L'exercice à long terme est un déclencheur puissant pour l'induction du ΔFosB dans l'hippocampe le long de l'axe dorso-ventral (2013)

PLoS One. 2013 nov 25; 8 (11): e81245. doi: 10.1371 / journal.pone.0081245.

Nishijima T, Kawakami M, Kita I.

Identifier

Laboratoire de physiologie comportementale, École supérieure de sciences de la santé humaine, Université métropolitaine de Tokyo, Tokyo, Japon.

Abstract

L'exercice physique améliore plusieurs aspects de la fonction hippocampique. Conformément à la notion selon laquelle l'activité neuronale est la clé de la promotion des fonctions neuronales, la littérature antérieure a constamment démontré que les périodes d'exercice intense provoquaient une activation neuronale dans l'hippocampe. Des stimuli d'activation répétés conduisent à une accumulation du facteur de transcription ΔFosB, qui intervient dans la plasticité neuronale à long terme.

Dans cette étude, nous avons testé l'hypothèse selon laquelle une course volontaire à long terme de la roue induit l'expression de ΔFosB dans l'hippocampe et avons examiné les éventuels effets spécifiques à une région dans les sous-champs de l'hippocampe le long de l'axe dorso-ventral. Des souris mâles C57BL / 6 ont été logées avec ou sans roue de roulement pendant des semaines 4. L’utilisation prolongée de la roue a considérablement augmenté l’immunoréactivité FosB / ΔFosB dans toutes les régions de l’hippocampe mesurées (c.-à-d. dans les sous-champs DG, CA1 et CA3 de l'hippocampe dorsal et ventral). Les résultats ont confirmé que l’exécution d’une roue induisait l’expression spécifique de l’immunoréactivité FosB / ΔFosB dans le cortex, ce qui suggère que l’augmentation uniforme de FosB / ΔFosB dans l’hippocampe n’est pas une conséquence non spécifique de la course. Les données de transfert Western ont indiqué que l'augmentation de l'immunoréactivité FosB / ΔFosB de l'hippocampe était principalement due à une augmentation de ΔFosB. Ces résultats suggèrent que l'exercice physique à long terme est un puissant déclencheur de l'induction du ΔFosB dans l'ensemble de l'hippocampe, ce qui expliquerait pourquoi l'exercice peut améliorer les fonctions dépendantes de l'hippocampe dorsal et ventral. De manière intéressante, nous avons trouvé que l’expression FosB / ΔFosB dans la DG était positivement corrélée au nombre de neurones immunoréactifs (c’est-à-dire immatures) de la doublécortine.

Bien que les mécanismes par lesquels ΔFosB intervient dans la neurogenèse induite par l'exercice demeurent incertains, ces données impliquent que la neurogenèse induite par l'exercice dépend au moins de l'activité. Pris ensemble, nos résultats actuels suggèrent que ΔFosB est une nouvelle cible moléculaire impliquée dans la régulation de la plasticité de l'hippocampe induite par l'exercice.

Introduction

L’exercice confère divers avantages aux aspects moléculaires, structurels et fonctionnels de l’hippocampe chez les rongeurs [1,2], dont certains ont été soutenus par des études humaines [3,4]. Cependant, les mécanismes sous-jacents aux modifications de la plasticité de l'hippocampe induites par l'exercice ne sont pas suffisamment compris. La littérature précédente a constamment démontré que l'exercice évoque l'activation neuronale de l'hippocampe chez les rongeurs. Des études immunohistochimiques utilisant le c-Fos, marqueur de l'activation neuronale transitoire, ont montré que, lors du fonctionnement forcé ou volontaire, l'expression accrue de c-Fos dans le gyrus denté (DG), CA1 et CA3 de l'hippocampe du rongeur [5-7]. De plus, une étude antérieure utilisant la débitmétrie laser-Doppler (LDF) a démontré que le tapis roulant léger fonctionnant avec une augmentation du débit sanguin cérébral régional (rCBF), un marqueur alternatif de l'activation neuronale, dans le sous-champ CA1 chez le rat [8]. Les études immunohistochimiques permettent des analyses détaillées par région après la cessation de l'exercice, tandis que les LDF permettent un suivi en temps réel de la FBC dans une zone localisée pendant l'exercice. Malgré les avantages et les limites de chaque étude, ces études ont démontré de la même manière un effet d'épisodes aigus d'exercice sur l'activité neuronale de l'hippocampe. Ces résultats suggèrent un mécanisme par lequel un exercice régulier à long terme favorise la plasticité de l'hippocampe en déclenchant de manière répétée l'activation neuronale [9].

