Trafic des récepteurs AMPA et plasticité synaptique. Annu Rev Neurosci. 2002; 25: 103 – 126. [PubMed]
35. Matsuzaki M, Honkura N, GC Ellis-Davies, Kasai H. Base structurelle de la potentialisation à long terme des épines dendritiques simples. La nature. 2004; 429: 761 – 766. [PubMed]
36. Mayford M, Bach ME, Huang YY, Wang L, RD Hawkins, ER Kandel. Contrôle de la formation de la mémoire par l'expression régulée d'un transgène CaMKII. Science. 1996; 274: 1678 – 1683. [PubMed]
37. Maze I, Covington HE, 3rd, DM Dietz, LaPlant Q, Renthal W, Russo SJ, Mécanicien M, Mouzon E., Neve RL, Haggarty SJ, Ren Y, Sampath SC, Hurd YL, Greengard P, Tarakhovsky A, Schaefer A, Nestler EJ. Rôle essentiel de l'histone méthyltransférase G9a dans la plasticité induite par la cocaïne. Science. 2010; 327: 213 – 216. [Article gratuit PMC] [PubMed]
38. McClung CA, Nestler EJ. Régulation de l'expression des gènes et de la récompense de la cocaïne par CREB et DeltaFosB. Nat Neurosci. 2003; 6: 1208 – 1215. [PubMed]
39. Nestler EJ. La revue. Mécanismes transcriptionnels de la dépendance: rôle de DeltaFosB. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2008; 363: 3245 – 3255. [Article gratuit PMC] [PubMed]
40. Nye HE, espoir BT, Kelz MB, Iadarola M, Nestler EJ. Études pharmacologiques sur la régulation de l'induction chronique de l'antigène lié au FOS par la cocaïne dans le striatum et le noyau accumbens. J Pharmacol Exp Ther. 1995; 275: 1671 – 1680. [PubMed]
41. Okamoto K, Bosch M, Hayashi Y. Les rôles de la CaMKII et de la F-actine dans la plasticité structurale des épines dendritiques: une identité moléculaire potentielle d'une étiquette synaptique? Physiologie (Bethesda) 2009; 24: 357 – 366. [PubMed]
42. Olausson P, Jentsch JD, Tronson N, Neve RL, Nestler EJ, Taylor JR. DeltaFosB dans le noyau accumbens régule le comportement instrumental renforcé et la motivation. J Neurosci. 2006; 26: 9196 – 9204. [PubMed]
43. Paxinos G, Watson C. Le cerveau de rat en coordonnées stéréotaxiques. 6th Edition. Amsterdam Boston: Academic Press / Elsevier; 2007.
44. Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, Chao J, Duman C, Steffen C, Monteggia L, Allen MR, Stock JL, Duman RS, McNeish JD, Barrot M, Self DW, Nestler EJ , Schaeffer E. L'expression inductible, spécifique à la région cérébrale, d'un mutant négatif dominant de c-Jun chez des souris transgéniques diminue la sensibilité à la cocaïne. Brain Res. 2003; 970: 73 – 86. [PubMed]
45. Penzes P, ME Cahill, Jones KA, DP Srivastava. Les signaux convergents CaMK et RacGEF contrôlent la structure et la fonction dendritiques. Trends Cell Biol. 2008; 18: 405 – 413. [PubMed]
46. Perrotti LI, Y Hadeishi, PG Ulery, M. Barrot, L Monteggia, Duman RS, EJ Nestler. Induction de deltaFosB dans les structures cérébrales liées aux récompenses après un stress chronique. J Neurosci. 2004; 24: 10594 – 10602. [PubMed]
47. Perrotti LI, RR tisserand, Robison B, Renthal W, Maze I, S Yazdani, Elmore RG, DJ Knapp, Selley DE, Martin BR, Sim-Selley L, Bachtell RK, Self DW, Nestler EJ. Schémas distincts d’induction de DeltaFosB dans le cerveau par des drogues d’abus. Synapse. 2008; 62: 358 – 369. [Article gratuit PMC] [PubMed]
48. Pickens CL, Airavaara M, Theberge F, S Fanous, Hope BT, Shaham Y. Neurobiologie de l'incubation de la soif de drogue. Tendances Neurosci. 2011; 34: 411 – 420. [Article gratuit PMC] [PubMed]
49. Pierce RC, EA rapide, Reeder DC, Morgan ZR et Kalivas PW. Les seconds messagers médiés par le calcium modulent l'expression de la sensibilisation comportementale à la cocaïne. J Pharmacol Exp Ther. 1998; 286: 1171 – 1176. [PubMed]
50. Quirion R, Y Robitaille, Martial J, Chabot JG, Lemoine P, Pilapil C, Dalpe M. Autoradiographie des récepteurs du cerveau humain utilisant des sections d'hémisphère entier: méthode générale permettant de minimiser les artefacts tissulaires. Synapse. 1987; 1: 446 – 454. [PubMed]
51. Robinson TE, Kolb B. Plasticité structurelle associée à l'exposition à des drogues d'abus. Neuropharmacologie. 2004; 47 (Suppl. 1): 33 – 46. [PubMed]
52. Robison AJ, Nestler EJ. Mécanismes transcriptionnels et épigénétiques de la dépendance. Nat Rev Neurosci. 2011; 12: 623 – 637. [Article gratuit PMC] [PubMed]
53. Robison AJ, Bass MA, Jiao Y, MacMillan LB, Carmody LC, Bartlett RK, Colbran RJ. Interactions multivalentes de la protéine kinase II dépendant du calcium / calmoduline avec les protéines de densité postsynaptiques NR2B, densin-180 et alpha-actinine-2. J Biol Chem. 2005; 280: 35329 – 35336. [PubMed]
54. Ross PL, Huang YN, Marchese JN, Williamson B, Parker K, S Hattan, Khainovski N, Pillai S, Dey S, Daniels S, Purkayastha S, Juhasz P, Martin S, Bartlet-Jones M, He F, Jacobson A, DJ Pappin. Quantification de protéines multiplexées dans Saccharomyces cerevisiae à l'aide de réactifs de marquage isobare réactifs aux amines. Protéomique des cellules de Mol. 2004; 3: 1154 – 1169. [PubMed]
55. Russo SJ, DM Dietz, D Dumitriu, JH Morrison, RC Malenka, EJ Nestler. La synapse dépendante: mécanismes de plasticité synaptique et structurale du noyau accumbens. Tendances Neurosci. 2010; 33: 267 – 276. [Article gratuit PMC] [PubMed]
