L'augmentation de l'activité de la kinase 5 dépendant de la cycline entraîne une atténuation de la signalisation de la dopamine par la cocaïne (2005)

Proc Natl Acad Sci US A. 2005 Février 1; 102(5): 1737-1742.

Publié en ligne 2005 Janvier 21. doi:  10.1073 / pnas.0409456102
PMCID: PMC547862
Neuroscience
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Abstrait

La cocaïne, une drogue d'abus, augmente les niveaux de dopamine synaptique dans le striatum en bloquant la recapture de la dopamine aux extrémités des axones. La kinase cycline-dépendante 5 (Cdk5) et son activateur p35, protéines impliquées dans la phosphorylation de substrats dans des neurones postmitotiques, se sont révélés être régulés positivement après une exposition chronique à la cocaïne. Pour examiner plus en détail les effets de l'induction de Cdk5 et de p35 sur la signalisation striatale de la dopamine, nous avons généré deux lignées de souris transgéniques indépendantes dans lesquelles Cdk5 ou p35 étaient surexprimés spécifiquement dans les neurones. Nous rapportons ici que l'activité accrue de Cdk5, résultant de p35 mais pas de la surexpression de Cdk5, conduit à une atténuation de la signalisation de la dopamine induite par la cocaïne. Une phosphorylation accrue de la dopamine et de la phosphoprotéine régulée par l'AMPc, de masse moléculaire 5 kDa (DARPP-32) à Thr-32, s'accompagnait d'une diminution de la phosphorylation de DARPP-75 à Thr-32. La phosphorylation accrue induite par Cdk34 de la kinase kinase 5 régulée par le signal extracellulaire au niveau de Thr-1 était accompagnée d'une activation réduite de la kinase 286 / 1 régulée par le signal extracellulaire. Ces effets ont contribué à l'atténuation de la phosphorylation induite par la cocaïne de la protéine de liaison aux éléments de réponse à l'AMPc, ainsi qu'à une moindre induction de c-fos dans le striatum. Ces résultats confortent l'idée selon laquelle l'activité de Cdk2 est impliquée dans l'expression génique altérée après une exposition chronique à la cocaïne et a donc un impact sur les modifications durables de la fonction neuronale sous-jacente à la dépendance à la cocaïne.

Mots clés: dépendance à la cocaïne, phosphorylation, striatum

La cocaïne augmente les niveaux de dopamine synaptique dans le striatum et modifie l’expression des gènes dans les neurones dopaminoceptifs en activant les voies intracellulaires qui propagent le signal initial du récepteur D1 de la dopamine au noyau (1). L'exposition chronique à la cocaïne régule à la hausse plusieurs facteurs de transcription, ce qui entraîne des modifications durables de l'expression des gènes qui seraient à la base des adaptations neuronales de la dépendance à la cocaïne (2). ΔFosB, identifié comme tel facteur de transcription (3), a été montré pour améliorer la réactivité comportementale des animaux à la cocaïne (4, 5). Par conséquent, l’identification des gènes cibles régulés par l’induction du ΔFosB devrait contribuer à une meilleure compréhension du mécanisme moléculaire sous-jacent à la dépendance à la cocaïne. Récemment, il a été démontré que le traitement chronique des animaux à la cocaïne régulait positivement l’expression de la kinase dépendante de la cycline 5 (Cdk5) et de son activateur p35 dans le striatum par induction du ΔFosB (6, 7).

