PSMC5, une ATPase protéasomal de 19S, régule l'action de la cocaïne dans le noyau accumbens (2015)

PLoS One. 2015 mai 11; 10 (5): e0126710. doi: 10.1371 / journal.pone.0126710. eCollection 2015.

Ohnishi YH1, Ohnishi YN2, Nakamura T3, Ohno M4, Kennedy PJ5, Yasuyuki O6, Nishi A7, Jamais8, Tsuzuki T4, Nestler EJ5.

Abstrait

Le ΔFosB est un facteur de transcription stable qui s'accumule dans le noyau accumbens (NAc), un élément clé du circuit de récompense du cerveau, en réponse à une exposition chronique à la cocaïne ou à d'autres drogues d'abus. Alors que ΔFosB est connu pour s'hétérodimériser avec un membre de la famille Jun pour former un complexe de facteur de transcription actif, il n'y a pas eu à ce jour d'exploration ouverte d'autres partenaires de liaison possibles pour ΔFosB dans le cerveau. Ici, en utilisant des tests de levure à deux hybrides, nous identifions PSMC5-également connu sous le nom de SUG1, une sous-unité contenant l'ATPase du complexe protéasomal 19S-comme une nouvelle protéine interagissant avec ΔFosB. Nous vérifions ces interactions entre ΔFosB endogène et PSMC5 dans le NAc et démontrons que les deux protéines forment également des complexes avec d'autres protéines régulatrices de la chromatine associées à l'activation du gène. Nous montrons ensuite que la cocaïne chronique augmente les niveaux nucléaires, mais non cytoplasmiques, de PSMC5 dans la NAc et que la surexpression de PSMC5 dans cette région cérébrale favorise les réponses locomotrices à la cocaïne. Ensemble, ces résultats décrivent un nouveau mécanisme qui contribue aux actions de ΔFosB et, pour la première fois, implique le PSMC5 dans la plasticité moléculaire et comportementale induite par la cocaïne.

Citation: Ohnishi YH, Ohnishi YN, Nakamura T, Ohno M, PJ Kennedy, Yasuyuki O et al. (2015) PSMC5, une ATPase protéasomal de 19S, régule l'action de la cocaïne dans le noyau accumbens. PLoS ONE 10 (5): e0126710. doi: 10.1371 / journal.pone.0126710

Editeur académique: James Edgar McCutcheon, Université de Leicester, ROYAUME UNI

reçu: Décembre 10, 2014; Accepté: April 7, 2015; Publié le: 11 mai 2015

Droits d'auteur: © 2015 Ohnishi et al. Ceci est un article en accès libre distribué selon les termes de la Licence Creative Commons Attribution, qui autorise une utilisation, une distribution et une reproduction sans restriction sur tout support, à condition que l'auteur et la source d'origine soient crédités

Disponibilité des données: Toutes les données pertinentes sont dans le papier.

Financement: Ce travail a été financé par des subventions des Instituts nationaux de la santé, de l'Institut national de lutte contre l'abus des drogues, de la Fondation Ishibashi et de la Société japonaise pour la promotion de la science (numéros KAKENHI: 24591735, 26290064, 25116010). Les bailleurs de fonds n'ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publication ou la préparation du manuscrit.

Intérêts concurrents: Les auteurs ont déclaré qu'ils n'existaient pas de conflit d'intérêts.

Introduction

ΔFosB, un produit tronqué de la FosB Ce gène appartient à la famille des facteurs de transcription Fos, qui comprennent également c-Fos, FosB complet, Fra-1 et Fra-2. ΔFosB, comme les autres protéines Fos, s'hétérodimérise avec une protéine de la famille Jun - c-Jun, JunB ou JunD - pour former un complexe actif de facteur de transcription AP-1 (protéine activatrice-1), qui induit ou réprime l'expression de gènes cibles spécifiques [1,2].

Il a été démontré que ΔFosB joue un rôle clé dans la toxicomanie [2]. Parmi les protéines de la famille Fos, il s’accumule dans le noyau accumbens (NAc) et d’autres régions cérébrales liées aux récompenses après administration répétée de médicaments en raison de son haut niveau de stabilité [3,4], provoquée par l’absence de domaines de degron C-terminaux et par la phosphorylation de plusieurs protéines kinases [5-7]. Une telle induction de ΔFosB dans le NAc induit une augmentation des réponses comportementales aux drogues. Ainsi, la surexpression de ΔFosB dans cette région cérébrale d’animaux adultes, soit par l’utilisation de vecteurs viraux ou de souris bitransgéniques inductibles, augmente la sensibilité d’un animal aux effets locomoteurs activant et récompensant de la cocaïne et des opiacés, ainsi que sa motivation à s’auto-administrer. cocaïne [7-11]. Inversement, la surexpression d’antagonistes négatifs dominants de ΔFosB provoque les phénotypes comportementaux opposés [10-12].