56. Self DW. Dans: Les récepteurs de la dopamine. Neve KA, éditeur. New York: Humana Press; 2010. pp. 479 – 524.
57. Singer BF, Loweth JA, Neve RL, Vezina P. La surexpression transitoire, à médiation virale, de la protéine kinase II dépendante de l'alpha-calcium / de la calmoduline dans l'enveloppe du noyau accumbens conduit à une régulation positive à long terme de l'alpha-amino-3-hydroxyl-5 -méthyl-4-isoxazole-propionate: récepteur du type dopamine 1 et dépendance à la protéine kinase A. Eur J Neurosci. 2010; 31: 1243 – 1251. [Article gratuit PMC] [PubMed]
58. Strack S, RB McNeill, RJ Colbran. Mécanisme et régulation de la protéine kinase II calcium / calmoduline-dépendante ciblant la sous-unité NR2B du récepteur N-méthyl-D-aspartate. J Biol Chem. 2000; 275: 23798 – 23806. [PubMed]
59. Ulery-Reynolds PG, MA Castillo, Vialou V, Russo SJ, Nestler EJ. La phosphorylation de DeltaFosB détermine sa stabilité in vivo. Neuroscience. 2009; 158: 369 – 372. [Article gratuit PMC] [PubMed]
60. Ulery PG, Nestler EJ. Régulation de l'activité de transcription de DeltaFosB par la phosphorylation de Ser27. Eur J Neurosci. 2007; 25: 224 – 230. [PubMed]
61. Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ. Régulation de la stabilité du DeltaFosB par phosphorylation. J Neurosci. 2006; 26: 5131 – 5142. [PubMed]
62. Vialou V, et al. DeltaFosB dans les circuits de récompense du cerveau assure la résilience au stress et aux réponses des antidépresseurs. Nat Neurosci. 2010; 13: 745 – 752. [Article gratuit PMC] [PubMed]
63. Wang L, Z Z, Hu Z, Sheng J, Hui B, Sun J, Ma L. L'acétylation H3 induite par la cocaïne et l'activation de la transcription de CaMKIIalpha dans le noyau accumbens sont essentielles à la motivation pour le renforcement de la drogue. Neuropsychopharmacologie. 2010; 35: 913 – 928. [Article gratuit PMC] [PubMed]
64. Werme M, Messer C, Olson L, Gilden L, Thoren P, Nestler EJ, Brene S. Delta FosB régule la roue. J Neurosci. 2002; 22: 8133 – 8138. [PubMed]
65. Winstanley CA, LaPlant Q, Theobald DE, Green TA, Bachtell RK, Perrotti LI, DiLeone RJ, Russo SJ, Garth WJ, Self DW, Nestler EJ. L'induction de DeltaFosB dans le cortex orbitofrontal induit une tolérance au dysfonctionnement cognitif induit par la cocaïne. J Neurosci. 2007; 27: 10497 – 10507. [PubMed]
66. Zachariou V, CA Bolanos, DE Selley, D. Theobald, député de Cassidy, MB Kelz, T Shaw-Lutchman, O Berton, LJ Sim-Selley, RJ Dileone, Kumar A, EJ Nestler. Un rôle essentiel pour DeltaFosB dans le noyau accumbens dans l’action de la morphine. Nat Neurosci. 2006; 9: 205 – 211. [PubMed]
67. Zhang R, Khoo MS, Wu Y, Yang Y, Grueter CE, Ni G, Prix EE, Jr, Thiel W, Guatimosim S, Chanson LS, Madu EC, Shah AN, Vishnivetskaya TA, Atkinson JB, Gurvich VV, Salaman G, Salama G, Lederer WJ, Colbran RJ, Anderson ME. L'inhibition de la calmoduline kinase II protège contre les maladies cardiaques structurelles. Nat Med. 2005; 11: 409 – 417. [PubMed]