Le facteur de transcription ΔFosB, un isoforme d'épissage tronqué du FosB de longueur totale, est induit par divers types de stimuli répétés dans des régions spécifiques du cerveau, où il s'accumule progressivement du fait de sa stabilité unique (demi-vie de plusieurs semaines) [10-12]. De plus en plus de preuves démontrent que des niveaux accrus de ΔFosB induisent une plasticité neuronale et comportementale de longue durée associée à des stimuli particuliers [11,13]. Par exemple, l’administration chronique de drogues abusives telles que la cocaïne et la morphine augmente généralement l’expression de ΔFosB dans le noyau accumbens, ce qui représente l’un des mécanismes moléculaires à la base d’une sensibilité accrue à ces drogues. [11,14,15]. Sde façon similaire à d’autres stimuli de récompense, y compris un régime alimentaire riche en graisses et une expérience sexuelle [16,17], lLa course volontaire à la roue à long terme a également augmenté l'immunoréactivité de FosB / ΔFosB dans le noyau accumbens du rat, ce qui suggère que la course volontaire est une récompense naturelle pour les rongeurs. [18,19]. Cependant, à notre connaissance, aucune littérature n'a examiné si une exposition répétée à un exercice physique induisait l'expression de ΔFosB dans l'hippocampe. Parce que l'exercice déclenche l'activation neuronale dans l'hippocampe, nous avons émis l'hypothèse qu'une course volontaire à long terme de la roue induirait également l'expression de ΔFosB dans l'hippocampe. Bien que les mécanismes exacts par lesquels ΔFosB régule la plasticité de l'hippocampe restent incertains, des études ont montré que les souris dépourvues de FOSB neurogenèse de l’hippocampe avec une altération du comportement de type dépression20,21]. jeEn effet, l’exercice est réputé améliorer la neurogenèse et avoir des propriétés antidépressives. [22-25]. jeSi notre hypothèse est correcte, ΔFosB serait une nouvelle cible moléculaire potentielle médiant la plasticité de l'hippocampe induite par l'exercice.

L’hippocampe présente un gradient anatomique et fonctionnel le long de son axe longitudinal (dorso – ventral) [26]. L’hippocampe dorsal joue un rôle essentiel dans l’apprentissage et la mémoire spatiaux [27,28], alors que l’hippocampe ventral est impliqué de préférence dans la régulation des comportements émotionnels [29,30]. De plus, des études ont démontré que les stimuli physiologiques induisent différents modèles d’expression de c-Fos dans les parties dorsale et ventrale de l’hippocampe [31-33]. Parce que l'exercice améliore les deux dorsaux [34-37] et les fonctions dépendantes de l'hippocampe ventral [24,25,38], il est important d’examiner si une course volontaire à long terme provoque une expression spécifique de la région de ΔFosB dans l’hippocampe.

L’hypothèse principale de cette étude était que la course volontaire à long terme des roues induirait l’expression de ΔFosB dans l’hippocampe de souris. L'immunohistochimie FosB / ΔFosB a étudié cette hypothèse dans les sous-champs de l'hippocampe dorsal et ventral, DG, CA1 et CA3, en mettant davantage l'accent sur l'identification de l'induction spécifique à la région. Les résultats ont été confirmés par Western blot, qui a été utilisé pour identifier l'isoforme de FOSB produits géniques induits dans l'hippocampe. Nous avons également examiné le cortex pour l'induction de FosB / ΔFosB spécifique à la région afin d'éliminer la possibilité qu'un exercice à long terme induise une immunoréactivité accrue de FosB / ΔFosB dans le cerveau. Enfin, l'association corrélative entre l'expression de FosB / ΔFosB et la neurogenèse a été étudiée comme première étape dans la recherche des implications fonctionnelles de l'induction de ΔFosB induite par l'exercice dans la régulation de la plasticité de l'hippocampe.

Matériels et méthodes

1: Déclaration sur les animaux et l'éthique

Vingt souris C57BL / 6 mâles (semaines 8) ont été achetées à un éleveur commercial (SLC, Shizuoka, Japon). Dix souris ont été utilisées pour l'expérience 1 et les dix autres pour l'expérience 2. Les souris ont été hébergées dans des conditions contrôlées de température (22 – 24 ° C) et de lumière (cycle lumière / obscurité 12 / 12-h, lumière allumée à 0500), et ont reçu de la nourriture et de l'eau. ad libitum. Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par le Comité d’éthique expérimental sur les animaux de l’Université métropolitaine de Tokyo.

À chaque expérience, à leur arrivée, les souris ont été assignées de manière aléatoire à un groupe de contrôle (Control, n = 5) ou à un groupe actif (Runner, n = 5). Au cours de la première semaine, toutes les souris ont été logées dans des cages en plastique standard en groupes (souris 5 / cage) pour une acclimatation initiale. Ensuite, les souris Runner ont été transférées dans une cage équipée d'une roue de roulement (ENV-046, Med Associate Inc., Géorgie, Vermont, États-Unis). On sait que l'isolement social supprime la neurogenèse induite par l'exercice dans l'hippocampe [39], Les souris Runner ont été hébergées en groupe (souris / cage 5) pendant plusieurs semaines supplémentaires. Le nombre de rotations des roues a été enregistré chaque matin et le poids corporel (g) a été mesuré chaque semaine.

2: Expérience 1. Examen immunohistochimique de l'expression de FosB / ΔFosB et de la neurogenèse de l'hippocampe

2.1: Perfusion et traitement des tissus

Le matin (0900 – 1100) après le dernier jour de la période de rodage, les souris ont été profondément anesthésiées avec du pentobarbital sodique et perfusées transcardialement avec une solution saline froide. Le cerveau a été rapidement retiré et post-fixé dans 4% paraformaldéhyde dans une solution saline tamponnée au phosphate 0.1 M (PBS, pH 7.4) pendant une nuit. Le cerveau a ensuite été cryoprotégé dans 30% saccharose dans du PBS et congelé jusqu'au traitement ultérieur. Des coupes coronales du cerveau (40, um) d'un hémisphère ont été obtenues à l'aide d'un microtome à congélation et recueillies dans du PBS contenant du 0.01% d'azide de sodium.