Cdk5 appartient à la famille des sérine / thréonine kinases Cdk. Contrairement aux autres Cdks, principaux régulateurs de la progression du cycle cellulaire, Cdk5 est principalement impliqué dans la phosphorylation de substrats dans les neurones postmitotiques. (8). La spécificité neuronale de l’activité de Cdk5 est obtenue par l’association de ses activateurs, p35 ou p39, qui sont principalement exprimés dans les neurones postmitotiques (8). En plus du rôle essentiel de Cdk5 dans le développement du cerveau (9, 10), Ett a également été impliqué dans la transmission dopaminergique dans le cerveau postnatal (11, 12). L'inhibition de l'activité de Cdk5 entraîne une libération accrue de dopamine dans le striatum, indiquant une fonction présynaptique de Cdk5 en tant que régulateur négatif de la libération de dopamine (11). De plus, Cdk5 module l'efficacité de la signalisation postsynaptique de la dopamine en phosphorylant la phosphoprotéine régulée par la dopamine et l'AMPc, la masse moléculaire 32 kDa (DARPP-32) chez Thr-75, qui convertit DARPP-32 en un inhibiteur de la kinase dépendante de l'AMPc (PKA) (12).

Ces observations suggèrent que Cdk5 et p35 sont des régulateurs en aval de l'activation prolongée de la signalisation de la dopamine après une exposition chronique à la cocaïne et donc à une dépendance à la cocaïne. Pour aborder davantage le rôle de Cdk5 dans la signalisation striatale de la dopamine, nous avons généré deux lignées de souris transgéniques dans lesquelles Cdk5 ou p35 étaient surexprimés spécifiquement dans les neurones sous le contrôle du promoteur p35. Nos résultats ont indiqué que l'activité de Cdk5 était régulée à la hausse avec des niveaux accrus de protéine p35 mais pas de protéine Cdk5, ce qui suggère que le niveau de protéine p35 est limitant pour l'activité de Cdk5. Nous fournissons ici in vivo la preuve que l'activité accrue de Cdk5, résultant de la surexpression de p35, atténue la signalisation de la dopamine induite par la cocaïne au noyau par l'inhibition de la PKA et la cascade de kinases à régulation de signal extracellulaire (ERK).

Matériels et méthodes

Anticorps. Les anticorps polyclonaux dirigés contre Cdk5 (C-8) et p35 (C-19) ont été achetés chez Santa Cruz Biotechnology. Les anticorps dépendants de la phosphorylation et indépendants de la kinase ERK (MEK) 1 / 2, ERK1 / 2 et la protéine de liaison à l'élément AMPc-réponse (CREB) ont été obtenus auprès de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Les anticorps anti-phospho-Thr-34 DARPP 32 (13), phospho-Thr-75 DARPP-32 (12), total DARPP-32 (12) et c-fos (14) ont été utilisés comme décrit. Un anticorps contre l'actine a été acheté chez Sigma.

Animaux expérimentaux. Nous avons précédemment cloné le gène de la souris p35 Cdk5r1, qui code pour la protéine p35 et caractérise sa structure génomique (15). Pour générer la souris transgénique avec une surexpression neuronale de p35 (Tgp35), le 6-kb EcoRI-EcoLe fragment RI contenant la région promotrice 1.2-kb a été sous-cloné dans un plasmide pGEM9Z (-) et un marqueur 45-pb dérivé de SV40 a été inséré dans le plasmide. KpnJe site en aval du poly (A+) signal (Fig. 1A). La balise contenait un SpeJe site pour le génotypage des animaux. Le fragment 6-kb a été excisé du plasmide et purifié, suivi par une injection pronucléaire du transgène pour générer les souris transgéniques. Examiner le profil d'expression du transgène sous le contrôle régulateur du promoteur p1.2 35-kb in vivo, une souris double transgénique (Tgp35; p35 - / -) a ensuite été générée en utilisant une stratégie de reproduction en deux étapes au moyen de laquelle la souris Tgp35 a été régénérée dans un arrière-plan endogène p35. Les autres modèles de souris utilisés dans cette étude comprenaient p35 +/–, p35 - / -, Cdk5 +/– et une souris transgénique avec surexpression neuronale de Cdk5 (TgCdk5)9, 16, 17). Les génotypes de ces souris ont été déterminés en effectuant une analyse par transfert de Southern ou une PCR sur de l'ADN génomique isolé des biopsies de la queue. Les souris ont été logées dans un cycle d'obscurité 12-h light / 12-h. Tous les soins ont été prodigués conformément aux directives des National Institutes of Health sur le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire et des animaux d'expérimentation.