Nous et d’autres avons précédemment confirmé, au moyen d’essais sur gel décalé, que JunD et peut-être d’autres protéines de la famille Jun sont les principaux partenaires de liaison de ΔFosB dans le cerveau in vivo [13-15]. Cependant, à ce jour, aucune évaluation impartiale et ouverte des partenaires de liaison de ΔFosB dans le cerveau n'a été réalisée. Ici, nous avons cherché à identifier de nouveaux partenaires de liaison pour ΔFosB en utilisant un dosage de deux hybrides de levure [16,17]. Nos données ont révélé que PSMC5, également connu sous le nom de SUG1, est un partenaire robuste de ΔFosB in vitro et dans le NAc in vivo, où il se joint à ΔFosB dans le cadre d’un complexe d’activation de la transcription induit par la cocaïne, qui contient également du CBP (protéine de liaison CREB). ) et p300 - les deux histones acétyltransférases (HAT) - ainsi que BRG1 (une protéine de remodelage de la chromatine). Nous montrons ensuite que l'exposition chronique à la cocaïne modifie les niveaux nucléaires de PSMC5, une sous-unité du complexe protéasomal 19S contenant de l'ATPase, et que PSMC5 contrôle à son tour les réponses comportementales à la cocaïne.

Matériel et méthodes

Criblage à deux hybrides de levure

Des cellules de levure MaV203 (Invitrogen Life Technologies) ont été co-transfectées avec pDBLeu entraînant différents fragments de la protéine ΔFosB, et une bibliothèque de cerveau de souris a été sous-clonée dans pPC86 (Invitrogen Life Technologies). Les cellules transformées ont été cultivées sur un milieu SC dépourvu de leucine, de tryptophane et d'histidine, et contenant 10 mM de 3-aminotriazole. La liaison entre des fragments de FosB et un partenaire candidat induit trois gènes rapporteurs (His3, Ura3et LacZ), et l’induction permet aux transformants de survivre dans les conditions de culture utilisées. Les clones positifs ont été retestés avec des fragments frais de pDBLeu-AFOSB par des essais de retransformation dans des cellules MaV203.

Lignées cellulaires

Les cellules de neuroblastome de souris Neuro 2A (ATCC) ont été maintenues dans le milieu essentiel minimum d'Eagle (EMEM) (ATCC), complété avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) à 37 ° C et 5% de CO2. Les cellules 1A de rat étaient un cadeau de Yusaku Nakabeppu (Fukuoka, Japon) [18] et maintenu dans le MEM (DMEM) (Life Technologies) de Dulbecco, complété par 10% FBS à 37 ° C et 5% CO2. La transfection de cellules avec l'ADN plasmidique a été réalisée en utilisant Effectene (Qiagen) selon les instructions du fabricant.

Constructions PSMC5 et ΔFosB

Plusieurs formes mutantes de PSMC5, chacune étiquetée FLAG au niveau de leur extrémité N-terminale, ont été générées pour être utilisées dans des expériences d'immunoprécipitation ou de transfert de gène à médiation virale. Ceux-ci comprennent: PSMC5-K196M, PSMC5-Δcoiled-coil domain (PSMC5-ΔCC, acides aminés manquants 27 – 68), PSMCXNNUMX-NT (composé du fragment N-terminal de la protéine, les acides aminés 5 – 1), et PSXXXX. -CT (composé du fragment C-terminal de la protéine, les acides aminés 151) (voir Fig 1). Nous avons également utilisé des formes N-terminales marquées par le MYC ΔFosB de type sauvage ainsi que ΔFosB avec une mutation de son domaine leucine-zipper (mutation des acides aminés 182 en 205, connue pour oblitérer l'hétérodimérisation avec les protéines de la famille Jun [6].

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Fig 1. ΔFosB se lie à PSMC5 in vitro.