2.2: Immunohistochimie

Une série de coupes sur six a été sélectionnée de manière aléatoire pour l'immunocoloration FosB / AFosB. Une série adjacente a été utilisée pour le marquage de la doublecortine (DCX), un marqueur de neurones immatures validé pour l’évaluation de la neurogenèse [40,41]. Après avoir éteint l’activité de la peroxydase endogène avec 1% H₂O₂ dans du PBS, les sections en suspension libre ont été préincubées avec une solution de blocage contenant 10% de sérum de cheval normal dans du PBS pour 2 h. Après rinçage dans du PBS, les coupes ont été incubées avec un anticorps pan-FosB polyclonal de lapin (1: 1000, sc-48, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) dilué dans du PBS avec 0.5% Triton X-100 et 0.5% BSA (PBST). -BSA) pour 24 h à 4 ° C. Une autre série de coupes a été incubée avec un anticorps anti-DCX polyclonal de chèvre (1: 500, sc-8066, Santa Cruz) dans PBST-BSA pour 48 h à 4 ° C. Les coupes ont ensuite été incubées avec un anticorps secondaire biotinylé approprié (IgG de lapin, 1: 1000, AP182B; IgG de chèvre, 1: 1000, AP180B, les deux anticorps de EMD Millipore, Billerica, MA, USA) dans PBST-BSA. pour 2 h à la température ambiante. Les coupes ont ensuite été traitées avec le complexe avidine-biotine-peroxydase (kit Vectastain ABC peroxydase, Vector Laboratories Inc., Burlingame, Californie, États-Unis) pendant un minimum de 90 conformément aux instructions du fabricant. Les antigènes ont finalement été visualisés avec 0.02% 3,3-diaminobenzidine (DAB) dans du 0.1 M Tris-HCl (pH 7.6) contenant 0.01% H₂O₂. Pour l'immunomarquage FosB / AFosB, la réaction a été intensifiée avec du sulfate de nickel ammonium. Pour la coloration à la DCX, les noyaux des cellules ont été contre-colorés avec la coloration de Nissl. Les coupes ont été montées sur des lames revêtues de gélatine et des lamelles ont été placées.

2.3: Quantification de l'immunoréactivité FosB / ΔFosB en utilisant le seuillage d'image

L'anticorps pan-FosB utilisé dans cette étude a été dirigé contre une région interne commune aux régions N-terminale de FosB et ΔFosB, de sorte qu'il est impossible de discriminer entre les deux isoformes. Par conséquent, les structures immunocolorées ont été décrites comme des noyaux immunoréactifs FosB / AFSB (FosB / AFSB-ir). Pour une quantification à l'aveugle non biaisée, les lames ont été codées avant l'analyse. Atlas du cerveau de souris [42] a été utilisé pour identifier l'emplacement des régions d'intérêt (ROI) suivantes: couche de cellules granulaires (GCL) de DG (sections 3), couche de cellules pyramidale de CA1 (sections 3) et CA3 (sections 2 – 3) dans l'hippocampe dorsal (fermé à -2.2 mm du bregma); DG (sections 2), CA1 (sections 2) et CA3 (sections 2) dans l'hippocampe ventral (fermé à -3.4 mm du bregma) (Figure 4, la gauche). Les sections caudales contiennent les parties dorsale et ventrale de l'hippocampe, mais la partie ventrale a été ciblée. Dans le DG, les lames suprapyramidal (DGsp) et infrapyramidal (DGip) ont été analysées séparément. Cortex moteur (coupes 2 – 3, proches de -0.6 mm du bregma), cortex cortical somatosensoriel (coupes 2 – 3, fermées à -0.6 du bregma), cortex visuel (coupes 3, fermées à -2.9) bregma), le cortex auditif (sections 3 fermées à -2.9 mm du bregma) et le bulbe olfactif (sections 3 fermées à + 4.3 mm du bregma) ont également été analysés (Figure 6, la gauche).

Une corrélation significative a été trouvée entre la surface FosB / ΔFosB-ir (% ROI) obtenue par seuillage d’image et la densité des noyaux FosB / ΔFosB-ir (noyaux / mm²) obtenu par comptage manuel.

Quantification de la surface FosB / ΔFosB-ir dans les ROI de l'hippocampe.