Figue. 1.  

Génération de souris transgéniques avec surexpression neuronale de p35 dirigée par le promoteur p35 (Tgp35). (A) La construction transgénique est représentée avec les structures schématiques des allèles p35 de type sauvage et ciblés. Les barres rouges indiquent la sonde utilisée pour le génotypage. ...

Analyse Southern Blot. L’ADN génomique extrait des biopsies de la queue a été digéré avec EcoRI et SpeJ'ai soumis à une électrophorèse sur un gel d'agarose 0.9% et transféré sur une membrane de nylon. La membrane a été hybridée avec une solution amorcée de manière aléatoire. 32Sonde marquée par P à 42 ° C pendant la nuit. La sonde 485-bp pour le génotypage des souris knock-out p35 (p35 - / -) et Tgp35 a été générée par PCR en utilisant les amorces suivantes: 5′-ACATCCTGCTGCCACGGTGAC-3′ et 5′-CCACTGTA′A CCAACAACA La membrane hybride a été lavée deux fois dans 3 × SSC / 2% SDS à 0.1 ° C pour 42 min et deux fois à 10 × SSC / 0.1% SDS à 0.1 ° C pour 65 min et exposée à un film à rayons X.

Traitement médical. La cocaïne (Sigma) a été dissoute dans une solution saline stérile. Les animaux ont reçu une injection ip de cocaïne (15 mg / kg) ou d'un volume égal de solution saline à l'âge de 3 mois et ont été sacrifiés par décapitation à différents moments (15, 30, 60 et 120 min) après l'injection. Les cerveaux ont été rapidement retirés et refroidis dans du PBS glacé. Les striata ont ensuite été disséqués et soumis à une analyse par transfert Northern ou Western. Pour l'analyse immunohistochimique, des coupes striatales ont été obtenues chez la souris 2 h après l'injection.

Analyse Northern Blot. L'ARN total a été extrait du striata avec le réactif TRIzol (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) et soumis à une analyse par transfert de Northern comme décrit (18). Pour la détection de l'ARNm de c-fos, un fragment 189-bp de l'ADNc de c-fos de souris a été utilisé comme sonde, comme décrit ci-dessus (19). Les niveaux d'ARNm de c-fos ont été quantifiés en mesurant la densité optique de la bande spécifique en utilisant un système d'analyse d'image avec le logiciel d'image Nih, version 1.62.

Analyse Western Blot. Les tissus striatals ont été soumis à une sonication dans 1% SDS et bouillis pendant 10 min. La concentration en protéines dans chaque échantillon a été déterminée par dosage de protéines BCA (Pierce). Des quantités égales de protéines ont été séparées par SDS / PAGE avant d'être transférées sur une membrane de nitrocellulose. Les membranes ont été bloquées dans 1 × PBS contenant 5% lait écrémé et 0.05% Tween 20 et incubées avec des anticorps primaires pendant une nuit à 4 ° C. L'incubation avec des IgG anti-souris ou de lapin conjuguées à la peroxydase (Sigma) a été réalisée à la température ambiante pendant 60 min. Un signal a été détecté par chimioluminescence améliorée (Pierce) et les densités optiques des bandes ont été quantifiées comme décrit ci-dessus.