 

A. Schéma de ΔFosB, ΔFosB-LZM dans lequel le domaine de fermeture éclair de leucine est muté pour effacer l'hétérodimérisation de ΔFosB avec les protéines Jun, et Δ2ΔFosB dépourvu des premiers acides aminés 78 de l'extrémité N osFosB. B. Schéma de PSMC5, PSMC5-NT, qui comprend les premiers acides aminés 151 de PSMC5, PSMC5-CT, dépourvus des premiers acides aminés 235 de PSMC5 et de PSMC5-ΔCC, dépourvus du domaine en spirale coïncidé (28 – XNX). . Le domaine AAA correspond à un motif, ATPases associé à diverses activités cellulaires, présent dans de nombreuses ATPases. C. 68 µg de pcDNA2.4-AFOSB (pistes 3.1 – 1) ou AFFBB-LZM (piste 4) a été co-transfecté avec 5 µg de PSMC2.4 marqués par FLAG ou de divers mutants de délétion dans des cellules NeuroXNXa. Deux jours après la transfection, les cellules ont été lysées et soumises à une immunoprécipitation avec un anticorps anti-FLAG, puis Western blotées avec un anticorps anti-AFOSB ou anti-FLAG. Notez que AFOSB, mais pas AFOSB-LZM, se lie de manière robuste à PSMC5 ou PSMC2-NT, mais pas à PSMC5-CT ni à PSMC5-ACC. Les données présentées sur la figure ont été répliquées en triple dans chacune des trois expériences séparées.

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Animaux

Des souris mâles C11BL / 57J âgées de neuf à dix semaines (The Jackson Laboratory) ont été utilisées pour toutes les expériences. Les animaux ont été logés dans un cycle lumière-obscurité 6-h avec accès à de la nourriture et à de l'eau ad libitum et ont été habitués 1 semaine avant l'expérimentation. Deux schémas thérapeutiques à la cocaïne ont été utilisés. Pour étudier les effets biochimiques de la cocaïne, les animaux ont reçu des doses quotidiennes de 7 de cocaïne (20 en mg / kg) ou de solution saline, et ont été éliminés par décapitation 24 après la dernière injection. Ceci est un protocole standard, qui a été montré pour produire de nombreuses réponses moléculaires et cellulaires au médicament [7]. Pour étudier l'influence de PSMC5 dans le noyau accumbens sur les réponses comportementales à la cocaïne, nous avons utilisé une dose inférieure au seuil du médicament (7.5 mg / kg; voir Sensibilisation locomotrice ci-dessous), en partant de l'hypothèse que PSMC5 augmenterait, comme le ΔFosB, la sensibilité de l'animal à cocaïne [8]. Toutes les expériences sur des animaux ont été approuvées par le comité de protection et d'utilisation des animaux de l'établissement, au mont Sinaï.

Immunoprécipitation et Western Blot

Les cellules Neuro 2A ont été transfectées avec des formes sauvages ou mutantes de PSMC5. Deux jours après la transfection, les cellules ont été lavées dans du PBS, lysées dans du tampon RIPA (50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 0.25% de sodium désoxycholate, 10 mM de sodium, butyrate de protease) . Les lysats ont été divisés et incubés avec des anticorps IgG non-immunes (Sigma) ou anti-FLAG (Sigma) contre 3 hr à 4 ° C. L’immunoprécipitation a été réalisée avec des billes de protéine G (Invitrogen) comme décrit [19]. En bref, les protéines immunoprécipitées ont été soumises à une SDS-PAGE et analysées par Western blot en utilisant un anticorps anti-FosB / ΔFosB (Cell Signaling Technology) basé sur les protocoles publiés7]. Pour les tests de liaison aux protéines in vivo, nous avons utilisé des fractions nucléaires purifiées provenant de souris NAc disséquées par un poinçon après un traitement chronique à la cocaïne (mg / kg IP par jour 20 par jour pendant 7, les souris ayant utilisé 24 h après la dernière injection). La co-immunoprécipitation à partir de fractions nucléaires a été réalisée à l'aide du kit de complexe nucléaire Co-IP (Active Motif) en suivant les instructions du fabricant. Les anticorps suivants ont été utilisés: MYC ou ß-actine, technologie de signalisation cellulaire (Danvers, MA), PSMC5 et histone H3, Abcam (Cambridge, MA), CBP, p300 et BRG1, Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), et DRAPEAU M2, Sigma.

Immunohistochimie

L'immunohistochimie a été réalisée conformément aux procédures publiées [20]. Les souris ont été anesthésiées et perfusées par voie intracardique avec 4% paraformaldéhyde dans du PBS. Le cerveau a été cryoprotégé avec 30% saccharose, puis congelé et stocké à -80 ° C jusqu'à son utilisation. Des coupes coronales (40, um) ont été coupées sur un cryostat et traitées pour l'immunohistochimie. Les sections flottantes ont été pré-incubées dans un tampon de blocage contenant 0.3% Triton et 3% sérum d'âne normal. ΔFosB a été détecté à l'aide d'un anticorps polyclonal de chèvre dirigé contre la partie N-terminale de la protéine (1 / 1000 Santa Cruz Biotechnology). PSMC5 a été détecté en utilisant un anticorps polyclonal de lapin (1 / 100 Abcam, Cambridge, MA). Les images ont été prises avec un microscope confocal (grossissement 60x; Zeiss).