Les images numériques (pixels 2070 × 1548) de chaque retour sur investissement ont été prises à l'aide d'un microscope optique (BX-51, Olympus, Tokyo, Japon) équipé d'une caméra CCD (DP-73, Olympus) et d'un logiciel d'imagerie (cellSens, Olympus). le grossissement de l'objectif était de 10 × pour les ROI de l'hippocampe et 4 × pour les ROI de la corticale. Afin d’identifier l’immunoréactivité FosB / ΔFosB de modérée à forte (Figure 1D – G), en utilisant plusieurs sections à l’avance, les paramètres d’acquisition d’images (intensité lumineuse, taille de la limite de trame, durée d’exposition et balance des blancs) et les niveaux de seuil de chacun des composants RVB ont été optimisés pour les ROI hippocampiques et corticales. L'analyse suivante a ensuite été réalisée dans les conditions optimisées (1). Les ROI ont été sélectionnés par un polygone de forme irrégulière (Figure 1A, B) (2). L'image a été seuil, ce qui a converti les noyaux FosB / ΔFosB-ir en une couleur rouge (Figure 1C-G) (3). Le% ROI a ensuite été automatiquement calculé comme suit:% ROI = (surface convertie (en rouge) / surface totale de retour sur investissement) × 100.

Images représentatives illustrant les étapes de l'analyse par seuillage d'image de l'immunoréactivité FosB / ΔFosB.

Pour valider cette analyse de seuillage d'image, les régions 20 ont été sélectionnées de manière aléatoire dans différentes zones du cerveau avec différentes tailles de région. En plus de la quantification du seuil d’image, le nombre de noyaux FosB / ΔFosB-ir dans les régions sélectionnées a été compté manuellement et la densité des noyaux FosB / ΔFosB-ir a été obtenue en divisant le nombre de noyaux FosB / ΔFosB-ir par les valeurs mesurées. surface (mm²).

2.4: Quantification des neurones immatures DCX-ir dans le gyrus denté

Les neurones immatures de DCX-ir dans le DG de souris Runner étaient abondants et se chevauchaient, ce qui rend difficile le comptage précis du nombre discret de soma de DCX-ir à l'aide d'un microscope optique. Cependant, dans une étude précédente, l'analyse Sholl pour l'évaluation morphologique avait montré que chaque neurone DCX-ir avait, en moyenne, une seule dendrite mesurée dans 40 µm du soma [43]. Par conséquent, l'analyse originale suivante a été développée pour permettre la quantification par région des neurones DCX-ir.

(1) Une image de la GCL a été projetée sur un écran d'ordinateur à l'aide d'un logiciel de traitement de l'image et d'un objectif 40 × (2). Sur l’image en direct, un segment de droite (150 ± 0.1 µm) a été tracé le long du milieu de la GCL (Figure 2) (3). Modification de la profondeur focale, nombre de fois où le segment de ligne a traversé des dendrites DCX-ir ont été comptés (4). Les ROI (DGsp dorsale, dDGsp; DGip dorsale, dDGip; DGsp ventral, vDGsp; DGip ventral, vDGip) correspondaient aux régions où l’immunoréactivité FosB / ΔFosB a été analysée (5). Dans chaque retour sur investissement, les segments de la ligne 2 – 3 ont été dessinés par section et le nombre de croisements a été calculé en moyenne sur les sections 2 – 3 par souris. Du fait que l'épaisseur de la GCL est d'environ 60 – 80 μm, le nombre de croisements doit refléter le nombre de neurones DCX-ir dans la région restreinte analysée.

Figure 2
Une image représentative de neurones immatures DCX-ir et un segment de droite (150 ± 0.1 µm) superposés pour compter le nombre de croisements avec les dendrites DCX-ir.

3. Expérience 2. Identification de l'isoforme FosB / ΔFosB induite par le roulement des roues

3.1: Perfusion et traitement des tissus

Une autre cohorte de souris a été traitée comme ci-dessus dans l'expérience 1. Après plusieurs semaines d’exécution, les souris ont été perfusées transcardialement avec une solution saline froide sous anesthésie profonde. L'hippocampe a été rapidement disséqué et congelé avec de l'azote liquide et stocké à -4 ° C. Les hippocampes de chaque souris ont été homogénéisés dans du tampon RIPA (80 mM NaCl, 150 mM Tris-HCl pH 25, 7.6% NP-1, 40% de désoxycholate de sodium, 1% SDS, #0.1%, XXUMX, Thermo Scientific, IL, USA) contenant du protease inhibiteurs (cOmplete Mini, Roche, Manheim, Allemagne). Les lysats ont été centrifugés pendant 8990 min à la vitesse de rotation de 15 à 5000 ° C et les surnageants ont été recueillis. Les concentrations en protéines ont été mesurées avec un kit BCA Protein Assay (#4, Thermo Scientific, IL, USA).

3.2: Western blot

Des quantités égales de protéine (30, μg / voie) ont été électrophoresées sur un gel 10% Polyacrylamide, puis transférées sur une membrane de PVDF (Immun-Blot, 0.2, Bio-Rad, MD, USA). La liaison non spécifique a été bloquée en pré-incubant la membrane pour 1 h dans TBST (0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.1% Tween-20) contenant 3% BSA. La membrane a été incubée avec l'anticorps pan-FosB (1: 1000) utilisé ci-dessus pour l'immunohistochimie, dissous dans du TBST contenant 3% BSA. Après des lavages avec du TBST, la membrane a été incubée avec un anticorps IgG anti-lapin conjugué à la HRP (1: 5000 dans TBST, NA934, GE Healthcare, Buckinghamshire, Royaume-Uni) pendant 1 h à température ambiante. Après lavage avec du TBST, les bandes de protéines ont été visualisées par incubation avec Enhanced Chemiluminescence (Western Lightning Plus-ECL, PerkinElmer, MA, États-Unis) et capturées à l'aide d'un LAS 4000 mini Image Quant (GE Healthcare, Buckinghamshire, Royaume-Uni). La membrane a ensuite été reprobée avec un anticorps anti-glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) (#2275, 1: 5000 dans TBS-T, Trevigen, MD, USA) comme contrôle de chargement. La densité optique des bandes de protéines a été quantifiée à l’aide d’Image-J et normalisée au niveau de GAPDH.