Cdk5 Kinase Assay. Des lysats striataux ont été préparés avec un tampon de lyse constitué de 50 mM Tris · HCl, pH 7.4 / 50 mM NaCl / 5 mM EDTA / 1% Triton X-100 / 1mMDTT / 1 mM de phénylméthylsulfonyle ml d'inhibiteurs de leupeptine / phosphatase (mélanges d'inhibiteurs de phosphatases I et II, Sigma). Les lysats ont été immunoprécipités avec des anticorps anti-Cdk1 (C-1) ou anti-p5 (C-8). Les immunoprécipités de Cdk35 ont été préparés par incubation de 19 μl du lysat (correspondant à 5 μg de protéine) avec un anticorps anti-Cdk300 (300 μg) pendant une nuit à 5 ° C, puis à une nouvelle incubation avec 3 μl de protéine Protein A (XNx). % de suspension dans le tampon de lyse; Santa Cruz Biotechnology) pour 4 h à 25 ° C. Pour la préparation d'immunoprécipités p50, 3 ul du lysat (correspondant à 4 mg de protéine) a été incubé avec un anticorps anti-p35 (500 μg) comme décrit ci-dessus. Les immunoprécipités ont été lavés deux fois avec le tampon de lyse et deux fois avec un tampon de kinase consistant en 1 mM Tris-HCl, pH 35 / 3 mM MgCl.2/ 1 mM EDTA / 1 mM EGTA / 1 mM DTT, remis en suspension dans 60 µl du tampon kinase. L’activité kinase a été mesurée en utilisant l’histone H1 comme substrat (18).

Immunohistochimie. Les souris ont été anesthésiées par des injections ip d’avertin (250 mg / kg, Fluka) et perfusées transcardialement avec du tampon phosphate de sodium 0.1 M, pH 7.4, suivies du fixateur tissulaire Streck (Streck Laboratories, La Vista, NE), fixateur non réticulant. Les cerveaux disséqués ont ensuite été fixés dans le même fixateur pendant une nuit à 37 ° C. Ensuite, les cerveaux ont été inclus dans de la paraffine, coupés en coupes coronales d'épaisseur 5 et soumis à une immunohistochimie en utilisant la technique du complexe avidine-biotine-peroxydase (Vector Laboratories) avec la diaminobenzidine comme substrat. Les sections ont été incubées avec un anticorps polyclonal purifié par affinité contre c-fos pendant une nuit à 4 ° C. La spécificité de la coloration a été évaluée par omission de l'anticorps primaire.

Resultats

Génération de souris transgéniques avec surexpression neuronale de p35. Le transgène utilisé pour augmenter l'expression neuronale de p35 comprenait le fragment 6-kb du gène p35 de souris cloné contenant le promoteur 1.2-kb et la séquence codante complète de p35 (Fig. 1 A). Les génotypes de souris ont été déterminés par analyse de Southern blot en utilisant une sonde conçue pour distinguer les souris p35 - / - et Tgp35 des souris de type sauvage (Fig. 1 A et B). Pour examiner l'expression du transgène sous le contrôle du promoteur p1.2 de 35-kb, nous avons généré des souris doubles transgéniques (Tgp35; p35 - / -) dans lesquelles l'expression de p35 était uniquement tirée du transgène. L’expression de p35 chez les souris Tgp35; p35 - / - n’a été observée que dans le cerveau (Fig. 1C), où le motif d’expression spatiale était similaire à celui des souris de type sauvage (Fig. 1D). L’absence de p35 a entraîné une structure de stratification anormale dans le cortex cérébral et l’hippocampe de souris (10). Cependant, les souris Tgp35; p35 - / - ont montré une récupération complète du phénotype cérébral p35 - / - (Fig. 1E). Ces données ont indiqué que le promoteur p1.2 35-kb contrôlait l'expression du transgène avec un profil d'expression similaire à celui de p35 à partir du gène p35 endogène.