Sensibilisation locomotrice

Toutes les souris ont reçu des injections IP quotidiennes de solution saline pendant les jours 3 afin de les habituer au stress des injections. Le lendemain, des souris ont reçu une solution saline ou une dose infime de cocaïne (7.5, mg / kg; voir Animaux ci-dessus) à des souris et ont été placées immédiatement dans de nouvelles boîtes locomotrices. L'activité locomotrice des souris a été enregistrée en utilisant un système de photobeam comme coupure du faisceau ambulatoire pour 30 min. Ces traitements ont été répétés quotidiennement pendant les jours 3.

Transfert de gène à médiation virale

Nous avons utilisé des méthodes largement publiées pour le transfert de gène à médiation virale [7,8,11,19]. En bref, les plasmides d'expression de PSMC5 ou de plusieurs de ses mutants (voir les constructions PSMC5 et AFOSB ci-dessus) ont été sous-clonés dans le plasmide bicistronique p1005 (+) HSV exprimant GFP sous le contrôle du promoteur du CMV, et PSMC5 ou ses mutants sous celui de la IE4 / 5 promoteur. Sous anesthésie à la kétamine (100 mg / kg) / xylazine (10 mg / kg), les souris ont été placées dans un instrument stéréotaxique de petit animal et la surface crânienne a été exposée. Trente-trois aiguilles de seringue de calibre ont été utilisées pour infuser bilatéralement 0.5 μl d’un vecteur HSV dans le NAc à un angle 10 ° (AP + 1.6; ML + 1.5; DV -4.4) à un débit de 0.1 μl / min. Les animaux recevant des injections de HSV ont été autorisés à récupérer pendant 2 jours après la chirurgie avant l'expérimentation.

Données statistiques

Des ANOVA et des tests t de Student ont été utilisés, corrigés pour des comparaisons multiples, avec une signification fixée à p <0.05.

Resultats

PSMC5: nouveau partenaire de liaison de ΔFosB

Nous avons effectué des expériences préliminaires pour identifier un fragment approprié de ΔFosB qui a servi d'appât dans un test de double hybride sur levure sans autoactivation du système. Holo-AFOSB a induit seule l'activité du gène rapporteur, de même que le fragment d'acide aminé 1 – 78 N-terminal de la protéine. Cependant, un ΔFosB tronqué N-terminalFig 1A), dénommé Δ2ΔFosB, dépourvu des premiers acides aminés 78 de la protéine, n’a pas eu cet effet. Par conséquent, nous avons utilisé Δ2ΔFosB en tant que protéine d'appât.

Pour rechercher des partenaires de liaison potentiels, nous avons utilisé une bibliothèque de cerveau de souris sous-clonée dans pPC86. Nous avons identifié les candidats 11 pour les partenaires de liaison. Bien que ces protéines incluent les partenaires connus de l'hétérodimérisation de ΔFosB, c-Jun et JunD (Tableau 1), le candidat le plus répandu était de loin PSMC5. Bien que surprenant, il s’agissait là d’une découverte intéressante, puisqu’il a été démontré dans un seul rapport il y a plusieurs années que PSMCXNXX se liait au c-Fos in vitro21]. Cependant, il n’ya pas eu de rapports antérieurs d’implication de PSMC5 dans l’action contre la cocaïne. Néanmoins, en raison de la force du signal PSMC5 dans le test de deux hybrides de levure, nous avons entrepris d’étudier plus avant les interactions ΔFosB-PSMC5 possibles.

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Tableau 1. Résultats du criblage à deux hybrides de levure avec Δ2ΔFosB.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.t001

Tout d'abord, pour confirmer l'interaction physique entre ΔFosB et PSMC5, nous avons effectué des expériences de co-immunoprécipitation in vitro. Nous avons constaté que PSMC5 (Fig 1B), transfectés dans des cellules Neuro 2A, a efficacement éliminé ΔFosB (Fig 1C). Deuxièmement, pour identifier la région de PSMC5 responsable de sa liaison à ΔFosB, nous avons généré plusieurs mutants PSMC5 marqués par FLAG (Fig 1B) et répété l'expérience de co-immunoprécipitation. ΔFosB a été éliminé efficacement avec les acides aminés 151 N-terminaux de PSMC5 (PSMC5-NT), mais pas avec le fragment d’acides aminés 172 C-terminal de la protéine (PSMC5-CT) (Fig 1C). PSMC5 dépourvu de son domaine de bobine enroulé (PSMC5-ΔCC) s'est également avéré inefficace pour précipiter ΔFosB. Ces résultats suggèrent que PSMC5 se lie à ΔFosB via son domaine en spirale enroulée (acides aminés 27 – 68). De plus, PSMC5 marqué par FLAG n’a pas précipité une forme mutante de ΔFosB avec un domaine zipper de leucine muté (ΔFosB-LZM) (Fig 1C), indiquant que AFOSB lie PSMC5 via ce domaine ou, plus vraisemblablement, qu'une hétérodimérisation de AFOSB est requise pour la liaison PSMC5.