4: Analyse statistique

Les modifications du poids corporel de la souris ont été analysées par ANOVA à mesures répétées dans les deux sens (groupe × temps). Un test t non apparié a été utilisé pour déterminer les différences statistiques entre les groupes (contrôle vs. Runner). L'analyse de corrélation de Pearson a été utilisée pour valider l'analyse d'immunoréactivité FosB / ΔFosB (comptage manuel en fonction du seuillage d'image) et pour examiner l'association entre le niveau d'expression de FosB / ΔFosB et le nombre de croisements de DCX dans la DG. Les données ont été présentées sous forme de moyenne ± SEM. Le seuil de signification statistique a été fixé à P <0.05.

Résultats

1: poids corporel et distance de course dans les expériences 1 et 2

Les changements de poids corporel des souris Control et Runner dans les expériences 1 et 2 sont regroupés et illustrés dans Figure 3. Une ANOVA à mesures répétées bidirectionnelles a indiqué une interaction significative (groupe × temps, F(4, 72) = 13.6, P <0.001) et effet principal du groupe F(1, 18) = 6.07, P <0.05), indiquant un poids corporel significativement plus faible chez les souris Runner. La distance parcourue par cage est indiquée dans Tableau 1. Bien que la distance de fonctionnement précise de chaque souris soit incertaine car les souris étaient logées ensemble, une observation régulière a confirmé que toutes les souris effectuaient fréquemment une course de roue. Les souris Runner de l'expérience 2 ont fonctionné plus longtemps que celles de l'expérience 1, mais la distance de course moyenne (m / jour / cage) était la même tout au long de chaque expérience.

Modification du poids corporel des souris Control et Runner de l'expérience 1 et 2.

Distance de course quotidienne moyenne pour chaque semaine pendant la période de marche de 4.

2: Validation de la quantification de l'immunoréactivité FosB / ΔFosB à l'aide du seuillage d'image

Il existait une corrélation significative entre la zone FosB / ΔFosB-ir obtenue par seuillage de l’image et la densité des noyaux FosB / ΔFosB-ir obtenue par comptage manuel (r = 0.941, P <00001, Figure 4).

3: immunoréactivité FosB / ΔFosB dans l'hippocampe

Des images représentatives de l’immunomarquage FosB / ΔFosB dans les sous-champs dorsal et ventral de l’hippocampe ont été montrées dans Figure 5. Dans toutes les ROI analysées, l’immunoréactivité FosB / ΔFosB chez la souris Runner (Figure 5, à droite) était qualitativement plus élevé que celui des souris Control (Figure 5, centre). Chez les souris Runner, l’analyse quantitative indique une augmentation significative de la surface FosB / ΔFosB-ir dans les deux zones dorsales (DGsp: P <0.01; DGip: P <0.01; CA1: P <0.05; CA3: P <0.05) et les sous-champs de l'hippocampe ventral (DGsp: P <0.01; DGip: P <0.05; CA1: P <0.05; CA3: P <0.05; Figure 6).

Images représentatives de l'immunomarquage FosB / ΔFosB dans les ROI de l'hippocampe dorsal et ventral.

4: immunoréactivité FosB / ΔFosB dans le cortex

Des images représentatives de l’immunomarquage FosB / ΔFosB dans les ROI corticales sont présentées en Figure 7. L’analyse quantitative a révélé des modifications de l’immunoréactivité FosB / ΔFosB dépendantes de la région sur le long terme (Figure 8). Chez les souris Runner, la surface FosB / ΔFosB-ir était significativement plus élevée dans le cortex moteur (P <0.05) et le cortex somatosensoriel en barillet (P <0.05), mais pas dans le cortex visuel (P = 0.662) ou le bulbe olfactif (P = 0.523). Dans le cortex auditif, l’aire FosB / ΔFosB-ir tend à augmenter chez la souris Runner (P = 0.105).

Images représentatives de l'immunomarquage FosB / ΔFosB dans les ROI corticales.

Quantification de la surface FosB / ΔFosB-ir dans les ROI corticales.

5: Neurogenèse

Des images représentatives de l’immunocoloration de DCX sont présentées dans la section Figure 9. Dans l’hippocampe dorsal, immunoréactivité de DCX chez la souris Runner (Figure 9, à droite) était qualitativement plus élevé que celui des souris témoins (Figure 9, la gauche). Comparée à l'hippocampe dorsal, l'immunoréactivité de DCX dans l'hippocampe ventral était plus faible chez les souris témoins et les souris Runner. Chez les souris Runner, le nombre de croisements était significativement plus élevé dans le dDGsp (P <0.01) et dDGip (P <0.01; Figure 10). Dans l'hippocampe ventral, le nombre de passages chez les souris Runner avait tendance à augmenter, mais il n'y avait pas de différence significative entre les groupes (vDGsp, P = 0.101; vDGip, P = 0.257; Figure 10).