Le niveau de protéine p35 limite le débit pour la régulation à la hausse de l'activité de Cdk5. Nous avons examiné les effets posologiques des gènes codant pour p35 et Cdk5 sur l’expression protéique dans des extraits striataux provenant de p35 - / -, p35 +/–, de type sauvage, Tgp35, Cdk5 +/– et TgCdkXUMX à l’âge de X-XXX. Les taux de protéines p5 et Cdk3 étaient bien corrélés avec les doses du gène, respectivement (Fig. 2 A et B). Les souris Tgp35 ont présenté une augmentation du taux de protéine p1.6 multipliée par 1 par rapport aux souris de type sauvage, alors que les niveaux de protéine Cdk35 n'étaient pas affectés par les différents niveaux de protéine p5. Les souris TgCdk35 ont présenté une augmentation du niveau de la protéine Cdk5 multipliée par x par rapport aux souris de type sauvage, alors que les niveaux de la protéine p1.9 n'étaient pas affectés par les différents niveaux de la protéine Cdk5. Pour examiner les effets de différentes quantités de la protéine p35 sur l'activité de Cdk5, Cdk35 a été immunoprécipité à partir d'extraits striataux avec un anticorps anti-Cdk5 et l'activité de kinase a été mesurée. De même, pour examiner les effets de différentes quantités de la protéine Cdk5 sur l'activité de la kinase, p5 a été immunoprécipité à partir d'extraits striataux avec un anticorps anti-p5 et l'activité de la kinase a été mesurée. L’activité de Cdk35 est bien corrélée avec le niveau de protéine p35 mais pas avec le niveau de protéine Cdk5 (Fig. 2 C et D). Ces résultats indiquent que la quantité de protéine p35 est un facteur limitant de l'activité de Cdk5. Nous avons donc utilisé des souris Tgp35 pour étudier les effets d'une activité accrue de Cdk5 sur la signalisation striatale de la dopamine.

Figue. 2.  

La régulation à la hausse de l'activité de Cdk5 est limitée par le taux de protéine p35. (A) Western blots montrant que les niveaux de protéines de p35 et de Cdk5 sont en corrélation avec les dosages géniques des gènes de p35 et de Cdk5, respectivement. (B) Niveaux relatifs de la protéine p35 ou Cdk5 ...

La phosphorylation induite par la cocaïne de DARPP-32 au niveau de Thr-34 est atténuée chez les souris Tgp35. La fonction de DARPP-32 dépend de son état de phosphorylation sur plusieurs sites (20). La PKA phosphoryle DARPP-32 en Thr-34, alors que Cdk5 phosphoryle DARPP-32 en Thr-75. Ainsi, nous avons examiné l'état de phosphorylation de DARPP-32 dans des extraits striataux de souris de type sauvage et de souris Tgp35. Le taux de phospho-Thr-75 DARPP-32 était plus élevé chez les souris Tgp35 (Fig. 3A; 1.6 ± 0.2-fold au-dessus de la valeur des souris de type sauvage). Nous avons ensuite évalué les effets de l’activité accrue de Cdk5 sur la signalisation striatale de la dopamine. Nous avons examiné l'activation de la PKA induite par la cocaïne chez des souris Tgp35 en analysant l'état de phosphorylation de DARPP-32 au niveau de Thr-34. Le niveau de phospho-Thr-34 DARPP-32 a augmenté chez les souris de type sauvage 15 min après l'injection de cocaïne (Fig. 3B; 1.8 ± 0.2-fold au-dessus du niveau basal). Cependant, l'effet de la cocaïne sur la phosphorylation de DARPP-34 par Thr-32 a été atténué chez les souris Tgp35 (1.2 ± 0.3 au-dessus du niveau de base). Ces résultats indiquent qu’une augmentation de l’activité de Cdk5 atténue l’activation de la PKA induite par la cocaïne, probablement par la phosphorylation de DARPP-32 au niveau de Thr-75 (6, 12). Il est également possible qu'une augmentation de l'activité présynaptique de Cdk5 entraîne une diminution de la libération de dopamine, contribuant ainsi à réduire l'effet de la cocaïne. Notamment, une seule injection de cocaïne n’a eu aucune incidence sur les taux de protéines p35 et Cdk5, ni sur l’activité de la kinase (Fig. 3 C et D). Ceci contraste avec une étude précédente dans laquelle l'exposition chronique à la cocaïne régulait positivement l'expression de p35 et de Cdk5 (6).

Figue. 3.  

La régulation à la hausse de l'activité de Cdk5 augmente le niveau de phospho-Thr-75 DARPP-32 et atténue l'activation de la PKA induite par la cocaïne. (A) Immunoblot montrant une augmentation de la phosphorylation de DARPP-32 au niveau de Thr-75 (P-D32 Thr-75) dans des extraits striataux de souris Tgp35. Dans ...