Liaison PSMC5-ΔFosB dans NAc après administration chronique de cocaïne

Sur la base de ces découvertes in vitro, nous avons étudié si les niveaux de PSMC5 dans le NAc étaient altérés en réponse à l’administration chronique de cocaïne. Nous avons constaté, par fractionnement subcellulaire et Western blot, que la cocaïne chronique augmente les niveaux nucléaires de PSMC5 dans cette région du cerveau sans modification des niveaux cytoplasmiques (Fig 2A). Cet effet n'a pas été observé après l'administration de doses uniques de cocaïne (données non présentées). Nous avons ensuite examiné la localisation de PSMC5 et de ΔFosB dans NAc par microscopie confocale à immunofluorescence. Nous avons analysé les souris 24 h après la dernière dose répétée de cocaïne, moment où ΔFosB est le seul effet détectable. FosB produit génique (voir Nestler 2008). Nous avons trouvé une forte immunoréactivité du PSMC5 dans le NAc, y compris un fort signal nucléaire. ~ 85% des noyaux ΔFosB + co-colorés pour PSMC5 (Fig 2B). En outre, nous avons effectué des expériences de co-immunoprécipitation sur des extraits de NAc et avons constaté qu’après un traitement chronique à la cocaïne, ΔFosB était efficacement éliminé par un anticorps anti-PSMC5 (Fig 2C). En revanche, l'analyse de NAc n'ayant jamais reçu de médicament (après des injections répétées de solution saline) n'a révélé aucune diminution détectable du ΔFosB (données non présentées). Ces données sont cohérentes avec nos découvertes en culture cellulaire et confirment que ΔFosB et PSMC5 interagissent dans le NAc in vivo.

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Fig 2. Régulation PSMC5 dans les souris NAc.

 

A. Western blot des fractions nucléaires et cytosoliques de NAc de souris traitées quotidiennement avec une solution saline ou de la cocaïne (20 mg / kg) pendant 7 jours, avec des animaux analysés 24 heures après la dernière injection. La cocaïne augmente les niveaux nucléaires mais non cytosoliques de PSMC5. L'histone H3 et la ß-actine, qui n'étaient pas affectées par la cocaïne, ont été utilisées comme témoins de charge. Les données sont la moyenne ± SEM (n = 8–10 / groupe, * p <0.05). B. Co-localisation de PSMC5 endogène (vert) et ΔFosB (bleu) dans NAc de souris traitées de manière chronique à la cocaïne comme dans AC Des lysats nucléaires de souris NAc après traitement chronique à la cocaïne ont été soumis à une immunoprécipitation avec un anticorps anti-PSMC5 ou une IgG de souris comme contrôle , puis Western bloté avec un anticorps anti-FosB / ΔFosB. La figure montre les interactions PSMC5-ΔFosB dans le NAc in vivo. Les données en B et C ont été répliquées en triple dans chacune des trois expériences distinctes.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g002

PSMC5 améliore l'expression de ΔFosB in vitro

Comme PSMC5 est un membre connu du complexe protéasome, nous avons vérifié s’il régulait les niveaux de ΔFosB à l’aide de cellules 1A de Rat. La surexpression de PSMC5 n’a eu aucun effet sur les taux basaux de ΔFosB, mais a entraîné une augmentation faible mais significative de l’induction de ΔFosB lors de la stimulation sérique des cellules (Fig 3A). Une tendance similaire a été observée pour le FosB de pleine longueur mais l'effet n'a pas été statistiquement significatif. Inversement, la suppression de l’expression de PSMC5 endogène dans les cellules 1A de rat, obtenue par l’utilisation d’ARNsi ciblant PSMC5, n’a pas affecté les niveaux basaux de ΔFosB, mais a fortement inhibé l’induction de ΔFosB par stimulation sérique (Fig 3B). Des effets similaires ont été observés pour le FosB de pleine longueur. Ces données suggèrent que PSMC5 ne favorise pas la dégradation protéasomale de ΔFosB, contrairement à ce qu’on pourrait s’attendre en tant que sous-unité centrale du protéasome, mais est plutôt nécessaire pour une accumulation maximale de FosB produits géniques in vitro, peut-être en stabilisant les protéines.

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Fig 3. Régulation PSMC5 de l'expression de FosB / ΔFosB dans des cellules 1A de rat.