Images représentatives de l'immunomarquage à la DCX-ir de la DG dorsale et ventrale obtenues à partir des cerveaux des souris Control et Runner, respectivement.

Quantification des neurones immatures DCX-ir dans le DG.

6: Corrélation entre l'expression de FosB / ΔFosB et la neurogenèse

Une analyse de corrélation a été réalisée entre la zone FosB / ΔFosB-ir et le nombre de croisements DCX (Figure 11). Étant donné que chaque ensemble de données (par exemple, DGsp dorsal dans les souris de contrôle) est constitué uniquement de paires 5, l'analyse a d'abord été réalisée avec toutes les paires 40. Curieusement, il existait une corrélation significative entre la zone FosB / ΔFosB-ir et le nombre de croisements DCX (r = 0.885, P <0.0001). De plus, une corrélation significative a également été identifiée lorsque la DG dorsale (r = 0.762, P <0.05) et la DG ventrale (r = 0.816, P <0.01) ont été analysés séparément.

Association corrélative entre l'expression de FosB / ΔFosB et la neurogenèse.

7: Identification de l'isoforme FosB / ΔFosB induite par un fonctionnement à long terme

Enfin, pour identifier l’isoforme de FOSB Produits de gènes induits dans l'hippocampe en réponse à une course à long terme, les hippocampes d'une cohorte supplémentaire de souris ont été soumis à un transfert de Western avec le même anticorps pan-FosB. Plusieurs bandes de 35 – 37 kDa, représentant des isoformes modifiées de ΔFosB [44], ont été significativement augmentés chez les souris Runner versus Control (Figure 12, P <0.01). D'autre part, l'isoforme FosB de 48 kDa était indétectable dans les deux groupes. Une autre bande faiblement visible au-dessus de 25 kDa représente probablement l'isoforme Δ2ΔFosB (27 kDa). Il y avait deux autres bandes, à plus de 50 kDa et 37 kDa, qui étaient très probablement en raison d'une liaison non spécifique. Une fois quantifiées, aucune différence n'a été trouvée dans ces bandes non-AFosB entre les groupes (données non présentées).

Identification des isoformes de le FOSB produit du gène induit par la course à long terme.

a lieu

En résumé, la présente étude a tout d’abord effectué une analyse immunohistochimique pour examiner 1) si le roulage volontaire à long terme de la roue induit l’expression de FosB / ΔFosB dans l’hippocampe; et 2) si une réponse spécifique à la région existe le long de son axe dorso – ventral.

Quatre semaines de roulage volontaire ont induit une augmentation significative de l'immunoréactivité FosB / ΔFosB dans toutes les régions de l'hippocampe analysées (à savoir les sous-champs DG, CA1 et CA3 des parties dorsale et ventrale de l'hippocampe). Nous avons confirmé que l’isoforme 35 – 37kDa ΔFosB était la principale FOSB produit de gène s’accumulant en réponse à la course à long terme. Ces résultats corroborent clairement l'hypothèse selon laquelle un exercice régulier à long terme est un puissant déclencheur de l'induction du ΔFosB dans tout l'hippocampe et que son induction pourrait être un nouveau mécanisme moléculaire par lequel l'exercice affecte divers types de fonctions dépendantes de l'hippocampe dorsal et / ou ventral.

1: Validation et limites de la quantification de l'immunoréactivité FosB / ΔFosB à l'aide du seuillage d'image

Une technique de seuillage d'image, largement utilisée dans les études immunohistochimiques pour compter le nombre de cellules cibles et pour évaluer la morphologie des cellules, a été adoptée dans cette étude pour la quantification spécifique de la région de l'immunoréactivité FosB / ΔFosB [15,45,46]. Une corrélation significative entre les niveaux d’immunoréactivité FosB / ΔFosB quantifiés par seuillage d’image et par comptage manuel a été démontrée (Figure 4). Cependant, comme la densité et le chevauchement empêchaient de compter le nombre de noyaux FosB / ΔFosB-ir dans les zones très denses, la corrélation démontrée n'implique la précision de la méthode de seuillage d'image que lorsque les zones FosB / ΔFosB-ir représentent <~ 40% du ROI total zone. Par conséquent, une interprétation prudente est nécessaire pour les zones FosB / ΔFosB-ir> 40% de la zone ROI totale.

En particulier, dans le DG des souris Runner (Figure 4), L’expression FosB / ΔFosB était fortement induite par le roulement des roues et la plupart des noyaux FosB / ΔFosB-ir se chevauchaient. Dans ces zones, l'induction accrue de l'expression de FosB / ΔFosB entraîne une sous-estimation plus importante du niveau d'expression, quelle que soit la méthode de quantification utilisée (seuillage de l'image ou comptage manuel). Cependant, malgré le risque de sous-estimation, il est important de noter que la présente étude a démontré avec succès une augmentation significative de la surface FosB / ΔFosB-ir chez les souris DG de Runner. Cela suggère que les limitations méthodologiques ne compromettent pas nos résultats. Au lieu de cela, la sous-estimation potentielle augmente la fiabilité de la conclusion selon laquelle le fonctionnement à long terme augmente l'immunoréactivité FosB / ΔFosB dans l'hippocampe.