La régulation à la hausse de l'activité de Cdk5 atténue l'activation induite par la cocaïne d'ERK1 / 2. Des preuves récentes indiquent que l'activation des récepteurs de la dopamine dans le striatum active également d'autres cascades de signalisation, y compris la voie ERK (21, 22), qui joue un rôle important dans la réponse comportementale à la cocaïne (23). Nous avons donc examiné si l'activité de Cdk5 pouvait affecter l'activation de la voie ERK induite par la cocaïne. L'activation de la voie ERK a été observée après injection de cocaïne dans des extraits striataux de souris de type sauvage, comme en témoigne l'augmentation de la phosphorylation de MEK1 / 2 à Ser-217 et Ser-221 (1.5 ± 0.2-fold au-dessus du niveau basal) et d'ERK1 / 2 à Thr-202 et Tyr-204 (Phosphorylation d’ERK2: 1.5 ± 0.2-fold au-dessus du niveau basal) (Fig. 4 A et B). Cependant, l'activation induite par la cocaïne de MEK1 / 2 (1.2 ± pli supérieur au niveau basal) et de ERK0.2 / 1 (phosphorylation ERK2: 2 ± pli supérieur au niveau basal) a été atténuée dans Tgp1.2 (mp)Fig. 4 A et B). De plus, les taux basaux de phospho-ERK1 / 2 étaient plus bas chez les souris Tgp35 (0.8 ± 0.2-fold inférieur à la valeur des souris de type sauvage), alors que cette tendance n’était pas statistiquement significative. Ce dernier résultat pourrait être attribué à la phosphorylation de MEK5 dépendante de Cdk1 au niveau de Thr-286, entraînant une diminution de l'activité catalytique (24). Pour évaluer cette possibilité, nous avons examiné l'état de phosphorylation de MEK1 au niveau de Thr-286 et avons constaté que des taux plus élevés de phospho-Thr-286, MEK1, étaient présents dans les extraits striataux de souris Tgp35 (Fig. 4C; 1.3 ± 0.1-fold au-dessus de la valeur des souris de type sauvage). En outre, l'état de phosphorylation de MEK1 au niveau de Thr-286 n'a ​​pas été modifié par une seule injection de cocaïne, ce qui concorde avec la conclusion selon laquelle l'activité du Cdk5 n'a ​​pas été affectée par le traitement (Fig. 3D).

Figue. 4.  

L'inhibition de MEK5 / 1 induite par Cdk2 entraîne une atténuation de l'activation induite par la cocaïne de ERK1 / 2. Des extraits striataux ont été préparés à partir de souris de type sauvage (WT) et Tgp35 15 min après l’injection de cocaïne ou de solution saline et soumis à un immunoblot ...

La propagation de la signalisation de la dopamine au noyau est atténuée par l’activité accrue de Cdk5. L'activation induite par la cocaïne de plusieurs cascades de signalisation impliquant PKA et ERK entraîne l'activation ultérieure du facteur de transcription CREB dans le noyau par le biais de sa phosphorylation sur Ser-133 (22, 25). Afin de déterminer si les effets inhibiteurs médiés par Cdk5 sur les cascades d'activation de PKA et ERK pourraient converger sur la phosphorylation de CREB dans le noyau, nous avons examiné l'état de phosphorylation de CREB chez Ser-133 dans des extraits striataux de souris de type sauvage et de souris Tgp35. Le niveau basal de phospho-CREB était plus bas chez les souris Tgp35 (0.7 ± 0.1-fold de la valeur des souris de type sauvage) (Fig. 5). En réponse à une injection de cocaïne, le niveau de phospho-CREB a augmenté dans le striatum de souris de type sauvage (1.5 ± 0.1 fois au-dessus du niveau basal), mais cette réponse à la cocaïne a été atténuée chez les souris Tgp35 (1.2 ± 0.1- pli au-dessus du niveau basal) (Fig. 5).

Figue. 5.  