 

A. Des cellules de rat 1A ont été transfectées avec 4 pg de PSMC5 ou d'ADN témoin. La surexpression de PSMC5 n'avait aucun effet sur les niveaux d'expression basaux de la protéine FosB ou ΔFosB comme déterminé par Western blot, mais a produit une augmentation faible mais significative de l'induction de ΔFosB par stimulation sérique (F (2,21) = 9.75, p = 0.001). B. Des cellules de rat 1A ont été transfectées avec 5 pmol de l'un des deux ARNsi ou de l'ARN brouillé (contrôle). Les deux siARN ont effectivement réduit les niveaux de protéine PSMC5 par rapport aux conditions de contrôle (siRNA # 1, 23 ± 5% du contrôle; siRNA # 2, 18 ± 6%; p <0.05; n = 4). Le knockdown de PSMC5 n'a eu aucun effet sur les niveaux basaux de FosB ou ΔFosB mais a atténué l'induction de FosB et ΔFosB par stimulation sérique (FosB: F (2,6) = 20.99, p = 0.002; ΔFosB: F (2,6) = 22.83 , p = 0.002).

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g003

ΔFosB et PSMC5 forment des complexes avec CBP, p300 et BRG1 dans NAc

Pour mieux comprendre les mécanismes de transcription par lesquels PSMC5 pourrait influer sur la fonction de ΔFosB, nous avons étudié d’éventuels partenaires de liaison supplémentaires pour les deux protéines de l’ANc dans des conditions de traitement chronique à la cocaïne. Il existe un rapport selon lequel PSMC5 se lie à la CBP - une HAT - et augmente l’acétylation de l’histone H3 au niveau du promoteur proximal MHC-II dans les cellules HeLa [22]. De plus, les souris déficientes en CBP présentent une sensibilité comportementale réduite à la cocaïne ainsi qu'une acétylation des histones réduite FosB promoteur [23]. Nous avons donc testé si PSMC5 pouvait se lier à ΔFosB dans le cadre de complexes contenant également du CBP et peut-être d’autres activateurs de la transcription.

Nous avons d’abord démontré que ΔFosB éliminait efficacement les protéines CBP et p300, une THA apparentée, dans des cellules Neuro2A (Fig 4A). En revanche, la forme mutante à glissière à leucine de ΔFosB, comme prévu, ne présentait pas cette activité. De même, PSMC5 a efficacement éliminé CBP et p300 (Fig 4B). Fait intéressant, cet effet a également été observé pour PSMC5-ΔCC, qui n'a pas abaissé ΔFosB, indiquant que PSMC5 interagit avec CBP et p300 via d'autres domaines de la protéine et indépendamment de sa liaison à ΔFosB.

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Fig 4. ΔFosB et PSMC5 interagissent avec CBP, p300 et BRG1 in vitro et in vivo.

 

A. Les cellules de Neuro2A ont été transfectées avec 2.4, µg de ΔFosB marqué par MYC ou de ΔFosB-LZM marqué par MYC. Les extraits cellulaires ont été immunoprécipités avec un anticorps anti-CBP ou anti-p300 et les précipités ont été soumis à un Western blot avec le même anticorps ou avec un anticorps anti-MYC. CBP et p300 interagissent tous deux avec ΔFosB et de telles interactions nécessitent une fermeture éclair intacte à la leucine. Les cellules de B. Neuro2A ont été transfectées avec 2.4 µg de PSMC5 marqué par FLAG ou de PSMC5-ΔCC marqué par FLAG. Les extraits cellulaires ont été immunoprécipités avec un anticorps anti-CBP ou anti-p300, et les précipités ont été soumis à un Western blot avec le même anticorps ou un anticorps anti-FLAG. CBP et p300 interagissent avec PSMC5 et de telles interactions ne nécessitent pas le domaine CC. C. Les lysats nucléaires de NAc de souris après traitement chronique à la cocaïne ont été soumis à une immunoprécipitation avec un anticorps anti-CBP ou anti-p300. Un transfert de Western ultérieur des précipités obtenus avec l'anticorps anti-FosB / AFSB a montré des interactions endogènes entre AFOSB et CBP / p300. D. Des parties aliquotes des mêmes lysats nucléaires ont été soumises à une immunoprécipitation avec un anticorps anti-BRG1 ou anti-PSMC5, suivie d'un Western blot de précipités avec un anticorps anti-FosB / AFOSB ou anti-BRG1. Les résultats montrent des interactions endogènes entre ΔFosB et BRG1, et BRG1 et PSMC5. E. Illustration schématique d'un complexe d'activation de la transcription composé d'hétérodimères AFOSB: JunD interagissant avec CBP / p300, BRG1 et PSMC5.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g004