2: Induction uniforme de ΔFosB dans l’hippocampe à long terme

L’hippocampe présente des gradients anatomiques et fonctionnels le long de son axe longitudinal [26], donc pour la présente étude, l’immunoréactivité FosB / ΔFosB dans les parties dorsale et ventrale de l’hippocampe a été analysée séparément. Les données ont démontré que l’exécution à long terme de manière uniforme augmentait l’expression de FosB / ΔFosB dans toutes les ROI de l’hippocampe mesurées. Cette induction uniforme de l'immunoréactivité FosB / ΔFosB pourrait être non spécifiquement causée par des modifications métaboliques systémiques associées à une course à long terme. Cependant, il est important de noter qu'il y a eu des augmentations de l'immunoréactivité FosB / ΔFosB spécifiques à la région dans le cortex. Ce résultat est corroboré par les récents résultats montrant qu’un épisode aigu de tapis roulant entraînant une augmentation du débit sanguin cérébral régional dans l’hippocampe, mais pas dans le bulbe olfactif [8]. De plus, Rhodes et al. (2003) a démontré que l'expression de c-Fos au cours d'une journée volontaire de roue par 7 dans le DG et CA2 / 3 de l'hippocampe (CA1 n'a pas été mesurée) et dans le cortex sensoriel, mais pas dans le cortex visuel [47]. Prises ensemble, ces études suggèrent que l'induction uniforme de l'expression de FosB / ΔFosB dans l'hippocampe n'est pas une conséquence non spécifique d'une course à long terme. Fait intéressant, Hawley et al. a récemment rapporté que le stress chronique imprévisible augmentait l'expression de FosB / ΔFosB dans le DG de l'hippocampe de dorsal, mais pas dans le ventral [48]. Après des recherches plus poussées, les schémas distincts d'induction de FosB / ΔFosB, tels que ceux induits par l'exercice ou le stress, fourniront des informations continues sur les impacts dépendants du stimulus sur l'hippocampe.

L'anticorps primaire pan-FosB utilisé dans cette étude est reconnu pour reconnaître toutes les isoformes des protéines FosB. Après analyse par transfert Western, nous avons constaté que les seules isoformes ayant augmenté dans l'hippocampe après une longue période étaient les isoformes modifiées de ΔFosB (35 – 37 kDa), les seules isoformes stables parmi les protéines de la famille Fos [11]. Cette découverte est conforme aux travaux antérieurs utilisant un anticorps pan-Fos pour démontrer que 35 – 37 kDa ΔFosB est la protéine prédominante de la famille Fos induite dans le cortex frontal par le stress chronique [44]. Par conséquent, l'augmentation de l'immunoréactivité FosB / ΔFosB de l'hippocampe induite ici par une course à long terme reflète très probablement le niveau de ΔFosB.

On en sait moins sur les effets de l'exercice sur des régions spécifiques sur les aspects moléculaires et structurels de l'hippocampe. Cependant, de nombreuses études comportementales indiquent un potentiel considérable d'amélioration induite par les fonctions hippocampique dorsale et ventrale. Il a été démontré que l’exercice améliore l’apprentissage spatial et la mémoire [34-38] et le traitement spatial et contextuel dépend principalement de l’hippocampe dorsal [27,28]. En revanche, on sait également que l'exercice exerce des propriétés anxiolytiques et antidépressives [24,25,38] et ces réponses émotionnelles sont principalement régulées par l’hippocampe ventral [29,30]. L'induction uniforme de ΔFosB par la course à long terme observée dans cette étude suggère qu'une certaine forme de modifications neuroplastiques s'est produite dans l'ensemble de l'hippocampe. Cela expliquerait pourquoi l'exercice peut affecter les fonctions dépendantes de l'hippocampe dorsal et ventral.

3: Analyse par région de la neurogenèse induite par l'exercice

Une dissociation fonctionnelle de la neurogenèse entre l'hippocampe dorsal et ventral attire également de plus en plus l'attention [49]. Dans cette étude, tirant parti des caractéristiques morphologiques des neurones immatures de DCX-ir [43], nous avons compté le nombre d'intersections entre les dendrites DCX-ir et un segment de droite tracé au milieu de la GCL. Cette mesure ne fournissait pas le nombre total de neurones DCX-ir dans la DG, mais elle permettait la quantification spécifique à la région nécessaire pour mener une analyse de corrélation avec les données d'expression FosB / ΔFosB (voir ci-dessous). Après une course de longue durée, le nombre de neurones DCX-ir a augmenté de manière significative dans le DG dorsal, mais pas dans le ventral. Cela suggère que l'exercice pourrait stimuler la neurogenèse de manière plus frappante dans la partie dorsale que dans la partie ventrale de la DG. Cependant, des études antérieures avaient rapporté des résultats contradictoires dans lesquels la rotation de la roue augmentait la neurogenèse dans les DG dorsale et ventrale [50,51]. Dans la présente étude, le nombre de croisements DCX-ir dans la DG ventrale avait tendance à augmenter avec la course, bien que la petite taille de l'échantillon (souris 5 par groupe) puisse avoir limité la capacité à détecter une différence statistiquement significative entre les groupes. Par conséquent, il est probablement prématuré d’exclure la possibilité que la course volontaire à la roue puisse stimuler la neurogenèse de l’hippocampe ventral. D'autres études détaillées sont nécessaires pour comprendre la spécificité régionale de la neurogenèse induite par l'exercice en ce qui concerne son processus en plusieurs étapes (prolifération cellulaire, différenciation, migration et survie).