La régulation à la hausse de l'activité de Cdk5 entraîne une diminution de la phosphorylation de CREB chez Ser-133 chez des souris avec injection de solution saline ou de cocaïne. Des extraits striataux ont été préparés à partir de souris de type sauvage (WT) et Tgp35 30 min après l’injection et soumis à un immunoblot ...

La phosphorylation de CREB chez Ser-133 augmente son activité transcriptionnelle via un élément de réponse à l'AMPc dans la région promotrice de certains gènes, y compris le gène c-fos (26). Nous avons donc examiné l'induction de c-fos dans le striatum de souris sauvages et de souris Tgp35 après une injection de cocaïne. Chez les souris de type sauvage, le niveau d'ARNm de c-fos a atteint une valeur maximale (1.8 ± multiplié par X au-dessus du niveau basal) 0.2 min après l'injection de cocaïne, puis est revenu au niveau basal par 30 min après l'injection (Fig. 6 A et B). Cependant, les taux d’ARNm de c-fos étaient 30% plus bas chez les souris Tgp35 que chez les souris de type sauvage jusqu’à 30 min après l’injection (Fig. 6 A et B). L’immunohistochimie a également corroboré l’induction moins importante de c-fos chez les souris Tgp35 (Fig. 6 C-F). L’administration de cocaïne a augmenté l’immunoréactivité de c-fos, fortement dans les parties dorsomédo-dorsocentrales du striatum et faiblement dans les parties latérales, chez les souris de type sauvage et Tgp35. Cependant, l’augmentation du nombre de cellules immuno-positives c-fos induite par la cocaïne a été considérablement atténuée dans le striatum des souris Tgp35 (Fig. 6G). Ensemble, ces résultats ont indiqué que l'amélioration de la signalisation de dopamine striatale à médiation par la cocaïne était inhibée chez les souris Tgp35, résultat probable d'une activité accrue de Cdk5.

Figue. 6.  

La régulation à la hausse de l'activité de Cdk5 entraîne une diminution de l'expression striatale du c-fos et une induction moindre après l'administration de cocaïne. (A) Northern blot montrant l'évolution dans le temps de l'induction de c-fos chez des souris de type sauvage (WT) et Tgp35 (Tg) après une injection de cocaïne. ...

Discussion

Cdk5 et son activateur p35 ont été identifiés comme gènes cibles qui sont régulés positivement par l'exposition chronique à la cocaïne (6). Nous rapportons ici des preuves qu'une augmentation de l'activité de Cdk5, résultant de la régulation à la hausse de p35 plutôt qu'à celle de Cdk5, conduit à une atténuation de la signalisation de la dopamine par la cocaïne dans les neurones du striatum. Pour examiner les conséquences de l'expression régulée positivement de Cdk5 ou de p35 sur la signalisation striatale de la dopamine, deux lignées de souris transgéniques, les souris TgCdk5 et Tgp35, ont été analysées. Nous avons constaté que l'activité de Cdk5 était régulée à la hausse proportionnellement à l'augmentation du niveau de protéine p35, mais n'était pas affectée par l'augmentation du niveau de protéine Cdk5. Notre précédent rapport avait également démontré que l'activité de Cdk5 dans le cerveau de souris TgCdk5 était inférieure à celle d'un cerveau de souris de type sauvage lorsque l'activité était mesurée à l'aide d'immunoprécipités de Cdk5 (17), suggérant que la surexpression de Cdk5 entraîne une augmentation du taux de Cdk5 monomère si le niveau de p35 n’est pas augmenté. Ces résultats indiquent que le taux de protéine p35 est un facteur limitant de l'activité de Cdk5.