Pour confirmer que ces interactions se produisent également in vivo, nous avons administré de la cocaïne de manière chronique pour induire les taux de ΔFosB et de PSMC5 nucléaire, puis des extraits de NAc immunoprécipités avec des anticorps anti-CBP ou anti-p300. Conformément à nos données sur la culture cellulaire, l’immunoprécipitation de CBP ou de p300 a efficacement éliminé ΔFosB (Fig 4C). Nous avons vérifié si BRG1, une sous-unité centrale du complexe de remodelage de la chromatine SWI-SNF, pouvait également se lier à AFOSB et à PSMC5, sur la base de notre découverte antérieure selon laquelle BRG1 est recruté pour certains gènes cibles de ΔFosB de concert avec leur activation dans la NCA après une cocaïne chronique [24]. Nous avons découvert que l’immunoprécipitation de BRG1 réduisait le ΔFosB dans les extraits NAc et que l’immunoprécipitation de PSMC5 était également une co-précipitation de BRG1 endogène (Fig 4D). Pris ensemble, ces résultats suggèrent que ΔFosB-PSMC5 forme des complexes dans NAc qui incluent également CBP / p300 et BRG1 (Fig 4E).

La surexpression de PSMC5 augmente les réponses locomotrices à la cocaïne

La liaison importante de PSMC5 avec ΔFosB dans NAc nous a incités à rechercher si l’augmentation des taux de PSMC5 dans cette région du cerveau régule les réponses comportementales à la cocaïne. Nous avons généré un vecteur du virus de l’herpès simplex (HSV) qui surexprime soit le type sauvage PSMC5, soit l’un de ses mutants, et nous avons validé les vecteurs dans NAc in vivo (Fig 5A). L’expression de PSMC5 à médiation virale prédomine dans le noyau cellulaire (Fig 5B). Les souris surexprimant PSMC5 de type sauvage ne présentaient pas de réponses altérées aux doses initiales de cocaïne, mais présentaient une activation locomotrice accrue en réponse à des doses répétées de cocaïne par rapport aux souris témoins exprimant GFP. En revanche, les souris surexprimant une forme mutante de PSMC5 qui manque de son domaine en spirale enroulée (PSMC5-ΔCC) ne présentent pas cet effet (Fig 5B). Il est intéressant de noter que la surexpression de PSMC5-K196M, dépourvue de l’activité ATPase de la protéine sauvage, a également potentialisé les réponses locomotrices de la cocaïne.

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Fig 5. La surexpression de PSMC5 dans NAc augmente les réponses locomotrices à la cocaïne.

 

A. Expression représentative du transgène médiée par le HSV dans NAc médiale. AC, commissure antérieure. Les sous-régions NAc core et shell sont indiquées sur la figure. B. Des agrandissements plus élevés représentatifs (60x) de la coloration immunohistochimique de PSMC5 dans les neurones NAc après injection de HSV-PSMC5 montrant que la protéine est principalement nucléaire comme marqué par la coloration DAPI. C. Les souris ont reçu des injections bilatérales de HSV dans NAc suivies d'injections IP quotidiennes de doses inférieures au seuil de cocaïne (7.5 mg / kg). Les réponses locomotrices sont présentées en réponse à la première et à la dernière des 3 doses quotidiennes du médicament. La surexpression de PSMC5 ou PSMC5-K196M augmente les réponses locomotrices à la cocaïne répétée, un effet non observé avec PSMC5-ΔCC. Il n'y avait aucun effet significatif des transgènes sur les réponses locomotrices aux doses initiales de cocaïne. ANOVA F (3,125 4.163) = 0.05, * p <XNUMX par le test posthoc de Dunnett.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g005

Discussion

Les résultats de la présente étude révèlent un nouveau mécanisme par lequel ΔFosB atténue ses effets sur le cerveau et un nouveau mécanisme impliqué dans l'action de la cocaïne. En utilisant une approche non biaisée, un dosage de deux hybrides chez la levure, nous avons identifié PSMC5 comme nouveau partenaire de liaison pour ΔFosB. Nous avons validé cette découverte à la fois dans des cellules en culture in vitro et dans le NAc in vivo en démontrant une liaison robuste de PSMC5-AFOSB. De manière importante, des niveaux nucléaires de PSMC5 sont induits dans NAc par une administration chronique de cocaïne. Nous avons également montré que la liaison PSMC5-AFOSB se produit de concert avec plusieurs autres protéines activatrices de la transcription, à savoir CBP et p300 (deux HAT) et BRG1 (un constituant clé des complexes de remodelage de la chromatine SWI-SNF). Ensemble, nos résultats corroborent l'hypothèse selon laquelle PSMC5 fait partie du complexe d'activation de la transcription recruté dans au moins certains gènes induits par ΔFosB au cours d'une administration chronique de cocaïne (Fig 4E). Cette hypothèse est cohérente avec la découverte supplémentaire que la surexpression de PSMC5 dans NAc, tout comme la surexpression de ΔFosB elle-même, favorise les réponses comportementales à la cocaïne. Il serait intéressant, dans les études futures, de suivre ces observations in vivo par la caractérisation des interactions PSMC5-AFOSB-HAT-BRG1 par l’utilisation d’essais rapporteurs in vitro.