4: Implications fonctionnelles de l'induction ΔFosB induite par l'exercice pour la régulation de la plasticité de l'hippocampe

Enfin, comme première étape dans la reconnaissance des implications fonctionnelles de l’induction du ΔFosB induit par l’exercice dans l’hippocampe, nous avons examiné la relation entre l’immunoréactivité FosB / ΔFosB et les croisements DCX-ir dans les DG dorsale et ventrale et avons mis en évidence une corrélation significative les deux variables. Bien que les mécanismes exacts par lesquels ΔFosB régule la neurogenèse induite par l'exercice restent incertains, une étude récente a montré que FOSBsouris -null, dépourvues de FosB, ΔFosB et Δ2ΔFosB (toutes les FOSB neurogenèse basale de l’hippocampe, y compris une diminution de la prolifération des cellules progénitrices neuronales, une augmentation de la migration ectopique des neurones du nouveau-né et des structures DG anormales [20]. Cependant, ces altérations n’ont pas été observées chez FOSB(d / d) souris dépourvues de FosB, mais pas de ΔFosB / Δ2ΔFosB. Fait intéressant, dans FOSBsouris, expression de certains gènes liés à la neurogenèse, y compris Vgf (Facteur de croissance nerveuse VGF inductible) et Fille Prépropeptide de Galanin) ont été régulés négativement [20]. Puisque le VGF et le GAL sont des molécules sécrétoires, une proposition qui semble prometteuse considère que les neurones exprimant ΔFosB peuvent réguler la neurogenèse par le biais d’une activité autocrine / paracrine [20].

De plus, il convient de noter que la région où ΔFosB est induit en effectuant un chevauchement spatial avec la région où l'activité neurogène est élevée. Cette découverte suggère que la neurogenèse induite par l'exercice est au minimum dépendante de l'activité. L’activation neuronale est la clé pour maintenir et améliorer la fonction du système nerveux central [9], par le biais de mécanismes incluant l’expression et la libération de facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF) [52,53], absorption du facteur de croissance 1 (IGF-1) dans le sérum par la barrière hémato-encéphalique [54,55], suppression de l'apoptose [56] et la régulation de la motilité mitochondriale [57]. Par conséquent, la présente étude suggère qu'un exercice à long terme a déclenché une activation neuronale répétée, ce qui est évident dans l'augmentation de l'expression de ΔFosB, ce qui contribue à améliorer la plasticité de l'hippocampe, potentiellement par le biais de ces multiples mécanismes décrits ci-dessus.

La présente étude a uniquement évalué la neurogenèse induite par l'exercice et son association avec l'expression de FosB / ΔFosB dans le DG. Cependant, une immunoréactivité FosB / ΔFosB a également été induite dans les sous-champs CA1 et CA3. Bien que d'autres études soient nécessaires pour mieux comprendre les rôles fonctionnels de l'expression de ΔFosB induite par l'exercice dans ces sous-champs, la littérature antérieure offre une possibilité prometteuse. Guan et al. (2011) a démontré que l'ablation spécifique de la kinase dépendante de la cycline 5 (Cdk5) dans les neurones pyramidaux CA1 ou CA3 altérait la consolidation ou la récupération de la mémoire, respectivement [58]. Fait intéressant, le Cdk5 est la cible en aval de ΔFosB [59] et participe à la régulation de la plasticité synaptique [60]. Par conséquent, l'expression de ΔFosB induite par l'exercice pourrait être impliquée dans la régulation de la plasticité synaptique par l'activation de Cdk5 dans les sous-champs CA1 et CA3.

Conclusion

Alors que l'on savait que des périodes d'activité physique aiguë induisaient l'expression de protéines de gènes précoces immédiates dans l'hippocampe, la présente étude fournit la première preuve qu'un exercice régulier à long terme induit de manière significative l'expression de ΔFosB dans l'ensemble de l'hippocampe. ThL’induction uniforme de ΔFosB confirme la compréhension actuelle selon laquelle l’exercice est une intervention non pharmacologique efficace capable d’améliorer les fonctions multiples de l’hippocampe. Associées à la corrélation significative entre l'expression de FosB / ΔFosB et la neurogenèse, ces données sont provocantes et indiquent la nécessité de poursuivre les études définissant le rôle de ΔFosB dans la médiation des effets de l'exercice sur la fonction de l'hippocampe, y compris la neurogenèse.

Déclaration de financement

Cette étude a été financée par une subvention d'aide aux jeunes scientifiques du ministère de l'Éducation, de la Culture, des Sports, de la Science et de la Technologie du Japon à TN (#23700775). Les bailleurs de fonds n'ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publication ou la préparation du manuscrit.

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