Les souris Tgp35 ont présenté une induction moindre de la phosphorylation de CREB et du c-fos dans le striatum après une injection aiguë de cocaïne, ce qui suggère que la réponse striatale à la cocaïne était inhibée par une activité accrue de Cdk5. L'atténuation de la signalisation de la dopamine à médiation par la cocaïne chez les souris Tgp35 a probablement été obtenue par l'inhibition à médiation par Cdk5 de plusieurs cascades de signalisation impliquant DARPP-32, PKA et ERK. L'administration de cocaïne a augmenté la phosphorylation de la PKA de DARPP-32 au niveau de Thr-34 chez des souris de type sauvage, alors que cette réponse était atténuée chez les souris Tgp35. La phosphorylation par la PKA de DARPP-32 au niveau de Thr-34 inhibe l’activité de la protéine phosphatase 1 (PP1), l’enzyme responsable de la déphosphorylation de Ser-133 de CREB (27). Ainsi, l'activité de PP1 ne serait pas antagonisée via la voie DARPP-32 / PP1 chez les souris Tgp35.

L'activation de ERK1 / 2 induite par la cocaïne a également été atténuée chez les souris Tgp35. Cdk5 pourrait inhiber l'activation induite par la cocaïne d'ERK1 / 2 selon plusieurs mécanismes. Premièrement, la phosphorylation dépendant de Cdk5 de DARPP-32 au niveau de Thr-75 pourrait inhiber la PKA, entraînant une inhibition ultérieure de toute activation de MEK1 / 2 médiée par la PKA nécessaire à l'activation de ERK1 / 2. Une étude récente a également montré que la phosphorylation de DARPP-32 au niveau de Thr-34 était nécessaire pour l'activation de ERK1 / 2 par la cocaïne par de multiples voies impliquant une régulation indirecte de l'activation de la MEK ainsi que la régulation de la phosphatase enrichie en striatum, une tyrosine phosphatase qui agit directement sur ERK1 / 2 (28). Cette possibilité est corroborée par la découverte que la phosphorylation de MEK1 / 2 induite par la cocaïne chez Ser-217 et Ser-221 a été supprimée chez les souris Tgp35. Une autre voie probable est la phosphorylation de MEK5 dépendant de Cdk1 au niveau de Thr-286, ce qui entraînerait une diminution de son activité catalytique et conduirait à une inhibition de l'activité de ERK1 / 2 (24).

Il a été démontré que l’inhibition de l’activité de Cdk5 dans le striatum potentialise les effets comportementaux du traitement chronique de la cocaïne chez l’animal (6). Conforme à l'hypothèse selon laquelle la régulation à la hausse de l'activité de Cdk5 pourrait contribuer à l'adaptation neuronale pour contrecarrer les effets d'une administration répétée de cocaïne (6), nous avons constaté que la phosphorylation de DARPP-5 et MEK32 induite par Cdk1 contribuait à atténuer l’activation de ERK1 / 2 induite par la cocaïne, ce qui induisait une induction moindre de la phosphorylation de CREB et de c-fos dans le striatum. Nos résultats corroborent l'idée selon laquelle une augmentation de l'activité de Cdk5, résultant de la régulation à la hausse de p35, peut altérer l'expression des gènes dans le striatum après une exposition chronique à la cocaïne. Cela peut se produire par le biais de changements dans les activités des facteurs de transcription tels que CREB et c-fos. Ainsi, l'activateur de Cdk5, p35, en raison de ses effets limitants sur l'activité de Cdk5, peut contribuer à des modifications durables de la fonction neuronale sous-jacente à la dépendance à la cocaïne.

Remerciements

Nous remercions les Drs. Mary Jo Danton, Philip Grant et Sashi Kesavapany pour leur lecture critique du manuscrit. Ce travail a été financé par Subvention Z01DE00664-05 (à ABK), Instituts nationaux de la santé, Subvention du service de santé publique américain DA10044 et des subventions de la Simons Foundation, de la Fondation Peter J. Sharp et de la Picower Foundation (à PG).

Notes

Abréviations: Cdk5, kinase dépendante de la cycline 5; ERK, kinase extracellulaire à signal régulé; DARPP-32, phosphoprotéine régulée par la dopamine et l'AMPc, masse moléculaire 32 kDa; PKA, kinase dépendante de l'AMPc; MEK, ERK kinase; CREB, protéine de liaison aux éléments de réponse à l'AMPc.

Références

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