L'implication de PSMC5 dans l'action de la cocaïne est complètement nouvelle. Identifié initialement en tant que membre d'une grande famille d'ATPases comprenant le protéasome, PSMC5 a démontré au fil des années une interaction avec plusieurs facteurs de transcription, notamment c-Fos, p53, les récepteurs nucléaires d'hormone et les constituants du complexe de transcription basal [25], cependant, peu d’études fonctionnelles ont été réalisées au fil des ans [26]. Son action la mieux établie consiste à promouvoir l'activité des facteurs de transcription MYC dans des cellules en culture [27]. L'implication de PSMC5 dans les mécanismes de transcription a suggéré un rôle potentiel pour l'activité ubiquitination-protéasomal dans la régulation de la transcription des gènes, mais l'implication de PSMC5 dans une telle régulation reste pratiquement non testée à ce jour [28,29].

On sait très peu de choses sur la fonction de PSMC5 dans le cerveau. Une étude antérieure avait démontré l’expression généralisée de l’ARNm de PSMC5 dans tout le cerveau [30], mais son activité fonctionnelle n’a pas été étudiée. Nos découvertes appellent maintenant de nouvelles études sur cette protéine intéressante afin de mieux comprendre son rôle dans la régulation de la transcription des gènes et sa relation avec la fonction ubiquitination-protéasomique dans le cerveau. La liaison de PSMC5 à ΔFosB est médiée par le domaine de bobinage en spirale de PSMC5. De plus, la capacité de PSMC5 à promouvoir les réponses locomotrices à la cocaïne, tout en nécessitant le domaine en spirale hélicoïdale, ne nécessite pas l'activité de l'ATPase, qui est intrinsèque à la protéine. Ces résultats laissent penser que, du moins dans notre système, l'activité principale de PSMC5 pourrait être médiée par sa liaison à AFOSB et à d'autres protéines régulatrices de la transcription et non par son activité liée au protéasome en tant que telle. Des travaux supplémentaires sont nécessaires pour tester directement cette possibilité et d’autres possibilités. L'hypothèse selon laquelle la surexpression de PSMC5 à médiation virale augmenterait les réponses locomotrices à la cocaïne via des interactions avec ΔFosB est plausible, malgré l'utilisation d'un schéma thérapeutique de traitement à la cocaïne de jour par 3, car il est connu que des niveaux appréciables de ΔFosB s'accumulent dans le cerveau pendant cette période [3].

Les présents résultats confirment davantage l'utilité d'utiliser des approches expérimentales non biaisées et ouvertes pour étudier les bases moléculaires de la régulation du cerveau. Notre attention initiale sur PSMC5 était uniquement basée sur sa liaison importante à ΔFosB dans un essai sur deux hybrides de levure; pourtant, il semble être un élément important des modifications transcriptionnelles recrutées dans l'ANc par administration répétée de cocaïne. Une meilleure compréhension des mécanismes détaillés par lesquels les taux nucléaires de PSMC5 sont induits par la cocaïne et, à son tour, par laquelle PSMC5 contribue ensuite aux complexes d'activation de la transcription induits par la cocaïne sont au centre des recherches actuelles. Pendant ce temps, notre test de double hybride de levure a révélé plusieurs partenaires de liaison putatifs supplémentaires de ΔFosB (Tableau 1) qui justifient également un examen direct dans les modèles contenant de la cocaïne. Ensemble, ces travaux contribuent à une compréhension croissante des mécanismes moléculaires complexes par lesquels la cocaïne modifie la fonction de NAc.

Remerciements

Ce travail a été financé par des subventions de l'Institut national de lutte contre l'abus des drogues, ainsi que par la Fondation Ishibashi et la Société japonaise pour la promotion de la science (numéros KAKENHI: 24591735, 26290064, 25116010).

Contributions d'auteur

Conçu et conçu les expériences: YHO YNO EJN. Effectué les expériences: YHO YNO PJK RN. Analysé les données: YHO YNO EJN. Réactifs, matériaux et outils d’analyse: TN MO OY AN RN TT. A écrit le papier: YHO EJN.

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